RODRIGUES, Fernanda Nascimento. Estabelecimento de cultivo in vitro e estudo proteômico de calos caulinares e foliares de Artocarpus incisa L. 2016. 70 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2016. / Submitted by Anderson Silva Pereira (anderson.pereiraaa@gmail.com) on 2017-01-03T20:49:55Z No. of bitstreams: 1 2016_dis_fnrodrigues.pdf: 1058982 bytes, checksum: 85e27505af970a6b39e312b8bc7ac445 (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2017-01-09T22:36:49Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_dis_fnrodrigues.pdf: 1058982 bytes, checksum: 85e27505af970a6b39e312b8bc7ac445 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-09T22:36:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_dis_fnrodrigues.pdf: 1058982 bytes, checksum: 85e27505af970a6b39e312b8bc7ac445 (MD5) Previous issue date: 2016 / The species Artocarpus incisa, belonging to the Moraceae family, is a tree-sized plant with multiple applications in folk medicine. As a woody species, several difficulties are reported to its spread, such as the delay in its development and low germination rate. In vitro culture of plant tissue, in particular callus culture, can serve as a tool to overcome these difficulties and to facilitate obtaining the compounds of interest. This work was meant to provide the best conditions of callus formation as well as perform histological analysis and proteomic study of A. incisa calluses. For induction of callus, explants were used arising from leaf and shoot, which have been added to the nutritional formulation Woody Plant Medium (WPM), and applied in treatments containing PVP, activated charcoal, and different growth regulators (2,4-D, BAP, NAA and KIN). The results showed that the cultivation of shoot and leaf explants in medium with 0.1% activated charcoal, supplemented with 4.5 uM of 2,4-D and 4.4 uM BAP treatment was the best callus induction with an 88% percentage production. Quantification of proteins by Protein UV from NanoVue detected 15.97 ug protein / uL shoot extract; 20.07 ug protein / uL leaf extract; 0.75 ug protein / uL of shoot callus extract; and 16.85 ug protein / uL of leaf callus extract. The original tissues showed higher protein concentration than those in produced calluses, which can be explained by the differentiation of tissue. Histological analysis indicated that the cells of calluses were homogeneous and viable, with thin cell wall, and large amount of polysaccharide granules. The proteomic study by mass spectrometry led to the identification of peptides that have relation to previously reported plant proteins. We were able to detect proteins related to the defense (KM+, chitinase, catalase), metabolism (fructose-bisphosphate aldolase, glutamate carboxypeptidase) and cell signaling (calmodulin) in calluses, regardless of the origin of these. The work pioneered the proteomic study of A. incisa calluses, and is an initial step in understanding the biochemistry and physiology of the species under study. / A espécie Artocarpus incisa, pertencente à família Moraceae, é uma planta de porte arbóreo com várias aplicações na medicina popular. Por ser uma espécie lenhosa, várias dificuldades são relatadas para sua propagação, como a demora no seu desenvolvimento e a baixa taxa de germinação. A cultura in vitro de tecidos vegetais, em particular a cultura de calos, pode servir como uma ferramenta para contornar essas dificuldades e facilitar a obtenção dos compostos de interesse. O presente trabalho teve como intuito estabelecer as melhores condições de calogênese, bem como realizar a análise histológica e o estudo proteômico de calos de A. incisa. Para a indução dos calos, utilizou-se explantes advindos de folha e de caule, os quais foram adicionados à formulação nutritiva Woody Plant Medium (WPM), e aplicados em tratamentos contendo PVP, carvão ativado, e diferentes reguladores de crescimento (2,4-D, BAP, ANA e CIN). Os resultados mostraram que o cultivo de explantes foliares e caulinares em meio com carvão ativado 0,1%, suplementado com 4,5 µM de 2,4-D e 4,4 µM de BAP foi o melhor tratamento de indução de calos, com um percentual de produção de 88%. A quantificação de proteínas através do Protein UV do NanoVue detectou 15,97 µg de proteína/µL de extrato de caule; 20,07 µg de proteína/µL de extrato de folha; 0,75 µg de proteína/µL de extrato de calos caulinares; e 16,85 µg de proteína/µL de extrato de calos foliares. Os tecidos originais apresentaram maior concentração de proteínas do que os calos produzidos, o que pode ser explicado pela diferenciação do tecido. A análise histológica indicou que as células de calos se mostraram homogêneas e viáveis, com parede celular fina, e com grande quantidade de polissacarídeos em grânulos. O estudo proteômico, através de espectrometria de massas, levou à identificação de peptídeos que apresentam relação com proteínas vegetais já relatadas. Detectou-se proteínas relacionadas com a defesa (KM+, quitinase, catalase), metabolismo (frutose-bifosfato aldolase, glutamato-carboxipeptidase) e sinalização celular (calmodulina) nos calos, independente da origem destes. O trabalho foi pioneiro no estudo proteômico de calos de A. incisa, e é um passo inicial na compreensão da bioquímica e fisiologia da espécie em estudo.

