Orientador: Hélia Harumi Sato / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-22T00:21:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Angelotti_JoelisedeAlencarFigueira_D.pdf: 2410193 bytes, checksum: f20b18fe7228677edbc62681e14fd595 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O presente trabalho visou o estudo da produção da ?-glicosidase pela linhagem de Aspergillus sp. utilizando-se resíduos agrícolas como o farelo de trigo, casca de maracujá e bagaço de cana-de-açúcar, a imobilização da enzima em diferentes suportes como lentes PVA - Lentikats®, sol-gel, Eupergit, Amberlite, gelatina e alginato de cálcio, e a aplicação da enzima livre e imobilizada na conversão de isoflavonas glicosiladas de soja em isoflavonas agliconas. O fungo foi identificado como Aspergillus niger LBA 02. O extrato enzimático bruto obtido de A. niger LBA 02 apresentou atividade de ?-glicosidase, CM -celulase, amilase, poligalacturonase e pectinase. Foi obtida maior atividade de ?-glicosidase (44,81 U/g) na fermentação da linhagem A. niger LBA 02 em meio semissólido composto por 25 g de farelo de trigo e 5,7 mL de água destilada, após 240 h de fermentação a 30°C. Os efeitos da adição do extrato de levedura e dos sais KH2PO4, NH4NO3, MgSO4.7H2O, no meio de farelo de trigo, para a produção de ?-glicosidase por A. niger LBA 02 não foram significativos nos níveis estudados. Os resíduos casca de maracujá e bagaço de cana-de-açúcar adicionados no meio de farelo de trigo não atuaram como indutores da produção de ?-glicosidase, nos níveis estudados. Dentre os 7 métodos de imobilização testados, as técnicas de sol-gel e lentes PVA - Lentikats® apresentaram melhores resultados para a imobilização da enzima ?-glicosidase. A enzima livre apresentou atividade ótima a 65°C e pH 4,5, enquanto a enzima imobilizada em sol-gel mostrou atividade ótima na faixa de 60 - 65°C. A temperatura de 50°C foi fixada como temperatura ótima de trabalho para a enzima imobilizada em lentes PVA - Lentikats®, pois acima da temperatura de 60°C ocorreu a fusão das lentes. A imobilização da ?-glicosidase não alterou o pH ótimo de atividade da enzima, permanecendo em 4,5. A imobilização resultou em um pequeno aumento da estabilidade térmica da ?-glicosidase. A ?-glicosidase imobilizada em lentes PVA - Lentikats® apresentou-se mais estável do que a enzima livre, após 3 h de tratamento na faixa de 45 a 55°C. O tempo de meia vida da ?-glicosidase imobilizada em sol-gel a 70°C foi 0,88 h. A ?-glicosidase imobilizada em sol-gel apresentou cerca de 10% de atividade residual após 3 h a 70°C, enquanto que a enzima livre foi inativada após 1 hora a 70°C. A ?-glicosidase imobilizada em sol-gel apresentou valores de KM na faixa de 1,0 a 1,25 mM de celobiose, a 60°C, estimados pelos métodos de Lineweaver - Burk, Hanes - Woolf e Solver, enquanto que a enzima livre apresentou valores de 0,92 a 1,69 mM de celobiose, sugerindo que não houve alteração da afinidade da enzima pelo substrato celobiose com a imobilização. A imobilização da enzima em lentes PVA - Lentikats® resultou em um aumento dos valores de KM estimados em 3,61; 2,7 e 3,03 mM de celobiose, a 50°C, respectivamente, pelos métodos de Lineweaver - Burk, Hanes - Woolf e Solver indicando que a imobilização resultou em diminuição da afinidade da enzima imobilizada pelo substrato. A taxa de conversão relativa da solução 1,5 mM de celobiose em tampão acetato 0,5 M pH 5,0 a 50°C, utilizando-se ?-glicosidase imobilizada em lentes PVA - Lentikats® em processo contínuo foi de 100% após 5 h, entretanto a porcentagem de conversão diminuiu para 40% após 148 h. A ?-glicosidase livre e imobilizada produzida pelo micro-organismo A. niger LBA 02 foi capaz de hidrolisar as isoflavonas glicosiladas de soja em suas formas agliconas. O teor da isoflavonas agliconas aumentou no extrato de isoflavonas de soja tratadas com ?-glicosidase livre e imobilizada em lentes PVA - Lentikats® e sol-gel, sendo que a daidzeína aumentou aproximadamente 2,6; 10,8 e 12,2 vezes e o teor de genisteína aumentou 11,7; 11,4 e 11,4 vezes quando aplicada a enzima ?-glicosidase livre e imobilizada em lentes PVA - Lentikats® e sol-gel, respectivamente, ao final de 24 h / Abstract: This work aimed to study the production of ?-glucosidase by Aspergillus sp. strain using agricultural residues such as wheat bran, passion fruit peel and sugarcane bagasse, the immobilization of the enzyme in different support such as lens - shaped PVA - Lentikats®, sol-gel, Eupergit, Amberlite, gelatin and calcium alginate and the application of free and immobilized enzyme in the conversion of isoflavone glucosides in soy isoflavone aglycones. The fungus was identified as Aspergillus niger LBA 02. The crude enzyme extract obtained from A. niger LBA 02 showed activity of ?-glucosidase, CM-cellulase, amylase, polygalacturonase and pectinase. It was obtained higher ?-glucosidase activity (44.81 U / g) in the fermentation of strain A. niger LBA 02 in semisolid media composed of 25 g of wheat bran and 5.7 mL of distilled water, after 240 h of fermentation at 30 °C. The effects of the addition of yeast extract and salts KH2PO4, NH4NO3, MgSO4.7H2O in wheat bran medium for production of ?-glucosidase by A. niger LBA 02 were not significant in the levels studied. The passion fruit peel waste and sugarcane bagasse added in the culture media of wheat bran did not act as inducers of the production of ?-glucosidase levels studied. Among the methods of immobilization tested, the sol-gel technique and lens - shaped PVA - Lentikats® showed better results for ?-glucosidase immobilization. The free enzyme showed optimum activity at 65 °C and pH 4.5, while the enzyme immobilized in sol-gel showed optimum activity in the range of 60 - 65 °C. A temperature of 50 °C was set as the working optimum temperature for the enzyme immobilized in lens - shaped PVA - Lentikats® because above 60 °C occurred melting of the lenses. Immobilization of ?