Este estudo descreve um novo método para a produção da Ca2+-ATPase do retículo sarcoplasmático de coelho em levedura utilizando um vetor de expressão regulado por choque térmico. Após solubilização das membranas de levedura com lisofosfatidilcolina, a introdução de um \"tag\" de 6 histidinas na extremidade amino-terminal da Ca2+-ATPase permitiu a sua purificação por cromatografia de afinidade utilizando uma resina carregada com níquel. Utilizando essa estratégia, foi possível obter frações enriquecidas em até 75% de Ca2+-ATPase recombinante, algo não descrito ainda na literatura. A 6xHis Ca2+-ATPase solubilizada em LPC e purificada em coluna de níquel se mantém estável desde que seja introduzido DOPC juntamente com o detergente nas etapas de lavagem e eluição. Nessas condições, a enzima purificada possui elevada atividade ATPásica cálcio-dependente (1.5-2.0 µmol/mg proteína.min) durante vários minutos de reação. A titulação da atividade ATPásica em função do cálcio livre demonstrou que a 6xHis Ca2+-ATPase purificada possui alta afinidade para o íon (K0.5= 0.15 µlM) e manteve uma forte cooperatividade na ativação por cálcio (nH = 2.07). A quantidade e o grau de pureza obtidos são suficientes para permitir a caracterização bioquímica e espectroscópica de mutantes pontuais da Ca2+-ATPase já construídos e expressos em levedura. A conversão da energia presente em ligações químicas em gradiente eletroquímico é um tema central da bioenergética. Espera-se que o estudo dos mutantes pontuais de triptofano da Ca2+-ATPase gerados nesse trabalho contribua para uma melhor compreensão do mecanismo de acoplamento entre a hidrólise de ATP e o transporte vetorial de íons nesse modêlo de estudo de proteínas de transporte. / We describe in this work a new method for the production of SERCA-l Ca2+-ATPase in yeast using a heat-shock regulated expression vector. Following solubilization of yeast membranes with lysophospholipids, the presence of an hexahistidine tag introduced at the Nterminal end of the Ca2+-ATPase allowed its purification by metal chelating affinity chromatography using a nickel-NTA resin. Using this procedure highly enriched ftactions (75% oftotal protein in the ftaction) of yeast-expressed rabbit Ca2+-ATPase were obtained. Detergent-solubilized 6xHis-Ca2+-ATPase retained highly active (1.5 - 2 µmol/mg protein .min) calcium-dependent, vanadate inhibitable ATPase activity as determined by 32P-γ-ATP hydrolysis. Titration of ATPase activity as a function of ftee calcium revealed high Ca2+ affinity (K0.5 =~ 0.15 µM) and the persistence of a strong cooperative pattem of calcium activation (Hill number of 2.07). The yield and purity of 6xHis Ca2+-ATPase fractions produced with this method allows the biochemical and spectroscopic characterization of Ca2+-ATPase mutants produced in the course of this work. Conversion of the energy present in chemical bonds to electrochemical gradient is a central theme of bioenergetics. It is hoped that the study of the Ca2+-ATPase tryptophan mutants generated in this work will contribute to a better understanding of the coupling mechanism between ATP hydrolysis and the vectorial transport of ions across membranes that occur in this model system.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:49:17Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo1297_1.pdf: 413812 bytes, checksum: 6e4701ae88794deb16a40909eddd00c3 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2008 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A desnutrição intra-uterina tem sido correlacionada com o desenvolvimento de doenças cardiovasculares e renais, que estão vinculadas ao balanço de Na+ alterado. No presente estudo, investigamos se a má-nutrição materna eleva o estresse oxidative placentário com impacto subseqüente nos transportadores renais de Na+ dependentes de ATP, na prole. A mánutrição materna foi induzida durante a gestação através de uma dieta multicarenciada, também denominada dieta básica regional. O estresse oxidativo foi avaliado pela mensuração de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico, os quais estavam 35-40% maiores nas mães malnutridas. As bombas de sódio foram avaliadas nos ratos controle e intra-uterinamente malnutridos (MalN) (25 e 90 dias de vida). A atividade da (Na++K+)ATPase foi idêntica nos grupos aos 25 dias (~150 nmol Pi×mg-1×min-1); aumentou 40% com o desenvolvimento nos ratos controle, mas permaneceu constante na prole de mães malnutridas. Em contraste, nos ratos em idade juvenil, a atividade da Na+-ATPase foi maior nos animais MalN do que nos controles (70 vs 25 nmol Pi×mg-1×min-1). Contudo, ela não acompanhou o desenvolvimento renal e corpóreo: aos 90 dias ela era 50% menor no MalN do que no controle. A estimulação máxima da Na+-ATPase pela angiotensina II foi 35% menor no MalN do que nos ratos controle e foi deflagrada apenas com doses bem maiores do peptídeo (10-10M), quando comparadas aos animais controles (10-14M). A atividade da proteína kinase C, que é um mediadora dos efeitos da angiotensina II na Na+-ATPase, atingiu um terço do valor normal. Podemos concluir que o estresse oxidativo placentário induzido má-nutrição altera o controle fino da manipulação renal de Na+ na prole e contribui para a programação de distúrbios tardios da homeostase de Na+

