O envelhecimento é um processo multifatorial caracterizado pela perda gradual e contínua da capacidade de realizar funções fisiológicas e de deflagrar respostas adaptativas, levando a prejuízos funcionais e estruturais dos diversos órgãos que compõem os diferentes sistemas, incluindo o sistema nervoso central. Nesse sentido, o exercício físico vem sendo amplamente especulado, pela capacidade de melhorar o funcionamento de diversos sistemas podendo amenizar os efeitos do envelhecimento, como a diminuição da via autofágica e o aumento do estresse oxidativo que colaboram para o início do processo neurodegenerativo. Desta forma, este estudo estabelece a relação entre diferentes protocolos de exercício físico aeróbico moderado em esteira (prática regular, prevenção e estabilização), a atividade proteossomal, o estado da autofagia celular e o nível de estresse oxidativo em ratos idosos na presença ou não de rotenona. Os resultados sugerem que o exercício aplicado após o tratamento com rotenona diminui os níveis de peróxido de hidrogênio (H2O2) no hipocampo, córtex motor e substância negra, acompanhado de um aumento na atividade da glutationa peroxidase (GPx) no hipocampo; diminui a atividade do proteossomo e não altera a via autofágica. O exercício antes do estímulo neurodegenerativo aumenta a atividade da GPx no hipocampo, córtex motor, locus coeruleus e medula cervical, bem como diminui a atividade do proteossomo no hipocampo, substância negra e locus coeruleus, e diminui os níveis de LC3II na substância negra. A prática regular demonstrou de uma forma geral que o exercício aumentou os níveis H2O2 em quase todas as áreas analisadas, exceto córtex motor e medula lombar, bem como diminuiu a atividade da GPx nas áreas encefálicas. Conclui-se que o exercício aplicado antes do tratamento com rotenona parece trazer maiores benefícios com relação aos parâmetros celulares analisados / Aging is a multifactorial process characterized by gradual and continuous loss of ability to perform physiological functions and trigger adaptive responses leading to functional and structural damage of various organs that constitute the biological system, including the central nervous system. Exercise training has been widely speculated for its ability to improve physiological function, which ameliorate age-associated physiological impairments, such as decreased autophagy pathway and increased oxidative stress that collaborate with the neurodegenerative process. Thus, this study aims to establish the relationship between moderate aerobic exercise training protocols (regular practice, prevention and stabilization), proteasomal activity, autophagy and oxidative stress in aged rats, in the presence or absence of rotenone. Results suggest that exercise applied after rotenone exposure decreases the levels of hydrogen peroxide (H2O2) in the hippocampus, motor cortex and substantia nigra, accompanied by an increase in glutathione peroxidase (GPx) activity in the hippocampus; decreases activity of the proteasome and does not alter autophagy. Exercise training applied before neurodegenerative stimulus increases GPx activity in hippocampus, motor cortex, locus coeruleus and cervical spinal cord; decreases proteasome activity in hippocampus, substantia nigra and locus coeruleus, as well as decreases LC3II levels in substantia nigra. Regular exercise practice promoted increase in H2O2 levels in almost all studied areas, except motor cortex and lumbar spinal cord, as well as reduced GPx activity in brain areas. In conclusion, results for the exercise applied before exposure to rotenona appear to have greater benefits regarding the analyzed cellular parameters

O envelhecimento é um processo multifatorial caracterizado pela perda gradual e contínua da capacidade de realizar funções fisiológicas e de deflagrar respostas adaptativas, levando a prejuízos funcionais e estruturais dos diversos órgãos que compõem os diferentes sistemas, incluindo o sistema nervoso central. Nesse sentido, o exercício físico vem sendo amplamente especulado, pela capacidade de melhorar o funcionamento de diversos sistemas podendo amenizar os efeitos do envelhecimento, como a diminuição da via autofágica e o aumento do estresse oxidativo que colaboram para o início do processo neurodegenerativo. Desta forma, este estudo estabelece a relação entre diferentes protocolos de exercício físico aeróbico moderado em esteira (prática regular, prevenção e estabilização), a atividade proteossomal, o estado da autofagia celular e o nível de estresse oxidativo em ratos idosos na presença ou não de rotenona. Os resultados sugerem que o exercício aplicado após o tratamento com rotenona diminui os níveis de peróxido de hidrogênio (H2O2) no hipocampo, córtex motor e substância negra, acompanhado de um aumento na atividade da glutationa peroxidase (GPx) no hipocampo; diminui a atividade do proteossomo e não altera a via autofágica. O exercício antes do estímulo neurodegenerativo aumenta a atividade da GPx no hipocampo, córtex motor, locus coeruleus e medula cervical, bem como diminui a atividade do proteossomo no hipocampo, substância negra e locus coeruleus, e diminui os níveis de LC3II na substância negra. A prática regular demonstrou de uma forma geral que o exercício aumentou os níveis H2O2 em quase todas as áreas analisadas, exceto córtex motor e medula lombar, bem como diminuiu