Iron/Manganese superoxide dismutases (Fe/Mn-SODs) are metalloenzymes with highly conserved protein folds, active sites, and dimer interfaces. They protect cells against oxidative stress by catalyzing the conversion of the cytotoxic free radical superoxide to molecular oxygen and hydrogen peroxide. The majority are highly specific for the type of metal (iron or manganese) present within the active site. However, there are many key aspects of metal specificity and catalytic activity that lack a structural explanation. Computational analyses suggested that several residues are important for fine-tuning the redox potential of the metal in the active site and thereby the catalytic activity. The main objective of this thesis is to evaluate the influence of several point mutations (M27V, G73A, H75I, L80F, D150G and Q172D) and one double mutation (Q149G+G74Q)) in terms of metal specificity, catalytic activity and three-dimensional structure using the superoxide dismutase from Trichoderma reesei (TrSOD) as a model system. The corresponding genes were cloned, expressed and the resulting proteins characterized by X-ray crystallography, electron paramagnetic resonance (EPR), atomic absorption spectroscopy (AAS), dynamic light scattering (DLS) and their enzymatic activity determined. The native protein was shown to be able to use either Mn or Fe (5000 units/mg and 500 units/mg, respectively) for catalysis suggesting it to be properly classified as cambialistic. Structures for native TrSOD and the Mn-G73A, Fe-H75I, Mn-L80F, Fe-D150G and Fe-M27V, Mn-M27V mutants were solved at 2.3 Å, 2.0 Å, 2.03 Å, 2.0 Å, 1.85 Å, 1.4 Å and 1.6 Å resolution, respectively. The H75I, L80F and M27V mutations are easily accommodated by small local structural changes to the three-dimensional structure. On the other hand, the G73A mutation destabilize one of the dimer-dimer interfaces of the tetramer making it possible for two distorted tetramers to interact forming an octamer. This enzyme also lost all catalytic activity probably due to resulting exposure of the active site consistent with the observation of a sixth ligand (solvent molecule) bound to the metal in one subunit. The D150G mutant remained tetrameric but with reduced symmetry related to the rearrangement of the last helix (H9). Our results show that a large impact on activity and oligomerization of TrSOD can be generated by a single amino acids substitution in some cases and provide some insights into our understanding of the structural details associated with the metal ion specificity and oligomerization in superoxide dismutases. / Superóxido dismutases de ferro e manganês (Fe/Mn-SODs) são metaloenzimas com enovelamentos, sítios ativos e interfaces diméricas altamente conservados. Estas enzimas protegem as células contra o estresse oxidativo pela conversão do ânion superóxido em oxigênio molecular e peróxido de hidrogênio. A maioria são altamente específicas pelo tipo de metal (ferro ou manganês) presente no sítio ativo. Entretanto, existem vários aspectos críticos sobre a especificidade pelo metal e da atividade catalítica que ainda não foram explicados em termos estruturais. Análises computacionais sugerem que vários resíduos são importantes para o ajuste do potencial redox do metal no sitio ativo e, portanto, a atividade catalítica. O objetivo principal deste trabalho é avaliar a influência de mutações simples (TrSOD) (M27V, G73A, H75I, L80F, D150G e Q172D) e dupla (Q149G + G74Q) em superóxido dismutases de Trichoderma reesei em termos de especificidade pelo metal, atividade catalítica e estrutura. Os genes correspondentes foram clonados, expressos e as proteínas resultantes caracterizadas por cristalografia de raios-X, ressonância paramagnética electrónica (EPR), espectroscopia de absorção atómica (AAS), dispersão de luz dinâmica (DLS), e a atividade enzimática foi determinada. Foi mostrado que a proteína nativa é capaz de usar tanto Mn quanto Fe (5000units/mg e 500units/mg, respectivamente) para catálise sugerindo que deveria ser a classificada como enzima cambialistica. Estruturas da enzima nativa e mutantes (Mn-G73A, Fe-H75I, Mn-L80F, Fe-D150G, Fe-M27V e Mn-M27V) foram resolvidas a resoluções de 2.3 Å, 2.0 Å, 2.03 Å, 2.0 Å, 1.85 Å, 1.4 Å e 1.6 Å respetivamente. As mutações H75I, L80F e M27V são acomodadas facilmente por reajustes locais na estrutura tridimensional. Por outro lado, a mutação G73A desestabiliza uma das interfaces dímero-dímero do tetrâmero levando à formação de um octâmero feito por dois tetrâmeros distorcidos. Esta enzima também perde atividade provavelmente devido a um aumento na acessibilidade do sítio ativo, coerente com a observação de um sexto ligante (molécula de solvente) coordenando o metal em uma das subunidades. O mutante D150G continuou tetramérica mas com simetria reduzida relacionado com o rearranjo da última hélice (H9). Estes resultados mostram que, em alguns casos, uma mutação simples pode ter um impacto significativo no estado oligomérico e atividade catalítica da proteína TrSOD e fornece conhecimentos para a nossa compreensão dos detalhes estruturais associados com a especificidade de íons metálicos e oligomerização em superóxido dismutases.