VIEIRA NETO, Antonio Eufrásio. Caracterização estrutural da frutalina, uma lectina α-D-Galactose ligante de sementes de Artocarpus incisa e análise das suas bases moleculares de ligação a D-galactose. 2015. 88 f. Dissertação (mestrado em bioquímica)- Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2015. / Submitted by Elineudson Ribeiro (elineudsonr@gmail.com) on 2016-03-22T17:47:01Z No. of bitstreams: 1 2016_dis_aevneto.pdf: 1681651 bytes, checksum: 2953060bc810e7a4ab0f8a702a2583f8 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-04-28T20:57:34Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_dis_aevneto.pdf: 1681651 bytes, checksum: 2953060bc810e7a4ab0f8a702a2583f8 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-28T20:57:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_dis_aevneto.pdf: 1681651 bytes, checksum: 2953060bc810e7a4ab0f8a702a2583f8 (MD5) Previous issue date: 2016 / Lectins are proteins containing at least one non-catalytic domain that allows them to recognize and selectively bind a reversible specific glycans. Frutalin is a lectin obtained from Artocarpus incisa seeds, popularly known as breadfruit. The isolation was performed by affinity chromatography on column of Agarose-D-Galactose and their characterization shows that frutalin is a glycoprotein mainly α-D-galactose ligand, because it also recognizes epimers of α-D-mannose. It has 2.1% of carbohydrates and presents, in its SDS-PAGE profile, two protein bands with apparent molecular masses of 12 and 15 kDa, with an oligomeric protein, lying as tetramer only in alkaline pH, with apparent molecular mass of 60 kDa. Several masses around 16 kDa was observed in deconvoluted spectra in Mass Spectrometry, which confirms the presence of isoforms. This work shows the crystallization and analysis of data obtained by x-ray diffraction to determine the three-dimensional structure of this lectin, and that were performed crystallization trials of frutalin isolated from the mature seeds in the presence of ligand (D-galactose) and the way apo (no binders). The frutalin crystals have grown primarily in wells of pH 8.5 containing PEG as precipitant and ethylene glycol and the best crystals appeared after one week of maturation being diffracted to a maximum resolution of 1.81 Å. The best solution, for the space group, considering axes and planes of symmetry, has been obtained for the I2 space group, with the construction of an Rfactor of 38.6% and LLG = 19.9. The structure of frutalin presents in each monomeric unit, a symmetrical β-prism with three groups of four beta strands each. The carbohydrate recognition site is similar to the jacalin, and involves the N-terminus of the α chain, showing, in the region, a characteristic folding of the Moraceae family. The frutalin binding site cavity is near the N-terminus of the α chain formed by four key residues Gly25, Tyr146, Asp149, and Trp147. The bases of interaction with the binder are related to the number of interactions occurring between the C1 hydroxyl and Tyr146 residue, C3 hydroxyl and Gly25 residue, C4 hydroxyl and Asp149/Gly25 residues, and C6 hydroxyl and Tyr146/Trp147/Asp149 residues. Some hydroxyls of α-D-galactose also utilize interactions called structural waters, to seek stability in the carbohydrate recognition site. The large number of interactions agrees with the high affinity that frutalin has with galactose and its great capacity for agglutination, in