a atividade da GPx nas áreas encefálicas. Conclui-se que o exercício aplicado antes do tratamento com rotenona parece trazer maiores benefícios com relação aos parâmetros celulares analisados / Aging is a multifactorial process characterized by gradual and continuous loss of ability to perform physiological functions and trigger adaptive responses leading to functional and structural damage of various organs that constitute the biological system, including the central nervous system. Exercise training has been widely speculated for its ability to improve physiological function, which ameliorate age-associated physiological impairments, such as decreased autophagy pathway and increased oxidative stress that collaborate with the neurodegenerative process. Thus, this study aims to establish the relationship between moderate aerobic exercise training protocols (regular practice, prevention and stabilization), proteasomal activity, autophagy and oxidative stress in aged rats, in the presence or absence of rotenone. Results suggest that exercise applied after rotenone exposure decreases the levels of hydrogen peroxide (H2O2) in the hippocampus, motor cortex and substantia nigra, accompanied by an increase in glutathione peroxidase (GPx) activity in the hippocampus; decreases activity of the proteasome and does not alter autophagy. Exercise training applied before neurodegenerative stimulus increases GPx activity in hippocampus, motor cortex, locus coeruleus and cervical spinal cord; decreases proteasome activity in hippocampus, substantia nigra and locus coeruleus, as well as decreases LC3II levels in substantia nigra. Regular exercise practice promoted increase in H2O2 levels in almost all studied areas, except motor cortex and lumbar spinal cord, as well as reduced GPx activity in brain areas. In conclusion, results for the exercise applied before exposure to rotenona appear to have greater benefits regarding the analyzed cellular parameters

Orientador: Ney Lemke / Resumo: A doença de Crohn é um subtipo de doença inflamatória intestinal caracterizada pela inflamação intestinal e disbiose da microbiota. A doença é causada uma manifestação atípica da resposta imune à presença de proteínas microbianas alteradas na interface da mucosa intestinal. Várias análises meta-ômicas têm sido executadas para caracterizar a microbiota intestinal em casos de doença de Crohn. Entretanto, devido à limitações das tecnologias e desvantagens inerentes aos métodos experimentais existentes, os mecanismos mediados pelas proteínas do microbioma alterado de doença de Crohn ainda não foram exploradas. Para analisar essa interação a nível molecular, executamos uma abordagem computacional que combina conjuntos de dados de metaproteômica publicados de um estudo clínico de pares de gêmeos com predições de interação entre proteínas microbianas e humanas. Essa predição baseia-se em características estruturais, inferências de regiões desordenadas, vias de sinalização e redes de interação para determinar as possíveis funções mediadas pelas proteínas microbianas. Como resultado, foi obtida uma rede de interação microbioma-hospedeiro que inicia sua sinalização com proteínas bacterianas que interagem com proteínas humanas de superfície celular. A expansão desse sinal foi modelada em direção ao núcleo da célula, onde observamos potenciais pontos de modulação de genes de autofagia: um dos processos celulares mais modificados em células de doença de Crohn em comparação às saudáveis. E... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Crohn’s disease (CD) is a subtype of inflammatory bowel disease (IBD) characterized by intestinal inflammation and microbiome dysbiosis. The disease is caused by an atypical manifestation of immune response to altered microbial proteins located in the intestinal mucosa. Various meta-omic based analyses have been carried out to profile and characterize the gut microbiota upon onset of CD. However, the molecular mechanisms mediated by the altered CD microbiome wasn’t explored yet due to the technology limitations and disavantages of the experimental methods. In order to analyse this interactio in a molecular level, we performed a computational approach which uses metaproteomic datasets from a twin-pair CD cohort study and prediction of the interaction between human and bacterial proteins. This prediction relies on structural feature based interaction prediction between microbial and host receptor proteins, disordered region inferences, signalling pathways and interaction networks to determine the possible functions mediated by the microbial proteins. As a result, we obtained a host-microbiome interaction network which starts the molecular signal with bacterial proteins interacting with human receptor proteins interactions. The expansion of this signal was modeled in direction to the cellular nucleus, where reaches autophagy genes modulation spots, hence autophagy is one of the key cellular processes to CD development. This model revealed potential differences between CD and hea... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Os éteres de difenilas polibromados (PBDEs) são largamente usados como retardantes de chama e têm sido detectados em diversas amostras biológicas, devido às suas características físico-químicas e bioacumuladoras, as quais fazem com que estes compostos tenham uma elevada persistência no meio ambiente. A exposição a estes compostos pode ser nociva ao homem e aos organismos vivos, uma vez que muitos estudos têm relatado que este composto possui atividade citotóxica. Desta forma, no presente estudo, investigamos o mecanismo de ação dos BDE-47, BDE-99, BDE-154 e BDE-209 sobre o processo autofágico de células HepG2, pois além de ser um processo de reciclagem de moléculas intracelular, a autofagia atua ainda na citoproteção celular. Foram realizados ensaios de imunocitoquímica para detecção de alterações no processo autofágico, no qual foi avaliado, sob microscopia de fluorescência, o padrão de distribuição das proteínas LC3-I e LC3-II; paralelamente, foi realizada a técnica de western blotting para a quantificação de três proteínas associadas ao processo de autofagia - LC3, Beclin-1 e p62. Em nossas análises de imunocitoquímica pode-se observar que os quatro PBDEs em estudo foram capazes desencadear o processo de autofagia, sendo que a magnitude do efeito tóxico foi dependente do tempo de exposição (24 e 48 horas), da concentração utilizada (0,1; 1; 5; 25 ?mol/L) e variável de acordo com o congênere em questão, sendo os BDE-47 e BDE-99 os que apresentaram maior potencial de ativação da autofagia. Além disso, esta indução de autofagia ainda pode ser detectada nos ensaios de western blotting, pois os PBDEs alteraram os níveis de LC3-II, Beclin-1 e p62, havendo um padrão de toxicidade semelhante ao visualizado nos ensaios de imunoistoquímica. Adicionalmente, devido ao fato dos PBDEs poderem se acumular no meio ambiente, principalmente em organismos aquáticos, uma análise dos efeitos destes compostos sobre um modelo ecotoxicológico foi realizada. O zebrafish (D. rerio) foi utilizado como organismoteste, a fim de avaliar a toxicidade destes contaminantes ambientais sobre seus estágios embrionários e larvais. Foram analisados endpoints de letalidade, subletalidade e teratogenicidade após a exposição aos PBDEs em estudo. Sendo que os compostos BDE-47, BDE-99 e BDE-209 (na presença de luz) apresentaram alterações em pelo menos um dos indicadores avaliados, sendo que o parâmetro mais afetado foi a inflação das bexigas natatórias, indicando uma possível teratogenicidade causada por estes compostos. Por outro lado, os BDE-154 e BDE- 209 (na ausência de luz) não causaram malformações no organismo-teste. Diante dos resultados obtidos, pode-se concluir que estes compostos podem causar alterações na homeostase celular desencadeando o processo autofágico, sendo que se absorvidos por organismos, podem afetar o desenvolvimento de espécies como o zebrafish. / Polybrominated diphenyl ethers (PBDEs) are widely used as flame retardants and they have been detected in several biological samples due to their physicochemical and bioaccumulating characteristics, which make these compounds to have a high persistence in the environment. The exposure to these compounds can be harmful to man and other living organisms, since many studies have reported that this compound has cytotoxic activity. Thus, in the present study, we investigated the mechanism of action of the BDE-47, the BDE-99, the BDE-154 and the BDE-209 on the autophagic process of HepG2 cells, because beyond being an intracellular molecule recycling process, autophagy acts also in the cell cytoprotection. Immunocytochemistry assays were performed to detect changes in the autophagic process, in which the distribution pattern of the LC3-I and LC3-II proteins was evaluated under fluorescence microscopy. In parallel, the western blotting technique was used to quantify three proteins associated with the autophagy process - LC3, Beclin and p62. In our analyzes of immunocytochemistry it can be observed that the four PBDEs in the study were able to trigger the autophagy process, and the magnitude of the toxic effect was dependent on the exposure time (24 and 48 hours), on the used concentration (0.1; 1; 5; 25 ?mol/L), and it varies according to the congener. The BDE-47 and BDE-99 are the ones with the highest potential for autophagy activation. In addition, this autophagy induction can still be detected in the western blotting assays, because the PBDEs altered the levels of LC3-II, Beclin-1 and p62, with a similar pattern of toxicity as seen in the immunohistochemical assays. In addition, due to the fact that PBDEs may accumulate in the environment, mainly in aquatic organisms, an analysis of the effects of these compounds on an ecotoxicological model was performed. The Zebrafish (D. rerio) was used as a test organism in order to evaluate the toxicity of these environmental contaminants on their embryonic and larval stages. In this study, lethality, sublethality and teratogenicity endpoints were analyzed after exposure to the PBDEs. The BDE-47, BDE-99 and BDE-209 compounds (in the presence of light) presented alterations in at least one of the indicators evaluated, and the most affected parameter was the swim bladder inflation, indicating a possible teratogenicity caused by these compounds. On the other hand, the BDE-154 and the BDE-209 (in the absence of light) did not cause malformations in the test organism. Considering the results, it can be concluded that these compounds are able to cause changes in cellular homeostasis triggering the autophagic process, and whether absorbed by organisms, they can affect the development of species such as zebrafish.