O objetivo do estudo foi avaliar a inclusão de enzimas exógenas nas rações sobre o desempenho, rendimento de carcaça e cortes, digestibilidade de nutrientes, peso relativo do pâncreas, atividade endógena de enzimas e expressão de RNA mensageiro de enzimas pancreáticas de frangos de corte alimentados com dietas contendo enzimas exógenas, no período de 1 a 42 dias de idade. Para tanto, foram conduzidos dois experimentos, o primeiro com a utilização da protease e o segundo, com o uso da α-amilase exógenas. No primeiro experimento, foram utilizados quatro tratamentos com níveis crescentes de inclusão da protease monocomponente à dieta: 0,50%, 100%, 150% da inclusão recomendada pelo fornecedor. As formulações foram a base de milho e farelo de soja e formuladas de acordo com as recomendações nutricionais sugeridas por Rostagno et al. (2011). Não foram observados efeitos significativos da adição da enzima sobre os parâmetros de desempenho, rendimento de carcaça e de cortes, digestibilidade de nutrientes e sobre o peso relativo do pâncreas de frangos de corte. O uso da protease exógenas não alterou (P>0,05) a atividade da tripsina pancreática nas idades avaliadas (21 e 42 dias), porém observou-se o aumento (P<0,05) da expressão de RNA mensageiro da tripsina pancreática em aves aos 42 dias de idade, em função do aumento da inclusão da enzima na dieta. A produção da tripsina pancreática foi maior (P<0,05) nas aves aos 42 dias do que nas aves jovens (21 dias de idade). No segundo experimento, foram utilizados quatro tratamentos com o uso da -amilase exógena, sendo o controle sem o uso de enzimas, 2 tratamentos com a inclusão de α-amilase (50% e 100% da dosagem recomendada pelo fornecedor) e um tratamento com a inclusão da amilase exógena (100% da dosagem recomendada) combinada com o uso de 500 FTU de fitase por quilograma de ração. As formulações foram a base de milho e farelo de soja e formuladas de acordo com as recomendações nutricionais sugeridas por Rostagno et al. (2011). Não foram observados efeitos significativos da adição da α-amilase sobre os parâmetros de desempenho, rendimento de carcaça e de cortes, digestibilidade de nutrientes e sobre o peso relativo do pâncreas de frangos de corte. A suplementação de -amilase nas rações aumentou (P<0,05) a atividade da amilase pancreática e reduziu (P<0,05) a atividade da tripsina endógena em frangos na fase inicial (1 a 21 dias de idade). A expressão de RNA mensageiro da amilase e tripsina pancreática não foram alteradas com o uso das enzimas nas rações. Com o avançar da idade, observou-se o aumento significativo da atividade e da expressão do RNA mensageiro da amilase pancreática, sendo maior aos 42 dias do que aos 21 dias de idade da ave. / The objective of the study was evaluate the inclusion of exogenous enzymes on performance, carcass yield and commercial cuts, nutrient digestibility, relative weight of pancreas, endogenous activity of enzymes and mRNA expression of pancreatic enzymes of broilers fed with diets containing exogenous enzymes, from 1 to 42 days of age. To this end, two experiments were conducted, the first with the use of protease and the second, with the use of exogenous α-amylase. In the first experiment, four treatments with increasing levels of inclusion of single-component protease were used in the diet: 0,50%, 100%, 150% of the inclusion recommended by the supplier. The formulations were based on corn and soybean meal and formulated according to the nutritional recommendations suggested by Rostagno et al. (2011). Significant effects were not observed on the addition of enzyme on performance, carcass yield and commercial cuts, digestibility of nutrients and on the relative weight of the pancreas of broilers. The use of exogenous protease did not change (P>0.05) the activity of pancreatic trypsin in evaluated ages (21 and 42 days), however the increase was observed (P<0.05) in mRNA expression of pancreatic trypsin in 42-days-old birds, due to the increased inclusion of the enzyme in the diet. Pancreatic trypsin production was higher (P<0.05) in 42-days birds than the young birds (21 days of age). In the second experiment, four treatments with the use of exogenous α-amylase were used, being the control without the use of enzymes, 2 treatments with the inclusion of α-amylase (50% and 100% of the dosage recommended by the supplier) and a treatment with the inclusion of exogenous amylase (100% of recommended dosage) combined with the use of 500 FTU of phytase per kilogram of feed. The formulations were based on corn and soybean meal and formulated according to the nutritional recommendations suggested by Rostagno et al. (2011). Significant effects were not observed on the addition of -amylase on performance, carcass yield and commercial cuts, digestibility of nutrients and on the relative weight of the pancreas of broilers. The -amylase supplementation in feed increased (P<0.05) the activity of amylase and reduced (P<0.05) the activity of endogenous trypsin in initial phase chickens (1 to 21dias). mRNA expression of amylase and pancreatic trypsin have not changed with the use of enzymes in feed. As the age increased, there was a significant increase in activity and expression of mRNA of pancreatic amylase, being higher at 42 days than at 21 days of age of the bird.

Este trabalho foi realizado com o objetivo de avaliar o efeito de frações (em hexano, diclorometano, acetato de etila e hidroalcoólica) de extratos etanólicos de Trichilia pallida Swartz, Trichilia pallens C.DC. e Toona ciliata M. Roemer sobre Spodoptera frugiperda (J. E. Smith), e isolar, identificar e avaliar o efeito dos compostos dessas três meliáceas sobre o desenvolvimento e o metabolismo do inseto, com ênfase para o limonoide cedrelona. As frações causaram baixa mortalidade, mas houve grande redução de peso das lagartas com as frações em diclorometano de folhas e de ramos de T. pallida, de ramos de T. pallens e de folhas e de frutos de T. ciliata, além de maior duração da fase larval, redução do peso de pupas e alteração dos índices nutricionais, sendo a fração de ramos de T. pallida a de maior efeito tóxico e com fagodeterrência secundária, e a fração de folhas de T. ciliata sem efeito tóxico, mas apresentando fagodeterrência possivelmente primária. A partir da fração em diclorometano de frutos de T. ciliata obteve-se um triglicerídeo; da fração em acetato de etila de ramos de T. ciliata obteve-se o flavonoide (+/-)-catequina; da fração em hexano de folhas de T. pallida obteve-se o triterpeno damaradienol e da fração em diclorometano