addition to providing an analysis of the dimensions of the lectin in relation to the binder, which may justify the preference that frutalin tends to present by higher molecular weight glycoconjugates, and that happens due to the most fitting, and the greatest number of chemical interactions among a larger glycoconjugate. / As lectinas são proteínas que contêm pelo menos um domínio não catalítico que lhes permite reconhecer seletivamente e se ligar de uma forma reversível a glicanos específicos. A Frutalina é uma lectina obtida a partir das sementes de Artocarpus incisa, conhecida popularmente como fruta-pão. O isolamento foi realizado por cromatografia de afinidade em coluna de Agarose-D-Galactose e sua caracterização demonstrou que a Frutalina é uma glicoproteína, principalmente α-D-galactose ligante, mas que também reconhece α-D-Manose. Possui 2,1% de carboidratos e apresenta, em seu perfil de SDS-PAGE, duas bandas protéicas com massas moleculares aparentes de 12 e 15 kDa, sendo uma proteína oligomérica, encontrando-se como tetrâmero apenas em pH alcalino, com massa molecular aparente de 60 kDa. Massas diversas em torno de 16 kDa foram observadas nos espectros deconvoluídos em espectrometria de massas, o que corrobora a presença de isoformas. Este trabalho mostra a cristalização e análises dos dados obtidos por difração de raios-x para determinação da estrutura tridimensional desta lectina, e para isso foram realizados ensaios de cristalização da Frutalina isolada a partir das sementes maduras, na presença do ligante (α-D-galactose) e na sua forma apo (sem ligantes). Os cristais de Frutalina cresceram principalmente em poços de pH 8,5 contendo PEG como precipitante e etileno-glicol e os melhores cristais apareceram após uma semana de maturação, sendo difratados a uma resolução máxima de 1,81 Å. A melhor solução para o grupo espacial, considerando eixos e planos de simetria, foi obtida para o grupo espacial I2 com a obtenção de um Rfactor de 38,6% e LLG de 19,9. A estrutura da Frutalina apresenta, em cada unidade monomérica, um β prisma simétrico, com três grupos de 4 folhas beta, cada. O sítio de reconhecimento a carboidratos, é semelhante ao da Jacalina, e envolve o N-terminal da cadeia α, demonstrando, na região, um enovelamento característico de lectinas da família Moraceae. O sítio de ligação da Frutalina consiste numa cavidade próxima ao N-terminal da cadeia α, formada por quatro resíduos-chave: Gly25, Tyr146, Trp147 e Asp149. As bases de interação com o ligante são relacionadas ao número de interações, que ocorrem entre a hidroxila do C1 e o resíduo Tyr146, a hidroxila do C3 e o resíduo Gly25, a hidroxila do C4 e os resíduos de Gly25 e Asp149 e a hidroxila do carbono 6 aos resíduos Tyr146, Trp147 e Asp149. Algumas hidroxilas da α-D-Galactose também utilizam de interações com moléculas de água estruturais, para buscar estabilidade no sítio de reconhecimento a carboidratos. O grande número de interações corrobora com a grande afinidade que a Frutalina têm a galactose e à sua grande capacidade de aglutinação, além de proporcionar uma análise das dimensões da lectina em relação ao ligante, onde se visualiza que o sitio de ligação é muito maior que o açúcar, o que pode justificar a preferência que a Frutalina costuma apresentar por glicoconjugados de maior massa molecular, proporcionando maior encaixe, e maior número de interações químicas entre um glicoconjugado maior.

