Orientador : Prof. Dr. Silvio Sanches Veiga / Coorientador : Prof. Dr. Olga Meiri Chaim / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 25/02/2016 / Inclui referências : f. 33-34;53-61 / Área de concentração :Biologia Celular e Molecular / Resumo: Loxoscelismo é a denominação do quadro clínico provocado em pacientes picados por aranhas do gênero Loxosceles, caracterizado principalmente por causar lesão dermonecrótica com intensa resposta inflamatória no local da picada, e raramente ocorrem manifestações sistêmicas, como distúrbios renais e hematológicos. O veneno loxoscélico é um líquido cristalino e incolor composto essencialmente por proteínas e peptídeos entre 5 a 40kDa, contendo cerca de 30?g de proteínas. Sabe-se que as toxinas da família das fosfolipases-D são capazes de desencadear a maioria dos efeitos biológicos causados pelo envenenamento, tornando-se necessário o aprofundamento da ação completa desta toxina. Algumas isoformas de fosfolipases-D de veneno de aranha-marrom já foram identificadas e biologicamente caracterizadas. Após análise do transcriptoma da glândula produtora de veneno de Loxosceles intermedia, algumas prováveis novas isoformas desta toxina foram identificadas e, entre elas, uma se destacou por sua presença em proporção relevante. O objetivo deste trabalho foi a clonagem, expressão heteróloga e purificação desta nova isoforma de toxina dermonecrótica, de modo a permitir sua avaliação biológica por testes in vitro e in vivo. A partir de técnicas de biologia molecular, foi possível obter a sequência nucleotídica e, por sua vez, aminoacídica completas da LiRecDT7, relatando que esta possui uma substituição conservativa no resíduo de aminoácido Asp233'Glu233. Houve pouco rendimento na expressão da toxina recombinante na forma solúvel e o processo de purificação por cromatografia mostrou-se pouco eficiente. Os testes de atividade esfingomielinásica sugerem que esta toxina como enzima está ativa. Os resultados obtidos até o presente demonstram que esta toxina é uma nova isoforma de fosfolipase-D presente no veneno de L. intermedia. Ainda assim, o processo de expressão e purificação devem ser otimizados, para avaliá-la biologicamente, contribuindo para a compreensão da composição do veneno dessa espécie, além de ser mais uma alternativa de ferramenta com potencial de aplicação biotecnológica. Palavras-chave: aranha, Loxosceles intermedia, veneno, fosfolipase-D / Abstract: Loxoscelism is the name of the clinical picture provoked in patients bitten by Loxosceles spiders. It is mainly characterized by dermonecrotic lesions with an intense inflammatory response at the site of the bite, and rarely systemic manifestations such as renal and hematological disorders. The venom produced by Loxosceles spiders is a crystalline, colorless liquid consisting mainly of proteins and peptides between 5 and 40kDa. It is known that the phospholipase-D family of toxins present in this venom is capable of causing most of the biological effects observed in accidents with the spiders. Some isoforms of phospholipases-D have been identified in the Loxosceles venom and biologically characterized. Transcriptome analysis of the venom gland of Loxosceles intermedia revealed some potential novel isoforms of this toxin and among them, one stood out for its presence in significant proportion. The aim of this work was the cloning, heterologous expression and purification of this new isoform of dermonecrotic toxin, named LiRecDT7, to allow their biological evaluation by in vitro and in vivo analysis. Using molecular biology techniques, it was possible to obtain the nucleotide sequence and, in turn, the complete amino acid sequence of LiRecDT7. Further analysis showed a conservative substitution at amino acid residue Glu233'Asp233. The expression of recombinant toxin in soluble form resulted in a low yield and the process of purification by chromatography proved to be inefficient. Nevertheless, preliminary assays that tested the sphingomyelinasic activity of LiRecDT7 suggest that this toxin is active as an enzyme. The results show that LiRecDT7 is a new isoform of phospholipase-D present in the venom of L. intermedia. Still, the expression and purification process must be optimized to allow further assessments. Thus, the results will help to expand the knowledge concerning the composition of the venom of this species, besides being an alternative tool with potential biotechnological applications. Key-words: spider, Loxosceles intermedia, venom, phospholipase-D