A Na,K-ATPase é uma proteína integral que utiliza a energia derivada da hidrólise do ATP para transportar íons Na+ e K+ através da membrana contra seus gradientes eletroquímicos. É composta por três subunidades, denominadas alfa, beta e gama. Alguns autores defendem que o protômero (alfa-beta) seja a unidade estrutural e funcional da enzima, porém outros consideram que a enzima nativa da membrana funciona como um oligômero, na forma de um dímero (alfa-beta)2. Em estudos com proteínas de membrana, o uso de detergentes é bastante comum para manter a proteína de interesse em um estado funcional após ser retirada da bicamada lipídica, além disso, sabe-se que vários fatores interferem a atividade enzimática da Na,K-ATPase e existem evidências que mostram que a bicamada lipídica, na qual a enzima está inserida, também controla a interação entre os protômeros da proteína e alterações nas suas propriedades biofísicas podem modular a atividade da enzima. O objetivo do trabalho foi verificar o efeito de diferentes razões detergente/proteína na estabilidade da Na,K-ATPase solubilizada e de diferentes microambientes lipídicos na sua atividade, analisando as alterações no comportamento termotrópico da bicamada com a mudança da composição lipídica, observando as alterações da incorporação e recuperação da atividade enzimática quando a proteína foi reconstituída em sistemas miméticos de membrana. Utilizando o espalhamento dinâmico de luz (DLS) foi possível acompanhar o processo de agregação térmica da enzima, fornecendo informações da sua estrutura, bem como avaliar a sua estabilidade quando solubilizada. A desnaturação térmica da Na,K-ATPase também foi avaliada por calorimetria diferencial de varredura (DSC) e verificou-se que é um processo irreversível, e ocorreu entre 50 e 70°C, sendo a soma de três transições. Utilizando DSC, analisou-se ainda o comportamento termotrópico dos sistemas de lipossomos e proteolipossomos constituídos de DPPC, DPPE e colesterol. Para os sistemas vesiculares, na ausência da proteína, foi observado que para o sistema binário de DPPC e DPPE, o aumento da proporção do último lipídio induz uma separação de fase, assim como a presença de colesterol, tanto nos sistemas binários (DPPC:Col e DPPE:Col), quanto no ternário (DPPC:DPPE:Col). Avaliou-se ainda como o microambiente lipídico interfere na incorporação e atividade da Na,K-ATPase. Verificou que diferentes quantidades de colesterol alteram a atividade enzimática, confirmando que este possui um importante papel na modulação da atividade, alterando propriedades da membrana e influenciando na conformação da proteína. / Na,K-ATPase is an enzyme that is intrinsic to the plasma membrane, responsible for the coupled active transport of Na+ and K+ across animal cell membranes. The enzyme consists of alfa, beta and gama subunits. It has been demonstrated that the alfa-beta form of Na,K-ATPase is capable of both ATP hydrolysis and active ion transport, however accumulating evidence suggest that the enzyme normally self-associates as (alfa-beta)2 dimers. In membrane protein research, the most typical use of a detergent is to maintain a target membrane protein in a functional, folded state in the absence of a membrane. Moreover, it is known that several factors influence the enzymatic activity of Na, K-ATPase and there is evidence that the lipid bilayer, in which the enzyme is located, also controls the interaction between protomers and that changes in their biophysical properties can modulate the activity of the enzyme. The objective of this study was to investigate the effect of different detergent/protein ratios on the stability solubilized of Na, K-ATPase and different lipid microenvironments in their activity by analyzing changes in the thermotropic behavior of the bilayer, analysing the incorporation changes and the recovery of enzyme activity when the protein was reconstituted in a membrane mimetic systems. Dynamic light scattering (DLS) was used to monitor the process of thermal aggregation of the enzyme, providing information on their structure and evaluating its stability when solubized. The thermal denaturation of Na, K-ATPase was also evaluated by differential scanning calorimetry (DSC) and it was verified that it is an irreversible process, which occurred between 50 and 70 ° C, being the sum of three transitions. Using DSC, we analyzed the thermotropic behavior of proteolipossomos and liposomes consisting of DPPC, DPPE and cholesterol. For vesicular systems in the absence of the protein, it was observed that for the binary system of DPPC and DPPE, increasing the proportion of the latter induces a lipid phase separation and the presence of cholesterol in both binary systems (DPPC: Col and DPPE: Chol), and in the ternary system (DPPC: DPPE: Chol) it induces a lipid phase separation. It was also evaluated how the lipid microenvironment interferes on the incorporation and activity of Na, K-ATPase. It was found that different amounts of cholesterol alter the enzyme activity, confirming cholesterol has an important role in the modulation of the activity by altering the membrane properties and influencing the protein conformation.

