Submitted by Chaylane Marques (chaylane.marques@ufpe.br) on 2015-03-13T18:58:18Z No. of bitstreams: 2 CALD.pdf: 3116341 bytes, checksum: c6dca14c2b7bf3f18c0fc5859910b6ec (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-13T18:58:18Z (GMT). No. of bitstreams: 2 CALD.pdf: 3116341 bytes, checksum: c6dca14c2b7bf3f18c0fc5859910b6ec (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2012 / CNPQ

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:55:41Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo9503_1.pdf: 3116341 bytes, checksum: c6dca14c2b7bf3f18c0fc5859910b6ec (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2012 / Colagenases são enzimas proteolíticas capazes de degradar a região helicoidal do colágeno em pequenos fragmentos. Em contraste com as colagenases de mamíferos, que clivam a hélice do colágeno em um único ponto, as colagenases microbianas atacam múltiplos sítios ao longo da hélice e por este motivo vem sendo largamente aplicadas na obtenção de peptídeos bioativos do colágeno. Devido ao uso potencial das colagenases microbianas na produção de peptídeos bioativos, existe um interesse em encontrar novas linhagens de fungos capazes de produzir estas enzimas com novas características e em um meio de produção com baixo custo industrial. O presente trabalho teve como objetivo otimizar a produção da colagenase do Penicillium aurantiogriseum utilizando um meio de produção econômico a base de farinha de soja, caracterizar a enzima obtida a partir das condições de cultivo mais favoráveis, aplicar o sistema de duas fases aquosas (SDFA) polietileno glicol (PEG)/fosfato para pré-purificar a colagenase do meio de fermentação e utilizar a cologanase na forma pré-purificada para a produção de peptídeos bioativos do colágeno bovino tipo I. Três planejamentos experimentais (24 e 23 fatorial completo e um 22 central composto) foram empregados para otimizar a produção da colagenase. Os resultados do planejamento completo 24 indicaram que as variáveis mais significativas para a produção da colagenase foram a concentração da farinha de soja e o pH inicial do meio de cultura que exerceram efeitos positivos, e a temperatura que exerceu efeito negativo. Os resultados do planejamento completo 23 indicaram que o pH inicial do meio de cultura e a temperatura exerceram efeitos negativos significativos, enquanto que a concentração da farinha de soja apresentou efeito positivo na produção da colagenase. A produção enzimática máxima (283,36  1,33 U) foi obtida a 1,645% (m/v) de farinha de soja, pH 7,21 e 24 ºC, conforme predita pela superfície de resposta. A enzima apresentou uma atividade máxima a pH 9,0 e 37 ºC, foi estável em uma ampla faixa de pH (6,0 a 10,0) e temperatura (25 a 45 ºC) e foi fortemente inibida por 10 mM de fenil metil sulfonil fluoreto. A energia de ativação e a entalpia de ativação da enzima foram 107,4 kJ/mol e 104,7 kJ/mol, respectivamente. A análise dos resultados do planejamento fatorial 24 utilizado para estudar a influência da massa molar do PEG (MMPEG), da concentração do PEG (CPEG), da concentração do fosfato (CFOSF) e do pH na extração da colagenase no SDFA indicou que o fator de purificação (FP), o coeficiente de partição (K) e o rendimento em atividade (Y) da colagenase na fase superior aumentaram com o aumento da CPEG e da CFOSF e com a diminuição da MMPEG e do pH. O FP máximo (5,23) foi obtido com MMPEG de 1500 g/mol, CPEG de 17,5% (m/m), CFOSF de 15% (m/m) e pH 6,0, enquanto que o Y máximo (167,01%) foi obtido com MMPEG de 1500 g/mol, CPEG de 17,5% (m/m), CFOSF de 10% (m/m) e pH 8,0. A eficiência do SDFA foi confirmada pelo estudo eletroforético, que revelou a eliminação de proteínas contaminantes. Os resultados do planejamento fatorial completo 23 utilizado para identificar as condições mais favoráveis de hidrólise do colágeno bovino tipo I, a partir da colagenase prépurificada do P. aurantiogriseum, indicaram que o pH e a concentração do colágeno exerceram efeitos positivos sobre o grau de hidrólise, enquanto que o efeito da temperatura foi negativo. O grau de hidrólise máximo (4,65 μmol/mL) foi obtido utilizando uma concentração de colágeno de 7,5 mg/mL, pH 8,0 e 25 ºC. O perfil de peptídeos obtido por espectrometria de massa mostrou a presença de peptídeos com massas molares inferiores a 11 kDa e inúmeros peptídeos com massas molares menores de 2 kDa. Estes peptídeos apresentaram atividade antimicrobiana contra Escherichia coli (CIM = 0,625 mg/mL), Bacillus subtilis (CIM = 5 mg/mL) e Staphylococcus aureus (CIM = 0,55 mg/mL) e atividade antioxidante de 84,7 ± 0,24% (50 mg/mL). Os resultados do presente trabalho demonstram que P. aurantiogriseum é produtor de colagenase, a qual é uma alternativa tecnologicamente viável para a produção de peptídeos bioativos do colágeno