Resumo: O conteúdo total do veneno das aranhas do gênero Loxosceles permanece ainda desconhecido, entretanto, muitos estudos têm mostrado que se constitui uma mistura complexa de compostos biologicamente ativos. Por meio de análises eletroforéticas, observa-se a predominância de moléculas de baixa massa molecular (3-45 kDa), enquanto moléculas de alta massa molecular são menos abundantes. Os venenos de aranhas estão funcionalmente relacionados à defesa contra predadores e também à paralisia e captura de presas, especialmente insetos. As aranhas desenvolveram um arsenal de moléculas inseticidas, resultando em uma biblioteca combinatória de peptídeos que tem sido aprimorada durante sua evolução. Comumente, tais peptídeos consistem em moléculas de cadeia única com massa molecular variando de 3 a 10 kDa, ricos em resíduos de cisteína, os quais estabelecem pontes dissulfeto intramoleculares características. Essas pontes se organizam em um motivo estrutural característico denominado "nó de cistina inibidor" ou ICK (Inhibitor Cystine Knot) e, por isso, os peptídeos que o contém são denominados notinas ("knottins"). Recentemente, análises do transcriptoma da glândula de veneno de L. intermedia (GREMSKI et al., 2010) revelaram ESTs com similaridade a notinas previamente descritas como LiTx (De CASTRO et al., 2004). Sequências relacionadas à LiTx3 foram as mais abundantes no transcriptoma de L. intermedia, representando aproximadamente 13,9% de todas as ESTs obtidas e compreendendo 32% dos mRNAs codificantes de toxinas. Devido a alta proporção de sequências codificantes para peptídeos semelhantes a LiTx3, o presente estudo teve como objetivo a clonagem e expressão de um peptídeo dessa família. Primers foram desenhados para a realização das técnicas de 3' e 5' RACE, o qual teve como resultado a obtenção da sequência nucleotídica completa do cDNA correspondente ao peptídeo em estudo. A sequência do propeptídeo associado ao peptídeo maduro foi amplificada e modificada por PCR com primers contendo sítios de restrição para as enzimas XhoI e BamHI e inseridos no vetor de expressão pET-14b. A construção foi transformada em cepa de E. coli AD494(DE3). Um teste de expressão foi realizado para determinar as condições ótimas de expressão do peptídeo. Verificou-se que a indução com 0,5mM de IPTG, por 3 horas e meia, a 30oC era a melhor condição de expressão. A partir desse resultado, uma expressão em larga escala foi realizada, obtendo-se o peptídeo recombinante na fração solúvel, após cromatografia de afinidade em resina de Ni2+-NTA. A diversidade de peptídeos presentes no veneno de L. intermedia representa uma fonte importante de possíveis novas ferramentas moleculares com aplicação farmacológica e/ou biotecnológica.

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Orientador: Gilberto de Nucci / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Dados retirados da capa / Made available in DSpace on 2018-07-14T02:22:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Borges_NeyCarterdoCarmo_M.pdf: 987938 bytes, checksum: d5cbce73e0bd89562ae0bdf5807eda06 (MD5) Previous issue date: 1992 / Resumo: Esta tese descreve a atividade contrátll em músculo liso vascular de coelho do veneno da aranha arrnadeira Phoneutria nigriventer. ° endotélio dos vasos foi retirado mecanicamente e os mesmos foram montados em um sistema de cascata, superfundidos com solução de Krebs aquecida (37°C) e oxigenada (95% 02 + 5% C02)' ° Phoneutria nigriventer (0.3 - 30 µg) produziu contrações dependentes da dose em arterias (pulmonar, mesentérica e celíaca) e veias (jugular, mesentérica e cava). A atividade contrátll do veneno em tecidos venosos e na artéria pulmonar não foi alterada quando o mesmo foi submetido a diálise (20-72h) ou quando os tecidos .foram perfundidos com metisergida, indicando que tal atividade não depende da serotonina contida no veneno. A atividade contrátll nas artérias mesentérica e celíaca foi abolida com a diálise do veneno ou com o uso da metisergida, indicando a serotonina corno principal agente espasmogênico nestes tecidos. A tetrodotoxina e a fenoxibenzarnina não afetaram significativamente a. contração induzida pelo Phoneutria nigriventer, sugerindo que o efeito contrátll independe da ativação de canais de sódio e da liberação de catecolarninas das terminações nervosas da parede do vaso. A atividade contrátll do Phoneutria nigriventer apresentou urna redução significativa quando incubado com tripsina, indicando que o veneno contém polipeptídeos responsáveis pela atividade espasmogênica. Após o fracionamento parcial do veneno através de filtração em gel de Sephadex G-1O e cromatografia de troca iônica, obtivemos 8 frações as quais revelaram atividade contrátll em tecido liso vascular. A eletroforese em gel de SDS-poliacrilarnida-tricina mostrou que o massa molecular destas frações está situado entre 8-50 kDa. / Abstract: The effects produced by Phoneutria nigriventer("armed spider") venom (PNV) in rabbit vascular smooth musc1e have been investigated. De endothelialized vascular strips