-glucosidase did not alter the optimum pH of the enzyme activity, remaining at pH 4.5. Immobilization resulted in a small increase in the thermal stability of ?-glucosidase. The ?-glucosidase immobilized in lens - shaped PVA - Lentikats® showed to be more stable than the free enzyme after 3 h of treatment in the range of 45 to 55 °C. The half-life of the ?-glucosidase immobilized in sol-gel at 70 °C was 0.88 h. The ?-glucosidase immobilized in sol-gel showed about 10% residual activity after 3 h at 70 °C while free enzyme was inactivated after 1 h at 70 °C. The ?-glucosidase immobilized in sol-gel showed KM in the range of 1.0 to 1.25 mM of cellobiose at 60 °C, estimated by the method of Lineweaver - Burk, Hanes - Woolf and Solver while free enzyme showed KM values in the range of 0.92 to 1.69 mM of cellobiose, suggesting no change in the affinity of the enzyme for the substrate cellobiose after immobilization. The immobilized enzyme in lens - shaped PVA - Lentikats® resulted in an increase in the KM values estimated 3.61, 2.7 and 3.03 mM of cellobiose at 50 °C, respectively, by methods Lineweaver - Burk, Hanes - Woolf and Solver indicating that immobilization resulted in decreasing affinity of the immobilized enzyme to the substrate. Relative conversion rate of 1.5 mM cellobiose solution in acetate buffer 0.5 M pH 5.0 at 50 °C, using ?-glucosidase immobilized in lens - shaped PVA - Lentikats® in continuous process was 100% after 5 h, but the conversion decreased to 40% after 148 h. The ?-glucosidase produced by the micro-organism A. niger LBA 02, free and immobilized was able to hydrolyze isoflavone glycosides from soy in their aglycone forms. The content of isoflavone aglycones increased in soy isoflavones extract treated with ?-glucosidase free and immobilized in lens - shaped PVA - Lentikats® and sol-gel, and the daidzein increased approximately 2.6, 10.8 and 12.2 times, and genistein increased content of 11.7, 11.4 and 11.4 fold when applied to ?-glucosidase enzyme free and immobilized in lens - shaped PVA - Lentikats ® and sol-gel, respectively, at the end of 24 h / Doutorado / Ciência de Alimentos / Doutora em Ciência de Alimentos

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / This study aimed to the chemical and pharmacological research of biodiversity of marine fungi associated with sediment from the coastline of northeastern Brazil, especially the state of CearÃ. From the collection of marine sediments at the beach Pecem - SÃo GonÃalo do Amarante-CE, were cultivated various fungi, of which the strain identified as Aspergillus sp. (BRF 087), showed a preliminary cytotoxic activity. The methodology has been directed in finding secondary metabolites with cytotoxic activity using a kinetic fungus study was grown in four different media, BD (potato dextrose), BDL (potato dextrose and yeast), MPD (malt, peptone and dextrose ) and MntPL (mannitol, peptone and yeast) and in different culture periods (7, 14, 21, 28 days). This procedure resulted in the isolation of nine diketopiperazines two tetrapeptides cycle, 3 derivatives of succinic acid and p-hydroxyphenylacetic acid, characterized as cyclo (L-Pro-L-Leu) (A-1), cyclo (L-Pro-L -Phe) (A-2), cyclo (4-OH-Pro-Leu) (A-3), cyclo (4-OH-Pro-Phe) (A-4), cyclo (L-Pro-L-tyr ) (A-5), cyclo (L-Leu-L-Val) (A-6), cyclo (L-Phe-L-Val) (A-7), cyclo (L-Phe-L-Leu) (A-8), cyclo (L-Leu-L-Ile) (A-9), cyclo (L-Ile-L-Pro-L-Leu-L-Pro) (A-10), cyclo (Leu-Ile Leu-Phe) (A-11), 2-metilenosuccinic acid (A-12), 3-Methyl-2-metilenosuccinic (A-13), 4-metoxy-2-methylidene-4-oxobutanoic acid (A-14) and p-hydroxyphenylacetic acid (A-15). The isolation of secondary metabolites was conducted by using usual chromatographic techniques, including chromatography on reverse phase C18 column and high-performance liquid chromatography (HPLC). For structural characterization of the compounds were used customary spectrometric techniques like IR, mass spectrometry and nuclear magnetic resonance (NMR), one and two dimensional, and compared with literature data. / O presente trabalho teve como objetivo principal a investigaÃÃo quÃmico-farmacolÃgica da biodiversidade dos fungos marinhos associados a sedimentos da costa litorÃnea do Nordeste do Brasil, e em especial do estado do CearÃ. A partir da coleta de sedimentos marinhos na praia do PecÃm - SÃo GonÃalo do Amarante-CE, foram cultivados vÃrios fungos, dos quais a cepa identificada como Aspergillus sp. (BRF 087), mostrou uma atividade citotÃxica preliminar. A metodologia empregada foi direcionada na busca de metabÃlitos secundÃrios com atividade citotÃxica, atravÃs de um estudo cinÃtico do fungo que foi cultivado em quatro meios diferentes, BD (batata dextrose), BDL (batata dextrose e levedura), MPD (malte, peptona e dextrose) e MntPL (manitol, peptona e levedura) e em diferentes perÃodos de cultivo (7, 14, 21, 28 dias). Este procedimento resultou no isolamento de nove dicetopiperazinas, dois ciclo tetrapeptÃdeos, 3 derivados do Ãcido succinio e o Ãcido p-hidroxifenilacÃtico, caracterizados como ciclo (L-Pro-L-Leu) (A-1), ciclo (L-Pro-L-Fen) (A-2),ciclo (4-OH-Pro-Leu) (A-3), ciclo (4-OH-Pro-Fen) (A-4), ciclo (L-Pro-L-Tyr) (A-5), ciclo (L-Leu-L-Val) (A-6), ciclo (L-Fen-L-Val) (A-7), ciclo (L-Fen-L-Leu) (A-8), ciclo (L-Leu-L-Ile) (A-9), ciclo (L-Ile-L-Pro-L-Leu-L-Pro) (A-10), ciclo (Leu-Ile-Leu-Fen) (A-11), Ãcido 2-metilenosuccinio (A-12), Ãcido 3-metil-2-metilenosuccinio (A-13), Ãcido 4-metoxi-2-metileno-4-oxobutanÃico (A-14) e o Ãcido p-hidroxifenilacÃtico (A-15). O isolamento dos metabÃlitos secundÃrios foi realizado atravÃs do uso de tÃcnicas cromatogrÃficas usuais, incluindo cromatografia em coluna de fase reversa C18 e cromatografia lÃquida de alta eficiÃncia (CLAE). Para a caracterizaÃÃo estrutural dos compostos foram utilizadas tÃcnicas espectromÃtricas usuais como infravermelho, espectrometria de massa e ressonÃncia magnÃtica nuclear (RMN), uni e bidimensional, alÃm de comparaÃÃo com dados da literatura.