Bromelina é um nome coletivo para enzimas proteolíticas encontradas no talo, fruto e folhas do abacaxi (Ananas comosus Merr). A bromelina possui propriedades anti-inflamatórias, de debridamento, entre outras. Para a produção da bromelina deve-se, preferencialmente, usar resíduos do abacaxi, visto que os produtos do fruto têm aplicação comercial. Este trabalho teve como objetivo a extração de bromelina a partir de cascas de abacaxi através de sistema de duas fases aquosas (SDFA), e sua aplicação em hidrogel polimérico. Foram realizados estudos de estabilidade da bromelina comercial, em que se observou maior estabilidade em pH 5,0 com menor perda da atividade relativa em todas as temperaturas estudadas (20, 30, 40 e 50°C). O estudo da extração da bromelina em SDFA formado por polietileno glicol (PEG) e ácido poliacrílico (PAA) (com auxílio da análise de variância de parâmetros como rendimento, fator de purificação e coeficiente de partição) proporcionou rendimento de 335% e fator de purificação de 25,8. Os hidrogéis poliméricos à base de PEG estudados apresentaram-se flexíveis, com pouca elasticidade e taxa de absorção superior a 1000%. Hidrogel carreado de bromelina pelo método de turgescência proporcionou a maior liberação da enzima, assim como a maior atividade (80% da bromelina liberada em 24 h e 278 ± 89 U/mL). / Bromelain is a collective name for the proteolytic enzymes found in the stem, fruit and leaves of pineapple (Ananas comosus Merr.). Bromelain possesses anti-inflammatory properties, debridement, among others. For bromelain production one should preferably use the waste materials, whereas pineapple fruit products have commercial application. This study aimed to extract bromelain from pineapple peels using aqueous two-phase system (ATPS), and its application in polymeric hydrogels. Stability studies of commercial bromelain were performed, which found greater stability at pH 5.0 with minor loss of relative activity at all temperatures studied. The study of bromelain extraction in ATPS composed by polyethylene glycol (PEG) and poly acrylic acid (PAA) (with assistance of variance analysis of parameters such as yield, purification factor and partition coefficient) showed yield 335% and purification factor of 25.8. The PEG-based hydrogels studied presented flexibility, low elasticity and swelling ratio higher than 1000%. Hydrogel containing bromelain, loading by embedding (solvent sorption) method, yielded the highest enzyme release, as well as the highest activity (80% bromelain released over 24 h and 278 ± 89 U / mL).

A partição das enzimas glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PD) e uroquinase (UK) em sistemas micelares de duas fases aquosas foi investigada, teórica e experimentalmente. Inicialmente, a partição de G6PD em sistema micelar de duas fases aquosas composto pelo tensoativo não-iônico C10E4 (óxido de n-deciltetraetileno) foi estudada. Observou-se uma partição governada primariamente por interações repulsivas estéricas, do tipo \"volume de exclusão\", sendo a G6PD recuperada preferencialmente na fase inferior do sistema, pobre em micelas, resultando em valores de KG6PD inferiores a 1,0. Os tensoativos catiônicos CnTAB (brometos de alquiltrimetilamônio, n = 8, 10 e 12) foram adicionados ao tensoativo C10E4, de modo a formar sistemas micelares mistos (não-iônico/catiônico) de duas fases aquosas e atrair a G6PD de carga efetiva negativa para a fase superior, rica em micelas positivamente carregadas. Os coeficientes de partição obtidos nos sistemas C10E4/CnTAB/tampão foram no mínimo 2,5 vezes maiores que os correspondentes no sistema C10E4/tampão mantendo-se o volume de exclusão constante. De uma forma geral, o sistema micelar misto C10E4/C10TAB/tampão forneceu o melhor KG6PD = 7,7, com um rendimento de G6PD na fase superior de 71%. A adição de ligantes de afinidade (inibidores enzimáticos) ao sistema de duas fases aquosas C10E4/tampão para purificação de UK e G6PD também foi estudada. Não foram observadas diferenças significativas no perfil de partição da UK na presença ou não do ligante p-aminobenzamidina, o qual apresentou partição uniforme entre as duas fases do sistema, sendo obtidos valores de KUK ~ 0,70 em ambos os casos. Para a G6PD, um pequeno incremento no KG6PD foi observado na presença dos ligantes de afinidade cibacron blue e procion red, porém resultando ainda em valoresfnferiores a 1. Portanto, a utilização de inibidores enzimáticos livres em solução como ligantes de afinidade para purificação de UK e G6PD em sistema micelar C10E4/tampão de duas fases aquosas não resultou em diferenças significativas no perfil de partição das enzimas. Por fim, um sistema de purificação em dois estágios, sendo o primeiro constituído de sistema micelar não-iônico (C10E4) de duas fases aquosas e o segundo de sistema micelar misto (C10E4/ C10TAB) de duas fases aquosas foi aplicado para a purificação de G6PD presente em homogeneizado celular de Saccharomyces cerevisiae, sendo obtido um rendimento final de G6PD de 59%, com um fator de purificação de 1,3. / The partitioning of the hydrophilic enzymes glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) and