Processos biotecnológicos dependem significativamente das técnicas de separação e purificação utilizadas, para manter boa relação custo-benefício na produção em escala industrial de produtos biotecnológicos com fins comerciais, industriais e terapêuticos. A aplicação do sistema micelar de duas fases aquosas (SMDFA) é proposta como alternativa para purificação de biomoléculas/biopartículas, pois permite sua separação e análise, muitas vezes sem que essas percam sua atividade ou propriedades desejadas. Com essa técnica é possível realizar uma partição seletiva que possibilita altos rendimentos. Esse trabalho destinou-se a estudar o emprego dessa metodologia na extração e purificação de Adenovírus em sistema micelar de duas fases aquosas formado por Triton X-114/Suspensão viral. Os ensaios foram realizados em sistemas de 5 g seguindo um planejamento fatorial completo (23) com 4 pontos centrais. Os fatores estudados foram temperatura de extração, pH da suspensão viral e concentração do tensoativo. Sistemas contendo massas de 3g, 10g e 40g foram avaliados. Foi avaliado o efeito do processo de extração com SMDFA sobre a integridade e infectividade de Adenovírus. Alguns dos parâmetros avaliados no processo foram a recuperação da potência viral (RPv) e a recuperação da potência viral específica (RPvø). Esses dois parâmetros avaliam a inativação do Adenovirus pelo processo de extração e ambos apresentaram melhoras quando comparados com a própria suspensão viral para alguns dos sistemas estudados (i.e RPv:341 % e RPvø 1466 %). Esses resultados indicam que o SMDFA foi capaz de particionar seletivamente as partículas virais infecciosas. De acordo com os resultados do planejamento é possível aumentar ainda mais esses resultados controlando as variáveis concentração de tensoativo, pH da suspensão viral e temperatura de extração. / Biotechnological processes depend significantly on separation and purification techniques used to maintain cost-effective industrial-scale production of biotechnological products for commercial, industrial and therapeutic uses. The application of the aqueous two-phase micelar system (ATPMS) is proposed as an alternative for purification, since it allows the separation and analysis of biomolecules /bioparticles, often without loses of activity or their properties. This allows to perform a selective partition that enables high yields. This work aims to study the use of this methodology in the extraction and purification of adenovirus in micelle aqueous two-phase formed by TritonX-114/Viral suspension. All assays were performed in 5 g systems following a full factorial design (23) with four central points. The studied factors were extraction temperature, pH of the viral suspension and concentration of the surfactant. Systems containing masses of 3g, 10g and 40g were evaluated. Extraction procedure effects over integrity and infectivity of adenovirus were also evaluated. Some of the parameters evaluated in the viral recovery process were viral potency (RPv) and recovery of viral specific potency (RPvø). These two parameters measure the inactivation of Adenovirus by the extraction process and both showed improvement when compared with the viral suspension for some of the systems studied (i.e RPv: 341% and RPvø 1466%). These results show that ATPMS selectively partition the infectious viral particles. According to the results of the experimental design is possible to increase, even further, these results controlling the surfactant concentration, viral suspension pH and temperature of extraction.