No presente trabalho foram estudadas a caracterização cinética e as propriedades bioquímicas da (Na+, K+)-ATPase branquial dos estágios ontogenéticos juvenil e adulto do camarão de água doce M. amazonicum. Em ambos os estágios de desenvolvimento foi expressa uma (Na+, K+)-ATPase com peso molecular de 105 kDa. A estimulação da atividade (Na+, K+)-ATPase de animais adultos pelo ATP apresentou comportamento michaeliano (V=181,8±77,83 U mg-1; KM=0,11±0,01 mmol L-1). Entretanto a estimulação da atividade (Na+, K+)-ATPase pelo Mg2+ (V=174,7±74,76 U mg-1; K0,5=0,27±0,05 mmol L-1; n= 2,5), Na+ (V=175,5±75,12 U mg-1; K0,5=4,73±0,81 mmol L-1; n= 1,9), K+ (V=171,2±73,28 U mg-1; K0,5=1,00±0,17 mmol L-1; n=1,2) e NH4+ (V=194,2±63,34 U mg-1; K0,5= 4,76±2,15 mmol L-1; n=1,9) ocorreu segundo cinética cooperativa. Nos animais juvenis, a modulação da atividade (Na+, K+)-ATPase pelo ATP, também apresentou comportamento michaeliano (V=189,52±32,45 U mg-1; KM= 0,14±0,02 mmol L-1). O mesmo foi observado para o K+ (V=178,56±30,58 U mg-1; KM= 1,30±0,22 mmol L-1) e o NH4+ (V=205,91±35,26 U mg-1; KM=1,88±0,32 mmol L-1). Para o Mg2+ (V=168,35±28,83 U mg-1; K0,5=0,51±0,09 mmol L-1; n=3,5) e o Na+ (V=165,48±28,33 U mg-1; K0,5=4,92±0,84 mmol L-1; n=1,3), a estimulação da enzima ocorreu através de interações sítio-sítio. Na presença de K+ e NH4+ a atividade da enzima de animais adultos, foi estimulada 30% e o K0,5 aumentou 3 vezes. Já os animais juvenis, apresentaram um aumento de 12% na velocidade máxima e o K0,5 aumentou 2 vezes. Na presença de K+ a atividade ATPase total dos animais adultos foi inibida 62% pela ouabaína com Ki=114±2,41 µmol L-1. Já para os animais juvenis, a inibição foi da ordem de 87% com Ki=91,22±15,62 µmol L-1. Na presença de NH4+ a inibição pela ouabaína da atividade ATPase total dos animais adultos foi da ordem de 70% com Ki=57,95±17,04 µmol L-1 enquanto para os juvenis a inibição foi da ordem de 85% com Ki=53,98±9,24 µmol L-1. / In the present work the kinetic characterization and biochemical properties of the (Na+, K+)-ATPase gill in ontogenetic stages of juvenile and adult freshwater prawn M. amazonicum was studied. In both stages of development the (Na+, K+)-ATPase was expressed as a molecular weight of 105 kDa. The stimulation of activity (Na+, K+)-ATPase by ATP in adult animals showed a michaeliano comportament (V=181.8±77.83 U mg-1, KM=0.11±0.01 mmol L -1). However the stimulation of activity (Na+, K+)-ATPase by Mg2 + (V=174.7±74.76 U mg-1, K0,5 =0.27±0.05 mmol L-1, n=2.5 ), Na+ (V=175.5±75.12 U mg-1, K0,5=4.73±0.81 mmol L-1, n=1.9), K+ (V =171.2±73,28 U mg-1, K0,5=1.00±0.17 mmol L-1, n=1,2) and NH4+ (V=194.2±63.34 U mg-1, K0,5=4, 76±2.15 mmol L-1, n=1.9) ocorred second cooperative kinetics. In juvenile animals, modulation of the activity (Na+, K+)-ATPase by ATP, exhibited behavior michaeliano (V=189.52±32.45 U mg-1, KM=0.14±0.02 mmol L-1). The same was observed for K+ (V=178.56±30.58 U mg-1, KM=1.30±0.22 mmol L-1) and NH4+ (V=205.91±35.26 U mg -1, KM=1.88±0.32 mmol L-1). For Mg2 + (V=168.35±28.83 U mg-1, K0,5=0.51 ± 0.09 mmol L-1, n=3.5) and Na+ (V=65.48±28 mmol L-1, 33 U mg-1, K0,5=4.92±0.84 mmol L-1, n=1.3), stimulation of the enzyme occurred through site-site interactions. In the presence of K+ and NH4+ the enzyme activity of adult animals, was stimulated 30% and K0,5 increased by 3 times. Already the young animals showed a 12% increase in speed and K0,5 increased by 2 times. In the presence of K+ ATPase activity of the total adult animals was inhibited 62% by ouabain with Ki=114±2.41 mmol L-1. As for the juvenile animals, the inhibition was approximately 87% with Ki=1.22±15.62 mmol L-1. In the presence of NH4+ by ouabain inhibition of total ATPase activity of adult animals was about 70% with Ki=57.95±17.04 mmol L-1 while for juveniles the inhibition was approximately 85% with Ki=53.98 ± 9.24 mmol L-1.