urokinase (UK) in two-phase aqueous micellar systems was investigated, both experimentally and theoretically. Initially, the partitioning of G6PD in two-phase aqueous micellar system composed of the nonionic surfactant C10E4 (n-decyl tetra(ethylene oxide) was studied. It was observed a partitioning behavior governed primarily by repulsive, steric, excluded-volume interactions, which drove the enzyme preferentially to the bottom, micelle-poor phase, resulting in KG6PD values smaller than one. The cationic surfactants CnTAB ((alkyltrimethylammonium bromide, n = 8, 10, and 12) were mixed wíth the nonionic surfactant C10E4 to form two-phase aqueous mixed (nonionic/cationic) micellar systems. The measured G6PD partition coefficients in the C10E4/CnTAB/buffer systems were at least 2.5 times larger than those in the corresponding C10E4/buffer system, clearly demonstrating that the net negatively charged G6PD was attracted electrostatically to the top, mixed micelle-rich phase, containing a greater number of positively-charged C10E4/CnTAB mixed micelles. Overall, the two-phase aqueous mixed (C10E4/C10TAB) micellar system yielded the highest KG6PD = 7.7, with a G6PD yield in the top phase of 71%. The addition of affinity ligands (enzyme inhibitors) to the two-phase C10E4 /buffer systems was studied for UK and G6PD purification. No significant differences in the UK partitioning behavior was observed in the presence or not of the ligand p-aminobenzamidine, since the ligand was found to partition evenly between the two phases of the system. Partition coefficient values of about 0.70 were obtained in both cases. For the G6PD, the partition coefficient was found to be slightly higher in the presence of either cibacron blue or procion red as affinity ligand, however still smaller than one. Therefore, the use of competitive inhibitors free in solution as affinity ligands for UK and G6PD purification in two-phase C10E4 /buffer systems did not provide significant differences in the enzymes partitioning behaviors. Finally, a two-step purification process, combining a two-phase aqueous nonionic (C10E4) micelar system, followed by a two-phase aqueous mixed (C10E4/C10TAB) micellar system, was employed for the purification of G6PD present in a Saccharomyces cerevisiae cell homogenate. It was obtained a G6PD final yield of 59%, and a purification factor of 1,3.

Bromelina é um nome coletivo para enzimas proteolíticas encontradas no talo, fruto e folhas do abacaxi (Ananas comosus Merr). A bromelina possui propriedades anti-inflamatórias, de debridamento, entre outras. Para a produção da bromelina deve-se, preferencialmente, usar resíduos do abacaxi, visto que os produtos do fruto têm aplicação comercial. Este trabalho teve como objetivo a extração de bromelina a partir de cascas de abacaxi através de sistema de duas fases aquosas (SDFA), e sua aplicação em hidrogel polimérico. Foram realizados estudos de estabilidade da bromelina comercial, em que se observou maior estabilidade em pH 5,0 com menor perda da atividade relativa em todas as temperaturas estudadas (20, 30, 40 e 50°C). O estudo da extração da bromelina em SDFA formado por polietileno glicol (PEG) e ácido poliacrílico (PAA) (com auxílio da análise de variância de parâmetros como rendimento, fator de purificação e coeficiente de partição) proporcionou rendimento de 335% e fator de purificação de 25,8. Os hidrogéis poliméricos à base de PEG estudados apresentaram-se flexíveis, com pouca elasticidade e taxa de absorção superior a 1000%. Hidrogel carreado de bromelina pelo método de turgescência proporcionou a maior liberação da enzima, assim como a maior atividade (80% da bromelina liberada em 24 h e 278 ± 89 U/mL). / Bromelain is a collective name for the proteolytic enzymes found in the stem, fruit and leaves of pineapple (Ananas comosus Merr.). Bromelain possesses anti-inflammatory properties, debridement, among others. For bromelain production one should preferably use the waste materials, whereas pineapple fruit products have commercial application. This study aimed to extract bromelain from pineapple peels using aqueous two-phase system (ATPS), and its application in polymeric hydrogels. Stability studies of commercial bromelain were performed, which found greater stability at pH 5.0 with minor loss of relative activity at all temperatures studied. The study of bromelain extraction in ATPS composed by polyethylene glycol (PEG) and poly acrylic acid (PAA) (with assistance of variance analysis of parameters such as yield, purification factor and partition coefficient) showed yield 335% and purification factor of 25.8. The PEG-based hydrogels studied presented flexibility, low elasticity and swelling ratio higher than 1000%. Hydrogel containing bromelain, loading by embedding (solvent sorption) method, yielded the highest enzyme release, as well as the highest activity (80% bromelain released over 24 h and 278 ± 89 U / mL).