Processos biotecnológicos dependem significativamente das técnicas de separação e purificação utilizadas, para manter boa relação custo-benefício na produção em escala industrial de produtos biotecnológicos com fins comerciais, industriais e terapêuticos. A aplicação do sistema micelar de duas fases aquosas (SMDFA) é proposta como alternativa para purificação de biomoléculas/biopartículas, pois permite sua separação e análise, muitas vezes sem que essas percam sua atividade ou propriedades desejadas. Com essa técnica é possível realizar uma partição seletiva que possibilita altos rendimentos. Esse trabalho destinou-se a estudar o emprego dessa metodologia na extração e purificação de Adenovírus em sistema micelar de duas fases aquosas formado por Triton X-114/Suspensão viral. Os ensaios foram realizados em sistemas de 5 g seguindo um planejamento fatorial completo (23) com 4 pontos centrais. Os fatores estudados foram temperatura de extração, pH da suspensão viral e concentração do tensoativo. Sistemas contendo massas de 3g, 10g e 40g foram avaliados. Foi avaliado o efeito do processo de extração com SMDFA sobre a integridade e infectividade de Adenovírus. Alguns dos parâmetros avaliados no processo foram a recuperação da potência viral (RPv) e a recuperação da potência viral específica (RPvø). Esses dois parâmetros avaliam a inativação do Adenovirus pelo processo de extração e ambos apresentaram melhoras quando comparados com a própria suspensão viral para alguns dos sistemas estudados (i.e RPv:341 % e RPvø 1466 %). Esses resultados indicam que o SMDFA foi capaz de particionar seletivamente as partículas virais infecciosas. De acordo com os resultados do planejamento é possível aumentar ainda mais esses resultados controlando as variáveis concentração de tensoativo, pH da suspensão viral e temperatura de extração. / Biotechnological processes depend significantly on separation and purification techniques used to maintain cost-effective industrial-scale production of biotechnological products for commercial, industrial and therapeutic uses. The application of the aqueous two-phase micelar system (ATPMS) is proposed as an alternative for purification, since it allows the separation and analysis of biomolecules /bioparticles, often without loses of activity or their properties. This allows to perform a selective partition that enables high yields. This work aims to study the use of this methodology in the extraction and purification of adenovirus in micelle aqueous two-phase formed by TritonX-114/Viral suspension. All assays were performed in 5 g systems following a full factorial design (23) with four central points. The studied factors were extraction temperature, pH of the viral suspension and concentration of the surfactant. Systems containing masses of 3g, 10g and 40g were evaluated. Extraction procedure effects over integrity and infectivity of adenovirus were also evaluated. Some of the parameters evaluated in the viral recovery process were viral potency (RPv) and recovery of viral specific potency (RPvø). These two parameters measure the inactivation of Adenovirus by the extraction process and both showed improvement when compared with the viral suspension for some of the systems studied (i.e RPv: 341% and RPvø 1466%). These results show that ATPMS selectively partition the infectious viral particles. According to the results of the experimental design is possible to increase, even further, these results controlling the surfactant concentration, viral suspension pH and temperature of extraction.

Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2016-09-02T12:53:33Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Dissertação CCB - Kátia Albuquerque 2016.pdf: 1508022 bytes, checksum: 82278b56e00cafb789bead747a3af48d (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-02T12:53:33Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Dissertação CCB - Kátia Albuquerque 2016.pdf: 1508022 bytes, checksum: 82278b56e00cafb789bead747a3af48d (MD5) Previous issue date: 2016-02-19 / CAPEs / Enzimas são proteínas com atividade catalítica capazes de integrar diferentes processos biotecnológicos. Dentre as enzimas com aplicação na indústria destaca-se a tanino acil hidrolase (EC 3.1.1.20) ou simplesmente tanase, uma enzima extracelular produzida na presença de ácido tânico por fungos filamentosos, bactérias e leveduras. A tanase (TAH) catalisa a hidrólise de taninos liberando ácido gálico e glicose. TAH pode ser utilizada no tratamento de efluentes, na indústria farmacêutica, de alimentos, bebidas entre outros. Na biotecnologia, o grande desafio na produção de enzimas é extrair a molécula a partir de métodos economicamente viáveis. Assim, o sistema de duas fases aquosas (SDFA) tem sido cada vez mais utilizado para purificar parcialmente diversos produtos biológicos. Neste sentido, o presente trabalho teve como finalidade extrair em SDFA, caracterizar bioquimicamente e aplicar em chá verde a enzima tanase obtida de Aspergillus sp. SIS 25 por fermentação em estado sólido, utilizando a fibra do coco como substrato. Um planejamento fatorial 23 foi utilizado para avaliar a influência das variáveis principais: massa molar (MMPEG) do PEG (1000, 3350 e 6000 g/mol), concentração (20, 22 e 24% m/m) do PEG (CPEG) e concentração (15, 17,5 e 20% m/m) de citrato de sódio (CCIT), sobre as variáveis resposta: coeficiente de partição (K), recuperação (Rec) e aumento de pureza (AP), em pH 6. A tanase foi preferencialmente particionada para a fase sal do sistema uma vez que em todos os ensaios os valores de K foram menores do que 1. As variáveis MMPEG e a interação entre MMPEG-CPEG apresentaram os resultados mais significativos para o valor de K, sendo ambos os efeitos negativos. Com relação ao aumento de pureza, o melhor resultado (3,2) foi observado no ensaio 8 com 24% de PEG 6000 e 20% de sal. A tanase extraída do sistema apresentou temperatura ótima a 30° C e pH ótimo 5,0. A perda da estabilidade foi observada a 50 °C. A TAH desse estudo foi estimulada na presença de Na+ e completamente inibida na presença de Zn2+. Os surfactantes não interferiram significativamente em sua atividade, com exceção do Triton X-100 a 2% que diminuiu a atividade relativa em aproximadamente 50%. No processo de hidrólise dos compostos fenólicos do chá verde, a tanase pré-purificada em SDFA apresentou melhor resultado se comparada ao extrato bruto; 0,75 mL da enzima do sistema reduziu 44% dos fenóis do chá. Os resultados demonstram que o modelo estatístico montado para o SDFA além de permitir a extração de uma tanase parcialmente pura tornou conhecido outros modelos que favorecem a otimização das variáveis estudadas, principalmente o aumento de pureza. Com isso, é possível afirmar que a tanase de Aspergillus sp. SIS 25 pode ser extraída através de um método de baixo custo, que emprega material reutilizável, biodegradável e que o processo conservou as características biquímicas dessa enzima devido à abundância de água que ocorre no sistema e pela utilização de componentes inertes à maioria das bimoléculas. A criação desse ambiente favorável para separar moléculas biológicas pode explicar o fato da tanase não ter perdido sua atividade durante o estudo, mantendo sua ação catalítica principalmente durante a aplicação em chá verde. / Enzymes are proteins with catalytic activity capable of integrating different biotechnological processes. One of the enzymes with application in industry stands out the tannin acyl hydrolase (EC 3.1.1.20) or simply tannase, an extracellular enzyme produced in the presence of tannic acid by filamentous fungi, bacteria and yeast. The tannase (TAH) catalyzes the hydrolysis of tannins releasing gallic acid and glucose. TAH can be used for effluent treatment, pharmaceutical industry, food, beveragesand others. In biotechnology, the big challenge in the production of enzymes is to extract the molecule from economically viable methods. Thus, the aqueous two-phase system (ATPS) has been increasingly used to partiallypurify biological products. In this sense, the present work had as purpose to extract in ATPS, characterize biochemically and apply in green tea the tannase enzyme obtained from Aspergillus sp. SIS 25 by solid state fermentation using coconut fiber like substrate. A factorial design 23 was used to evaluate the influence of major variables: PEG molar mass (1000, 3350 and 6000 g/mol), PEG concentration (CPEG) and sodium citrate concentration (CCIT), on the response variables: partition coefficient (K), recovery (Rec) and purity increase (AP), at pH 6. The tanase was preferentially partitioned to stage the salt system once in all tests the values of K were lower than 1. The variables MMPEG and the interaction between MMPEG-CPEG presented the results more meaningful for the value of K, being both negative effects. With regard to the increase in purity, the best result (3.2) was observed in 8 test with 24% of PEG 6000 and 20% salt. The tannase extracted from system showed optimum temperature at 30 ° C and optimum pH 5.0. The loss of stability was observed at 50° c. TAH this study was stimulated in the presence of Na+ and completely inhibited in the presence of Zn2+. Surfactants not significantly interfere in their activity, with the exception of Triton X-100 2% that decreased the relative activity by approximately 50%. In the process of hydrolysis of phenolic compounds from green tea, tannase pre-purified in ATPS showed better results when compared to the crude extract; 0.75 ml of the enzyme from system has reduced 44% of tea phenols. The results show that the statistical model fitted to the ATPS and allow the extraction of a pure and partially known other models that favor the optimization of the studied variables, especially the increase in purity. With this, it is possible to affirm that the tanase of Aspergillus sp. SIS 25 can be extracted through a low-cost method, employing reusable, biodegradable material and the process preserved the biquímicas features of this enzyme because of the abundance of water that occurs in the system and by the use of inert components to most bimoléculas. The creation of this favourable environment to separate biological molecules can explain the fact of tannase didn't lose its activity during the study, keeping their catalytic action primarily during application in green tea.