A autofagia é o processo de degradação de estruturas celulares através do seu direcionamento ao lisossomo. As proteínas TRIMs reconhecem as -cargas? autofágicas e reúnem o complexo de nucleação do fagóforo, contudo se desconhece a função de cada domínio e a importância da atividade de E3 ligase para a sua atividade. A proteína TRIM49 clonada e expressa em E. coli ou em células humanas HEK293T não apresentou atividade de E3 ubiquitina ligase in vitro e reduziu os níveis totais de ubiquitinação in vivo, indicando que não é um E3 ubiquitina ligase. Células desafiadas com Htt74Q apresentaram menores níveis de citotoxicidade quando co-transfectadas com TRIM49 selvagem, mas não com os mutantes do domínio RING ou SPRY, indicando os dois domínios são necessários para sua atividade celular. A proteína selvagem se colocaliza com o marcador autofágico LC3, após o bloqueio da autofagia com bafilomicina A1. Os resultados indicam que a TRIM49 pode atuar na degradação intracelular de proteínas, por um mecanismo não dependente de atividade de E3 ligase. / Autophagy is the process of degradation of intracellular proteins through their directioning to the lysosome. TRIM proteins can directely recognize autophagic cargo and also act as a hub for the phagophore nucleation complex, however the function of each domain and the role of the E3 ligase activity in this process is unknown. The TRIM49 protein cloned and expressed in E. coli or in human cells HEK23T showed no ubiquitin E3 ligase activity in vitro and cells transfected with the wild type protein showed lower levels of polyubiquitinated proteins, indicating that TRIM49 is not a bona fide E3 ubiquitin ligase. Cells challenged with Htt74Q presented lower cytotoxicity levels when cotransfected with wild type TRIM49, when compared with the RING domain mutant or with the truncated protein lacking the SPRY domain, indicating that both domains are required for its cellular activity. The wild type protein colocalizes with the autophagic marker LC3 after treatment with the autophagy inhibitor bafilomycin A1. Taken together, these results indicate that the TRIM49 protein plays a role in protein degradation independently of a E3 ligase activity.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario. Tesis para optar al Grado de Magíster en Ciencias Animales y Veterinarias mención Patología Animal. / Introducción. El cáncer mamario es el tipo de tumor más prevalente en la hembra canina. Información reciente demuestra que simvastatina exhibe un efecto antitumoral in vitro e induce autofagia sobre diversas líneas celulares neoplásicas. Sin embargo, no hay evidencia de que ocurra en células de carcinoma mamario canino. La autofagia es un proceso catabólico que permite a las células sobrevivir bajo condiciones de estrés metabólico, cumpliendo un rol dual en cáncer asociado a supresión y promoción tumoral dependiendo del contexto celular. En ese contexto, la autofagia jugaría un rol en la sobrevida y muerte de células tumorales en respuesta a agentes antitumorales. El objetivo de este estudio fue analizar los efectos de simvastatina sobre la autofagia y la viabilidad de células de carcinoma mamario canino CF41.Mg. Materiales y métodos. Células CF41. Mg fueron cultivadas y tratadas con simvastatina (1 y 5 M) por 24 horas y analizadas mediante citometría de flujo utilizando naranja de acridina. Se analizó la expresión de LC3 y beclina-1 en células tratadas con simvastatina y 3-metiladenina (inhibidor de autofagia) mediante inmunocitoquímica. Adicionalmente, se realizó un ensayo de viabilidad celular mediante el método de exclusión de azul tripan con células tratadas con simvastatina en presencia de Q-VD-OPh (inhibidor de apoptosis) y 3-metiladenina. Resultados Tanto la actividad autofágica como la expresión de LC3 y beclina-1 fueron inducidas por simvastatina (p<0.05). Estos efectos fueron revertidos por 3-metiladenina. Simvastatina inhibió la viabilidad celular en forma significativa, aún en presencia de 3-metiladenina (p<0.05). Q-VD-OPh bloqueó el efecto antiproliferativo desencadenado por simvastatina. Conclusiones El efecto antiproliferativo de simvastatina sobre células de carcinoma mamario canino CF41.Mg no es dependiente de la autofagia inducida por la misma droga. La citotoxicidad de simvastatina se explica casi completamente por la activación de caspasas / Introduction Mammary cancer is the most prevalent type of tumor in the female dogs. Recent data shows that simvastatin exhibit an antitumor effect in vitro and it is able to induce autophagy in some neoplastic cell lines. However, there is still no evidence in canine mammary cancer cells. Autophagy is a mayor catabolic process that allows the cells to survive under metabolic stress, performing a dual role in cancer associated to tumor suppression/progression depending on cellular context. Under this context, the autophagy may play a role in the survival and death of tumoral cell in response to anti-tumoral agents. The object of this study was to analyze the effects of simvastatin over the autophagy and viability of canine mammary carcinoma cells CF41.Mg. Materials and methods CF41.Mg cells were treated with simvastatin (1 y 5 M) for 24 hours and analyzed by flow cytometry using acridine orange dye. The expression of LC3 and beclin-1 in cells treated with simvastatin/3-methyladenine (autophagy inhibitor) by immunocytochemistry was analyzed. Cell proliferation assays with trypan blue dye in presence of simvastatin, Q-VD-OPh hydrate (pancaspase inhibitor) and 3-methyladenine were performed. Results Both autophagy activity and LC3/beclin-1 expression were induced by simvastatin (p<0.05). These effects were reversed by 3-methyladenine. This statin inhibited the cell viability, even in the presence of 3-methyladenine (p<0.05). Q-VD-OPh hydrate blocked the anti-proliferative effect of simvastatin. Conclusions The anti-proliferative effect of simvastatin over canine mammary carcinoma cells CF41.Mg it’s non-depending of the autophagy induced by the drug. The cytotoxicity of simvastatin it’s explained almost completely by the caspases activation / Financiamiento: Proyecto Fondecyt No. 11110148.