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:55:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 5315.pdf: 2167736 bytes, checksum: 42c21ae0612a2550b93786bcc8cd967b (MD5) Previous issue date: 2013-04-26 / Universidade Federal de Sao Carlos / Cephamycin C is a β-lactam antibiotic that belongs to the cephalosporins. This antibiotic stands out from other cephalosporins because it has activity against gram-negative bacteria and for being resistent to β-lactamases produced by pathogenic microorganisms, and which represent one of the major mechanisms of bacterial resistance to β-lactam antibiotics. In view of the restricted information in the literature about the steps of the process, both from the point of view of research and of industrial production of cephamycin C, the study about its production and, consequently, the process of separation and purification becomes of great importance. Therefore, the main objective of this work was to develop a separation and purification process of cephamycin C from a fermentation broth produced by cultivations of Streptomyces clavuligerus in aired submerged processes. Extraction and separation processes of cephamycin C were performed by means of an aqueous two-phase system (ATPS) and ionexchange chromatography, respectively. Initially, studies on the stability of cephamycin C were performed in order to allow the establishment of conditions which minimize losses and increase the yield of the global process. In these studies, conditions at pH levels of 2.2, 3.0, 5.0, 6.0, 7.0, 7.6 and 8.7 at a temperature of 20 °C were evaluated. The smallest half-life was of 52.6 hours and was verified for pH 8.7; the longest half-life was of 459 hours for pH 6.0; and for the most acid pH (2.2), half-life was of 118.2 hours. The second step of the work was the study of the separation of cephamycin C and amino acids with the aqueous two-phase system composed by PEG/phosphate. The presence of ornithine, lysine and asparagine amino acids in the fermentation broth, even after the primary separation steps performed by filtration processes consisting of microfiltration and ultrafiltration, is due to the composition of the culture medium which is of complex origin. The experiments were carried out by varying the following parameters: molecular mass of PEG (400, 600, 1000 and 4000), pH (6, 7 and 8), tieline length (TLL 37 and 43) and phase volume ratio (rTLL 0.75, 1.00 and 1.25), in order to enable the determination of the best system for cephamycin C extraction. The best conditions obtained for this process were pH 8, PEG 400, TLL 43 and rTLL 1.00, where the highest partition coefficient, kp of 5.57, was acquired. For the separations of cephamycin C and the amino acids present in the broth, it was possible to verify the following separation efficiencies: 3.4 (ornithine), 6.9 (lysine) and 2.8 (asparagine). The last step of the work showed that it is possible to recover cephamycin C from the PEG phase promoting an even greater purification with the residual amino acids. The ion-exchange chromatography was used to propose so. For this proposal, we used the ion exchange chromatographic technique, with use of anionic resin Amberlite IRA 400. These experiments were performed under temperatures of 20, 25 and 30 °C and pH 2.8 and 6.8. The Amberlite IRA 400 Cl- resin showed affinity for cephamycin C, and in the experiments in fixed bed column, it was possible to separate cephamycin C from PEG, from the phosphate salt and from the amino acids present in the top phase. The results allowed the conclusion that the proposed process is an excellent alternative for the extraction, separation and purification of cephamycin C. / A cefamicina C (cef C) é um antibiótico β-lactâmico que pertence à classe das cefalosporinas. Este antibiótico se destaca das demais cefalosporinas por possuir atividade frente a bactérias gram-negativas e ser resistente à ação das β-lactamases, produzidas por micro-organismos patogênicos, e que representam um dos principais mecanismos de resistência bacteriana aos antibióticos β-lactâmicos. Tendo em vista as restritas informações na literatura sobre as etapas do processo, tanto sob o ponto de vista de pesquisa e industrial de produção da cefamicina C, torna-se de grande importância o estudo de sua produção e consequentemente do processo de separação e purificação. Portanto, o objetivo principal deste trabalho foi desenvolver um processo de separação e purificação da cefamicina C, a partir de um caldo fermentado produzido por cultivos da bactéria Streptomyces clavuligerus, em processos submersos aerados. Os processos de extração e separação da cefamicina C foram realizados por meio de sistema de duas fases aquosas (SDFA) e cromatografia de troca iônica em coluna de leito fixo, respectivamente. Inicialmente, foram realizados estudos de estabilidade da cefamicina C, tendo em vista permitir o estabelecimento de condições que minimizem as perdas e aumentem o rendimento do processo global. Nestes estudos foram avaliadas as condições em pH de 2,2, 3,3, 5,0, 6,0; 7,0; 7,6 e 8,7 a uma temperatura de 20 °C. A