Orientador: Elias Basile Tambourgi / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química / Made available in DSpace on 2018-08-16T08:45:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Sbruzzi_Dalva_M.pdf: 1983604 bytes, checksum: 3ca47c66cbfb0f6dcff7d83c5b614ccc (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: O curauá (Ananas Erectifolius L.B. Smith), espécie vegetal de porte herbáceo, é uma monocotiledônea pertencente à família Bromeliaceae, nativa da região norte do Brasil, especialmente da Amazônia, de onde pode ser extraída a bromelina. Essa faz parte de um grupo de enzimas proteolíticas, usadas na indústria alimentícia e como medicamento, pois oferece amplo espectro de eficácias terapêuticas: antiedemas, anti-inflamatórias, antitrombóticas e atividades fibrinolíticas. O desenvolvimento de novos processos de extração e purificação de proteínas é muito importante, uma vez que essa é uma etapa limitante na produção de bioprodutos. Sistemas de duas fases aquosas são amplamente utilizados para a separação e purificação de biomoléculas. As vantagens da extração em duas fases aquosas, em comparação com outros métodos de purificação, são o elevado rendimento, a faixa de trabalho próxima do equilíbrio, a fácil ampliação de escala e o uso em processos contínuos. Esta pesquisa propõe a caracterização da bromelina do curauá e a sua purificação por extração líquido-líquido em duas fases aquosas, formadas por um polímero (polietilenoglicol) e um sal (fosfato de potássio). Apresenta também um estudo sobre os custos do processo e o preço de venda estimado, e demonstra a sua viabilidade econômica, quer seja para uso como pré-processo nos tradicionais sistemas cromatográficos, quer para a comercialização direta, como alternativa para a bromelina do abacaxi. Os resultados da caracterização mostraram que as condições ideais de trabalho são pH 8,5 e temperatura 35º C para a variedade branca, e pH 8,5 e 30º C de temperatura para a variedade roxa. A massa molar é de 24 kDa, e o melhor sistema de partição da bromelina foi o SBA PEG 4000 em pH 9. A solução enzimática dos melhores sistemas contém 7 U de bromelina e, aproximadamente, 17 mg/L de proteína total medida por Bradford (curauá branco); e 6 U de bromelina e, aproximadamente, 23 mg/L de proteína total medida por Bradford (curauá roxo). O preço de venda calculado para um litro dessa solução enzimática, quando não se obtém lucro (margem de lucro desejada é 0%), foi estimado em R$75,06. Assim, pode-se concluir que o processo de purificação da bromelina das folhas de curauá, ao ser utilizado sistema bifásico aquoso, PEG/sal, é promissor no que diz respeito a sua possibilidade de produção em escala industrial / Abstract: Curaua (Ananas erectifolius L.B. Smith) is a mocotyledonous herbaceous specie belonging to the Bromeliaceae family and it is native to the north region of Brazil, especially the Amazonian Complex, that we can extract bromelain which belongs to a group of proteolytic enzymes derived from herbaceous species of Bromeliaceae family, which are used in food industries and as drugs as such as they offer a wide spectrum of therapeutic efficacies: antiedemateous, antiinflammatory, antithrombotic and fibrinolytic activities. The development of new extraction and purification processes of proteins is very important, as this is a limiting step in the production of bioproducts. Aqueous two-phase systems are widely used for separation and purification of biomolecules. The advantages of aqueous two-phase extraction compared to other purification methods lie in high productivity, working range close to equilibrium, easy scale up and use in continuous processes. This research proposes the curaua's bromelain characterization, and its purification by a liquid-liquid extraction in aqueous two-phase system, formed by a polymer (polyethylene glycol) and a salt (potassium phosphate). It also presents a study about the costs of this process and the estimated sale price, showing its economic viability, whether it is for use as a pre-process in traditional chromatographic systems or direct commercialization, as an alternative for the bromelain of pineapple. The curaua's bromelain characterization results showed that the ideal working conditions are pH 8.5 and 35 ºC of temperature to white variety and pH 8.5 and 30°C of temperature to purple variety. The curaua's molecular weight is 24 kDa and the best bromelain partitioning system was the SBA PEG 4000 at pH 9. The enzyme solution of the best purification system contains 7 U of bromelain and about 17 mg/L of total protein measured by Bradford (white curaua) and 6 U of bromelain and about 23 mg/L of total protein measured by Bradford (purple curaua). The estimated sale price for a liter of this enzyme solution, when profit is not achieved (0% of desired markup), was estimated at R$ 75, 06. So, the curaua's bromelain purification process using an aqueous two-phase system, PEG/salt, is promising with regard to the possibility of industrial scale production / Mestrado / Sistemas de Processos Quimicos e Informatica / Mestre em Engenharia Química