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2014-11-03T14:46:10Z No. of bitstreams: 2 Tese - Milton Camplesi Júnior - 2013.pdf: 1024643 bytes, checksum: cb368bee54b97ea46107c5023cb02036 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2014-11-03T14:53:13Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Milton Camplesi Júnior - 2013.pdf: 1024643 bytes, checksum: cb368bee54b97ea46107c5023cb02036 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-11-03T14:53:13Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese - Milton Camplesi Júnior - 2013.pdf: 1024643 bytes, checksum: cb368bee54b97ea46107c5023cb02036 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2013-08-20 / Invasive fungal infections have emerged in the last two decades as a major cause of nosocomial fungal infections, with emphasis on those caused by Candida species and Aspergillus. Invasive aspergillosis (IA) has a high mortality rate and early detection of Aspergillus is of paramount importance for the treatment and consequently prevention of patient death. The galactomannan (GM) cell wall protein component of Aspergillus species can be detected in serum, urine, cerebrospinal fluid and bronchoalveolar lavage. The detection of GM in the early stages of the disease is considered a useful marker for early diagnosis of the disease. The aim of this study was to determine the incidence of fungal infections in patients transplanted hematopoietic stem cells. In this study was verified the incidence of fungal infections in 117 patients undergoing hematopoietic stem cell transplantation (HSCT), whose data such as age, gender and underlying disease were cataloged. Blood samples of these 392 patients were collected, and tested for detection of GM using ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) test and cultivated in culture medium containing biphasic brain heart infusion (broth) and Sabouraud dextrose (agar) for isolation of fungal. The fungi isolated were subjected to in vitro susceptibility testing using broth microdilution method for the antifungal agents: itraconazole, voriconazole, fluconazole, caspofungin and amphotericin B. Among the data obtained from HSCT patient it has been found that the mean age was 35,7 years and the largest number belonged to the age group between 21 and 60 years; 52,2% were male, 53% had received allogeneic stem cell transplant. Leukemias (55,5%) were the main diseases responsible for transplant. Fungal isolates from clinical samples were identified as A. fumigatus (02), Aspergillus flavus (01), Fusarium sp (01), Acremonium strictum (01), Candida parapsilosis (06), Candida tropicalis (06) and Candida albicans (04). Of all patients analyzed 19,6% (23/117) had two or more positive samples for GM. According to European Organization for Research and Treatment of Cancer, invasive aspergillosis was interpreted as proven in 2,5% defined by growth of Aspergillus in culture, 5,9% as probable for the detection of GM in blood and pulmonary infiltrates and 2,5% as possible by radiological changes suggestive of aspergillosis and negative GM. The mortality rate for AI proven/probable was 60% and showed that the disease was significantly associated with the risk of death (P <0,05). The filamentous fungi were more susceptible in vitro to voriconazole, while higher susceptibility of the yeast was found to Caspofungin. Considering that the crude mortality rate of IA is very high and the early therapy may lead to improved prognosis, we could suggest that the Platelia Aspergillus GM EIA in serum of patients could be useful as screening tools for identification in patients at high risk of developing IA. / Infecções fúngicas invasivas têm emergido nas últimas duas décadas como uma das principais micoses causadoras de infecções nosocomiais, merecendo destaque aquelas causadas por espécies de Candida e Aspergillus. A aspergilose invasiva (AI) apresenta alta taxa de mortalidade e a detecção precoce de Aspergillus pode ser de extrema importância para o tratamento e consequentemente evitar a morte do paciente. O galactomanana (GM), componente protéico da parede celular de Aspergillus spp, pode ser detectado no soro, urina, líquido cefalorraquidiano e lavado bronqueoalveolar. A detecção de GM nos estágios iniciais da doença é considerada um marcador útil no diagnóstico precoce da doença. Neste estudo foi verificada a incidência de infecções fúngicas nos pacientes transplantados de células tronco hematopoiéticas (HCTH) procedentes do Hospital Araújo Jorge de Goiânia-GO. Foram analisados 117 pacientes dos quais foram catalogados dados como idade, gênero e doença de base. Destes pacientes foram coletadas 392 amostras de sangue e analisadas para detecção de GM por ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) e por cultivo em meio bifásico contendo brain heart infusion (caldo) e Sabouraud dextrose (ágar) para isolamento de fungos. Testes de suscetibilidade in vitro utilizando o método de microdiluição em caldo para os agentes antifúngicos: itraconazol, voriconazol, fluconazol, caspofungina e anfotericina B foram utilizados para os fungos isolados. Dentre os dados obtidos dos pacientes TCTH verificou-se que a média de idade foi de 35,7 anos e o maior número pertencia à faixa etária entre 21 e 60 anos com 52,2% pertencentes ao sexo masculino. Nestes pacientes havia 53% de receptores alogênicos e das doenças associadas os diferentes tipos de leucemias (55,5%) foram as principais responsáveis pelo transplante. Dos fungos isolados das amostras clínicas, foram identificados dois Aspergillus fumigatus, um Aspergillus flavus, um Fusarium sp, um Acremonium strictum, seis Candida parapsilosis, seis Candida tropicalis e quatro Candida albicans. Do total de pacientes analisados 19,6% (23/117) apresentaram duas ou mais amostras positivas para GM. Seguindo a classificação do European Organization for Research and Treatment of Cancer, a aspergilose invasiva foi interpretada como provada em 2,5%, definida pelo crescimento de Aspergillus em cultivo, 5,9% como provável pela detecção de GM no sangue e presença de infiltrados pulmonares e 2,5% como possível por alterações radiológicas sugestivas de aspergilose e GM negativo. A taxa de mortalidade para AI provada/provável foi de 60% e mostrou que a doença estava significativamente associada com o risco de morte (P <0,05). Os fungos filamentosos mostraram-se mais suscetíveis in vitro ao voriconazol, enquanto para as leveduras a maior suscetibilidade foi encontrada para caspofungina. Considerando-se que a taxa de mortalidade da AI é muito elevada e a terapia inicial pode levar ao melhor prognóstico da doença, pode-se sugerir que a detecção de GM no soro de pacientes TCTH é uma ferramenta útil para a identificação de pacientes com risco elevado de desenvolver AI, a fim de reduzir a alta mortalidade relacionada a esta condição.