ARAUJO, João Ronielly Campelo. Efeito antidepressivo-símile da frutalina, lectina α-d-galactose ligante, isolada de sementes de Artocarpus incisa L., em camundongos. 2016. 79 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2016. / Submitted by Anderson Silva Pereira (anderson.pereiraaa@gmail.com) on 2017-04-03T18:22:06Z No. of bitstreams: 1 2016_dis_jrcaraújo.pdf: 2086872 bytes, checksum: 3373789680d8de097182e323441225d7 (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2017-04-04T22:36:31Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_dis_jrcaraújo.pdf: 2086872 bytes, checksum: 3373789680d8de097182e323441225d7 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-04T22:36:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_dis_jrcaraújo.pdf: 2086872 bytes, checksum: 3373789680d8de097182e323441225d7 (MD5) Previous issue date: 2016 / Frutalin (FTL), an α-D-galactose-binding lectin isolated from breadfruit seeds (Artocarpus incisa L.), has a range biological activities, but has not been conclusively shown to act on CNS disorders. In this study we evaluated the effect of FTL on mouse behavior. Mice (n=6/group) were treated with FTL (0.25; 0.5 or 1 mg/kg; i.p.) or vehicle (NaCl 0.9 %;10 mL/kg; i.p.) and submitted to hole-board (HBT), elevated plus maze (PMT), open field (OFT), tail suspension (TST) and forced swimming (FST) tests. In a second set of experiments, yohimbine (1 mg/kg), ketamine (0.1 mg/kg), L-NAME (10 mg/kg) or methylene blue (10 mg/kg) were administered (i.p.) 30 min before FTL (0.5 mg/kg). In order to evaluate the subchronic effect of FTL, animals were injected with FTL (0.5 mg/kg) or vehicle for 7 days and submitted to FST on the first and last day of treatment. A molecular docking was conducted on the NOS enzyme and NMDA receptor. No changes were observed in HBT and OFT results. The smallest dose of FTL (0.25 mg/kg) was associated with an increase in the number of entries into closed arms in PMT (p<0.05). FTL reduced immobility in TST (0.25 and 0.5 mg/kg; p<0.05) and FST (0.25 mg/kg; p<0.05 and 0.5 mg/kg; p<0.01). In FST, the effect of FTL was dependent on carbohydrate interaction and protein structure integrity and it was reduced by ketamine (NMDA antagonist), L-NAME (non-selective NOS inhibitor) and methylene blue (soluble guanylyl cyclase inhibitor). The antidepressant-like effect remained after subchronic treatment. Matching the results of the experiment in vivo, the docking study indicated an interaction between FTL and NOS enzyme and NMDA receptor. In conclusion, FTL was found to have an antidepressant-like effect mediated by the NMDA receptor/NO/cGMP pathway. / Frutalina (FTL), uma lectina α-D-galactose ligante, obtida de sementes de Artocarpus incisa L., tem apresentado várias atividades biológicas, como ação na modulação de alvos moleculares e reversão de neurotoxicidade in vitro, porém, há pouca evidência de seu efeito sobre doenças no Sistema Nervoso Central (SNC). Diante disto, este estudo avaliou os efeitos neurocomportamentais da FTL em camundongos. Os camundongos (n = 6 / grupo) foram tratados com FTL (0,25; 0,5 ou 1 mg/kg; i.p.) ou Veículo (NaCl 0,9 % 10 mL/kg; i.p.; Controle) e submetidos aos testes da placa perfurada, labirinto em cruz elevado, campo aberto, suspensão pela cauda ou natação forçada. Num segundo conjunto de experimentos, a ioimbina (1 mg/kg), cetamina (0,1 mg/kg), L-NAME (10 mg/kg) ou azul de metileno (10 mg/kg) foram administrados (i.p.) 15 min antes da FTL (0,5 mg/kg) e os animais foram submetidos ao teste de natação forçada. Verificou-se também se o efeito de FTL no teste de natação forçada era dependente da integridade estrutural e capacidade de interação a carboidratos. A fim de avaliar o efeito subcrônico da FTL, os camundongos receberam FTL (0,5 mg/kg) ou veículo durante 7 dias