were superfused in a cascade system with oxygenated (95% O2 /5% C02) and warmed (37°C) Krebs' solution at 5 rnl/min. PNV (0.3-30 µg) produced dose-dependent contractions in both 'venous and arterial tissues (cava, mesenteric and jugular veins and puImonazy, mesenteric and coeliac arteries, respectively). Methysergide did not s1gniflcantly a:ffect PNV-induced contractions in venous tissues or Í'Il puImonazy artery ind1cating that serotonin 1s not involved. Furthermore, d1alysis of the venom for up to 48 h d1d not alter th1s contractile activity. Ne1ther tetrodotoxin nor phenoxybenzamine s1gnificantly affected PNV induced contractlons suggesting that voltage-dependent sodium channel actlvatlon and endogenous catecholamine release from vessel wall autonomic nerve endings are also Í10t involved in the PNV response. The incubatlon with trypsin reduced significantly PNV-induced contractions. suggesting that the venom contains polypeptides Following gel-filtration, 10n-exchange chromatography and trtcine SDS- PAGE electrophoresis of the PNV, 8 fractlons (mw 8-50 kDa) with contractile activity were isolated. / Mestrado / Mestre em Farmacologia

Resumo: No Brasil, existem vários animais de importância médica, as aranhas do gênero Loxosceles e as lagartas do gênero Lonomia em especial apresentam índices alarmantes de acidentes com humanos. Esses animais peçonhentos e traumatizantes podem provocar morbidez importante e algumas vezes mortalidade em humanos. Após a picada da aranha marrom (Loxosceles intermedia), as vítimas apresentam lesões cutâneas necróticas ao redor da picada e, em menor freqüência, sinais sistêmicos tais como insuficiência renal, coagulação intravascular disseminada e hemólise. Enquanto, o contato acidental com as cerdas pontiagudas contendo o veneno da lagarta (Lonomia obliqua) leva a dor em queimação, edema, eritema e em alguns casos hemorragias, hemólise e insuficiência renal. Neste presente trabalho, nós caracterizamos bioquímica e biologicamente seis isoformas recombinantes e uma isoforma mutada de fosfolipase-D presentes no veneno de Loxosceles intermedia. O tratamento de eritrócitos provenientes de sangue humano com as toxinas induziu experimentalmente hemólise direta de modo concentração- e tempo-dependentes. Os eritrócitos expostos à toxina fosfolipase-D recombinante apresentaram alterações morfológicas no tamanho e na forma, agregação dos lipid rafts e externalização de fosfatidilserina. A lise direta dos eritrócitos induzida pela fosfolipase-D recombinante depende da espécie do animal testado, já que eritrócitos obtidos a partir de humanos, de coelhos e de carneiros sofreram hemólise em uma porcentagem muito superior do que a observada com eritrócitos de cavalo. Em ensaios de microscopia confocal e imunofluorescência indireta, bem como em citometria de fluxo, utilizando uma toxina fluorescente recombinante GFPfosfolipase- D mostraram a ligação direta da toxina à membrana dos eritrócitos humanos. Além disso, observou-se que está enzima promove a hidrólise de fosfolipídios como a esfingomielina e lisofosfatidilcolina da membrana dos eritrócitos, formando ácido lisofosfatídico e ceramida-1-fosfato respectivamente, que são capazes de ativar uma série de enzimas intracelulares que culminam na morte e ruptura dos eritrócitos. Além disso, o tratamento com a fosfolipase-D recombinante estimula o influxo de cálcio detectado através de uma sonda fluorescente sensível ao cálcio (Fluo-4). Este influxo de cálcio mostrou ser mediado por canais de cálcio do tipo-L. Fazendo o uso de alguns inibidores sugere-se duas possíveis vias que explicam a hemólise induzida pela fosfolipase-D. A primeira através da formação de ácido lisofosfatídico e ativação dos receptores LPA1/LPA3 acoplados a proteína G e a segunda pela formação de eramida-1-fosfato e da sua interconversão em ceramida, esfingosina e esfingosina-1-fosfato. Desse modo, os resultados aqui descritos fornecem evidências de que as fosfolipases-D do veneno de L. intermedia desencadeiam a hemólise direta sobre de eritrócitos humanos de maneira dependente da atividade catalítica e que a ruptura das células ocorre com a formação de metabolitos bioativos que ativam cascatas de sinalização. Por fim, foi clonada uma nova fosfolipase A2 presente nas cerdas de Lonomia obliqua. Esta nova toxina foi parcialmente caracterizada, porém futuramente será feita uma avaliação mais aprofundada das suas características bioquímicas, estruturais e biológicas. Logo, esse estudo sobre as fosfolipases presente nos venenos de Loxosceles intermedia e de Lonomia obliqua pode auxiliar o melhor entendimento dos efeitos fisiopatológicos desenvolvidos nos acidentes com esses animais, assim como para o esenvolvimento de novas manobras terapêuticas e aplicações biotecnológicas e industriais.