Neste trabalho estudou-se a modelagem termodinâmica do equilíbrio de fases de sistemas aquosos bifásicos formados por um polímero neutro, especificamente o poli(etileno glicol), e um sal. O modelo implementado é baseado na equação de Pitzer para soluções de eletrólitos, dele diferindo ao considerar a influência das propriedades do polímero no cálculo da constante dielétrica e da densidade do meio, presentes no cálculo do termo relativo às interações de longo alcance da energia de Gibbs excedente. Além disso, procurou-se também considerar a dependência dos parâmetros relativos ao polímero com respeito ao tamanho de sua cadeia. Dados experimentais obtidos da literatura foram utilizados para a obtenção dos parâmetros ajustáveis do modelo, em cuja implementação foi utilizada a linguagem FORTRAN. A alteração nas propriedades do meio modificou o estado de equilíbrio calculado, fato que pôde ser observado por meio da análise de fatores como o desvio entre a composição calculada pelos modelos e os valores experimentais em cada fase e a inclinação da linha de amarração. Em alguns sistemas o desempenho do modelo modificado foi superior nesses parâmetros, mas em termos gerais a modificação no cálculo da constante dielétrica e da densidade não resultou em melhora no cálculo do equilíbrio de fases, por vezes piorando-o, de modo que investigações específicas sobre o termo de longo alcance foram conduzidas para verificar a razão deste comportamento. A inclusão de parâmetros ternários aumentou a capacidade de correlação de ambos os modelos. No que diz respeito à possibilidade de correlação dos parâmetros de interação como função do tamanho da cadeia polimérica, que poderia levar a um modelo preditivo, observou-se que somente para tamanhos grandes de cadeia foi possível estabelecer uma dependência direta e inequívoca. / The thermodynamic modeling of phase equilibrium in aqueous two phase systems containing the neutral polymer poly(ethylene glycol) and a salt was studied in this work. The implemented model is based on the Pitzer equation for electrolytes solutions, modified in order to account for the influence of polymer properties in both the medium dielectric constant and the medium density, values which are present in long range term of the excess Gibbs energy. The dependence of the adjustable parameters on the polymer molecule size was also investigated. Experimental data from literature were used to obtain the adjustable parameters of the model, in whose implementation the FORTRAN computer language was used. The changes introduced into the long range term resulted in a shift of the calculated equilibrium compositions, which could be observed by analyzing the deviation between calculated and experimental compositions and tie-line slopes. For some systems the performance of the modified model was superior, but in most cases the changes introduced did not result in a significant improvement in phase equilibrium calculations, and even worsened them. Specific investigations on the long range term were carried out to verify the reason for such behavior. The insertion of ternary parameters increased the correlation capacity of both models. Concerning the hypothesis that the interaction parameters can be directly related to the polymer chain size, which might eventually lead to a predictive model, it was noticed that a direct dependency holds only for larger chain sizes.

O ambiente Antártico é caracterizado por condições ambientais restritivas de clima, hábitat e biogeografia. Neste sentido, o objetivo deste estudo foi avaliar a diversidade de leveduras em amostras marinhas e terrestres do ambiente Antártico, além da prospecção de lipases que atuem em processos que requerem baixas e moderadas temperaturas. De acordo com os resultados obtidos, 97 leveduras foram recuperadas por semeadura em meio de cultura PDA e YMA a partir de diferentes amostras coletadas na OPERANTAR XXVIII (verão 2010), das quais foram identificados 12 gêneros e 21 espécies. Destas, 45 apresentaram atividade de lipase e duas foram selecionadas para o ensaio de otimização da produção enzimática: C. laurentii L59 e L. scotti L117. A extração de lipase de L. scottii L117 foi avaliada por Sistema de Duas fases Aquosas e o sistema micelar utilizando TX-114 foi o mais eficiente para purificação parcial desta enzima. Por fim, a avaliação da diversidade das 405 leveduras isoladas de macroalgas e liquens (coletadas na OPERANTAR XXXII no verão de 2013) revelou a ocorrência de 24 taxons de leveduras a partir das amostras de macroalgas e 18 taxons a partir das amostras de liquens, sendo apenas cinco espécies comuns a estes dois substratos. / The Antarctic continent is characterized by restrictive environmental conditions of climate, habitats and biogeography. In this sense, the objective of this study was to evaluate the diversity of yeasts in marine and terrestrial samples of the Antarctic environments, as well as the propspecting of lipases that can act in proceses that require low and moderate temperatures. According to the results, 97 yeasts were recovered from different samples collected in OPERANTAR XXVIII (summer 2010), representing 21 different species. Among them, 45 showed lipase activity and two were selected for the optimization of enzyme production: C. laurentii L59 and L. scotti L117. Extraction of L. scottii L117 lipase was assessed by Aqueous Two-Phase System and the micellar system TX-114 was the most efficient for partial enzyme purification. Finally, the diversity evaluation of 405 isolates from seaweeds and lichens (collected in XXXII OPERANTAR, summer of 2013) revealed the occurrence of 24 taxa from macroalgae samples and 18 taxa from lichens samples, being only five substrates common to these two substrata.