Este trabajo de tesis pretende profundizar el conocimiento de las vacuolas asociadas a la senescencia (VAS) a través de tres temáticas: - el desarrollo, entendido como la variación temporal de las VAS, su biogénesis y el efecto de moduladores de la senescencia; - la caracterización de la actividad biológica de las VAS participando en el desmantelamiento del aparato fotosintético; - y la relación entre el mecanismo de autofagia y el desarrollo de las VAS. En general, para abordar estos objetos de estudios se empleó un sistema sencillo y frecuentemente empleado en trabajos sobre senescencia foliar. El modelo de senescencia inducida permite trabajar en un sistema relativamente homogéneo y reproducible. Consiste en separar las hojas de la planta, tratarlas con un precursor de la hormona etileno, denominado etefón, y almacenarlas en oscuridad. De esta manera, la senescencia es inducida por el corte y la oscuridad, y sincronizada a nivel tisular por el tratamiento hormonal.

A hipóxia-isquemia (HI) encefálica é uma das causas mais frequentes de lesões graves com comprometimento crônico das capacidades neurológicas e também de óbito neonatal do mundo. A HI cerebral resulta em alterações hemodinâmicas, bioquímicas e neurofisiológicas como uma consequência direta da falta de oxigênio e glicose. Esses processos podem levar a um dano cerebral por meio da ativação de mecanismos citotóxicos e apoptóticos, que causam prejuízo e morte à célula. Recentemente, alguns estudos mostraram que os danos gerados pela HI neonatal apresentam dimorfismo sexual. Na presente tese, foram avaliados os efeitos da HI neonatal sobre parâmetros de estresse oxidativo e de dano celular após a lesão encefálica em machos e fêmeas a fim de se detectar a contribuição do dimorfismo sexual para a lesão. Foi observado que a HI aumentou a produção de radicais livres causando peroxidação lipídica, e também aumentou a atividade da enzima antioxidante superóxido dismutase (1h e 2h após a HI). Além disso, a HI inibiu a atividade da enzima Na+, K+-ATPase imediatamente após a lesão. Estes dados demonstram que a HI foi capaz de induzir o estresse oxidativo e levar à perda de homeostase celular através da alteração no controle da bomba de Na+ e K+ no encéfalo dos neonatos após a lesão. Tendo em vista que a mitocôndria é a principal fonte de espécies reativas de oxigênio (EROs) na célula nós investigamos os efeitos da HI sobre a função mitocondrial. Machos e fêmeas expostos à HI apresentaram diminuição na atividade do complexo II da cadeia respiratória em hipocampo, além de diminuição da massa e do potencial de membrana (Δψ) mitocondrial tanto no córtex quanto no hipocampo, 2h após o insulto. Por outro lado, em 18h, a atividade dos complexos (I-III, II e IV) da cadeia respiratória mostrou uma inibição severa que foi acompanhada de diminuição de massa e Δψ mitocondrial em ambos os sexos, exceto pelo fato dos machos não apresentarem diminuição na massa mitocondrial. Esses dados mostram que a formação de espécies reativas bem como a peroxidação lipídica ocorre provavelmente devido à inibição da atividade dos complexos da cadeia respiratória. Tão importante quanto a disfunção mitocondrial induzida pela HI, os resultados apontam a presença de dimorfismo sexual neste parâmetro avaliado, uma vez que as fêmeas, além de apresentarem uma atividade dos complexos da cadeia respiratória per se maior quando comparadas aos machos, elas mostraram-se mais vulneráveis ao dano da HI. Com a finalidade de identificar a possível contribuição da autofagia para as diferentes alterações mitocondriais encontradas em machos e fêmeas, a atividade autofágica foi mensurada nos neonatos 18h após a lesão. Nós constatamos que as alterações encontradas – estresse oxidativo e disfunção mitocondrial – foram capazes de induzir a atividade autofágica. Entretanto esta se manifestou de forma distinta em córtex e hipocampo e também de maneira diferente em machos e fêmeas. No córtex, as fêmeas submetidas à HI tiveram aumento no número de autofagossomos (ativação da autofagia), porém diminuição dos autolisossomos, demonstrando uma possível inibição de algum passo final do processo. Já no hipocampo, os machos submetidos à HI tiveram indução da autofagia e as fêmeas apresentaram um aumento per se da atividade autofágica tanto nos animais controle quanto nos HI. É possível que o aumento das EROs pela cadeia respiratória e a perda de Δψ mitocondrial tenham induzido a autofagia após a lesão causada pela HI no encéfalo dos neonatos. Essas diferenças sexo-específicas são importantes não somente para entendermos o mecanismo de dano causado pelo insulto, mas também para direcionarmos os estudos