meia-vida para o pH 8,7 foi de 52,6 horas, para o pH 6,0 a meia-vida foi de 459 horas e, para o pH mais ácido (2,2), a meia-vida foi de 118,6 horas. A segunda etapa do trabalho correspondeu ao estudo da separação entre a cefamicina C e os aminoácidos, por meio do sistema de duas fases aquosas composto por polietileno glicol (PEG) /fosfato. A presença dos aminoácidos ornitina, lisina e asparagina no caldo fermentado, mesmo após as etapas de separação primária, realizada por processos de filtração compostos por microfiltração e ultrafiltração, devem-se a composição do meio de cultura de origem complexa. Os experimentos foram realizados variando-se os seguintes parâmetros: massa molecular de PEG (400, 600, 1000 e 4000), pH (6, 7 e 8), tamanho de tieline (TLL 37 e 43) e razão de volume das fases (rTLL 0,75, 1,00 e 1,25), de modo a possibilitar a determinação do melhor sistema para a extração da cefamicina C. As melhores condições obtidas para este processo foram pH 8, PEG 400, TLL 43 e rTLL 1,00, onde se obteve o maior coeficiente de partição, kp de 5,57. Para as separações entre a cef C e os aminoácidos presentes no caldo foi possível verificar as seguintes eficiências de separação: 3,4 (ornitina), 6,9 (lisina) e 2,8 (asparagina). Na etapa final do trabalho foi possível recuperar a cef C da fase PEG, promovendo ainda uma maior purificação com os aminoácidos residuais. Para tal proposta, utilizou-se a técnica cromatográfica de troca iônica, com utilização da resina aniônica Amberlite IRA 400. Estes experimentos foram realizados sob temperaturas de 20, 25 e 30 °C e pH 2,8 e 6,8. A resina Amberlite IRA 400 mostrou afinidade em relação à cef C, e nos experimentos em coluna de leito fixo, foi possível separar a cef C do PEG, do sal de fosfato e dos aminoácidos presentes na fase de topo. Os resultados obtidos permitiram concluir, que o processo proposto mostrou-se viável para a extração e separação da cefamicina C.

Submitted by Amanda Silva (amanda.osilva2@ufpe.br) on 2015-03-13T11:45:48Z No. of bitstreams: 2 DISSERTAÇÃO Thiago Pajéu Nascimento.pdf: 2049991 bytes, checksum: 727ddd1c6164d42cf0e18c5f4bd1a865 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-13T11:45:48Z (GMT). No. of bitstreams: 2 DISSERTAÇÃO Thiago Pajéu Nascimento.pdf: 2049991 bytes, checksum: 727ddd1c6164d42cf0e18c5f4bd1a865 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2014 / Enzimas fibrinolíticas têm recebido atenção, devido ao seu potencial medicinal para doenças trombolíticas, estas estão se tornando uma das principais causas de morbidade e mortalidade em todo o mundo. Este trabalho teve como finalidade obter condições de produção e caracterização de proteases fibrinolítica, produzida por fungos filamentosos isolados de solo da Caatinga-PE-Brasil, utilizando fermentação em estado sólido, e purificar essa enzima utilizando Sistema de Duas Fases Aquosas. Dentre os fungos estudados, foi selecionado o Mucor subtillissimus SIS42 como melhor produtor da protease e entre os resíduos agroindustriais utilizados, o melhor substrato foi o farelo de trigo. Através de um planejamento fatorial 23 as condições otimizadas de produção foram: 3g de farelo de trigo, 50% de umidade, submetidos a 25ºC após 72 horas de fermentação, com uma atividade fibrinolítica e proteásica de 144,58 U/mL e 48,33 U/mL, respectivamente. A protease fibrinolítica contida no extrato bruto apresentou uma temperatura ótima de 45ºC e foi estável nesta temperatura por 150 minutos, a mesma teve sua atividade proteásica aumentada na presença de K+, Ca+ e Mn+ e diminuída na adição de Cu+. De acordo com a especificidade a substratos cromogênicos e a presença de PMSF, esta enzima foi classificada como uma serino protease do tipo quimiotrispsina. A partir dos resultados obtidos, foi realizado um planejamento experimental (23) para purificação da protease fibrinolítica produzido pelo M. subtillissimus SIS42 utilizando o sistema de duas fases aquosas, onde foi possível avaliar a influência das variáveis: concentração e massa molar do PEG e concentração de sulfato de sódio na purificação da enzima. Três variáveisrespostas foram avaliadas (coeficiente de partição, recuperação da enzima e fator de purificação). Utilizando um planejamento central composto para ampliar os estudos e efeitos na purificação da enzima, foram estudadas as variáveis: concentração de PEG (6000 g/mol) e sulfato de sódio. Os resultados atingidos foram: coeficiente de partição para a fase rica em sal (0,049 a 0,795), um aumento de pureza de 10 com uma recuperação de 102% da atividade enzimática na fase inferior do sistema. O sistema que proporcionou as melhores condições de purificação foi constituído por: PEG 6000 (g/mol) e concentração de 30,00% (m/m) com uma concentração de sulfato de sódio de 13,20% (m/m). A protease fibrinolítica apresentou através de uma SDS-PAGE uma massa massa molar após a purificação de 94kDa e atividade no zimograma de fibrina. Após a purificação, por sistema de duas fases aquosas a protease fibrinolítica foi novamente avaliada a presença de PMSF e a substratos cromogênicos, indicando a enzima como uma quimiotripsina.