de ramos de T. pallens obteve-se a cumarina escopoletina. O triglicerídeo e a escopoletina causaram pequena mortalidade e redução de peso das lagartas por ingestão, enquanto a catequina causou apenas redução de peso. Por contato, a escopoletina também afetou a sobrevivência. O limonoide cedrelona, isolado do extrato bruto em hexano de caules de T. ciliata, apresentou o maior efeito, tanto por ingestão quanto por contato. Por ingestão, os valores estimados de CL50, CL90 e CE50 para a cedrelona aplicada sobre a dieta foram 365,33, 659,62 e 95,02 ppm, respectivamente, e após incorporação na dieta, os valores foram 119,05, 491,14 e 45,13 ppm, respectivamente. A cedrelona causou fagodeterrência em teste com chance de escolha e redução no consumo foliar no teste sem chance de escolha. A ingestão de cedrelona causou menor peso de lagartas e de pupas, aumento da duração da fase larval e da mortalidade de modo dose dependente, com efeitos subletais observados a partir de 24 ppm. Lagartas de quarto ínstar que ingeriram dieta contendo cedrelona a 300 ppm tiveram redução na eficiência de conversão do alimento ingerido (ECI) e digerido (ECD) e na taxa de crescimento relativo (RGR), enquanto o custo metabólico (MC), a taxa metabólica relativa (RMR) e a digestibilidade aproximada (AD) aumentaram, e a taxa de consumo relativo (RCR) não foi alterada, indicando efeitos tóxicos pós-ingestão e efeito fagodeterrente secundário, com a maior parte do alimento assimilado sendo utilizada no metabolismo. A atividade de proteases no mesêntero das lagartas que ingeriram dieta contendo cedrelona foi reduzida, assim como a quantidade de grupos heme, relacionados às monoxigenases do citocromo P450, enquanto a atividade de glutationa-S-transferases não foi alterada. A atividade de acetilcolinesterase no extrato enzimático de lagartas inteiras aumentou. A bioatividade da cedrelona e os possíveis modos de ação são discutidos. / This work was carried out to evaluate the effect of fractions (in hexane, dichloromethane, ethyl acetate and hydroalcoholic) of ethanolic extracts of Trichilia pallida Swartz, Trichilia pallens C.DC. and Toona ciliata M. Roemer to Spodoptera frugiperda (J.E. Smith ), and to isolate, identify and evaluate the effect of the compounds from the three Meliaceae on the larvae development and metabolism, with emphasis on the cedrelone limonoid. The fractions caused low mortality, but there was a great reduction in weight of larvae with dichloromethane leaves and stems fractions of T. pallida, stems of T. pallens and leaves and fruits of T. ciliata, in addition to longer duration of the larval stage, pupae weight reduction and changes on nutritional indices. The fraction of T. pallida stems caused the highest toxic effects and secondary phagodeterence, and the fraction of T. ciliata leaves showed probably primary phagodeterrence, but no toxic effect. From the dichloromethane fraction of T. ciliata fruits was obtained a triglyceride (unidentified), from the ethyl acetate fraction of T. ciliata stems was obtained the flavonoid (+/-)-catechin, from the hexane fraction of T. pallida leaves was obtained the triterpene dammaradienol and from the dichloromethane fraction of T. pallens stems was obtained the coumarin scopoletin. Scopoletin and triglyceride caused low mortality and larval weight reduction after ingestion, catechin caused only larval weight reduction. Scopoletin either affect survival by contact. The limonoid cedrelone, isolated from the crude hexane extract of stems of T. ciliata, was the most effective compound, either by ingestion or by contact. After ingestion, the estimated LC50, LC90 and EC50 values for cedrelone applied onto the diet were 365.33, 659.62 and 95,02 ppm, respectively, and after diet incorporation, the values were119.05, 491.14 and 45.13 ppm, respectively. Cedrelone caused feeding deterrence on choice test and reduced leaf consumption in the no-choice test. Cedrelone intake caused low weight gain by larvae and pupae, increased mortality and duration of larval stage in a dose-dependent manner, with sublethal effects observed at 24 ppm. Fourth instar larvae that ingested diet containing 300 ppm cedrelone showed reduced efficiency conversion of ingested (ECI) and digested food (ECD), reduced relative growth rate (RGR), increased metabolic cost (MC), relative metabolic rate (RMR) and approximatte digestibility (AD), but no change in relative consumption rate (RCR), suggesting toxic effects post ingestion and secondary phagodeterrence, in which most of the assimilated food was used in metabolism. The protease activity in the midgut of the larvae that ingested diet containing 300 ppm of cedrelone was reduced, as well the amount of heme groups related to cytochrome P450 monoxygenases in the midgut, but there was no change in the glutathione S-transferases activity. , There was an increase of acetylcholinesterase activity in the larvae bodies. Cedrelone bioactivity and the possible modes of action are discussed.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2018-04-25T12:12:13Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1655662 bytes, checksum: c2460b038388046dbed898dded1a7531 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-25T12:12:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1655662 bytes, checksum: c2460b038388046dbed898dded1a7531 (MD5) Previous issue date: 2018-02-05 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Fungos nematófagos são controladores naturais de nematoides parasitos de plantas e animais. São amplamente usados no controle biológico de nematoides parasitos gastrintestinais (NPG) de ruminantes por reduzir formas de vida livre nas pastagens. O processo de captura de nematoides segue uma ordem de eventos que envolve atração, adesão, penetração e degradação da cutícula do nematoide. As fases de penetração e degradação, envolvem a produção e secreção de enzimas extracelulares capazes de hidrolisar a cutícula dos nematoides, causando sua morte. Proteases de Arthrobotrys cladodes (CG719) foram purificadas por cromatografia de troca aniônica (Mono Q) e gel filtração em coluna Protein-Pak em sistema HPLC. A atividade nematicida das proteases foi testada em larvas infectantes (L 3 ) de nematoides parasitos gastrintestinais de ruminantes. O efeito sobre a bainha e cutícula das larvas foi observado por microscopia eletrônica de varredura e transmissão. As proteases purificadas chamadas de proteases de Arthrobotrys cladodes I (AcPI) e proteases de Arthrobotrys cladodes II (AcPII), têm massa molecular estimada