No description available.

<p>The two techniques aqueoustwo-phase partitioning and expanded bed adsorption that bothare suitable for primary protein recovery were studied. Most ofthe work was focused on partition in aqueous two-phase systemsand in particular on the possibility to effect the partitionbehaviour by fusion of short peptide tags or protein domains tothe target protein.</p><p>The partitioning of fusionproteins between different variants of the domain tag Z and thenaturally occurring protein DNA Klenow polymerase were studiedin Breox/Reppal aqueous two-phase systems. Most studies wereperformed with cell homogenate. The Breox/Reppal system was infocus because if the fusion protein can be partitioned to theBreox-rich top phase the next step can be a thermoseparatingaqueous two-phase system. When the Breox phase is heated to50°C it switches from a one-phase system to a two-phasesystem resulting in an almost pure water rich top phase andhighly concentrated Breox-rich bottom phase. The Breox can thenbe reused and the protein recovered from the water phase. TheZ-domain was genetically modified in different ways to Z_basic1, Z_acid2and Z_trp12and fused to the Klenow protein to try toenhance partitioning to the Breox-rich phase. From theexperiments it was not possible to observe any effects on thepartition behaviour irrespectively of tested properties of thedomain tag. Despite the absence of domain tag effects highK-values, i.e. partition to the Breox-rich top phase, wereobserved in the Breox/Reppal system. However, the proteinK-values seemed to be rather sensitive to the cell homogenateload and showed a tendency to decrease with increased cellhomogenate load. Also increased phosphate concentration reducedthe K-values. The partitioning of cell debris also seemed todependent on the cell homogenate load. At higher homogenateload (<=20g DW/L) clear Breox-rich top phases were observedwith the cell debris collected in Reppal-rich bottomphases.</p><p>Two different tetrapeptides,AlaTrpTrpPro and AlaIleIlePro were inserted near the C-terminusof the protein ZZT0. The Trp-rich peptide unit stronglyincreased both the partitioning of ZZT0 into the poly(ethyleneglycol) (PEG)-rich phase in a PEG/potassium phosphate aqueoustwo-phase system and its retention on PEG and propylhydrophobic interaction chromatographic columns with potassiumphosphate as eluent in isocratic systems. Both the partitioningand the retention increased with increasing number of Trp-richpeptide units inserted into ZZT0. Insertion of Ile-richtetrapeptide units affected the partitioning and retention to amuch lesser extent. Partition and modelling data also indicateda folding of inserted Trp and Ile tetrapeptide units, probablyto minimise their water contact. It was also investigated howto predict the partitioning of proteins in isoelectricPEG/phosphate aqueous two-phase systems.</p><p>The capture ofß-galactosidase from<i>E. coli</i>cell homogentate (50g DW/L) by metal chelatexpanded bed adsorption was studied. These experiments showedthat capture, with a certain degree of selectivity, andclarification of ß-galactosidase could be achieved from acell homogenate. However, a rather low recovery of about 35 %was obtained at a capacity of 0.25mg/mL of gel. Thus, severalparameters remain to be optimised like the load buffercomposition and the cell homogenate load.</p><p><b>Keywords:</b><i>E. coli</i>, aqueous two-phase systems, fusion proteins,hydrophobic interaction chromatography, expanded bedadsorption, ß-galactosidase, Klenow polymerase, Z-domain,peptide tags</p>

Este trabalho tem como finalidade obter condições de recuperar e purificar a pró-toxina épsilon e uma protease produzida pelo Clostridium perfringens através do uso da técnica de extração líquido-líquido em sistema de duas fases aquosas (SDFA) para utilização na produção de vacinas. A aplicação do sistema de duas fases aquosas é proposta como alternativa para a purificação, pois permite a separação e análise de partículas biológicas. Esta técnica é aconselhável para purificação em larga escala pela possibilidade de partição seletiva com altos rendimentos, além de apresentar uma boa relação custo-benefício. Foram construídas as curvas binodais