Submitted by Amanda Silva (amanda.osilva2@ufpe.br) on 2015-04-08T13:11:22Z No. of bitstreams: 2 DISSERTAÇÃO Vanessa Couto - CCB.pdf: 1379075 bytes, checksum: 22dec4476e89d6b363739f14fc25766e (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-08T13:11:22Z (GMT). No. of bitstreams: 2 DISSERTAÇÃO Vanessa Couto - CCB.pdf: 1379075 bytes, checksum: 22dec4476e89d6b363739f14fc25766e (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2012 / FACEPE / O gênero Streptomyces produz cerca de 70% dos antibióticos de origem natural utilizados na prática médica. Com o advento e ampla utilização dos antibióticos β-lactâmicos no tratamento de infecções bacterianas, logo surgiram cepas resistentes a estes fármacos, sendo um dos principais mecanismos de resistência microbiana a produção de enzimas β-lactamases, capazes de hidrolisar o anel β-lactâmico do antibiótico tornando a droga inativa. Ácido clavulânico (AC) é um potente inibidor de β-lactamases produzido por espécies de actinobactérias do gênero Streptomyces em processos fermentativos. O sucesso de tais processos depende, sobretudo, dos substratos e dos nutrientes fornecidos ao micro-organismo no meio de cultivo. Em fermentações extrativas, são adicionados ao meio de cultivo os sistemas de duas fases aquosas (SDFA) compostos por polímero/sal que propiciam uma simultânea produção e recuperação da biomolécula de interesse. Neste contexto, torna-se fundamental a investigação de compostos com atividade antimicrobiana de fontes diversas e, o presente trabalho teve como objetivo produzir e recuperar AC por processo de fermentação em frascos agitados através de fermentação extrativa por Streptomyces sp. DPUA 1542 isolado de liquens da Região Amazônica. A linhagem de Streptomyces sp. foi inicialmente cultivada com farinha de soja (20 g/L), extrato de soja (20 g/L) e milhocina (20 g/L) como fontes de nitrogênio (FN) e glicerol (10 g/L) como fonte de carbono (FC) em agitação orbital de 250 rpm em cultivo submerso por 144 horas a 28ºC. Sendo a melhor produção de AC verificada com o uso de farinha de soja, foi realizada uma segunda fermentação utilizando um planejamento fatorial 23 com quatro pontos centrais a fim de avaliar a influência das variáveis independentes concentração de farinha de soja - FN (10, 20, 30 g/L), concentração de glicerol - FC (5, 10 e 15 g/L) e pH (6,3, 6,8 e 7,4) na produção da biomolécula . A mais alta produção de AC (63,93 mg/L) ocorreu em 96 horas de cultivo no ensaio do planejamento fatorial que utilizou pH 6,3 e as maiores concentrações de farinha de soja e glicerol, 30 e 15 g/L, respectivamente. Em adição, foi realizado um ensaio para atividade antimicrobiana da linhagem de Streptomyces frente Staphylococcus aureus multirresistente, sendo evidenciado halo de inibição de 33 mm de diâmetro. As melhores condições definidas no primeiro planejamento fatorial foram empregadas em um planejamento fatorial subseqüente 23 com quatro pontos centrais que avaliou a simultânea produção e extração da molécula de AC em fermentação extrativa com SDFA – Polietilenoglicol (PEG)/sais fosfatos – integrado ao meio de cultura. As variáveis independentes testadas foram massa molar do PEG (MPEG 400, 1.000 e 8.000 g/mol), concentração de PEG (CPEG 15, 20 e 25 m/m%) e concentração dos sais fosfatos (CSAL 15, 20 e 25 m/m%). As maiores concentrações de AC foram obtidas nos ensaios 3 e 5, respectivamente, na fase rica em sal (69,56 mg/L) com as condições (MPEG 400 g/mol; CPEG 25 m/m% e CSAL 15 m/m%) e na fase PEG (54,88 mg/L) nas condições (MPEG 400 g/mol; CPEG 15 m/m% e CSAL 25 m/m%) em 120 horas de cultivo. Os maiores valores do coeficiente de partição (K=3,27) e rendimento (Y=63,2%), foram obtidos no ensaio 5, indicando que o AC particionou, sobretudo, para a fase superior rica em PEG, e ficou concentrada em maior quantidade em percentual. Pelos resultados demonstrados, Streptomyces sp. DPUA 1542 apresentou efetiva produção de AC utilizando como FN e FC, farinha de soja e glicerol, respectivamente, além de ter apresentado atividade biológica contra bactéria patogênica. A produção e simultânea purificação de AC por fermentação extrativa nas condições testadas pode representar uma alternativa promissora para o emprego em processos de produção do inibidor de β-lactamases a nível comercial.