e submetidos ao teste de natação forçada no primeiro e último dia de tratamento. Foi realizado docking molecular da FTL com NOS e receptor NMDA. Os resultados mostraram que não houve alterações neurocomportamentais dos camundongos nos testes de placa perfurada e campo aberto. FTL na dose mais baixa (0,25 mg/kg) aumentou o número de entradas nos braços fechados no teste do labirinto em cruz elevado, permitindo sugerir um possível efeito do tipo ansiogênico. FTL reduziu o tempo de imobilidade nos testes de suspensão pela cauda (0,25 e 0,5 mg/kg; p <0,05) e natação forçada (0,25 mg/kg, p <0,05 e 0,5 mg/kg; p <0,01) apresentando um efeito antidepressivo-símile. A redução da imobilidade provocada pela FTL foi prevenida pela Cetamina (antagonista de receptores NMDA), L-NAME (inibidor não-seletivo da NOS) e azul de metileno (inibidor da cGMP), mas não pela Ioimbina (antagonista α2-adrenérgico). A desnaturação da FTL, bem como a sua associação à galactose, também preveniu o efeito antidepressivo-símile da lectina. O efeito antidepressivo-símile da FTL permaneceu o mesmo após tratamento subcrônico (7 dias) e não houve alteração no peso dos animais. Corroborando com os resultados in vivo, os estudos de docking molecular demonstraram que a FTL interage com a enzima NOS e receptor NMDA. Nossos resultados demonstraram que a FTL possui efeito antidepressivo-símile mediado por receptores NMDA e via L-Arginina/NO/cGMP, além de ser dependente de sua integridade estrutural e capacidade de ligação a α-D-galactose.

CoordenaÃÃo de AperfeÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / As lectinas sÃo proteÃnas que contÃm pelo menos um domÃnio nÃo catalÃtico que lhes permite reconhecer seletivamente e se ligar de uma forma reversÃvel a glicanos especÃficos. A Frutalina à uma lectina obtida a partir das sementes de Artocarpus incisa, conhecida popularmente como fruta-pÃo. O isolamento foi realizado por cromatografia de afinidade em coluna de Agarose-D-Galactose e sua caracterizaÃÃo demonstrou que a Frutalina à uma glicoproteÃna, principalmente &#945;-D-galactose ligante, mas que tambÃm reconhece &#945;-D-Manose. Possui 2,1% de carboidratos e apresenta, em seu perfil de SDS-PAGE, duas bandas protÃicas com massas moleculares aparentes de 12 e 15 kDa, sendo uma proteÃna oligomÃrica, encontrando-se como tetrÃmero apenas em pH alcalino, com massa molecular aparente de 60 kDa. Massas diversas em torno de 16 kDa foram observadas nos espectros deconvoluÃdos em espectrometria de massas, o que corrobora a presenÃa de isoformas. Este trabalho mostra a cristalizaÃÃo e anÃlises dos dados obtidos por difraÃÃo de raios-x para determinaÃÃo da estrutura tridimensional desta lectina, e para isso foram realizados ensaios de cristalizaÃÃo da Frutalina isolada a partir das sementes maduras, na presenÃa do ligante (&#945;-D-galactose) e na sua forma apo (sem ligantes). Os cristais de Frutalina cresceram principalmente em poÃos de pH 8,5 contendo PEG como precipitante e etileno-glicol e os melhores cristais apareceram apÃs uma semana de maturaÃÃo, sendo difratados a uma resoluÃÃo mÃxima de 1,81 Ã. A melhor soluÃÃo para o grupo espacial, considerando eixos e planos de simetria, foi obtida para o grupo espacial I2 com a obtenÃÃo de um Rfactor de 38,6% e LLG de 19,9. A estrutura da Frutalina apresenta, em cada unidade monomÃrica, um &#946; prisma simÃtrico, com trÃs grupos de 4 folhas beta, cada. O sÃtio de reconhecimento a carboidratos, à semelhante ao da Jacalina, e envolve o N-terminal da cadeia &#945;, demonstrando, na regiÃo, um enovelamento caracterÃstico de lectinas da famÃlia Moraceae. O sÃtio de ligaÃÃo da Frutalina consiste numa cavidade prÃxima ao N-terminal da cadeia &#945;, formada por quatro resÃduos-chave: Gly25, Tyr146, Trp147 e Asp149. As bases de interaÃÃo com o ligante