de 56 e 39 kDa, respectivamente. A atividade enzimática dessas proteases foi maior em pH neutro a alcalino (7-8) e em temperaturas de 55 a 60°C. Ambas foram inativadas pelo inibidor fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF) sugerindo pertencerem ao grupo das serina proteases. As proteases apresentaram maior atividade enzimática na presença do íon metálico Ca +2 . A fração de protease, purificada por cromatografia de troca aniônica, apresentou atividade larvicida provocando a morte de 53% das L 3 de NPG após 24 h de exposição. As AcPI e AcPII causaram mortalidade de 31 e 27% das L 3 , respectivamente, após 24 h, sugerindo ação aditiva na degradação da cutícula dos nematoides. Na microscopia eletrônica de varredura e transmissão, foram observadas alterações morfológicas, descamações, danos na camada basal, epicutícula, “annulis”, “furrows”, “alae”, hipoderme, e musculatura. Em algumas regiões, a camada cortical foi inteiramente destruída. Lesões provocaram extravasamento de líquido intracelular e perda de tecido. Proteases extracelulares secretadas por A. cladodes foram eficientes na penetração e degradação da cutícula de nematoides. Estas enzimas romperam a integridade física e fisiológica da dupla cutícula de L 3 de NPG. Isto pode permitir o desenvolvimento de fármacos para agir, diretamente, sobre helmintos ou, de forma sinérgica, com medicamentos comerciais. / Nematophagous fungi are natural enemies of parasitic nematodes of plants and animals. They are widely used in biological control of gastrointestinal nematodes (GIN) of ruminants by reducing free-living forms in pastures. The nematode capture process follows an order of events that involves attraction, adhesion, penetration and degradation of nematode cuticle. The phases of penetration and degradation, involve the production and secretion of extracellular enzymes capable of hydrolyzing the cuticle of the nematodes, causing their death. Proteases from Arthrobotrys cladodes (CG719) were purified by anion exchange chromatography (Mono Q) and gel filtration on a Protein-Pak column by HPLC system. The nematicidal activity of the proteases was tested in infective larvae (L3) of gastrointestinal parasitic nematodes of ruminants. The effect on the sheath and cuticle of the larvae were observed by scanning and transmission electron microscopy. The purified proteases called Proteases from Arthrobotrys cladodes I (AcPI) and Proteases from Arthrobotrys cladodes II (AcPII), have an estimated molecular mass of 56 and 39 kDa, respectively. The enzymatic activity of these proteases was higher at neutral to alkaline (7-8) pH and at temperatures of 55 to 60°C. Both were inactivated by the phenylmethylsulfonyl fluoride inhibitor (PMSF) suggesting that they belong to the serine proteases group. The proteases showed higher enzymatic activity in the presence of the Ca +2 metal ion. The protease fraction, purified by anion exchange chromatography, showed larvicidal activity causing the death of 53% of L 3 from GINs after 24 h of exposure. AcPI and AcPII caused mortality of 31 and 27% of L 3 , respectively, after 24 h, suggesting additive action in the degradation of the nematode cuticle. In scanning and transmission electron microscopy morphological changes, peeling, basal layer, epicuticle, annulis, furrows, alae, hypodermis, and musculature were observed. In some regions the cortical layer was entirely destroyed. Lesions caused extravasation of intracellular fluid and loss of tissue. Extracellular proteases secreted by A. cladodes were efficient in penetration and degradation of the nematode cuticle. These enzymes disrupted the physical and physiological integrity L 3 of GIN double cuticle. This may allow the development of drugs to act directly on helminths or, synergistically, with commercial drugs.

Pythium insidiosum, classificado no Reino Stramenipila e Classe Oomycetes, é o agente etiológico da pitiose, uma doença diagnosticada principalmente em equinos, caninos e humanos. A secreção de enzimas por micro-organismos é considerada um fator importante na invasão tecidual. O presente estudo teve como objetivo analisar a atividade enzimática de isolados de P. insidiosum obtidos de lesões equinas (n=13), coelhos infectados experimentalmente (n=2) e uma amostra padrão (ATCC). Para isso, utilizou-se o kit comercial API ZYM. Zoósporos foram cultivados em caldo RPMI 1640 por 24h a 37 oC. Após esse período, a presença de hifas foi observada, as quais foram separadas e 65μl do líquido restante foram inoculados em cada um dos 20 poços (um controle e 19 com substratos específicos para cada enzima) do kit. As galerias foram então incubadas por 4 h a 37 oC. Os resultados foram obtidos através da leitura visual das reações. As análises foram feitas em triplicata e submetidas à análise de variância utilizando um nível de significância de 5%. Houve uma variação intraespecífica na atividade enzimática entre os isolados, sendo que enzimas dos grupos fosfohidrolases e éster hidrolases foram as mais prevalentes. Esses dados demonstram a capacidade de P. insidiosum em secretar enzimas que degradam substratos presentes em animais e em plantas, bem como a variabilidade enzimática entre os isolados. / Pythium insidiosum is classified in the kingdom Stramenipila, class Oomycetes. It causes pythiosis, a disease mainly diagnosed in horses, dogs, and humans. This study aimed at analyzing the enzymatic activity of P. insidiosum isolates obtained from equine lesions (n=13), experimentally infected rabbits (n=2) and a standard strain (ATCC 58637). To address this issue, the API ZYM commercial kit was used. Zoospores were cultivated in RPMI 1640 broth for 24 h at 37oC. After this period, the presence of hyphae was observed and they were carefully separated from the liquid phase. Then, 65 μl of this liquid were inoculated in each of the 20 microwells (one control, 19 containing specific substrates for each enzyme) of the API ZYM kit. The strips were incubated for 4h at 37oC. Results were obtained by visual observation of the reactions. The tests were carried out in triplicate and submitted to an analysis of variance using a significance level of 5%. An intraspecific variation among the enzymatic activities was observed among the isolates, where the group of phosphohydrolases and ester hydrolases were conspicuous among most of the isolates. Data here obtained highlighted the capacity of P. insidiosum in secreting enzymes capable of degrading substrates present in animals and plants, besides the enzymatic variability among the isolates.