Made available in DSpace on 2017-05-12T14:47:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Talita C M _da Rosa.pdf: 1452058 bytes, checksum: 9e95c88d0d35eaed065618284fc8a393 (MD5) Previous issue date: 2014-07-01 / Aflatoxins are products of secondary metabolism of Aspergillus sp. that appear after the phase of exponential growth of fungi and contaminate a wide variety of foods, especially peanuts. Due to the carcinogenic, mutagenic and teratogenic effects, aflatoxins deserve special attention from the food industry, because they represent a risk to human health, thus it is necessary to develop control measures during the process of food production, as well as in farming, harvest, storage and transportation. Whereas peanuts and derivatives products are widely consumed, this study aimed to evaluate, in the city of Cascavel, state of Paraná, the occurrence of aflatoxins in peanuts and derivatives, the potential risk of human exposure to these mycotoxins, and the food safety and nutritional quality these products offer. First, a survey of consumption of peanuts and derivatives by the population of Cascavel PR was conducted through a structured questionnaire. 40 lots of peanut and peanut candy called paçoca were collected in five supermarkets, being half of the lots expiration date one month ahead, and the other half expiration date four or five months ahead. Physical, chemical, microbiological and determination analyzes of aflatoxins were performed. The results suggest that the shelf life of the peanut does not interfere in their nutritional quality; but it interferes in the peanut candy nutritional quality, as protein and lipid levels decrease. It was shown that all the samples of peanuts and peanut candy were contaminated with fungi, with an average of 7,24 and 3,13 UFC.g-1 x 103 to peanuts and peanut candy due to expire in one month, and 4,93 and 4,08 UFC.g-1 x 103 to new peanuts and peanut candy, respectively; especially the peanut near the expiration date was contaminated. The analysis showed high aflatoxin contamination in some lots of peanut and low contamination in peanut candy, with average of 36,15 and 0,21 &#956;g.Kg-1 for peanuts and peanut candy due to expire in one month, and 32,74 and 0,28 &#956;g.Kg-1 for new peanuts and peanut candy, respectively. Risk analysis indicated medium daily intake results for aflatoxins in peanuts and low daily intake for peanut candy. These two products offer a risk to population, as they are genotoxic substances that can cause harm to the consumer health. / Aflatoxinas são produtos do metabolismo secundário de Aspergillus sp., produzidas após a fase de crescimento exponencial dos fungos, podendo contaminar grande variedade de alimentos, principalmente o amendoim. Devido aos efeitos carcinogênicos, mutagênicos e teratogênicos, as aflatoxinas merecem especial atenção por parte da indústria de alimentos, pois representam um risco à saúde humana, sendo necessário o desenvolvimento de medidas de controle durante o processo de produção de alimentos, bem como no cultivo, colheita, armazenamento e transporte. Considerando que o amendoim e seus derivados são produtos amplamente consumidos pela população, este trabalho teve por objetivo avaliar a ocorrência de aflatoxinas em amendoins e produtos derivados, na cidade de Cascavel - PR, o potencial de risco da exposição humana a essas micotoxinas, a segurança alimentar e a qualidade nutricional que estes produtos oferecem. Primeiramente foi realizada uma pesquisa relativa ao consumo de amendoins e produtos derivados pela população de Cascavel - PR, através de questionário estruturado. Foram coletados 40 lotes de amendoim e paçoca em cinco supermercados do município, sendo metade dos lotes a um mês da data de validade e a outra metade de quatro a cinco meses da data de validade. Foram realizadas análises físico-químicas, microbiológicas e a determinação de aflatoxinas. Os resultados sugerem que a vida de prateleira do amendoim não interfere em sua qualidade nutricional, mas interfere na qualidade nutricional da paçoca, com diminuição de proteína e lipídio. Foi evidenciado que todas as amostras de amendoim e paçoca apresentaram contaminação por fungos, com média de 7,24 e 3,13 UFC.g-1 x 103 para amendoim e paçoca a vencer e 4,93 e 4,08 UFC.g-1 x 103 para amendoim e paçoca novo , respectivamente, principalmente o amendoim próximo a data final de validade. A análise de aflatoxinas demonstrou contaminação elevada em alguns lotes do amendoim e baixa contaminação para paçoca, com média de 36,15 e 0,21 &#956;g.Kg-1 para amendoim e paçoca a vencer e 32,74 e 0,28 &#956;g.Kg-1 para amendoim e paçoca novo , respectivamente. A análise de risco indicou resultados elevados de ingestão diária provável média para aflatoxinas no amendoim e baixa ingestão diária para a paçoca, porém estes dois produtos oferecem risco à população, pois são substâncias genotóxicas e podem ocasionar danos à saúde do consumidor.

Made available in DSpace on 2017-07-10T19:23:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Talita C M _da Rosa.pdf: 1452058 bytes, checksum: 9e95c88d0d35eaed065618284fc8a393 (MD5) Previous issue date: 2014-07-01 / Aflatoxins are products of secondary metabolism of Aspergillus sp. that appear after the phase of exponential growth of fungi and contaminate a wide variety of foods, especially peanuts. Due to the carcinogenic, mutagenic and teratogenic effects, aflatoxins deserve special attention from the food industry, because they represent a risk to human health, thus it is necessary to develop control measures during the process of food production, as well as in farming, harvest, storage and transportation. Whereas peanuts and derivatives products are widely consumed, this study aimed to evaluate, in the city of Cascavel, state of Paraná, the occurrence of aflatoxins in peanuts and derivatives, the potential risk of human exposure to these mycotoxins, and the food safety and nutritional quality these products offer. First, a survey of consumption of peanuts and derivatives by the population of Cascavel PR was conducted through a structured questionnaire. 40 lots of peanut and peanut candy called paçoca were collected in five supermarkets, being half of the lots expiration date one month ahead, and the other half expiration date four or five months ahead. Physical, chemical, microbiological and determination analyzes of aflatoxins were performed. The results suggest that the shelf life of the peanut does not interfere in their nutritional quality; but it interferes in the peanut candy nutritional quality, as protein and lipid levels decrease. It was shown that all the samples of peanuts and peanut candy were contaminated with fungi, with an average of 7,24 and 3,13 UFC.g-1 x 103 to peanuts and peanut candy due to expire in one month, and 4,93 and 4,08 UFC.g-1 x 103 to new peanuts and peanut candy, respectively; especially the peanut near the expiration date was contaminated. The analysis showed high aflatoxin contamination in some lots of peanut and low contamination in peanut candy, with average of 36,15 and 0,21 μg.Kg-1 for peanuts and peanut candy due to expire in one month, and 32,74 and 0,28 μg.Kg-1 for new peanuts and peanut candy, respectively. Risk analysis indicated medium daily intake results for aflatoxins in peanuts and low daily intake for peanut candy. These two products offer a risk to population, as they are genotoxic substances that can cause harm to the consumer health. / Aflatoxinas são produtos do metabolismo secundário de Aspergillus sp., produzidas após a fase de crescimento exponencial dos fungos, podendo contaminar grande variedade de alimentos, principalmente o amendoim. Devido aos efeitos carcinogênicos, mutagênicos e teratogênicos, as aflatoxinas merecem especial atenção por parte da indústria de alimentos, pois representam um risco à saúde humana, sendo necessário o desenvolvimento de medidas de controle durante o processo de produção de alimentos, bem como no cultivo, colheita, armazenamento e transporte. Considerando que o amendoim e seus derivados são produtos amplamente consumidos pela população, este trabalho teve por objetivo avaliar a ocorrência de aflatoxinas em amendoins e produtos derivados, na cidade de Cascavel - PR, o potencial de risco da exposição humana a essas micotoxinas, a segurança alimentar e a qualidade nutricional que estes produtos oferecem. Primeiramente foi realizada uma pesquisa relativa ao consumo de amendoins e produtos derivados pela população de Cascavel - PR, através de questionário estruturado. Foram coletados 40 lotes de amendoim e paçoca em cinco supermercados do município, sendo metade dos lotes a um mês da data de validade e a outra metade de quatro a cinco meses da data de validade. Foram realizadas análises físico-químicas, microbiológicas e a determinação de aflatoxinas. Os resultados sugerem que a vida de prateleira do amendoim não interfere em sua qualidade nutricional, mas interfere na qualidade nutricional da paçoca, com diminuição de proteína e lipídio. Foi evidenciado que todas as amostras de amendoim e paçoca apresentaram contaminação por fungos, com média de 7,24 e 3,13 UFC.g-1 x 103 para amendoim e paçoca a vencer e 4,93 e 4,08 UFC.g-1 x 103 para amendoim e paçoca novo , respectivamente, principalmente o amendoim próximo a data final de validade. A análise de aflatoxinas demonstrou contaminação elevada em alguns lotes do amendoim e baixa contaminação para paçoca, com média de 36,15 e 0,21 μg.Kg-1 para amendoim e paçoca a vencer e 32,74 e 0,28 μg.Kg-1 para amendoim e paçoca novo , respectivamente. A análise de risco indicou resultados elevados de ingestão diária provável média para aflatoxinas no amendoim e baixa ingestão diária para a paçoca, porém estes dois produtos oferecem risco à população, pois são substâncias genotóxicas e podem ocasionar danos à saúde do consumidor.