sobre as estratégias terapêuticas de acordo com o sexo do indivíduo afetado. / Brain hypoxia-ischemia (HI) is one of the most common causes of severe chronic impairment of neurological abilities and also neonatal death in the world. Brain HI results in hemodynamic, biochemical and neurophysiological changes as a direct consequence of oxygen and glucose absence. These processes can lead to brain damage through activation of cytotoxic and apoptotic mechanisms, which cause injury and death to the cell. Recently, some studies have shown that the damage caused by neonatal HI presents sexual dimorphism. In this thesis, it was evaluated the effects of neonatal HI on oxidative stress parameters and cell damage after brain lesion in males and females to verify sexual dimorphism contribution to the lesion. It was observed that HI increased free radicals production leading to lipid peroxidation and also increased superoxide dismutase activity (1h and 2h after HI). Besides, HI inhibited Na+, K+-ATPase activity immediately after injury. These data demonstrated that HI was able to induce oxidative stress and lead to cell homeostase loss through modifications on Na+ and K+ pump control in neonatal brain after injury. Considering that mitochondria are the main source of reactive oxygen species (ROS) in cell we investigated the effects of HI on mitochondrial function. Males and females exposed to HI showed a decrease in complex II activity of hippocampal respiratory chain in addition to diminished mass and mitochondrial membrane potential (Δψ) in both cortex and hippocampus, 2h after insult. On the other hand, at 18h activity of respiratory chain complexes (I-III, II e IV) showed a severe inhibition that was accompanied by a decrease of mitochondrial mass and Δψ in both sexes, except that males do not show decrease in mitochondrial mass. These data demonstrated that reactive species formation and lipid peroxidation probably occur due to inhibition of respiratory chain complexes activities. Just as important as mitochondrial dysfunction induced by HI, results indicate the presence of sexual dimorphism on this parameter, since females, besides having a higher per se activity of respiratory chain complexes compared to males, they were more vulnerable to HI damage. In order to identify the possible contribution of autophagy to the distinct mitochondrial alterations found in males and females, autophagic activity was measured in neonates 18h after injury. We verify that changes found – namely oxidative stress and mitochondrial dysfunction - were able to induce autophagic activity. However, it manifested differently in cortex and hippocampus and also in males and females. In the cortex, females subjected to HI had an increase in autophagosomes (activation of autophagy), but decreased autolysosomes, showing a possible inhibition of a final step of the process. On hippocampus, males subjected to HI had autophagy induction and females showed a per se increase in autophagic activity in both control and HI animals. It is possible that ROS increased in respiratory chain and loss of mitochondrial Δψ had induced autophagy after lesion caused by HI in the neonatal brain. These sex-specific differences are important not only to understand the mechanism of damage caused by HI insult, but also to direct studies on the therapeutic strategies according to the sex of the affected subject.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:25Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-06-30 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / O melanoma cutaneo e um tumor originado a partir da proliferacao descontrolada de melanocitos. A incidencia do melanoma maligno tem aumentado significativamente nas ultimas decadas e se tornado um problema de saude publica em muitos paises. Na imunoterapia contra o cancer, anticorpos monoclonais (mAbs) sao utilizados como ferramentas para diagnostico, monitoramento e tratamento da doenca. A descoberta de novos alvos terapeuticos para mAbs em celulas tumorais, e a determinacao dos mecanismos de citotoxicidade gerados pelos mesmos pode ampliar significativamente as possibilidades e o sucesso dos tratamentos. Anteriormente em nosso laboratorio, Dobroff e colaboradores (2002) isolaram um mAb (mAb A4) que foi citotoxico in vitro sobre celulas de melanoma murino B16F10-Nex2 e sobre algumas celulas tumorais humanas, efeito independente do complemento, mas aumentado por este. O mAb A4 reduziu o desenvolvimento do melanoma murino B16F10-Nex2 in vivo, aumentando a sobrevida dos animais. O alvo do mAb A4 na superficie celular e a proteina Protocaderina ƒÀ13 (PCDHƒÀ13), membro da superfamilia