Devido à necessidade de se conhecer os impactos que as diversas atividades antropogênicas exercem sobre os ecossistemas torna-se relevante o estudo dos organismos aquáticos perante os resíduos tóxicos resultantes, com o objetivo de facilitar a identificação de áreas poluiídas ou contaminadas e estudos de meios atingidos por estes agentes poluentes. Estudo da microalga em contato com o fenol em concentrações conhecidas, compreende a determinação dos efeitos tóxicos e geração de metabólitos, caracterizando uma possível utilização deste microorganismo como bioindicador para contaminações do poluente. Determinou-se as concentrações de fenol capazes de em 24 horas inibirem o crescimento das células de L. polyedrum em 20 e 50% (IC 20 e IC 50) respectivamente 40 µmol.L-1 e 120 µmol.L-1. Identificou-se a necessidade de padronização das variáveis na execução dos ensaios dose-resposta com algas, permitindo construir protocolos que auxiliariam a obtenção de legislações que assegurem os limites de compostos tóxicos aos organismos costeiros. Calculou-se que a microalga L. polyedrum possui uma taxa de biodegradação do fenol por célula na média de aproximadamente (0,02 µmol.h-1.cel-1), capaz de biotransformar 120 µmol.L-1 de fenol em um período de 16 horas. Vias de biotransformação do fenol na microalga L.polyedrum se dão pela conjugação com a glutationa, catalisada por glutationa S-transferase e pela via metabólica de fenol hidroxilase e catecol 2,3-dihidroxigenase. Identificou-se a geração do ácido 2-hidroximucônico semialdeído, 1,2-dihidroxibenzeno (Catecol) e ácido 2-oxo 4-pentenóico como metabólitos resultantes da exposição de L. polyedrum ao fenol. O composto orgânico fenol é capaz de induzir um estado de aumento na atividade antioxidante da microalga L. polyedrum, sendo as enzimas superóxido dismutase e catalase os melhores biomarcadores, por terem sua expressão até três vezes maior no grupo exposto. Determinou-se que a razão GSH/GSSG no grupo tratado com fenol é menor, devido ao aumento de 20 ng.mL-1 de GSSG, expressando o efeito oxidativo no sistema glutationa, que em condições normais possui os níveis de GSSG muito abaixo dos de GSH. A avaliação fotossintética sugeriu que o fenol interferiu relativamente na fotossíntese da microalga em um curto intervalo de tempo, demonstrando a promissora sensibilidade a este poluente presente no ambiente marinho. / Due necessity of knowing and understand the impacts of diverse anthropogenic activities exerted above ecosystems became relevant the study of aquatic organisms exposed to toxic waste, this can facilitate the identification of polluted or contaminated areas. Study of microalgae in contact with phenol at known concentrations, comprehended a determination of the toxic effects and generation metabolites of characterizing the possible use of the organism as a bioindicator to contamination of the pollutant. In this work it was determined in 24 hours those inhibitor phenol concentrations of cell growth of L.polyedrum on 20% and 50% (IC 20 and IC 50) respectively 40 µmol.L-1 and 120 µmol.L-1. Acknowledged need for standardization of variables in the implementation of dose-response tests with algae, allowing you to build protocols that would help to obtain laws that ensure the limits of toxic compounds to coastal organisms. It was assumed that the L. polyedrum microalgae has a biodegradation rate of phenol per cell on average of about (0,02 µmol.h-1.cel-1), capable of biotransformation 120 µmol.L-1 of phenol in a period of 16 hours. Biotransformation pathways of phenol in the microalgae L. polyedrum occur by conjugation with glutathione, catalyzed by glutathione S-transferase and the metabolic pathway of phenol hydroxylase and catechol 2,3-dihydroxygenase. We identified 2- hydroxy muconic semialdehyde acid, 1,2-dihydroxybenzene (catechol) and 2-oxo-4-pentenoic acid as metabolites resulting from exposure to phenol. The phenol is able to induce a high active antioxidant enzymes on L. polyhedron, and the enzymes superoxide dismutase and catalase the best biomarkers since were induced three times more in the exposed group. It was determined that the GSH / GSSG ratio in the group treated with phenol, GSSG has an increase of 20 ng.mL-1. Evaluation suggested that the phenol interfered on photosynthesis of microalgae in a short time, showing promising sensitivity to this pollutant in the marine environment.

Com a grande demanda por derivados da cana-de-açúcar no Brasil a expansão de área para produção, assim como o aumento da produtividade tem sido foco para áreas agrícolas na região centro-sul. Portanto áreas que anteriormente eram dedicadas a pastagem estão tornando-se cultivo de cana-de-açúcar. Essa mudança está ocorrendo com uma grande rapidez e por esse motivo preocupações com a sustentabilidade do solo estão sendo levantadas. O objetivo deste trabalho foi verificar como a atual mudança de uso da terra de pastagem para cultivo de canade- açúcar impacta atributos microbiológicos quantitativos e funcionais do solo em um transecto edafoclimático na região centro-sul do Brasil tendo a vegetação nativa como referência. Para isso foram feitas análises do carbono e nitrogênio da biomassa microbiana do solo segundo Vance, Brookes e Jenkinson (1987) e análises da atividade enzimática da β-glicosidase, fosfatase ácida e alcalina segundo Tabatabai (1994). Verifica-se a tendência de reduzir a fertilidade na pastagem em relação a mata nativa e posteriormente aumentar com o uso de fertilizantes na cana-de-açúcar. O estoque de C tem um menor valor na pastagem quando não manejada em Lat S 17º, diminui na sequencia de mudança dos sistemas de uso da terra em Lat S 21º, porém uma recuperação na mudança para cultivo de cana-de-açúcar e é maior em Lat S 23º quando a textura do solo é mais argilosa. Existe uma diminuição do estoque de CBM das matas nativas para as pastagens e um aumento nos cultivos de cana-de-açúcar em Lat S 17º e Lat S 21º. Em Lat S 23º a pastagem apresenta maior CBM do que os outros sistemas de uso da terra. Nos locais de estudo a menor relação CBM/C Total foi de 2,54% na mata nativa em Lat S 17º e a maior de 5,74% na pastagem de Lat S 23º. O N é um elemento muito sensível, em todos os atributos analisados a mudança de uso da terra causou uma grande diminuição, e a degradação do solo é o fator que causa o grande impacto nesses atributos. A textura argilosa do solo garante maior atividade enzimática, porém em cultivos de cana-de-açúcar a atividade diminui independente da classe textural. Os mesmos usos da terra em diferentes locais não podem ser analisados como repetições. Sendo assim pode-se concluir que nos casos analisados o impacto da mudança de uso da terra de pastagem para cultivo de cana-de-açúcar se manifestou de forma diferente em cada local, não permitindo uma generalização. / The great demand for derivatives of sugarcane in Brazil is the motive for the area expansion for production as well as the increase of productivity have been the focus of agricultural areas in the center-south