Orientador: Edson Antunes / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-07-21T01:45:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Costa_SoraiaKatiaPereira_M.pdf: 8130661 bytes, checksum: ab30b86629cbc4ddaaad83dddc5d7e5b (MD5) Previous issue date: 1996 / Resumo: Esta tese descreve os efeitos do veneno da aranha Phoneutria nigriventer sobre a pressão arterial média (PAM) e em corações isolados de ratos. Para avaliação dos parâmetros in vivo, o método utilizado consistiu basicamente de monitorização da PAM de ratos anestesiados através de transdutor de pressão. Os parâmetros in vitro foram avaliados em função da pressão desenvolvida no ventrículo esquerdo (PDVE), freqüência cardíaca (medidos através de um balão inserido na cavidade ventricular) e fluxo coronariano (coleta do efluente coronariano) em intervalos de tempo préestabelecidos. A administração endovenosa do veneno de Phoneutria nigriventer (0,1 mg/kg) produziu hipotensão rápida e reversível. Na dose de 0.3 mg/kg, o veneno evocou alterações bifásicas caracterizadas por hipotensão transitória seguida por hipertensão prolongada e discreto aumento da freqüência cardíaca. Tais alterações foram acompanhadas por fasciculações generalizadas, diurese, defecação, sialorréia, cianose e dispnéia. Doses de veneno mais elevadas (0.6 mg/kg) produziram alterações mais intensas, dessincronizadas e determinou a morte de 75 % (n=20) dos animais. O tratamento prévio dos animais com atropina, propranolol ou fenoxibenzamina não aboliu as alterações induzidas pelo veneno in vivo, excluindo o possível envolvimento do sistema nervoso autônomo nessa resposta. Posteriormente, investigamos o envolvimento de componentes como cininas, PAF, neurocininas e NO na resposta hipotensora induzida pelo veneno in vivo. O tratamento prévio dos animais com Hoe 140 (antagonista de receptores 82), WE8 2086 (antagonista de PAF), SR 140333 (antagonista de receptores NK1) ou L-NAME (inibidor da síntese de óxido nítrico) não alterou de modo significativo a hipotensão induzida pelo veneno sugerindo que tais mediadores não estão envolvidos nessa resposta hipotensora. A ausência de efeito da indometacina sobre a resposta bifásica induzida pelo veneno sugere que a hipotensão e hipertensão não são decorrentes da formação de PGb e TXA2, respectivamente. Finalmente, a queda na PAM induzida pelo veneno foi parcialmente inibida pelo bloqueador dos canais de potássio dependentes de ATP (glibenclamida) indicando que a hipotensão induzida pelo veneno é mediada, pelo menos em parte, da ativação de canais de potássio. A resposta hipertensora induzida pelo veneno não foi alterada nos animais tratados com antagonista de receptores AT1 de angiotensina II (Losartan) ou com antagonista de receptores de endotelina do tipo ETA(FR 139317) indicando que o veneno não estimula o sistema renina angiotensina e nem promove a liberação de ET-1 no organismo. Contudo, esse aumento de PAM induzido pelo veneno de Phoneutria nigriventer foi marcadamente reduzido de modo dose-dependente com antagonistas de canais de Ca2+ do tipo L (verapamil, diltiazem e nifedipina) sugerindo que essa hipertensão arterial é dependente da ativação de canais de cálcio do tipo L. A administração inta-aórtica do veneno (50 µg) em corações isolados produziu inotropismo positivo (aumento da PDVE) acompanhado por discreto cronotropismo positivo (aumento da FC). Na dose de 100 µg o veneno produziu inotropismo positivo imediato seguido por bloqueio átrio-ventricular transitório, bradicardia, aumento da pressão diastólica e queda do fluxo coronariano. Em corações isolados, a infusão contínua de propranolol foi capaz de proteger os corações das alterações induzidas pelo veneno em ambas as doses. Entretanto, o tratamento dos corações com atropina não modificou signifrcativamente tais alterações, exceto, uma discreta proteção sobre a bradicardia observada com altas doses do veneno. Isto sugere que nesta preparação in vitro, o veneno promove liberação de noradrenalina e acetildblina das terminações nervosas simpáticas e parassimpáticas do músculo cardraco. Todavia, embora o veneno produza a liberação desses neurotransmissores in vitro, concluimos que estes não são os responsáveis pela hipotensão e hipertensão observados in vivo em virtude dos resultados negativos obtidos com atropina, fenoxibenzamina e propranolol / Abstract: The changes induced in the mean arterial blood pressure (MABP) of anaesthetised rats following the administration of armed spider (Phoneutria nigriventer) venom have been investigated. The intravenous injection of Phoneutria nigriventer venom (PNV; 0.1 mg/kg) evoked a brief and reversible decrease in the MABP whereas a higher dose of venom (0.3 mg/kg) caused a biphasic response characterized by a short lasting hypotension followed by a sustained and prolonged hypertension (40-50 min). These changes were accompanied by tachycardia, salivation, fasciculations, defecation and respiratory disturbances. Pretreatment of the animais with atropine (10 mg/kg), propranolol (100 mg/kg), phenoxybenzamine (100 mg/kg) and indomethacin (4 mg/kg) did not significantly affect the MABP changes induced by PNV. Similarly, the bradykinin B2 receptor antagonist