Submitted by Leonardo Freitas (leonardo.hfreitas@ufpe.br) on 2015-04-09T18:28:06Z No. of bitstreams: 2 TESE MARÍLIA MACIEL.pdf: 3027098 bytes, checksum: 3d287d151c61c2f6ac29afba9e6589a1 (MD5) license_rdf: 9 bytes, checksum: 42dd12a06de379d3ffa39b67dc9c7aff (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-09T18:28:06Z (GMT). No. of bitstreams: 2 TESE MARÍLIA MACIEL.pdf: 3027098 bytes, checksum: 3d287d151c61c2f6ac29afba9e6589a1 (MD5) license_rdf: 9 bytes, checksum: 42dd12a06de379d3ffa39b67dc9c7aff (MD5) Previous issue date: 2013-02-27 / CNPq; EM / As espécies de Aspergillus pertencentes à seção Nigri são caracterizadas pela cor negra da maioria das colônias. A identificação destas espécies é complexa devido à alta diversidade genética. As características morfológicas, fisiológicas, bioquímicas, moleculares e espectrais são ferramentas que podem ser utilizadas na identificação polifásica. Aspergillus niger é a espécie da seção Nigri mais utilizada na indústria. Dentre as enzimas produzidas por este fungo podemos citar as poligalacturonases (PG), que possuem aplicação tecnológica no processamento de alimentos e frutas. Neste trabalho, linhagens de Aspergillus seção Nigri foram avaliadas por uma abordagem polifásica baseada na análise morfológica, bioquímica e espectral por Ionização/Dessorção de Matriz Assistida por Laser Tempo-de-Vôo/Espectrômetro de Massa (MALDI-TOF MS) para sua identificação e caracterização. Os dados obtidos a partir dessa abordagem indicaram que os resultados do MALDI-TOF MS corroboraram os dados da taxonomia clássica e análises bioquímicas. Cerca de 20% e 14% das linhagens de A. niger foram produtoras de ocratoxina A (OTA) e fumonisina B2 (FB2), respectivamente. As linhagens não micotoxigênicas foram avaliadas quanto à capacidade de produzir PG, sendo A. niger URM 5162 que apresentou maiores valores de atividade quando imobilizada em casca de laranja e com o reator operado sem aeração. Após a produção, as PG foram purificadas pelo sistema de duas fases aquosas (SDFA) formado por polietilenoglicol e sais de fosfato (PEG/fosfato). A endopoligalacturonase (endo-PG) e a exo-poligalacturonase (exo-PG) tiveram preferência pela fase superior do sistema (rica em PEG). Para as duas enzimas, os melhores resultados para o coeficiente de partição (K=1,23 para endo-PG e 2,40 para exo-PG), rendimento em atividade (Y=74,04% para endo-PG e 33,33% para exo-PG) e fator de purificação (FP=8,18 para endo-PG e 1,98 para exo-PG), foram obtidos com 12,5% (m/m) de PEG 8000 (g/mol) e concentração de fosfato de 25% (m/m) a pH 6,0, sendo esta a condição considerada como a mais adequada para a purificação das PG produzidas por A. niger URM 5162. A concentração de fosfato e a massa molar do PEG foram as variáveis independentes que mais influenciaram nos valores de K, Y e FP durante a purificação da endo- e exo-poligalacturonase, respectivamente. Diante dos resultados obtidos, observa-se que a utilização de uma abordagem polifásica consistindo de análise morfológica, bioquímica e proteômica, permite uma identificação mais precisa das espécies da seção Nigri. Aspergillus niger URM 5162 é a linhagem promissora para produção de PG, sendo o SDFA uma alternativa interessante e de baixo custo para a purificação destas enzimas.