region. So areas that were previously pastures have been changing for sugarcane cultivation. This change has occured with great speed and therefore concerns about the sustainability of soil have been raised. The aim of this study was to determine how the current change from pasture to sugarcane cultivation impacts quantitative and functional microbiological attributes of soil in a soil climatic zone in the central-south region of Brazil considering the native vegetation as reference. For it were made analysis of soil microbial biomass carbon and nitrogen according to Vance, Brookes and Jenkinson (1987) and analysis of enzymatic activity of β-glucosidase, acid and alkaline phosphatase according to Tabatabai (1994). There is a tendency to reduce fertility in pasture compared to native vegetation and then increase with the use of fertilizers in sugarcane cultivation. The stock of C has a lower value in the pasture when there is no fertilizers in Lat S 17º, decreases in the land use change in Lat S 21º, but there is a recovery in the switch over to sugarcane cultivation and it is the biggest in Lat S 23º when the soil texture is clayey. There is a decrease in the stock of CBM from native forests to pastures and an increase in sugarcane cultivation in Lat S 17º and Lat S 21º. In Lat S 23º the pasture has higher CBM stock than other land use systems. In the study sites the reason between CBM and C Total was 2.54% in the native vegetation in Lat S 17º and the highest 5.74% in the pasture of Lat S 23º. The N is a very sensitive element, in all attributes analyzed, the land use change caused a large decrease, and soil degradation is the factor that causes serious impact on those attributes. The clayey soil ensures greater enzymatic activity, but in sugarcane cultivation decreases the activity independent of the texture. The same land uses in different locations can\'t be analyzed as repetitions. Therefore in the cases analyzed the impact of the change from pasture to sugarcane cultivation was differently in each place, not allowing a generalization.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:54Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-05-25Bitstream added on 2014-06-13T19:03:38Z : No. of bitstreams: 1 garcia_mrl_dr_jabo.pdf: 770404 bytes, checksum: c5d7cc77256164ad2f734dd51d491a21 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Diversos estudos vêm buscando avaliar os diferentes impactos causados pelas várias formas de manejo do solo, procurando-se aliar a produção das culturas à preservação dos recursos naturais. O presente estudo objetivou avaliar a influência temporal (das estações do ano), do sistema de manejo do gado e das culturas nas características microbiológicas e químicas do solo em diferentes profundidades. O primeiro experimento foi conduzido no setor de bovinocultura da Estação Experimental da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinária, UNESP - Campus de Jaboticabal, localizada na região norte do Estado de São Paulo. Os sistemas de pastejo avaliados foram: pasto rotacionado, pasto contínuo e pasto controle (sem a presença de gado). As coletas das amostras de solo foram realizadas nas quatro estações do ano, no período de um ano (2005 – 2006). Cada amostra foi composta de 6 amostras simples, retiradas nas profundidades de 0 – 0,05, 0,05 – 0,10 e 0,10 – 0,20 m. O segundo experimento foi realizado nas fazendas Barracão e São João, no município de Guaíra, localizadas na região paulista da Alta Mogiana, Estado de São Paulo. Foram estudados quatro sistemas de manejo das culturas: plantio direto (PD), plantio direto integrado com pastagem (PD-I), cultivo convencional (CC) e Mata Natural (Mata). A coleta das amostras de solo foi feita somente na estação do verão, durante o período de janeiro e fevereiro do ano de 2006. Cada amostra foi composta de 10 amostras simples, retiradas nas profundidades de 0 – 0,10, 0,10 – 0,20 e 0,20 – 0,30 m. As variáveis microbiológicas, bioquímicas e químicas do solo avaliadas podem ser consideradas medidas sensíveis para determinar mudanças decorrentes dos efeitos das estações do ano, dos sistemas de manejo do gado e das culturas e da profundidade do solo. / Several, studies come searching evaluated the different impacts caused by some forms of management of soil, to try to get the production of the cultures to the preservation of the natural resources. The objective of this study was determine the influence of the seasonal, of the cattle management system and crop and the depth of the soil in the microbiological and chemical variable of the soil. The first experiment was lead in the sector of cattle breeding of the Experimental Station of the College of Agrarian Sciences and Veterinary medicine, UNESP - Campus of Jaboticabal, located in the north of São Paulo State. The evaluated systems of pasture were: rotation pasture, continuous pasture and controlled pasture. The collections of soil samples were carried in four-year seasons during the period of one year (2005 - 2006). Each sample was composed of 6 simple samples, withdrawals with hoe, in the depths of 0 – 0,05, 0,05 - 0,10 and 0,10 - 0,20 m. The second experiment was carried in the Barracão and São João farms, in the Guaíra Cite, located in the region of the Alta Mogiana, in São Paulo State. In view of evaluation of the effect of the management system crop, four systems were studied: no-tillage (NT), pasture and crop integrated systems (PD-I), conventional tillage (CC) and forest. The collection of soil samples was made in summer, during the period of January and February in 2006. Each sample was composed of 10 simple samples withdrawals with hoe, in the depths of 0 – 0,10, 0,10 - 0,20 and 0,20 - 0,30 m. The evaluated microbiological, biochemical and chemical variables of soil can be considered sensitive measurements to determinate changes due to the effects of year seasons, the cattle management system and crop and the depth of the soil.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:30:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 01 - capa_abstract.pdf: 21561 bytes, checksum: 6b48a9a4c021bab8bbd84b5d506aecaa (MD5) Previous issue date: 2008-02-25 / Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Insecticides can affect the activity of enzymes of the digestive and energy metabolism of insects. Those enzymes can contribute indirectly in the detoxification process making available energy for maintenance of their defense apparatus against insecticide. The effect of the insecticide can have reflex in the metabolic rate and patterns behavior of the insects. In this study, insects of a population susceptible of the maize weevil, Sitophilus zeamais Motschulsky (Coleoptera: Curculionidae), and two resistant populations to insecticides pyrethroid, with different demographic actings, were exposed to the cipermethrin to evaluate possible alterations in the enzymatic activity, in the metabolic rate and in the pattern behavior of this insects. Concentration-mortality bioassay were