das caderinas. A interacao entre ambos levou as celulas tumorais a morte, em processo sugestivo de apoptose (Dobroff et. al., 2010, em publicacao). Neste trabalho, verificamos a reatividade do mAb A4 com celulas do melanoma murino e com algumas outras linhagens tumorais humanas atraves de ELISAQuimioluminescente e Imunofluorescencia Indireta. A expressao do gene PcdhƒÀ13 foi verificada por RT-PCR nao quantitativo e a expressao da proteina PCDHƒÀ13, por Immunoblotting. Verificou-se que, somente celulas que expressam a proteina PCDHƒÀ13 na membrana plasmatica sao suscetiveis a acao do mAb A4. O mAb A4 foi citotoxico in vitro contra o melanoma murino e contra linhagens tumorais humanas, incluindo melanoma, carcinoma de colon, carcinoma de cervice uterino e glioblastoma. O mAb A4 nao foi citotoxico contra linhagens humanas de carcinoma de mama e contra a linhagem de melanocitos murinos imortalizados melan A, que nao expressam a PCDHƒÀ13. A interacao do mAb A4 com celulas B16F10-Nex2.1 in vitro ocasionou a endocitose do mAb A4 em vesiculas, rapida reducao nos niveis de ƒÀ-catenina livre no citoplasma e do fator de transcricao TCF-4, redistribuicao da ƒÀ-catenina para a periferia celular, ativacao das caspases-9, -3 e -6, exposicao de fosfatidilserina na membrana plasmatica, condensacao da cromatina e degradacao internucleossomal do DNA, corroborando a inducao de um processo de morte por apoptose pela via intrinseca nessa celula tumoral. Adicionalmente, observou-se o aumento da producao de especies reativas de oxigenio, que podem amplificar o processo apoptotico. A inibicao da via de sinalizacao da ƒÀ-catenina sugere que vias de sinalizacao intracelular que regulam o crescimento e a sobrevivencia foram inibidas pela interacao entre o mAb A4 e seu alvo na celula. A presenca de vesiculas sugestivas de autofagossomos nas imagens de microscopia de transmissao eletronica pode indicar a inducao de um processo de autofagia em paralelo ao processo apoptotico. Concluimos que o mAb A4 demonstrou ser um potencial agente anti-tumoral com atividade contra diversos tipos de tumores murinos e humanos. A proteina PCDHƒÀ13 pode ser um potencial marcador de malignidade para o melanoma. A interacao entre o mAb A4 e a PCDHƒÀ13 levou a celula de melanoma a morte atraves da inibicao da via de sinalizacao intracelular b-catenina/TCF-4 e da inducao de apoptose pela via intrinseca. O processo de autofagia pode ter uma possivel participacao no efeito anti-tumoral induzido pelo mAb A4. / Malignant melanoma is a highly metastatic skin cancer which arises from malignant transformation of melanocytes. Incidence of melanoma has been increasing in the last decades, becoming a major public health problem in many countries. Monoclonal antibodies (mAbs) have been used in cancer immunotherapy as tools for diagnosis, monitoring and treatment of tumors. The discovery of new therapeutic targets for mAbs in tumor cells, and the establishment of their cytotoxic mechanisms might significantly improve the possibilities and efficacy of cancer treatments. Previously in our research group, Dobroff and collaborators (2002) produced a mAb, named A4, which was cytotoxicity in vitro against B16F10-Nex2 murine melanoma cells and some human tumor cell lines. This effect was independent of complement, although enhanced by it. MAb A4 decreased B16F10-Nex2 murine melanoma development in vivo, significantly increasing animal survival. This mAb recognizes Protocadherin â13 (PCDHâ13) at tumor cell surface, a protein that belongs to the cadherin superfamily, and preliminary results suggested that mAb A4/PCDHâ13 interaction leads tumor cell to apoptosis (Dobroff et. al., 2010, in press). In the present work, mAb A4 reactivity with murine melanoma cells and several human tumor cell lines was verified by Chemoluminescent ELISA and Indirect Immunofluorescence assays. Pcdhâ13 mRNA expression was detected by nonquantitative RT-PCR and PCDHâ13 protein expression by Immunoblotting assay. Only PCDHâ13-expressing tumor cells were susceptible to mAb A4 cytotoxicity. MAb A4 was cytotoxic in vitro to murine melanoma and to human tumor cell lines, including melanoma, colon carcinoma, cervical uterine epithelioid carcinoma and glioblastoma. MAb A4 had no activity against breast carcinoma cell lines and murine immortalized melanocytes melan A, which do not express PCDHâ13. MAb A4 interaction with B16F10-Nex2.1 cells in vitro triggered mAb A4 endocytosis, rapid reduction of free cytoplasmic â-catenin and TCF-4 concentrations, redistribution of â-catenin to cell periphery, caspases-9, -3, and -6 activation, phosphatidilserine translocation to cell membrane, chromatin