Hoe 140 (0.6 mg/kg), the PAF antagonist WEB 2086 (20 mg/kg), the NK1 receptor antagonist SR 140333 (0.5 mg/kg) and the nitric oxide synthase inhibitor Nro-nitro-L-arginine methyl ester (10 mg/kg) had no significant effect on the PNV-induced MABP changes. The increase in the MABP induced by PNV was also not significantly affected by either angiotensin 11 receptor antagonist losartan (10 mg/kg) or the endothelin ET A receptor antagonist FR 139317 (30 mg/kg). The A TP-dependent potassium channel antagonist glibenclamide (50 mg/kg) reduced by 40% the hypotension induced by Pf'JV without affecting the hypertensive response. Pretreatment of the animais with Ltype Ca2+ channel antagonists such as verapamil (10-100 µ/kg/min), diltiazem (40-120 /-l9/kg/min) and nifedipine (0.3-10 mg/kg) markedly attenuated the PNVinduced hypertension. Verapamil (30 µ/kg/min) and diltiazem (120µ/kg/min) also promptly reversed the established hypertension induced by PNV when infused 8 min after venom injection. Our results indicate that the brief decrease of blood pressure induced by PNV is partially due to A TP-dependent or calcium activated channels activation. The prolonged hypertension seems to result from direct calcium entry in vascular and/or cardiac muscles. Phoneutria nigriventer venom (PNV; 50 and 100 µg) was also investigated in isolated rat hearts by the Langendorff method. Doses of 50 µg evoked a significant positive inotropism (increase of left ventricule developed pressure; LVDP) associated with discreete positive cronotropism. Higher doses of PNV (100µg caused an immediate increase of L VDP followed by bradicardy and temporary atrium-ventricule blockad (AVB). This was accompained by significant reduction of coronary blood flow. These changes were prevented by the P-blocker propranolol indicating that such effects are caused by activation of sympathetic nerve endings and hence noradrenaline release. Since atropine potentiated the increase of L VDP and attenuated the bradicardia induced by PNV, it is likely that PNV also induces the release of acetylcholine from parassympathetic nerve endings. However, the release of both noradrenaline and acetylcholine from the rat hearts does not probably account for the cardiovascular changes observed in vivo. The in vivo effect is likely to be of peripheral or CNS, rather than cardiac, origin / Mestrado / Farmacologia / Mestre em Farmacologia

Submitted by Maurílio Figueiredo (maurilioafigueiredo@yahoo.com.br) on 2013-03-06T21:13:13Z No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_ClonagemExpressãoCDNA.PDF: 1649529 bytes, checksum: 00aae23f984e9db472f5a8b04b6c2e83 (MD5) / Approved for entry into archive by Neide Nativa (neide@sisbin.ufop.br) on 2013-03-13T19:33:50Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_ClonagemExpressãoCDNA.PDF: 1649529 bytes, checksum: 00aae23f984e9db472f5a8b04b6c2e83 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-03-13T19:33:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_ClonagemExpressãoCDNA.PDF: 1649529 bytes, checksum: 00aae23f984e9db472f5a8b04b6c2e83 (MD5) Previous issue date: 2006 / O veneno de cobras, escorpiões, aranhas e outros animais venenosos é uma fonte rica em toxinas. Uma característica importante de algumas toxinas é o fato de serem espécie específicas. Neste trabalho, nós realizamos a clonagem da seqüência codificante para a toxina LTx2 da aranha Lasiodora sp. no vetor de expressão pET11a. Esta toxina foi previamente identificada, através da varredura de uma biblioteca de cDNA da glândula de veneno desta aranha. A análise de similaridade, feita com o programa de alinhamento local BLAST, mostrou que esta toxina apresenta similaridade com as toxinas huwetoxina-II e huwetoxina-VII da aranha Selenocosmia huwena, bem como com as toxinas LTx1 e LTx3 da Lasiodora sp. Após a clonagem no vetor de expressão, nós sequenciamos o produto da clonagem pelo método de Sanger e verificamos que o mesmo foi inserido no frame correto. A indução da expressão da toxina recombinante foi feita usando IPTG na concentração de 0,6 mM, por 3-4 horas. Através de ensaios imunoquímicos, nós constatamos que neste sistema a proteína recombinante é expressa sobretudo na forma de corpos de inclusão. Definimos então, uma estratégia para obter a toxina solúvel renaturada. Utilizando uma solução contendo uréia na concentração de 6 M realizamos a desnaturação dos corpos de inclusão, e procedemos a renaturação da proteína recombinante através de diálise em um tampão de renaturação. A amostra foi então submetida a uma cromatografia líquida de alta pressão em coluna de fase reversa. Através de eletroforese e Western Blotting, nós observamos que a estratégia de purificação foi eficiente. Realizamos então um ensaio antimicrobiano, onde observamos que a toxina recombinante, na concentração de 400 mg/mL. inibiu o crescimento dos microrganismos Escherichia coli, Salmonella Agona e Staphylococcus epidermidis. A expressão e recuperação da proteína recombinante em maior quantidade permitirá a realização de testes em outros organismos e a realização de ensaios eletrofisiológicos. ____________________________________________________________________________________________________ / ABSTRACT: The venom from snakes, scorpions, spiders and other venomous animals is a very rich source of potent toxins. An interesting feature of some toxins is their remarkable species specificity. In the present work we cloned a sequence which codifies for the toxin LTx2 from the venom of the spider Lasiodora sp, in the expression vector pET11a. This toxin was previously identified in the screening of the cDNA library of the total venom. This toxin, when submitted to the local alignment tool, BLAST, shown similarity with the toxins huwetoxina-II and huwetoxina-VII, from the venom of the spider Selenocosmia huwena, as well as with the toxins LTx1 and LTx3 from Lasiodora sp. venom. After cloning in expression vector we verified if the fragment was inserted in the correct frame using the Sanger DNA sequencing method. The expression of the target protein was made by adding 0,6 mM IPTG to the media followed by a 3 to 4 hours incubation. With the assistance of immunochemical assays, we were able to detect that the target protein was been expressed in the form of inclusion bodies. Then we defined a strategy to recover the soluble refolded protein. Using a solution containing 6 M urea we proceed the solubilization of the inclusion bodies. The refolding of the soluble protein was made by the dialysis method in refolding buffer. The sample was, then, submitted to high pressure liquid chromatography, in a reversed phase column, to purify the protein. The purifying process was efficient, as shown by the Western Blotting and electrophoresis results. After that, we made an anti microbial assay, where we could see that the target protein, in the concentration of 400 mg/mL, inhibited the growth of the organisms used in the test. The expression and recovery of larger amounts of the target protein will allow tests with this toxin in other organisms and electrophysiological experiments.

Submitted by Maurílio Figueiredo (maurilioafigueiredo@yahoo.com.br) on 2013-03-15T20:31:46Z No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_ClonagemExpressãoSequência.PDF: 5671313 bytes, checksum: 6449585170e71dbb4b26ba69ffcac214 (MD5) / Approved for entry into archive by Neide Nativa (neide@sisbin.ufop.br) on 2013-03-20T14:11:44Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_ClonagemExpressãoSequência.PDF: 5671313 bytes, checksum: 6449585170e71dbb4b26ba69ffcac214 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-03-20T14:11:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_ClonagemExpressãoSequência.PDF: 5671313 bytes, checksum: 6449585170e71dbb4b26ba69ffcac214 (MD5) Previous issue date: 2010 / Peptídeos neurotóxicos encontrados em venenos animais têm despertado um grande interesse de pesquisadores. A possibilidade de utilizá-los como ferramentas moleculares para estudos em canais iônicos, além do uso como bioinseticidas e/ou como biofármacos, tem impulsionado as pesquisas nessa área. Experimentos com o veneno bruto da aranha caranguejeira Lasiodora sp mostraram que o mesmo atua em canais iônicos de pequenos vertebrados e de invertebrados. Recentemente, construímos uma biblioteca de cDNA a partir dos mRNAs presentes na glândula de veneno dessa aranha. A varredura desta biblioteca, usando a técnica de ELISA, e o sequenciamento de DNA, permitiram a identificação de cinco toxinas presentes no veneno, nomeadas LTx1, LTx2, LTx3, LTx4 e LTx5. Experimentos realizados com a toxina recombinante LTx2, em células musculares BC3H1, mostraram que esse peptídeo bloqueia canais de cálcio tipo-L e inibe a recarga de Ca2+ dos estoques intracelulares. A estrutura primária do peptídeo LTx2 é muito similar a dos peptídeos LTx1 e LTx3, portanto, espera-se que essas toxinas possuam mescanismos de ação semelhantes. Por outro lado, a sequência de aminoácidos da LTx4 e da LTx5 são bem diferentes, tanto quando comparadas com a LTx1, LTx2 e LTx3, quanto entre si, o que leva a acreditar que elas possam atuar em diferentes canais e/ou ter diferentes mecanismos de ação. Neste trabalho, a sequência codificante para o peptídeo maduro LTx4 foi subclonada no vetor de expressão pET21b (Novagen). A estratégia foi inserir o gene de interesse sob o controle do promotor T7 e obter um produto expresso em fusão com uma cauda de seis histidinas. A confirmação da clonagem foi realizada através de PCR, digestão do DNA plasmidial com endonucleases de restrição e, finalmente, seqüenciamento dos DNAs extraídos dos clones positivos. A indução da expressão do peptídeo LTx4 foi realizada com a adição de 1mM de IPTG ao meio de cultura. Nos ensaios de imunodetecção utilizamos o anticorpo monclonal anti His-Tag. O peptídeo recombinante foi identificado tanto em experimentos de Western Blot como em experimentos de Dot Blot. O peptídeo recombinante foi expresso exclusivamente na forma de corpos de inclusão e em maiores quantidades após três a quatro horas de indução. O perfil protéico foi analisado em géis de poliacrilamida (Tricina-SDS). Experimentos de purificação do peptídeo encontramse em andamento. ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________ / ABSTRACT: Peptide neurotoxins found in animal venoms have attracted great interest of researchers. The possibility of using them as tools for molecular studies of ion channels in addition to use as biopesticides and/or as biopharmaceuticals has boosted research in this area. Experiments with the venom of the spider Lasiodora sp showed that it acts on ion channels of small vertebrates and invertebrates. Recently, we constructed a cDNA library from mRNAs present in the venom gland of this spider. The screen of this library, using ELISA and DNA sequencing, allowed the identification of five toxins in the venom, named LTx1, LTx2, LTx3, LTx4 and LTx5. Experiments conducted with recombinant toxin LTx2 in muscle cells BC3H1 showed that this peptide blocks L-type calcium channels and inhibits Ca+2 recharge from intracellular stores. The primary structure of the peptide LTx2 is very similar to the peptides LTx1 and LTx3, and consequently it is expected that these toxins have similar action mechanisms. On the other hand, the amino acids sequences of LTx4 and LTx5 are quite different, both when compared with LTx1, LTx2 LTx3 and as between themselves, which leads to believe that they can act on different channels and/or have different action mechanisms. In this work, the coding sequence for the mature peptide LTx4 was subcloned at the expression vector pET21b (Novagen). The strategy used was to insert the gene of interest under the control of T7 promoter and obtain the expression product in fusion with a six histidine tag. The cloning confirmation was performed by PCR, plasmid DNA digestion with restriction enzymes, and finally, sequencing of DNAs extracted from the positive clones. The induction of LTx4 peptide expression was performed by addition of 1mM IPTG to the culture medium. At the immunodetection assay, we used monoclonal antibody anti His-tag. The recombinant peptide was identified by both Western Blot and Dot Blot experiments. The recombinant peptide was expressed exclusively as inclusion bodies and in larger amounts after three to four hours of induction. The protein profile was analyzed on polyacrylamide gel electrophoresis (Tricine-SDS). Peptide purification experiments are in course.

Resumo: O presente trabalho teve como objetivo, estudar, a morfologia das glândulas produtoras de veneno da aranha L intermedia, bem como esclarecer questões relacionadas ao perfil e funções dos oligossacarídeos conjugados às glicoproteínas deste veneno. A aranha marrom, do gênero Loxosceles, tornou-se de grande importância médica, devido aos acidentes de envenenamento (loxoscelismo) que vem ocorrendo em diferentes partes do mundo. As atividades biológicas do veneno da aranha marrom normalmente incluem lesões dermonecróticas no local da picada, acompanhadas por efeitos hemolíticos e hemorrágicos e também pelo quadro clínico de insuficiência renal aguda (IRA). Pelo uso de microscopia óptica, microscopia eletrônica de transmissão e de varredura, demonstrou-se que a organização das glândulas produtoras de veneno de Loxosceles intermedia seguem a arquitetura geral das glândulas de veneno de outras aranhas. A microscopia eletrônica de varredura mostrou que as glândulas de veneno são estruturas pares, situadas no cefalotórax e que descarregam seus produtos de secreção diretamente em um par de tubos ligados a cada quelícera. Usando-se microscopia óptica e microscopia eletrônica de transmissão, observou-se que as glândulas apresentam camadas de fibras de músculos estriados, em contato com uma membrana basal que separa a região muscular da camada epitelial. As células epiteliais possuem um citoplasma rico em retículo endoplasmático rugoso, mitocôndrias, complexo de Golgi e vesículas secretoras contendo o veneno, uma mistura complexa de proteínas. Com as técnicas de lectina-blotting, cromatografia de afinidade lectínica e tratamentos com glicosidases, detectou-se no veneno estruturas do tipo alta-manose N-ligadas, proteínas com resíduos de fucose N-Iigados e proteínas com resíduos de N-acetilgalactosamina O-ligados, mas ausência de glicosaminoglicanos ou estruturas complexas contendo galactose ou ácido siálico terminais. Com veneno deglicosilado enzimática ou quimicamente, demonstrou-se que a agregação plaquetária (atividade trombocitopênica), como também os efeitos fibronectinolítico e fibrinogenolítico (hemorrágicos), são açúcar-independentes quando comparados com os efeitos do veneno glicosilado. Uma análise através de zimograma copolimerizado em géis de gelatina, mostrou que a loxolisina B, uma metaloprotease gelatinolítica de 32-35 kDa, é uma glicoproteína do tipo alta-manose e que após uma N-deglicosilação enzimática teve seu peso molecular reduzido em aproximadamente 2 kDa e seu efeito gelatinolítico residual em 28%, quando comparado com a molécula glicosilada. Nesta condição apontou também uma atividade gelatinolítica dependente da glicosilação pós-traducional. O tratamento químico ou enzimático do veneno de L. intermedia (deglicosilação), reduziu significativamente seu efeito dermonecrótico quando testado experimentalmente em coelhos. Este dado sugere fortemente que resíduos de oligossacarídeos exercem um importante papel nos efeitos lesivos do veneno da aranha marrom e abre a possibilidade de se postular uma terapia tópica das lesões cutâneas, baseada em carboidratos.