accomplished to verify the resistance level of the populations to the cipermethrin. The lethal concentration that it causes 10% of mortality of the insects susceptible (CL10), it was used in the treatment of the three populations for accomplishment of the assay. The enzymatic activity was certain for three enzymes of the energy metabolism (lypase, amylase and trehalase) and four enzymes of the digestive metabolism (cellulase, cysteine-proteinase and serine- proteinase (amydolitic and esterolytic). It was also certain the consumption of O2 and the pattern behavior of the exposed insects to the insecticide. The resistant populations had larger amylase activity, lypase and trehalase, reinforcing the hypothesis of the involvement of those enzymes with the mitigation of the costs physiologic associates to the resistance to insecticides in those populations. However, the treatment with insecticide reduced the specific activity of most of the studied enzymes. On the other hand, the consumption of O2 was similar among the populations and among exposed groups and no exposed to the cypermethrin. The insects of the resistant populations walked larger distances and they had larger medium walking speed, what can be reflex of the largest energy readiness in them. The reduction in the observed enzymatic activity can be resulted of the interference of the insecticide in the synthesis and neuropeptides liberation that affect the activity of the enzymes. Finally, the reduction of the activity of those enzymes might have affected the synthesis and liberation of a group of detoxification enzymes and the additional production of energy to mitigate the physiologic stress provoked by the insecticide. / Inseticidas podem afetar a atividade de enzimas do metabolismo digestivo e energético de insetos. Essas enzimas podem contribuir indiretamente no processo de destoxificação disponibilizando energia para manutenção do mecanismo destoxificativo. O efeito do inseticida pode ter reflexo na taxa metabólica e em padrões comportamentais dos insetos. Neste estudo, insetos de uma população susceptível do caruncho do milho, Sitophilus zeamais Motschulsky (Coleoptera: Curculionidae), e duas populações resistentes a inseticidas piretróides, com desempenhos demográficos diferentes, foram expostas à cipermetrina para avaliar possíveis alterações na atividade enzimática, na taxa metabólica e no padrão comportamental de caminhamento dos insetos. Foram realizados bioensaios de concentração-mortalidade para verificar o nível de resistência das populações à cipermetrina. A concentração letal que causa 10% de mortalidade dos insetos susceptíveis (CL10), foi utilizada no tratamento das três populações para realização dos ensaios. A atividade enzimática foi determinada para três enzimas do metabolismo energético (lipase, amilase e trealase) e quatro enzimas do metabolismo digestivo (celulase, cisteíno-protease e serino- protease amidásica e esterásica). Foi também determinado o consumo de O2 e o padrão comportamental dos insetos expostos ao inseticida. As populações resistentes tiveram maior atividade de amilase, lipase e trealase, reforçando a hipótese do envolvimento dessas enzimas com a mitigação dos custos fisiológicos associados à resistência a inseticidas nessas populações. Entretanto, o tratamento com inseticida reduziu a atividade específica da maioria das enzimas estudadas. Por outro lado, o consumo de O2 foi semelhante entre as populações e entre grupos expostos e não expostos à cipermetrina. Os insetos das populações resistentes caminharam maiores distâncias e tiveram maior velocidade média de caminhamento, o que pode ser reflexo da maior disponibilidade energética neles. A redução na atividade enzimática observada pode ser resultado da interferência do inseticida na síntese e liberação de neuropeptídeos que afetam a atividade das enzimas. Por fim, a redução da atividade dessas enzimas pode ter afetado a síntese e liberação de enzimas destoxificativas e a produção adicional de energia para mitigar o estresse fisiológico provocado pelo inseticida.

Submitted by Náthali Maria Machado de Lima (nathalimachadolima@gmail.com) on 2018-09-06T17:50:08Z No. of bitstreams: 1 Nathali Maria Machado de Lima - Copia (2)-pages-1-3,5-101-merged.pdf: 3526956 bytes, checksum: 5f5c8cc704c14910caa7d290299d4c24 (MD5) / Approved for entry into archive by Elza Mitiko Sato null (elzasato@ibilce.unesp.br) on 2018-09-06T18:17:51Z (GMT) No. of bitstreams: 1 lima_nmm_me_sjrp.pdf: 3526956 bytes, checksum: 5f5c8cc704c14910caa7d290299d4c24 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-06T18:17:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 lima_nmm_me_sjrp.pdf: 3526956 bytes, checksum: 5f5c8cc704c14910caa7d290299d4c24 (MD5) Previous issue date: 2016-10-31 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Crostas biológicas consistem de uma comunidade composta por cianobactérias, algas verdes, microfungos, bactérias, líquens e musgos. Estas ocorrem em uma variedade de solos e regiões climáticas ao redor do globo, exercendo funções importantes como a de conferir estabilidade e proteger o solo contra forças erosivas, acumular e aumentar o tempo de residência da água no solo, além de, favorecer a germinação e permitir a fixação de nitrogênio e carbono. Em crostas biológicas de regiões quentes e temperadas há o predomínio de líquens e cianobactérias, sendo que as cianobactérias são consideradas os primeiros organismos a estruturarem a crosta, sendo seguidas por outros grupos de organismos. A partir da investigação de cianobactérias em crostas biológicas, muitos novos gêneros e espécies têm sido descritos, o que também enfatiza a grande necessidade da investigação sobre tais comunidades. Devido às condições propícias do ambiente, em termos de exposição do solo e fitofisionomia, o bioma Cerrado (Savana) foi escolhido para ser o local de estudo de assembleias de cianobactérias de crostas. Além disso, devido a estudos prévios que relatam o potencial de produção de enzimas celulolíticas e hemicelulolíticas por cianobactérias heterocitadas e a presença comum deste tipo de organismos em crostas biológicas, também foram feitas análises para avaliar a produção de tais substâncias. Desse modo, os estudos objetivaram contribuir com conhecimento da biodiversidade de cianobactérias de crostas biológicas de solo e avaliar a capacidade de produção enzimática das cianobactérias encontradas em crostas biológicas de solo. Para isto, amostras de crostas foram coletadas nos Parques Nacionais da Serra da Canastra (MG) e da Serra do Cipó (MG), no Parque Estadual Furnas do Bom Jesus (SP) e na região de Caldas Novas (GO). As cianobactérias encontradas nas amostras foram estudadas morfologicamente a partir do material da natureza e também isoladas em cultivos artificiais, visando além do estudo morfológico, as análises moleculares e enzimáticas. No total, foram estudados 28 morfotipos, provenientes de 31 populações, dos quais 12 foram identificados em nível específico (destes, três ainda exigem