que foram utilizadas para análise da composição dos sistemas de duas fases aquosas formados por polietileno glicol e citrato de sódio, como também a extração e recuperação da pró-toxina épsilon e da protease produzidas por Clostridium perfringens. As curvas binodais foram construídas utilizando PEG 400, 550, 1000, 1500, 3350 e 8000 em diferentes valores de pH (6,0; 6,5; 7,0; 7,5 e 8,0) e água para formação do sistema. Também foram construídas curvas na presença de caldo clarificado em substituição à água. Foi avaliada ainda a estabilidade da pró-toxina épsilon, antes da extração, e da protease antes e após a extração, frente às variações de pH e temperatura. Um planejamento experimental ('2pot.8-3') foi usado para avaliar a influência das variáveis concentração e massa molar do PEG, concentração de citrato, pH, concentração de NaCl, fator de diluição do extrato, temperatura e massa total do sistema na extração da pró-toxina épsilon. A partição de uma protease presente no meio fermentado de C. perfringens foi estudada através do uso de três planejamentos experimentais completos (dois do tipo '2pot.4' e um do tipo '2pot.3') que avaliaram a influência das variáveis concentração e massa molar do PEG, concentração de citrato e pH. Três variáveis-resposta foram obtidas (aumento de pureza, coeficiente de partição e recuperação da enzima). Os resultados atingidos foram: coeficiente de partição de 0,57, aumento de pureza de 4,2 com uma recuperação de 131% da atividade enzimática na fase superior do sistema. O sistema de extração que proporcionou as melhores condições de extração foi constituído por: PEG 10000 (g/mol) e concentração de 22% (m/m), concentração de citrato de 8% (m/m) e pH 8,5. A protease permaneceu estável (durante 48 h), mesmo após a extração, nas temperaturas de 5°C e 25°C e nos valores de pH de 6,0 a 9,0. / The purpose of this work is to obtain best conditions of recovery and purification of proteins (epsilon prototoxin and a protease) produced by Clostridium perfringens through the use of the liquid-liquid extraction by aqueous two-phases systems (ATPS). The application of these systems is proposed as alternative for protein purification, because it allows the separation and analysis of biological particles. This technique is advisable process purification applied to large scale since it provides a selective partition with high yields, and good cost-benefit ratio. The binodal curves were constructed and used to determine the system composition based on polyethylene glicol and citrate concentrations. The binodal curves were built by using PEG 400, 550, 1000, 1500, 3350 and 8000 g/mol at different pH values (6.0; 6.5; 7.0; 7.5 and 8.0). The curves were, initially, built in the presence of water and, later, with clarified fermented broth. The differences in the curve profiles (water versus broth) helped to explain the phase separation behaviour. The stability, as a function of pH and temperature, of the epsilon prototoxin was evaluated before the extraction, while the stability of the protease was evaluated before and after the extraction. An experimental design ('2pot.8-3') was used to evaluate the influence of the following variables on epsilon prototoxin extraction: concentration and molar mass of PEG, citrate concentration and NaCl concentrations, pH, dilution factor of the extract, temperature and total mass of the system. However, the partition of the protease was studied through the use of the three full different experimental designs (two of the type '2pot.4', and one of the type '2pot.3') that evaluated the influence of the following variables: concentration and molar mass of PEG, citrate concentration and pH. Three parameter responses were obtained: purification factor; coefficient partition; and recovery yield of the enzyme. The results were satisfactory: partition coefficient = 0.57, purification factor = 4.2; yield = 131%. The extraction conditions which provided the best results were: molar mass of PEG 10000 (g/mol); concentration of PEG of 22% (w/w); concentration of citrate of 8% (w/w); and pH 8.5. The protease was stable (during 48h), even after the extraction, in the temperatures of 5°C and 25°C, and at pH values of from 6.0 to 9.0.