A Na, K-ATPase (NKA) é uma proteína de membrana encontrada em organismos eucariotos multicelulares cuja atividade e funções já são amplamente discutidas na literatura. Sua unidade funcional corresponde a um heterodímero formado por duas subunidades , com regiões transmembrana. Espécies multiméricas como dímeros e tetrâmeros dessa enzima também são conhecidos por exercer atividade enzimática. As interações lipídio-proteína são intrínsecas para a NKA, por tal motivo, proteolipossomos constituídos de DPPC e DPPC:DPPE foram preparados por co-solubilização. Como controle, lipossomos de mesma composição foram produzidos por extrusão e/ou sonicação. Para as imagens de AFM, as amostras foram fixadas com glutaraldeído, para proteção mecânica e contra desidratação das vesículas. Para lipossomos de DPPC as imagens topográficas de AFM das vesículas apresentaram formato oval, superfície perfeitamente lisa e diâmetro médio de 151 + 46 nm, enquanto as vesículas de composição DPPC:DPPE, apesar de lisas, tiveram cantos pontiagudos e diâmetro médio de 98 + 28 nm. Imagens de fase de ambas as composições não apresentaram qualquer indicativo de diferenças na composição química, provavelmente devido à natureza de carga neutra dos dois fosfolipídios. As imagens de fase por AFM para os proteolipossomos tanto de DPPC-NKA, quanto DPPC:DPPE-NKA, revelaram resultados inéditos na literatura, onde a inserção da NKA aparece como nítidas regiões transições de fase de composição química distinta quando comparadas com os lipossomos. No entanto, as mudanças de fase são diferentes entre as composições estudadas, aparecendo como manchas escuras circulares para DPPC-NKA e mais visíveis como interstícios brilhantes para composição de DPPC:DPPE-NKA. As vesículas de DPPC-NKA apresentaram diâmetro médio de 390 + 326 nm e, nas imagens de topografia tridimensionais, protusões de 38 a 115 nm correspondentes às regiões de mudanças de fase, que, indicaram o diâmetro dos microdomínios relacionados à proteína. Já nas imagens para DPPC:DPPE-NKA o diâmetro médio dos proteolipossomos foi de 189 + 156 nm, e as protusões apareceram entre os interstícios, variando de 20 a 66 nm. O estudo de DSC dos lipossomos revelou que a concentração de glutaraldeído nas condições das análises de AFM, em torno de 5% (v/v), afetam as características físico-químicas para as composições com DPPE. A AFM foi eficiente para confirmar a reinserção da NKA em proteolipossomos pelas imagens de fase, e, para medir o diâmetro dos microdomínios pelas imagens de topografia. / Na, K-ATPase (NKA) is a membrane protein present in eukaryotic multicellular organisms. Its functions and activity are already widely described in the literature. Its minimal functional structure is a heterodimer of two main subunits , with transmembrane domains. However, dimers and tetramers of the enzyme are also known to have enzymatic activity. Since there are intrinsic lipid-protein interactions, NKA proteoliposomes composed of DPPC and DPPC:DPPE (1:1 molar ratio) were prepared by the co-solubilization method and liposomes of the same compositions were obtained by extrusion and/or sonication to be used as control. The samples to the AFM study were prepared using glutaraldehyde to protect the vesicles from mechanical shocks and dehydration. Liposomes composed of DPPC and DPPC:DPPE (1:1 molar ratio) were prepared by extrusion and sonication, respectively, as control. The topographical images for DPPC liposomes showed vesicles with an oval shape and smoothed surfaces with a mean diameter of 151 + 46 nm. DPPC:DPPE vesicles also presented smoothed surfaces, but with pointed corners and mean diameter of 98 + 28 nm. Phase images for both lipid compositions showed no differences in chemical composition. For DPPC:DPPE samples, this can be explained by the neutral net charge of both lipids. The proteoliposomes observed in the AFM phase images showed darker and large circular spots in the vesicles. These spots represent delays in the phase oscillation of the AFM probe and are associated with different chemical composition. The phase changes showed the reconstitution of the NKA in the proteoliposomes. When compared with topographical images, this spots matched protrusions. The mean diameter of DPPC-NKA proteoliposomes determined by AFM was 390 + 326 nm. In the three-dimensional topographical images of composition, protrusions from 38 to 115 nm near the areas of different phases indicate the diameters of the NKA microdomains. The phase changes for DPPC:DPPE-NKA appeared as bright interstices with the protrusions of the topographical images in between them. The size of these protrusions ranged from 20 to 66 nm and the mean diameter of the proteoliposomes was 189 + 156 nm. The DSC liposomes data showed that the glutaraldehyde concentration used in the AFM analysis affect the physical chemistry properties of the samples with DPPE. AFM proved to be an efficient method to confirm the reconstitution of into proteoliposomes with phase images and to determine the diameter of the protein microdomains with the topographical images.