confirmação de identidade = cf) e 16 foram identificados apenas em nível genérico. Dezenove populações foram analisadas também em nível molecular por meio do sequenciamento parcial do gene 16S rRNA, e completo da Região Espaçadora Interna Transcrita 16S-23S (ITS). Seis populações foram também investigadas quanto a produção de enzimas. Entre os gêneros encontrados, muitos são comuns em assembleias de cianobactérias de crostas biológicas em outras regiões do mundo, entretanto, algumas identificações em nível de espécie não foram possíveis por diferenças importantes com os táxons já descritos em literatura. As análises moleculares enfatizaram e contribuíram com a problemática polifilia de gêneros como Leptolyngbya, Nostoc e Calothrix, reafirmaram a existência de um novo gênero próximo a Wilmottia e Microcoleus e apresentaram um novo grupo composto até o momento por uma espécie representada por duas populações. Este grupo revelou sequências moleculares que se aproximam de Brasilonema, entretanto os indivíduos apresentam ramificações verdadeiras e, portanto, investigações mais aprofundadas são necessárias para definição da identidade das populações. Dessa forma, as análises morfológicas e moleculares demonstraram a grande diversidade não acessada em localidades e habitats pobremente investigados e enfatizaram a contribuição deste trabalho ao enfocar pela primeira vez a flora de cianobactérias de solo de Cerrado. As análises de atividade enzimática revelaram que não houve produção de tais proteínas, tendo como possíveis explicações a ausência de habilidade para produção deste tipo de enzimas por parte das cepas, ou a ineficiência do método utilizado. De qualquer forma os resultados enfatizaram a necessidade de estudo nesta área, principalmente pela dificuldade no encontro de cepas produtoras e o desconhecimento sobre quais poderiam ser os fatores a estarem influenciando certas cepas a ativarem ou selecionarem diferentemente seus metabolismos. Em linhas gerais, os resultados do presente estudo apresentam, pela primeira vez, a composição das cianobactérias de crostas biológicas do território brasileiro e indicam uma flora diversificada e, em grande parte, desconhecida. Esses resultados fornecem subsídios e abrem caminho para outras pesquisas dentro do campo do conhecimento da biodiversidade presente em crostas biológicas. Complementarmente, estes trabalhos compõem a base para estudos sobre a ecologia de ambientes mais restritivos (como a caatinga ou o próprio Cerrado), permitindo abordagens como sucessão ecológica, produtividade primária, fluxos de nutrientes e dinâmicas de solo. / Biological soil crusts (BSCs) are communities potentially composed of cyanobacteria, green algae, micro fungi, bacteria, lichens and mosses. They occur in a variety of soils and climatic regions around the world, playing important roles as giving soil stability protecting against erosive forces, accumulating and increasing residence time for water in soil, besides promoting germination and performing nitrogen and carbon fixation. Biological soil crusts from hot deserts are frequently composed of cyanobacteria and lichens, and the cyanobacteria are considered the first colonizers in structuring the crust, being followed by other groups of organisms. A lot of new genera and species have been described based on crusts investigations and this fact also emphasizes the necessity of works on those communities. Due to environmental conditions, as soil exposition and phytophysiognomy, the biome Cerrado (Savannah) was chosen to be the place for studies on cyanobacterial assemblages of biological soil crusts. Besides, due to previous studies that indicate the production capability of celulolitic and hemicelulolitic enzymes by heterocytous cyanobacteria and the common presence of this kind of cyanobacteria in biological soil crusts, analyses of such production were also conducted. In this way, the studies aimed to contribute with knowledge about cyanobacterial biodiversity in biocrusts and evaluate the bioprospection capability of cyanobacterial from these biocrusts. Therefore, BSCs were sampled at the National Parks of Serra da Canastra (Minas Gerais State) and Serra do Cipó (Minas Gerais State), at the State Park of Furnas do Bom Jesus (São Paulo State) and in the region of the municipality of Caldas Novas (Goiás State). The cyanobacteria found in the samples had their morphology analyzed from the natural and cultivated conditions. Besides, molecular and enzymatic analysis were carried out. The results summarized 28 morphotypes from 31 populations, which 12 were identified at specie level (three of them need identity confirmation = cf) and 16 were identified only at genus level. Nineteen populations also were studied with molecular methods, through partial sequencing of 16S rRNA gene and complete sequencing of the Internal Transcribed Space Region (16S-23S ITS). In addition, six populations also were explored as possible enzymatic producers. Among the found genera, many are cyanobacteria frequently found in BSCs distributed around the world, however, some identifications at specific level were not possible due to considerable divergences in comparison with described taxa. The molecular analysis reaffirmed and emphasized the polyphyletic nature of Leptolyngbya, Nostoc and Calothrix, reinforced the existence of a new genus close related with Wilmottia and Microcoleus and presented a new group composed, until now, of one species represented by two populations. This group showed molecular sequences related with Brasilonema, however, the specimens are true branched, what requires more detailed studies to confirm the identification of the populations. In this way, the morphological and molecular analyses showed the wide diversity whose has not been accessed in poorly investigated places and habitats and reinforced the contribution of this work in focusing the cyanobacterial flora of crusts of Brazilian savannah area for the first time. The enzymatic activity analysis revealed that the strains studied did not produce celulolitic or hemicelulolitic compounds, having as possible explanations the absence of the production ability or the inefficiency of the utilized method. Either way, the results emphasized the necessity of studies in this area, mainly because of the difficulty in find producer strains and the lack of knowledge about which could be the factors influencing the strains in activate or select differently their metabolism. In general, our results presented for the first time the cyanobacterial composition for BSCs from Brazil and indicated a diverse, and sometimes, unknown flora. These results provided foundation and opened doors to investigations inside the biodiversity knowledge with biological soil crusts. Complementary, these works compound the basis for investigations in the ecology of extreme environments (as Caatinga and Cerrado), permiting studies about successional ecology, primary productivity, flow of nutrients and soil dynamics. / 2014/06245-8