A partição das enzimas glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PD) e uroquinase (UK) em sistemas micelares de duas fases aquosas foi investigada, teórica e experimentalmente. Inicialmente, a partição de G6PD em sistema micelar de duas fases aquosas composto pelo tensoativo não-iônico C10E4 (óxido de n-deciltetraetileno) foi estudada. Observou-se uma partição governada primariamente por interações repulsivas estéricas, do tipo \"volume de exclusão\", sendo a G6PD recuperada preferencialmente na fase inferior do sistema, pobre em micelas, resultando em valores de KG6PD inferiores a 1,0. Os tensoativos catiônicos CnTAB (brometos de alquiltrimetilamônio, n = 8, 10 e 12) foram adicionados ao tensoativo C10E4, de modo a formar sistemas micelares mistos (não-iônico/catiônico) de duas fases aquosas e atrair a G6PD de carga efetiva negativa para a fase superior, rica em micelas positivamente carregadas. Os coeficientes de partição obtidos nos sistemas C10E4/CnTAB/tampão foram no mínimo 2,5 vezes maiores que os correspondentes no sistema C10E4/tampão mantendo-se o volume de exclusão constante. De uma forma geral, o sistema micelar misto C10E4/C10TAB/tampão forneceu o melhor KG6PD = 7,7, com um rendimento de G6PD na fase superior de 71%. A adição de ligantes de afinidade (inibidores enzimáticos) ao sistema de duas fases aquosas C10E4/tampão para purificação de UK e G6PD também foi estudada. Não foram observadas diferenças significativas no perfil de partição da UK na presença ou não do ligante p-aminobenzamidina, o qual apresentou partição uniforme entre as duas fases do sistema, sendo obtidos valores de KUK ~ 0,70 em ambos os casos. Para a G6PD, um pequeno incremento no KG6PD foi observado na presença dos ligantes de afinidade cibacron blue e procion red, porém resultando ainda em valoresfnferiores a 1. Portanto, a utilização de inibidores enzimáticos livres em solução como ligantes de afinidade para purificação de UK e G6PD em sistema micelar C10E4/tampão de duas fases aquosas não resultou em diferenças significativas no perfil de partição das enzimas. Por fim, um sistema de purificação em dois estágios, sendo o primeiro constituído de sistema micelar não-iônico (C10E4) de duas fases aquosas e o segundo de sistema micelar misto (C10E4/ C10TAB) de duas fases aquosas foi aplicado para a purificação de G6PD presente em homogeneizado celular de Saccharomyces cerevisiae, sendo obtido um rendimento final de G6PD de 59%, com um fator de purificação de 1,3. / The partitioning of the hydrophilic enzymes glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) and urokinase (UK) in two-phase aqueous micellar systems was investigated, both experimentally and theoretically. Initially, the partitioning of G6PD in two-phase aqueous micellar system composed of the nonionic surfactant C10E4 (n-decyl tetra(ethylene oxide) was studied. It was observed a partitioning behavior governed primarily by repulsive, steric, excluded-volume interactions, which drove the enzyme preferentially to the bottom, micelle-poor phase, resulting in KG6PD values smaller than one. The cationic surfactants CnTAB ((alkyltrimethylammonium bromide, n = 8, 10, and 12) were mixed wíth the nonionic surfactant C10E4 to form two-phase aqueous mixed (nonionic/cationic) micellar systems. The measured G6PD partition coefficients in the C10E4/CnTAB/buffer systems were at least 2.5 times larger than those in the corresponding C10E4/buffer system, clearly demonstrating that the net negatively charged G6PD was attracted electrostatically to the top, mixed micelle-rich phase, containing a greater number of positively-charged C10E4/CnTAB mixed micelles. Overall, the two-phase aqueous mixed (C10E4/C10TAB) micellar system yielded the highest KG6PD = 7.7, with a G6PD yield in the top phase of 71%. The addition of affinity ligands (enzyme inhibitors) to the two-phase C10E4 /buffer systems was studied for UK and G6PD purification. No significant differences in the UK partitioning behavior was observed in the presence or not of the ligand p-aminobenzamidine, since the ligand was found to partition evenly between the two phases of the system. Partition coefficient values of about 0.70 were obtained in both cases. For the G6PD, the partition coefficient was found to be slightly higher in the presence of either cibacron blue or procion red as affinity ligand, however still smaller than one. Therefore, the use of competitive inhibitors free in solution as affinity ligands for UK and G6PD purification in two-phase C10E4 /buffer systems did not provide significant differences in the enzymes partitioning behaviors. Finally, a two-step purification process, combining a two-phase aqueous nonionic (C10E4) micelar system, followed by a two-phase aqueous mixed (C10E4/C10TAB) micellar system, was employed for the purification of G6PD present in a Saccharomyces cerevisiae cell homogenate. It was obtained a G6PD final yield of 59%, and a purification factor of 1,3.