A (Na+,K+)-ATPase presente no tecido branquial dos crustáceos osmorreguladores é um componente essencial de seu sistema de regulação iônica e osmótica. Esta enzima também apresenta um papel relevante no processo de excreção ativa de NH4+ através do tecido branquial dos crustáceos. Uma fração microsomal rica em (Na+, K+)ATPase foi preparada por centrifugação diferencial a partir de um homogeneizado do tecido branquial de Callinectes ornatus. A centrifugação em gradiente de sacarose revelou a presença de um unico pico de proteina com atividade ATPase, mas a eletroforese em gel de poliacrilamida em condições desnaturantes revelou a presença de várias bandas protéicas. O uso do anticorpo monoclonal 5 contra a subunidade da (Na+, K+) ATPase, revelou a presença de uma única banda proteica de 110 kDa com atividade (Na+, K+)?ATPase. A (Na+, K+) ATPase hidrolisou o PNPP (V= 52,0 ± 2,0 U/mg e K0,5 = 1,1 ± 0,1 mM) através de interações sítio-sítio (nH= 1,6). A modulação da enzima pelos íons magnésio (V= 52,3 ± 1,3 U/mg e K0,5 = 1,1 ± 0,05 mM), potássio (V= 51,4 ± 1,5 U/mg e K0,5 = 2,3 ± 0,1 mM) e amônio (V= 56,7 ± 2,6 U/mg e K0,5 = 9,8 ± 0,4 mM) ocorreu através de interações sítio-sítio. Os íons sódio atuaram como inibidores da atividade K+-fosfatase da enzima (Ki= 1,7 ± 0,1 mM) e a ouabaína inibiu cerca de 80% a atividade PNPPase independentemente da presença de íons amônio. A (Na+, K+) ATPase hidrolisou o ATP de acordo com cinética de Michelis-Menten, com KM= 0,16 0,01 mM e V= 116,3 5,6 U/mg, enquanto a modulação da atividade da enzima pelos íons magnésio (V= 111,0 ± 5,4 U/mg e K0,5= 0,54 ± 0,03 mM), sódio (V= 110,6 ± 5,3 U/mg e K0,5= 6,3 ± 0,3 mM), potássio (V= 116,0 ± 5,5 U/mg e K0,5= 1,5 ± 0,1 mM) e amônio (V= 173,3 ± 5,4 U/mg e K0,5= 5,4 ± 0,3 mM) ocorreram através de interações sítio-sítio. Também foi observado que na presença de concentrações crescentes de ions amonio, a estimulação da atividade (Na+,K+)-ATPase pelo íons potássio acarretou um aumento de 50% na atividade específica da enzima. A ouabaína inibiu cerca de 86% a atividade (Na+,K+)-ATPase com Ki= 74,5 ?M, sugerindo a presença de 14% de fosfatases e/ou outras ATPase contaminantes. Este é o primeiro trabalho onde se observa uma estimulação sinergística da atividade K-fosfatase da (Na+,K+)-ATPase de crustáceo pelos íons potássio e amônio. Os resultados cinéticos obtidos para a (Na+,K+)-ATPase branquial de Callinectes ornatus, analisados em conjunto com os já descritos para outras espécies de crustáceos poderão abrir novas perspectivas em relação ao papel dessa enzima na adaptação fisiológica-bioquímica, bem como para a sobrevivência desses animais em diferentes ambientes. / (Na+, K+)-ATPase present on branchial tissue osmoregulatory crustaceans is an essential component of their osmotic and ionic regulation system. Apparently, this enzyme also have a relevant role in the active excretion de NH4+ through the branchial crustacean tissue. A (Na+, K+) ATPase-rich microsomal fraction was prepared by differential centrifugation from Callinectes ornatus homogenized branchial tissue. The sucrose gradient sucrose centrifugation showed the presence of a single protein peak with ATPase activity, and SDS-PAGE revealed the presence of several proteins bands. The use of the 5 monoclonal antibody, against the ? subunit, revealed the presence of a unique protein band of 110 kDa corresponding to the (Na+, K+) ATPase. (Na+, K+) ATPase hydrolyzed the PNPP (V= 52.0 2.0 U/mg and K0.5= 1.1 0.1 mM) through the site-site interactions (nH= 1.6). The modulation of (Na+, K+) ATPase by magnesium (V= 52.3 1.3 U/mg and K0.5= 1.1 ? 0.05 mM), potassium (V= 51.4 1.5 U/mg and K0.5= 2.3 0.1 mM) and ammonia ions (V= 56.7 2.7 U/mg and K0.5= 9.8 ? 0.4 mM) followed cooperative kinetics. However, sodium ions inhibited PNPPase activity of (Na+, K+)?ATPase with Ki= 1.7 0.1 mM. Ouabain also inhibited up to 80% the total activity PNPPase independent of the presence of ammonium ions. The hydrolysis of ATP by (Na+, K+) ATPase followed Michaelis-Menten kinetics with Km= 0.16 0.01 mM and V= 116.3 5.6 U/mg, while enzyme modulation by magnesium (V= 111.0 5.4 U/mg and K0.5= 0.54 0.03 mM), sodium (V= 110.6 5.3 U/mg and K0.5= 6.3 0.3 mM), potassium (V= 116.0 5.5 U/mg and K0.5= 1.5 ? 