Resumo: As fosfolipases são uma família de enzimas encontradas em várias fontes biológicas incluindo os organismos procarióticos e eucarióticos. As aranhas do gênero Loxosceles, conhecidas popularmente como aranhas marrons, são eficazes em produzir em seus venenos uma grande proporção de fosfolipases-D. No veneno destas aranhas, estas enzimas estão relacionadas à dermonecrose, desregulação da resposta inflamatória, hemólise, nefrotoxicidade e agregação plaquetária. As fosfolipases-D catalizam a hidrólise de diferentes fosfolipídios gerando ácido fosfatídico, ou ácido lisofosfatídico, ou ceramida-1-fosfato, importantes mediadores nos eventos de sinalizações celulares. Alterações no padrão de expressão, atividade destas moléculas ou receptores para seus produtos tem sido relacionados com o desenvolvimento de muitos tumores. Desta forma, neste trabalho foi observado o efeito de uma fosfolipase-D exógena recombinante da glândula de veneno da aranha marrom Loxosceles intermedia (LiRecDT1) sobre as células das linhagens de melanoma murino B16-F10 e B16-F1. Por meio de experimentos de imunoblotting em duas dimensões com anticorpo contra a fosfolipase-D recombinante LiRecDT1 foi observada reatividade imunológica cruzada para pelo menos 25 spots no veneno bruto de L. intermedia, indicando alto nível de expressão para diferentes isoformas de fosfolipase-D. Experimentos de cinética de degradação de lipídios mostraram que esta toxina degrada de maneira tempo dependente tanto esfingomileina, gerando ceramida-1-fosfato e colina, quanto lisofosfatidilcolina, gerando ácido lisofosfatídico e colina e mostram menor atividade contra fosfatidilcolina. Através de experimentos de imunofluorescência com anticorpos contra LiRecDT1 e usando a toxina recombinante de fusão LiRecDT1-GFP foi observado a ligação direta de LiRecDT1 na membrana de células B16-F10. Também foi observado que a toxina recombinante LiRecDT1 tem acesso e degrada fosfolipídios das membranas das células B16-F10, observado em experimentos com extratos de membranas obtidos com detergente ou Ghosts de membrana pela geração de colina. Usando o Fluo-4 AM, um fluoróforo permeante sensível ao cálcio, foi possível observar que o tratamento das células B16-F10 e B16-F1 com a toxina LiRecDT1 induziu um aumento da concentração de cálcio no citoplasma. Em células B16-F10 também foram avaliadas a viabilidade e a morfologia após o tratamento com a fosfolipase-D recombinante e os resultados mostraram que não houve alterações sugerindo que a entrada de cálcio não foi decorrente a danos causados à membrana das células. Baseado no que é conhecido sobre a atividade de fosfolipases-D endógenas como indutores da proliferação celular e no fato de que LiRecDT1 se liga a superfície de células B16-F10 hidrolisando fosfolipídios e gerando lipídios bioativos, foi utilizada a toxina LiRecDT1 como uma fonte exógena de fosfolipase-D em células B16-F10. O tratamento destas células com a fosfolipase-D recombinante de aranha marrom foi efetivo no aumento da sua proliferação e de maneira tempo e concentração dependentes, especialmente na presença de esfingomielina sintética no meio. Estes resultados sugerem que a fosfolipase-D de aranha marrom pode ser usada como uma ferramenta bioativa para protocolos experimentais em biologia celular.