condensation and internucleossomal DNA fragmentation, confirming the induction of mitochondrialdependent apoptosis in that tumor cell line. Additionally, mAb A4 induced overproduction of oxygen reactive species, which can amplify the apoptotic process. The inhibition of â-catenin signaling suggests that signaling pathways that regulate cell survival and growth were inhibited by mAb A4 interaction with its target on the cell surface. Transmission electron microscopy images revealed the presence of autophagosomes, suggesting the simultaneous induction of autophagy and apoptosis by mAb A4. We conclude that mAb A4 may represent a new therapeutic agent with antitumor activity against murine and human tumors. PCDHâ13 is a potential melanoma marker. MAb A4 interaction with PCDHâ13 induced cell death through inhibition of b-catenin/TCF-4 signaling pathway and induction of the apoptosis intrinsic pathway. The autophagic process might be also implicated in mAb A4 cytotoxic effect. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2012-11-30T20:45:01Z No. of bitstreams: 1 José Geraldo Bomfim Lima Efeito da autofagia... 2009.pdf: 32365208 bytes, checksum: 34504be1e8f6483c263480600d8e1880 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-11-30T20:45:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 José Geraldo Bomfim Lima Efeito da autofagia... 2009.pdf: 32365208 bytes, checksum: 34504be1e8f6483c263480600d8e1880 (MD5) Previous issue date: 2009 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, Bahia, Brasil / A autofagia vem sendo alvo de estudos que demonstram sua participação em infecções por diversos patógenos intracelulares. A depender do patógeno, a autofagia pode facilitar a sobrevivência intracelular do patógeno ou pode funcionar como controle da infecção pela célula hospedeira. Pouco se sabe sobre a participação da autofagia na infecção por Leishmania. Foi demonstrado que o vacúolo parasitóforo induzido por L mexicana adquire nutrientes citosólicos por microautofagia. Além disso, recentemente foi demonstrado que a indução de autofagia promove aumento da carga parasitária de L. amazonensis em macrófagos infectados. Esses dados sugerem a participação do processo autofágico no estabelecimento da infecção por Leishmania, como um mecanismo que favorece a sobrevivência intracelular do parasito. Assim, o objetivo desse estudo foi determinar a influência da autofagia na infecção, in vitro, de macrófagos de camundongos CBA/J por L. amazonensis. Macrófagos foram induzidos à autofagia por duas formas, fisiológica ou farmacológica, após ou antes da infecção por L. amazonensis ou exposição a partículas de levedo ou zimosan. O percentual de infecção e de fagocitose foi estimado. Os resultados mostram que a indução de autofagia, após a infecção, não altera o percentual de macrófagos infectados, mas promove o aumento na carga parasitária de macrófagos infectados por L. amazonensis. Além disso, a prévia indução de autofagia promove a inibição da capacidade fagocítica do macrófago murino. Estudos adicionais serão realizados no intuito de esclarecer os mecanismos pelos quais a indução de autofagia favorece a infecção por L. amazonensis e altera a capacidade fagocítica do macrófago murino / Recently, studies to delineate the participation of autophagy in intracellular pathogen infections have been performed. Dependent on pathogen infection, autophagy can facilitate microorganism intracellular survival or can control pathogen infection by host cell. Few works evaluated the role of autophagy in Leishmania infection. Recently, it was demonstrated that L mexicana-'mduced parasitophorous vacuoles acquire cytosolic nutrients by microautophagy. Additionally, it was also demonstrated that autophagy promotes enhancement of L. amazonensis burden on infected cells. Taken together, these data suggest the involvement of autophagic process on Leishmania infection, as a mechanism that favors parasite survival. The present work intent to determine the influence of autophagy in L. amazonensis infection of CBA/J macrophages in vitro. Autophagy was induced after and before L. amazonensis infection or particle addition to macrophage cultures. The percentage of infection and particle phagocytosis was estimated. The results show that autophagy induction after infection does not influence the percentage of L. a/rjazonens/s-infected cells, but enhances L. amazonensis burden on infected cells. In addition, previous autophagy induction inhibited macrophage phagocytic capacity. Further studies will be performed to understand the mechanisms involved in autophagy effect on L. amazonensis infection and on macrophage phagocytic capacity.