O ácido clavulânico (AC) é um potente inibidor de &#946;-lactamases utilizado na área médica. Métodos alternativos, econômicos e simples para sua purificação são de grande interesse. Este trabalho objetivou produzir e extrair AC de Streptomyces spp. por fermentação extrativa utilizando sistema de duas fases aquosas (SDFA) - polietileno glicol (PEG)/sais fosfato. Foi selecionado o melhor produtor de AC entre sete linhagens de Streptomyces spp. Avaliou-se a influência de cinco fatores no cultivo do melhor produtor em frascos agitados (pH, temperatura, velocidade de agitação, concentrações das fontes de nitrogênio e de carbono), utilizando planejamento experimental estatístico. Definidas as melhores condições de cultivo, foram estudadas a produção e a extração do AC em fermentação extrativa utilizando SDFA em frascos agitados e em sistema descontínuo utilizando biorreator. Em biorreator também foram realizados o estudo termodinâmico do processo de fermentação nas condições ótimas obtidas nas etapas anteriores e a determinação do coeficiente volumétrico de transferência de massa (kLa), comparando os sistemas de fermentação no meio de cultivo simples (SF) e fermentação extrativa utilizando sistema SDFA PEG/sais fosfato (SFE) sem e com crescimento microbiano. A linhagem de Streptomyces selecionada como a melhor produtora de AC foi a DAUFPE 3060, a qual apresentou a maior produção desse inibidor, 494 mg/L em 48h, em frascos agitados nas condições: pH 6,0, 32°C, 150 rpm, 5 g/L de glicerol e 20 g/L de farinha de soja. Após a etapa de otimização realizada para o estudo da temperatura e da concentração de farinha de soja, variáveis mais significativas no estudo de seleção, a temperatura e a concentração de farinha de soja ótimas, foram 32°C e 40 g/L, respectivamente, com produção de 629 mg/L de AC em 48h. O estudo termodinâmico confirmou que a temperatura de 32°C é a máxima de produção do AC; após esse valor, inicia-se, gradualmente, a degradação do AC. No estudo da determinação do coeficiente de transferência de massa, kLa, sem crescimento microbiano, observaram-se valores maiores de kLa para o SF, devido à viscosidade do PEG utilizado no SFE. A massa molar do PEG e a velocidade de agitação foram as variáveis que mais influenciaram na extração de AC no SFE em frascos agitados, apresentando comportamento semelhante em biorreator. E, finalmente, o estudo da transferência de oxigênio do SFE utilizando SDFA com crescimento microbiano foi avaliado para otimizar a produção e a extração de AC. Os resultados obtidos demonstraram que existe uma faixa ideal de velocidade de agitação e de aeração para evitar o rompimento celular e aumentar a recuperação de AC. / Clavulanic acid (CA) is a potent inhibitor of &#946;-lactamases used in the medical field. Alternative methods, economic and simple purification are of great interest. This PhD project aims to produce and extract clavulanic acid of Streptomyces spp. By extractive fermentation using aqueous two-phase system (ATPS) - Polyethylene glycol (PEG)/phosphate salts. The best producer of clavulanic acid among seven strains of Streptomyces spp was selected. The influence of five factors in the cultivation of the best producer in flasks (pH, temperature, agitation velocity, concentrations of nitrogen and carbon sources) using statistical experimental design was evaluated. Defined the best cultivation conditions, the production and extraction of clavulanic acid by extractive fermentation using ATPS in flasks and in a batch system using a bioreactor was analyzed. In batch system using a bioreactor were also carried out the thermodynamic study of the fermentation process in optimum conditions determined in previous steps and also determined the volumetric mass transfer coefficient (kLa) comparing the fermentation systems in simple culture medium (SF) and in a extractive fermentation using aqueous two-phase system (ATPS) PEG/phosphate salts (SEF) medium with and without microbial growth. A strain of Streptomyces spp. selected as the best producer of AC was DAUFPE 3060, which showed the highest production of this inhibitor, 494 mg/L at 48h, in flasks under the conditions of pH 6.0, 32 °C, 150 rpm, 5 g/L of glycerol and 20 g/L of soybean flour. After the optimization step, the most significant variables in the study selection, temperature and concentration of soybean flour, were studied. The optimal values were 32 °C and 40 g/L of temperature and soybean flour concentration, respectively, with production of 629 mg/L of CA after 48h of cultivation. The thermodynamic study confirmed that 32 °C is the maximum temperature production of CA, after this value, starts gradually, the degradation of CA. In the study of volumetric mass transfer coefficient, kLa, without microbial growth, showed higher values of kLa for the SF, because the high viscosity of the PEG used in the SFE. The PEG molar mas and agitation velocity were the variables that most influenced the extraction of CA in flasks using a SFE, with similar behavior in a bioreactor. Finally, the study of oxygen transfer rate in SFE using ATPS with microbial growth was evaluated to optimize the production and extraction of CA. The results showed that there is an ideal range of agitation and aeration to prevent cell disruption and increase the CA recovery.