sÃo relacionadas ao nÃmero de interaÃÃes, que ocorrem entre a hidroxila do C1 e o resÃduo Tyr146, a hidroxila do C3 e o resÃduo Gly25, a hidroxila do C4 e os resÃduos de Gly25 e Asp149 e a hidroxila do carbono 6 aos resÃduos Tyr146, Trp147 e Asp149. Algumas hidroxilas da &#945;-D-Galactose tambÃm utilizam de interaÃÃes com molÃculas de Ãgua estruturais, para buscar estabilidade no sÃtio de reconhecimento a carboidratos. O grande nÃmero de interaÃÃes corrobora com a grande afinidade que a Frutalina tÃm a galactose e à sua grande capacidade de aglutinaÃÃo, alÃm de proporcionar uma anÃlise das dimensÃes da lectina em relaÃÃo ao ligante, onde se visualiza que o sitio de ligaÃÃo à muito maior que o aÃÃcar, o que pode justificar a preferÃncia que a Frutalina costuma apresentar por glicoconjugados de maior massa molecular, proporcionando maior encaixe, e maior nÃmero de interaÃÃes quÃmicas entre um glicoconjugado maior. / Lectins are proteins containing at least one non-catalytic domain that allows them to recognize and selectively bind a reversible specific glycans. Frutalin is a lectin obtained from Artocarpus incisa seeds, popularly known as breadfruit. The isolation was performed by affinity chromatography on column of Agarose-D-Galactose and their characterization shows that frutalin is a glycoprotein mainly &#945;-D-galactose ligand, because it also recognizes epimers of &#945;-D-mannose. It has 2.1% of carbohydrates and presents, in its SDS-PAGE profile, two protein bands with apparent molecular masses of 12 and 15 kDa, with an oligomeric protein, lying as tetramer only in alkaline pH, with apparent molecular mass of 60 kDa. Several masses around 16 kDa was observed in deconvoluted spectra in Mass Spectrometry, which confirms the presence of isoforms. This work shows the crystallization and analysis of data obtained by x-ray diffraction to determine the three-dimensional structure of this lectin, and that were performed crystallization trials of frutalin isolated from the mature seeds in the presence of ligand (D-galactose) and the way apo (no binders). The frutalin crystals have grown primarily in wells of pH 8.5 containing PEG as precipitant and ethylene glycol and the best crystals appeared after one week of maturation being diffracted to a maximum resolution of 1.81 Ã. The best solution, for the space group, considering axes and planes of symmetry, has been obtained for the I2 space group, with the construction of an Rfactor of 38.6% and LLG = 19.9. The structure of frutalin presents in each monomeric unit, a symmetrical &#946;-prism with three groups of four beta strands each. The carbohydrate recognition site is similar to the jacalin, and involves the N-terminus of the &#945; chain, showing, in the region, a characteristic folding of the Moraceae family. The frutalin binding site cavity is near the N-terminus of the &#945; chain formed by four key residues Gly25, Tyr146, Asp149, and Trp147. The bases of interaction with the binder are related to the number of interactions occurring between the C1 hydroxyl and Tyr146 residue, C3 hydroxyl and Gly25 residue, C4 hydroxyl and Asp149/Gly25 residues, and C6 hydroxyl and Tyr146/Trp147/Asp149 residues. Some hydroxyls of &#945;-D-galactose also utilize interactions called structural waters, to seek stability in the carbohydrate recognition site. The large number of interactions agrees with the high affinity that frutalin has with galactose and its great capacity for agglutination, in addition to providing an analysis of the dimensions of the lectin in relation to the binder, which may justify the preference that frutalin tends to present by higher molecular weight glycoconjugates, and that happens due to the most fitting, and the greatest number of chemical interactions among a larger glycoconjugate.