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:37:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_angela_cabana.pdf: 1514484 bytes, checksum: a7b8213a229cc70d85faecf587014b8a (MD5) Previous issue date: 2013-02-28 / Aspergillosis is a leading cause of death in captive penguins. Though being a known problem for decades, most reported cases are still only confirmed in post-mortem examinations, requiring further studies on methods for in vivo diagnosis of the disease. This study aimed to evaluate the efficacy of detection of anti-Aspergillus fumigatus antibodies through the performance by serological monitoring with agar gel double radial immunodiffusion (AGID) for in vivo diagnosis of aspergillosis in captive penguins. The study was performed including Magellanic penguins in a rehabilitation program at Center for Recovery of Marine Animals (CRAM/FURG) in the period from 2009 to 2011. We included 134 Magellanic penguins (Spheniscus magellanicus) in rehabilitation at CRAM, which were monitored by AGID weekly until its final destination (death or release) totaling 660 studied serum samples. The serological monitoring was performed in order to detect anti-Aspergillus fumigatus antibodies using commercial antibodies and antigen. All animals were clinically monitored and post-mortem examinations were performed on penguins that died during the study period. A total of 28% (37/134) penguin died, 89.2% (33/37) of aspergillosis, 11% (4/37) of other causes and 97 were released. From the 33 animals with proven aspergillosis, 21 had anti-A. fumigatus antibodies by AGID, being the average interval between death and the positive AGID result of 16.4 days. Twelve seronegative animals eventually died of aspergillosis. The rates of sensitivity and specificity were 63.6% and 95%, respectively, and positive and negative predictive values were 80.7% and 88.9% respectively. These data demonstrate that serological monitoring for the detection of antibodies by AGID may be a useful and important tool for the diagnosis of aspergillosis in penguins. As our study with AGID in penguins is pioneer, more studies are required concerning the prognosis in cases of aspergillosis in penguins whose therapeutic intervention is based on diagnosis by AGID, considering that the average period between the positive result of this test and the death of the animal was less than one month. Key-words: Sphenisciformes. Captivity / A aspergilose é uma das principais causas de morte de pinguins em cativeiro. Embora este seja um problema conhecido há décadas, a maioria dos casos relatados são ainda confirmados em exames post-mortem, sendo necessários mais estudos sobre os métodos de diagnóstico in vivo da doença. Assim, este trabalho objetivou avaliar a eficácia da detecção de anticorpos anti-Aspergillus fumigatus através do desempenho do monitoramento sorológico por imunodifusão radial dupla em gel de ágar (IDGA) para o diagnóstico in vivo da aspergilose em pinguins em cativeiro. O estudo foi realizado incluindo pinguins-de-Magalhães em reabilitação no Centro de Recuperação de Animais Marinhos (CRAM/FURG) no período de 2009 a 2011.. Foram incluídos 134 pingüins de Magalhães (Spheniscus magellanicus) em reabilitação no Centro de Recuperação de Animais Marinhos (CRAM / FURG), que foram monitorados por IDGA semanalmente até seu destino final (morte ou de liberação), totalizando 660 amostras de soro estudadas. O monitoramento sorológico foi realizado para detecção de anticorpos anti-Aspergillus fumigatus utilizando antígeno e anticorpos comerciais. Todos os animais foram acompanhados clinicamente e exames post-mortem foram realizados em pinguins que vieram a óbito durante o período do estudo. Um total de 28% (37/134) dos pinguins veio a óbito, 89,2% (33/37) de aspergilose, 11% (4/37) de outras causas e 97 foram libertados. A partir dos 33 animais com aspergilose comprovada, 21 apresentaram anticorpos anti- A. fumigatus por IDGA, sendo o intervalo médio entre a morte e as IDGA positivas 16,4 dias. Doze animais com sorologia negativa vieram a óbito por aspergilose. As taxas de sensibilidade e especificidade foram de 63,6% e 95%, respectivamente, e os valores preditivo positivo e negativo foram 80,7% e 88,9%, respectivamente. Estes dados demonstram que o acompanhamento serológico para a detecção de anticorpos por IDGA pode ser uma ferramenta útil e importante para o diagnóstico de aspergilose em pinguins. Como nosso estudo com IDGA em pinguins é pioneiro, maiores estudos são necessários acerca do prognóstico dos casos de aspergilose em pinguins cuja intervenção terapêutica se baseie no diagnóstico por IDGA, considerando que o período médio entre o resultado positivo deste teste e o óbito do animal foi de menos de um mês.