0.1 mM) and ammonium ions (V= 173.3 . Interestingly, the stimulation of (Na+, K+)-ATPase activity by potassium ions in the presence of increasing concentration of ammonium ions to K+ resulted in a 50% higher specific activity. Ouabain inhibited approximately 86% the activity (Na+, K+) ATPase with (Ki= 74.5 M), suggesting the presence of about 14% of phosphatases and/or other ATPases. This is the first work showing synergistic stimulation of crustacean (Na+, K+) ATPase by potassium and ammonium ions when PNPP is used a substrate. The results reported herein for Callinectes ornatus branchial (Na+, K+) ATPase might open new perspectives concerning the physiological adaption and the survival of these animals in different environmental.

Toxinas animais são moléculas aplicáveis na geração de agentes terapêuticos e/ou de ferramentas experimentais para a pesquisa básica e aplicada, justificando sua purificação e análise funcional. Considerando que estudos de venenos de sapos são relevantes, por serem estes considerados uma boa fonte de toxinas que atuam sobre diferentes sistemas biológicos, os objetivos deste trabalho foram isolar toxinas presentes no veneno de Rinella schneideri e avaliar suas ações sobre a atividade da enzima Na+K+-ATPase e os sistemas nervosos central e periférico. O veneno de Rhinella schneideri foi inicialmente submetido a diferentes extrações resultando em quatro amostras. A AMOSTRA A, que apresenta apenas componentes de baixa massa molecular, foi a mais efetiva na redução da atividade da Na+K+-ATPase e foi, portanto, liofilizada e submetida a uma cromatografia de fase reversa em sistema CLAE em coluna C2C18. Das 5 frações majoritárias obtidas nesta cromatografia apenas as Rs3, Rs4 e Rs5 induziram uma redução concentração-dependente da atividade da Na+K+-ATPase, mostrando IC50% de 33,6 g, 47,7 g e 98,92 g, respectivamente. Estes resultados indicam que o veneno de R. schneideri apresenta pelo menos três substâncias capazes de inibir a Na+K+-ATPase. As frações Rs3, Rs4 e Rs5, foram submetidas à espectrometria de massa e revelaram massas moleculares de 403, 401 e 387 Da, provavelmente correspondentes à Telocinobufagina, Desacetilcinobufagina e Bufalina, respectivamente. Estes compostos mostraram também neuroproteção central muito relevante sobre crises convulsivas induzidas por PTZ (Pentilenotetrazol) e NMDA (n-metil-d-aspartato), sendo que a Rs5 foi a que causou maior neuroproteção. No entanto, estas mesmas frações apresentaram ação neurotóxica periférica, induzindo bloqueio da junção neuromuscular de pintainhos. Manifestações como alucinações, dormência, confusão mental também são observadas em envenenamentos por sapos, que podem ser induzidos por alcalóides presentes no veneno, o que justifica os estudos para a identificação dos mesmos. Neste trabalho confirmou-se a presença de ii alcalóides no veneno. No entanto, foram priorizados os estudos com as toxinas isoladas Rs3, Rs4 e Rs5, por apresentarem ações biológicas importantes. Concluindo, neste trabalho foram isolados 3 compostos de baixa massa molecular, denominados Rs3, Rs4 e Rs5, que são capazes de inibir a atividade da Na+K+- ATPase, bloquear a transmissão do impulso nervoso na junção neuromuscular de pintainhos e, principalmente a Rs5, proteger crises convulsivas induzidas por PTZ e NMDA. Estudos adicionais serão necessários para estabelecer a correlação entre estes efeitos e determinar o mecanismo de ação destas toxinas. / Animal toxins are molecules applicable in the generation of therapeutic agents and / or experimental tools for basic and applied research, justifying its purification and functional analysis. Whereas studies of poison toads are relevant, since these are considered a good source of toxins that act on different biological systems, the objectives of this work were to isolate toxins in the venom of Rinella schneideri and evaluate