Orientador: Hélia Harumi Sato / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-16T13:30:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bedani_CarolinaCasagrande_M.pdf: 909079 bytes, checksum: 17274331f891e68042559fd5f2939310 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: As ß-glicosidases (ß-D-glucosídeo glucohidrolase, EC 3.2.1.21) catalisam a hidrólise de dissacarídeos e glicosídeos conjugados a partir da extremidade não redutora. A enzima ß-glicosidase apresenta inúmeras aplicações na indústria de alimentos e farmacêutica, atuando na hidrólise da celobiose em glicose, no processo de conversão da celulose em glicose em combinação com outras enzimas celulolíticas; na liberação de compostos de aroma em sucos de frutas e vinho; na hidrólise de compostos cianogênicos, presentes em plantas e resíduos agroindustriais e na transformação de isoflavonas glicosiladas de soja em isoflavonas agliconas, que podem ser utilizadas para reposição hormonal. Entre as linhagens de Aspergillus sp., Aspergillus oryzae, Mucor miehei, Penicillium sp. E Trichoderma viride a primeira apresentou a maior produção de ß-glicosidase. Na fermentação da linhagem Aspergillus sp. em meio semi sólido composto de farelo de trigo (Natur¿s): casca de maracujá: água destilada, na proporção 1:1:0,4; foram obtidos, respectivamente, 25,75 U/g, 45,88 U/g e 9,29 U/g de ß-glicosidase utilizando-se os substratos p-NPG, celobiose e amigdalina, após 30 minutos a 50°C. A ß-glicosidase bruta de Aspergillus oryzae apresentou atividade ótima na faixa de pH 5,0 - 5,5 e uma fração com atividade em pH 7,0. A enzima apresentou temperatura ótima de atividade na faixa de 45 - 50°C e mostrou-se estável a 45°C após 30 minutos de incubação em pH 5,0 e na faixa de pH 5,0 - 7,0 após 2 h a 47°C. A ß-glicosidase bruta de Penicillium sp. apresentou atividade ótima em pH 4,0 a 50°C e a 60ºC, evidenciando a presença de iso enzimas. Mostrou-se estável a 55°C após 30 minutos de incubação em pH 5,0 e apr esentou maior estabilidade na faixa de pH 3,0 - 7,0 após 2 h a 60°C. A ß-glicosidase bruta de Trichoderma viride mostrou atividade ótima em pH 5,0 - 5,5 e 45ºC e mostrou-se estável a 45°C após 30 minutos de incubação em pH 5,0 e na faixa de pH 5,0 - 7,0 após 2 h a 45°C . A ß-glicosidase bruta de Aspergillus sp. apresentou atividade ótima em pH 4,5 e 60°C, estabilidade a 60°C após 30 minutos de incubação em pH 4,5 e na faixa de pH 3,0 - 8,5 após 2 h de incubação a 60°C. A ß-glicosidase de Aspergillus sp. apresentou valores de Km de 3,41 mM e Vmax de 72,46 µmol p nitrofenol/mL.min para o substrato p-NPG. Após fracionamento com sulfato de amônio 80% e cromatografia em coluna DEAE-celulose, a ß-glicosidase de Aspergillus sp. foi parcialmente purificada cerca de 38 vezes com recuperação de 2,5%. Utilizando-se planejamento experimental a ß-glicosidase parcialmente purificada apresentou atividade ótima em pH 4,5 e 60°C e estabilidade na faixa de pH de 3,6 - 5,0 e temperatura de 30 - 50°C após 2 h de incubação. A ß-glicosidase parcialmente purificada de Aspergillus sp. apresentou atividade de hidrólise da celobiose, p-NPG e amigdalina / Abstract: The ß-glucosidases (ß-D-glucoside glucohydrolase, EC 3.2.1.21) catalyze the hydrolysis of disaccharides and conjugate glycosides from the non-reducing end. The ß-glucosidases have several applications in the food and pharmaceutical industries such as the hydrolysis of cellobiose into glucose, the conversion of cellulose into glucose together with other cellulolytic enzymes; the release of flavour compounds into fruit juices and wine; the hydrolysis of cyanogenic compounds present in plants and agro-industrial residues and the conversion of isoflavone glycosides into the soy isoflavone aglycone, which can be used for hormone replacement. Of the strains Aspergillus sp., Aspergillus oryzae, Mucor miehei, Penicillium sp. and Trichoderma viride, the first showed the greater production of ß-glucosidase. In the fermentation by the Aspergillus sp. strain in a semi-solid medium containing wheat bran: passion fruit peel: distilled water, in a ratio of 1:1:0.4; 25.75 U/g, 45.88 U/g and 9.29 U/g of ß-glucosidase were obtained, respectively, using p-NPG, amygdalin and cellobiose as the substrate, after 30 minutes at 50°C. The crude ß-glucosidase obtained from Aspergillus oryzae showed a fraction with optimal activity at pH 5.0 ¿ 5.5, and another fraction with activity at pH 7.0. The enzymes showed optimum activity in the temperature range from 45 to 50°C and were stable after 30 minutes of incubation at 45°C and pH 5.0, and also after 2 hours at 47°C in the pH range from 5.0 to 7.0. The crude ß-glucosidase from Penicillium sp. showed optimal activity at pH 4.0 and isoenzymes with optimal activity at 50°C and 60ºC. The enzymes showed stability after 30 minutes of incubation at 55°C and pH 5.0, and were stable in the pH range from pH 3.0 to 7.0 after 2 hours at 60°C. The crude ß-glucosidase from Trichoderma viride showed optimal activity in the pH range from 5.0 to 5.5 at 45°C; stability after 30 minutes of incubation at 45°C and pH 5.0 and stabil ity in the pH range from 5.0 to 7.0 after 2 hours at 45°C. The crude ß-glucosidase from Aspergillus sp. Showed optimal activity at pH 4.5 and 60°C; stability afte r 30 minutes of incubation at 60°C and pH 4.5, and stability in the pH range from 3.0 to 8.5 after 2 hours of incubation at 60°C. The ß-glucosidase from Aspergillus sp. showed a Km value of 3.41 mM and Vmax of 72.46 mmol p-nitrophenyl/mL.min with p-NPG as the substrate. After fractionation with 80% ammonium sulphate and chromatography on a DEAEcellulose column, the ß-glucosidase from Aspergillus sp. was purified 38 fold with a recovery of 2.5%. Using an experimental design the partially purified ß-glucosidase showed optimal activity at pH 4.5 and 60°C, and sta bility in the pH range from 3.6 to 5.0 and temperature range from 30°- 50°C, after 2 hours of incubation. The partially purified ß-glucosidase from Aspergillus sp. showed hydrolytic activity with respect to cellobiose, p-NPG and amygdalin / Mestrado / Mestre em Ciência de Alimentos

Selected fungal strain for production of raw-starch-digesting enzyme by solid state fermentation was improved by sequential exposures to γ-irradiation of Co60, ultraviolet and treatments with Nmethyl-N'-nitrosoguanidine. Mutant Aspergillus sp. CXN2-3A was chosen and its production of raw-starch-digesting enzyme (RSDE) was improved 2 folds higher than that of wild type. Optimal condition for the production of the enzyme using wheat bran as the substrate was accomplished for the CXN2-3A. With the optimal fermentation condition and the solid medium supplemented with urea and NH4NO3, CoSO4, Tween 80, 1% glucose, CXN2-3A produced RSDE 19.23 folds higher than wild type cultured in pre-optimized condition and un-supplemented medium. / Chủng nấm chọn lọc sản xuất enzyme thủy phân tinh bột bằng cách lên men trạng thái rắn, chủng nấm được cải thiện bằng chiếu xạ tia cực tím, tia Co60 và các phương pháp xử lí với N-methyl-N'-nitrosoguanidine. Mutant Aspergillus sp. CXN2-3A, đã được lựa chọn để sản xuất enzyme (RSDE) thủy phân tinh bột sống cải thiện cao hơn 2 lần so với chủng dại. Điều kiện tối ưu cho việc sản xuất các enzyme bằng cách sử dụng cám, lúa mì đã được thực hiện cho CXN2-3A. Với điều kiện lên men xốp tối ưu và bổ sung urê và NH4NO3, CoSO4, Tween 80, 1% glucose, CXN2-3A đã sản xuất RSDE cao gấp 19,23 lần so với kiểu dại ở cùng điều kiện.

Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2016-09-02T12:53:33Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Dissertação CCB - Kátia Albuquerque 2016.pdf: 1508022 bytes, checksum: 82278b56e00cafb789bead747a3af48d (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-02T12:53:33Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Dissertação CCB - Kátia Albuquerque 2016.pdf: 1508022 bytes, checksum: 82278b56e00cafb789bead747a3af48d (MD5) Previous issue date: 2016-02-19 / CAPEs / Enzimas são proteínas com atividade catalítica capazes de integrar diferentes processos biotecnológicos. Dentre as enzimas com aplicação na indústria destaca-se a tanino acil hidrolase (EC 3.1.1.20) ou simplesmente tanase, uma enzima extracelular produzida na presença de ácido tânico por fungos filamentosos, bactérias e leveduras. A tanase (TAH) catalisa a hidrólise de taninos liberando ácido gálico e glicose. TAH pode ser utilizada no tratamento de efluentes, na indústria farmacêutica, de alimentos, bebidas entre outros. Na biotecnologia, o grande desafio na produção de enzimas é extrair a molécula a partir de métodos economicamente viáveis. Assim, o sistema de duas fases aquosas (SDFA) tem sido cada vez mais utilizado para purificar parcialmente diversos produtos biológicos. Neste sentido, o presente trabalho teve como finalidade extrair em SDFA, caracterizar bioquimicamente e aplicar em chá verde a enzima tanase obtida de Aspergillus sp. SIS 25 por fermentação em estado sólido, utilizando a fibra do coco como substrato. Um planejamento fatorial 23 foi utilizado para avaliar a influência das variáveis principais: massa molar (MMPEG) do PEG (1000, 3350 e 6000 g/mol), concentração (20, 22 e 24% m/m) do PEG (CPEG) e concentração (15, 17,5 e 20% m/m) de citrato de sódio (CCIT), sobre as variáveis resposta: coeficiente de partição (K), recuperação (Rec) e aumento de pureza (AP), em pH 6. A tanase foi preferencialmente particionada para a fase sal do sistema uma vez que em todos os ensaios os valores de K foram menores do que 1. As variáveis MMPEG e a interação entre MMPEG-CPEG apresentaram os resultados mais significativos para o valor de K, sendo ambos os efeitos negativos. Com relação ao aumento de pureza, o melhor resultado (3,2) foi observado no ensaio 8 com 24% de PEG 6000 e 20% de sal. A tanase extraída do sistema apresentou temperatura ótima a 30° C e pH ótimo 5,0. A perda da estabilidade foi observada a 50 °C. A TAH desse estudo foi estimulada na presença de Na+ e completamente inibida na presença de Zn2+. Os surfactantes não interferiram significativamente em sua atividade, com exceção do Triton X-100 a 2% que diminuiu a atividade relativa em aproximadamente 50%. No processo de hidrólise dos compostos fenólicos do chá verde, a tanase pré-purificada em SDFA apresentou melhor resultado se comparada ao extrato bruto; 0,75 mL da enzima do sistema reduziu 44% dos fenóis do chá. Os resultados demonstram que o modelo estatístico montado para o SDFA além de permitir a extração de uma tanase parcialmente pura tornou conhecido outros modelos que favorecem a otimização das variáveis estudadas, principalmente o aumento de pureza. Com isso, é possível afirmar que a tanase de Aspergillus sp. SIS 25 pode ser extraída através de um método de baixo custo, que emprega material reutilizável, biodegradável e que o processo conservou as características biquímicas dessa enzima devido à abundância de água que ocorre no sistema e pela utilização de componentes inertes à maioria das bimoléculas. A criação desse ambiente favorável para separar moléculas biológicas pode explicar o fato da tanase não ter perdido sua atividade durante o estudo, mantendo sua ação catalítica principalmente durante a aplicação em chá verde. / Enzymes are proteins with catalytic activity capable of integrating different biotechnological processes. One of the enzymes with application in industry stands out the tannin acyl hydrolase (EC 3.1.1.20) or simply tannase, an extracellular enzyme produced in the presence of tannic acid by filamentous fungi, bacteria and yeast. The tannase (TAH) catalyzes the hydrolysis of tannins releasing gallic acid and glucose. TAH can be used for effluent treatment, pharmaceutical industry, food, beveragesand others. In biotechnology, the big challenge in the production of enzymes is to extract the molecule from economically viable methods. Thus, the aqueous two-phase system (ATPS) has been increasingly used to partiallypurify biological products. In this sense, the present work had as purpose to extract in ATPS, characterize biochemically and apply in green tea the tannase enzyme obtained from Aspergillus sp. SIS 25 by solid state fermentation using coconut fiber like substrate. A factorial design 23 was used to evaluate the influence of major variables: PEG molar mass (1000, 3350 and 6000 g/mol), PEG concentration (CPEG) and sodium citrate concentration (CCIT), on the response variables: partition coefficient (K), recovery (Rec) and purity increase (AP), at pH 6. The tanase was preferentially partitioned to stage the salt system once in all tests the values of K were lower than 1. The variables MMPEG and the interaction between MMPEG-CPEG presented the results more meaningful for the value of K, being both negative effects. With regard to the increase in purity, the best result (3.2) was observed in 8 test with 24% of PEG 6000 and 20% salt. The tannase extracted from system showed optimum temperature at 30 ° C and optimum pH 5.0. The loss of stability was observed at 50° c. TAH this study was stimulated in the presence of Na+ and completely inhibited in the presence of Zn2+. Surfactants not significantly interfere in their activity, with the exception of Triton X-100 2% that decreased the relative activity by approximately 50%. In the process of hydrolysis of phenolic compounds from green tea, tannase pre-purified in ATPS showed better results when compared to the crude extract; 0.75 ml of the enzyme from system has reduced 44% of tea phenols. The results show that the statistical model fitted to the ATPS and allow the extraction of a pure and partially known other models that favor the optimization of the studied variables, especially the increase in purity. With this, it is possible to affirm that the tanase of Aspergillus sp. SIS 25 can be extracted through a low-cost method, employing reusable, biodegradable material and the process preserved the biquímicas features of this enzyme because of the abundance of water that occurs in the system and by the use of inert components to most bimoléculas. The creation of this favourable environment to separate biological molecules can explain the fact of tannase didn't lose its activity during the study, keeping their catalytic action primarily during application in green tea.