their actions on the Na+K+-ATPase activity and the central and peripheral nervous systems. The venom Rhinella schneideri was initially submitted to different extractions resulting in four samples. The SAMPLE A, with only low molecular mass components, was the most effective in reducing the activity of Na+K+-ATPase and was lyophilized and subjected to reverse phase chromatography in the HPLC system in C2C18 column. Five majority fractions were obtained from this chromatography and only Rs3, Rs4 and Rs5 induced a concentration-dependent reduction in activity of Na+K+-ATPase, showing IC50% 33.6 g, 47.7 g and 98.92 g, respectively. These results indicate that R. schneideri venom presents at least three substances that can inhibit the Na+K+-ATPase. Fractions Rs3, Rs4 and Rs5 were submitted to mass spectrometry assay showing molecular masses of 403, 401and 387 Da, probably corresponding to Telocinobufagin, Desacetylcinobufagin and Bufalin, respectively. These compounds also showed a very relevant central neuroprotection on seizures induced by PTZ (Pentylenetetrazole) and NMDA (N-methyl-d-aspartate), and the Rs5 caused the highest neuroprotection. However, these same fractions showed neurotoxicity on peripheral nervous system, inducing blockade of the neuromuscular junction of chicks. Manifestations such as hallucinations, numbness, mental confusion are also seen in poisoning by toads, which can be induced by alkaloids present in the venom, which justifies the studies for their identification. This work confirmed the presence of alkaloids in the venom. However, have been prioritized the studies with isolated toxins Rs3, Rs4 and Rs5, because they have important biological actions. In conclusion, in this study were isolated three compounds with iv low molecular mass, known as Rs3, Rs4 and Rs5, which are capable of inhibiting the activity of Na+K+-ATPase, blocking the nerve impulse transmission at the neuromuscular junction of chickens, and especially the Rs5 by protecting seizures induced by PTZ and NMDA. Additional studies are necessary to establish the correlation between these effects and determine the mechanism of action of these toxins.

Em eucariotos, a origem de replicação é reconhecida por um complexo ORC, a proteína Cdc6 e outras proteínas. Nos tripanossomas, encontramos somente uma proteína similar a Orc1 e Cdc6, que chamaremos de Orc1/Cdc6. Nesta tese serão descritos os estudos realizados sobre Orc1/Cdc6 do Trypanosoma cruzi e do Trypanosoma brucei. As proteínas recombinantes dos tripanossomas apresentam atividade de ATPase e são capazes de substituir Cdc6 em ensaio de complementação em leveduras. A indução do silenciamento do gene de Orc1/Cdc6 por RNAi resulta em células anucleadas. Orc1/Cdc6 é expressa durante todo o ciclo celular das formas replicativas, permanecendo associada à cromatina. No caso do T.cruzi, Orc1/Cdc6 é expressa não só nas formas replicativas, mas também nas formas não replicativas. Nestas últimas, a proteína expressa não interage com o DNA, este resultado sugere que a ausência desta interação deve contribuir para ausência da duplicação do DNA nas formas infectivas do T. cruzi. / In eukaryotes, the replication origin is recognized by a complex ORC, Cdc6 and other proteins. The trypanosomes contain only one protein, we named it Orc1/Cdc6. Here we show that the recombinant Orc1/Cdc6 from T.cruzi (TcOrc1/Cdc6) and from T.brucei (TbOrc1/Cdc6) present ATPase activity, replaced yeast Cdc6 in a phenotypic complementation assay. The induction of Orc1/Cdc6 silencing by RNA interference in T.brucei resulted in enucleated cells. Orc1/Cdc6 is expressed during the entire cell cycle and in all stages of the life cycle of trypanosomes, remaining associated with chromatin in all stages of the cell cycle. This association is different among the stages from T. cruzi life cycle. In the non replicative ones, Orc1/Cdc6 does not interact with DNA. The lack of pre-replication machinery-DNA interaction in T. cruzi non-replicative stages might contribute to the absence of DNA replication in these stages.