Gliotoxin ist ein ubiquitär vorkommendes Mykotoxin und wird unter anderem von Aspergillus sp. gebildet. Das Gliotoxin ist toxisch und stellt für Mensch und Tier ein gesundheitliches Risiko dar. Über die Aufnahme von kontaminierten Futtermitteln (FM) kann es in tierische Produkte und anschließend in die Nahrungsmittelkette gelangen. Dem Mykotoxin werden starke immunmodulatorische Eigenschaften zugeschrieben. Gliotoxin gilt als eine sehr reaktive Verbindung, die in der Umwelt schnell zu bis(methylthio)Gliotoxin (bmGliotoxin) umgesetzt werden kann. Dieser Metabolit ist sowohl atoxisch als auch biologisch inaktiv und wird aufgrund seiner Stabilität als ein wichtiger und zuverlässiger Diagnostikmarker beschrieben. In der Mykotoxinanalytik werden Konzentrationsbestimmungen primär durch chromato-graphische Verfahren durchgeführt. Mit diesen Verfahren konnten bereits Gliotoxin-Konzentrationen in verschiedensten FM bestimmt werden. Im Gegensatz zu anderen prominenten Mykotoxinen gibt es für das Gliotoxin kein Nachweisverfahren für routinemäßige Kontrolluntersuchungen. Daher war das Ziel der Dissertationsarbeit die Entwicklung eines ELISA, mit dem Gliotoxin in FM einfach und schnell bestimmt werden kann. Es wurden zunächst geeignete Protein-Gliotoxin-Konjugate für die Anti-Gliotoxin-Immunisierung hergestellt. Kaninchen wurden nach einem festgelegten Protokoll mit diesen Hapten-Konjugaten immunisiert (Kurzzeit- bzw. Langzeitimmunisierung). Anschließend erfolgte die Titerbestimmung in den Antiseren und die Überprüfung der Paratophemmbarkeit durch freies Gliotoxin. Aus dem Antiserum mit der höchsten IgG-anti-Gliotoxin-Konzentration wurden die Antikörper antigenaffinitäts-chromatografisch aufgereinigt. Zusätzlich wurde für den kompetitiven ELISA ein geeignetes Gliotoxin-Peroxidase-Konjugat hergestellt. Alle Testkomponenten wurden vorab geprüft und danach der kompetitive Gliotoxin-ELISA validiert. Mit dem optimierten kompetitiven Testsystem wurden die Gliotoxin-Konzentrationen in Schimmelpilz-Kulturüberständen (Aspergillus sp.) gemessen. Anschließend erfolgte die Untersuchung von Futtermittelproben (Silagen) auf Gliotoxin. Nach der entsprechenden Probenaufbereitung der FM wurde das Gliotoxin im kompetitiven ELISA ebenfalls quantitativ bestimmt. Die hier gemessenen Gliotoxin-Konzentrationen wurden mit Ergebnissen aus parallel durchgeführten Untersuchungen mit der LC-MS/MS verglichen. Mit dem entwickelten kompetitiven ELISA sind quantitative Aussagen zu erhöhten Gliotoxin-Konzentrationen in verschiedenen Probenmaterialien möglich. Das Mykotoxin kann sowohl frei in seiner nativen Form, gebunden an Proteine oder metabolisiert als bis(methylthio)gliotoxin detektiert werden. Mit dem Testsystem kann die quantitative Produktion von Gliotoxin durch verschiedene Schimmelpilzarten beurteilt werden. Die untersuchten FM (Silageproben) konnten im entwickelten ELISA alle erfolgreich gemessen und beurteilt werden.:1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 2 2.1 Schimmelpilze 2 2.1.1 Definition und Zuordnung 2 2.1.2 Vorkommen in der Umwelt 4 2.1.3 Bedeutung und Nutzen 5 2.1.4 Schadwirkung für Mensch und Tier 7 2.2 Mykotoxine 9 2.3 Gliotoxin 10 2.3.1 Allgemeine Merkmale 10 2.3.2 Bis(methylthio)Gliotoxin 16 2.3.3 Ausgewählte Pathogenitätsmechanismen 17 2.3.3.1 Redox-Zirkel und ROS-Produktion 17 2.3.3.2 Verschiebung des TH1/ TH2-Gleichgewichtes 18 2.3.3.3 Inhibition des Transkriptionsfaktors NF-κB 19 2.3.3.4 Einleitung von Apoptose und Nekrose 20 2.3.3.5 Inhibition von Mastzellen 21 2.3.4 Nachweisverfahren 22 2.3.4.1 Chromatographie 22 2.3.4.2 Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) 23 2.3.5 Quantitative Mengenbestimmungen in Proben 25 2.3.5.1 Klinisches Probenmaterial 25 2.3.5.2 Belastete Futtermittelproben 27 2.3.5.3 Belastete Lebensmittelproben 33 3 Material und Methoden 34 3.1 Gliotoxin, Chemikalien und ausgewählte Laborgeräte 34 3.2 Gliotoxin-Hapten für die Immunisierung 35 3.3 Immunisierung 37 3.4 Untersuchung der Anti-Gliotoxin-Antiseren 37 3.4.1 Protein-Gliotoxin-Konjugate für ELISA 37 3.4.2 ELISA für Antiserumuntersuchung 39 3.4.3 ELISA für die Bestimmung der IgG-Konzentrationen anti-Gliotoxin 40 3.5 Etablierung des kompetitiven Gliotoxin-ELISA 42 3.5.1 Isolierung der IgG-anti-Gliotoxin 42 3.5.2 Herstellung des Gliotoxin-HRP-Konjugates 43 3.5.3 Prüfung der Testkomponenten 44 3.5.4 Validierung des kompetitiven Gliotoxin-ELISA 45 3.6 Untersuchung von Kreuzreaktionen 45 3.7 Untersuchung von Pilzkulturen auf Gliotoxin 45 3.8 Untersuchung von Futtermitteln auf Gliotoxin 47 3.8.1 Untersuchung von dotiertem Futtermittel 47 3.8.2 Futtermitteluntersuchung mit dem Gliotoxin-ELISA 48 3.8.3 Futtermitteluntersuchung mit der LC-MS/MS 49 3.9 Datenauswertung 49 4 Ergebnisse 50 4.1 Hapten für die Immunisierung 50 4.2 Untersuchung der Anti-Gliotoxin-Antiseren 50 4.2.1 Titerbestimmung 50 4.2.2 Bestimmung der Hemmungsrate durch freies Gliotoxin 51 4.2.3 IgG-anti-Gliotoxin-Konzentration in den Antiseren 53 4.3 Untersuchung der Antiseren 55 4.3.1 Isolierung des IgG-anti-Gliotoxin 55 4.3.2 Voruntersuchungen für die Etablierung des kompetitiven Gliotoxin-ELISA 57 4.3.3 Validierung des kompetitiven Gliotoxin-ELISA 60 4.4 Untersuchung von Kreuzreaktionen 64 4.5 Untersuchung von Pilzkulturen auf Gliotoxin 65 4.6 Untersuchung von Futtermitteln auf Gliotoxin 68 4.6.1 Untersuchung mit Gliotoxin dotierter Futtermittel 68 4.6.2 Futtermitteluntersuchung mit Gliotoxin-ELISA und LC-MS/MS 71 4.7 Auswertung und Bewertung 73 5 Diskussion 78 5.1 Bewertung der Gliotoxin-Antigen Entwicklung 78 5.2 Bewertung der Antiseren nach Immunisierung (28d- und 91d-Protokoll) 79 5.3 Etablierung des kompetitiven ELISA 83 5.4 Bewertung der Pilze und der Kulturüberstände 85 5.5 Bewertung der Futtermittel 88 6 Zusammenfassung 96 7 Summary 98 8 Literaturverzeichnis 100 9 Anhang 116