ATP-difosfohidrolases, comumente denominadas de apirases, descritas pela primeira vez à cerca de quarenta anos atrás, são enzimas que hidrolisam nucleosídeos di ou trifosfatados por um mecanismo que parece ser sequencial, mas sem a formação de um intermediário energético, e de funções metabólicas ainda desconhecidas. Elas tem sido encontradas nas células dos mais diversos pró- e eucariotos investigados e também em tumores. A vasta abundância dessas enzimas e a sua alta atividade enzimática sugerem que as mesmas estariam envolvidas em importantes funções do metabolismo celular. No presente trabalho, identificamos e caracterizamos a presença de uma nova enzima em Trypanosoma cruzi, o agente causador da doença de Chagas, uma apirase, com características semelliantes à outras apirases já descritas em diversos organismos. Diversos ensaios enzimáticos foram feitos mostrando uma atividade enzimática que não foi anulada pelos inibidores clássicos de ATPases tipo-P, tipo-F ou tipo-V. Esta enzima mostrou depende~n·cla para Mg2+, na~o acontecendo o mesmo para Ca2+. Experimentos usando soros imunes contra apirases de outras fontes, reveleram não apenas reação cruzada, mas também sugeriram que a massa molecular dessa enzima no T cruzi, estaria em tomo de 57,5 kDa. Ensaios citoquímicos (imunoflorescência) com o soro imune anti- NTPase de Toxoxplasma gondii, apresentou fluorescência contra diferentes estágios desse protozoa. No entanto, a localização subcelular dessa enzima no T cruzi não ficou muito clara, tomando-se necessário uma microscopia eletrônica para resolver esse problema. Um dado interessante e particular nesse traballio, foi a presença dessa enzima nos diversos estágios do ciclo de vida do parasita, com atividades enzimáticas diferentes para esses mesmos estágios. / ATP-diphosphohydrolases which are generally called apyrases were described for the first time some forty years ago. These are enzymes which hydrolyze di- and triphosphate nucleosides through a mechanism which seems to be sequential, without forming a high-energy enzyme intermediate. Their metabolic function is yet unknown. ATP-diphosphohydrolases have been found in a number of pro- and eucariotic cells and also in tumor cells. The vast abundance ofthese enzymes and their high enzymatic activity suggest that they are involved in important functions in the cell metabolism. In the present work we have identified and characterized the presence of a new enzyme in Trypanosoma cruzi, the agent of Chagas disease, namely an apyrase with characteristics which are similar to other apyrases already described in different organisms. A number of enzymatic assays showed that the enzyme is not inhibited by the classical inhibitors of P-type, F-type or V-type ATPases. The enzyme exhibited a marked dependence on Mg2+ and not on Ca2+. Experiments using immune sera against apyrases of other sources showed cross- reactivity and suggested that the molecular mass of the enzyme in cruzi is around 57.5 kDa. Immunofluorescence cytochemistry using antiToxoplasma gondii NTPase antibodies showed that fluorescence was present in different stages of the protozoa. However, the exact sub-cellular localization of the enzyme in T cruzi was not clear and electron microscopy will be necessary to answer this question. An interesting result of our work is the identification of the enzyme in different stages of the life cycle of the parasite, with different enzymatic activities among the stages.

A TPases do tipo P são proteínas integrais de membrana que usam a energia química contida na molécula de ATP para o transporte de cátions através de membranas. O nosso trabalho apresenta a clonagem e o sequenciamento de um gene (BePAT2) e a caracterização da expressão de dois genes (BePAT1 e BePAT2) codificando isoformas de uma ATPase do tipo P no fungo aquático Blastocladiella emersonii. As proteínas codificadas por estes genes, surpreendentemente se mostraram mais similares às Na+/K+ e H+/K+-ATPases de eucariotos superiores do que a outras ATPases de fungos. Experimentos de \"Northern blot\", imunoprecipitação e \"Western blot\" demonstraram que as ATPases (BePAT1 e BePAT2) são diferencialmente expressas durante o desenvolvimento de B. emersonii. Os resultados obtidos mostraram que o aumento da transcrição dos genes refletiu em um aumento da síntese e do acúmulo das ATPases, sugerindo um controle pré-traducional da expressão de BePAT1/2. Estudos de formação de fosfoenzima na presença de diferentes íons e inibidores, utilizando as enzimas imunopurificadas, sugerem que as proteínas codificadas por estes genes tenham uma atividade semelhante às Na+/K+-ATPases. Os nossos resultados de expressão e atividade mostram pela primeira vez, evidências da funcionalidade de genes codificando uma proteína similar às Na+/K+-ATPases em um eucarioto inferior. / P- type A TPases are integral membrane proteins which use the energy stored in the A TP molecule to drive the transport of cations through biological membranes. In this work we report the cloning and sequencing of the BePAT2 gene and the characterization and expression of two genes (BePAT1 and BePAT2) encoding isoforms of a P-Type ATPase in the aquatic fungus Blastocladiella emersonii. Surprisingly the putative BePAT1 and BePAT2 proteins are more similar to Na+/K+and H+/K+-ATPases from animal cells than to other P-type ATPases from fungi. Northern blot, immunoprecipitation and Western blot experiments demonstrated that these ATPases (BePAT1 and BePAT2) are developmentally regulated in B. emersonii. The results showed that the increase in the BePAT1/2 transcription reflects in an increase in the synthesis and accumulation of the proteins, suggesting a transcriptional control of the BePAT1/2 expression. Studies of phosphoenzyme formation using the immunopurified enzymes in the presence of different ions and inhibitors suggested a Na/K-ATPase like activity. Our results demonstrate for the first time biochemical evidences of functionality of genes encoding a Na+ /K+-ATPase like protein in an eucaryotic microorganism.