A urocortina 2 (Ucn2) é um peptídeo que pertence à família dos fatores liberadores de corticotrofina (CRF) e, assim como seu receptor específico CRF2R? (corticotropin releasing factor receptor type 2?), encontram-se expressos no músculo esquelético. Embora tenha sido demonstrado que o tratamento sistêmico com Ucn2 seja capaz de induzir hipertrofia e prevenir a perda de massa muscular, nada se conhece acerca dos mecanismos moleculares através dos quais a Ucn2 desempenha suas ações biológicas. O principal objetivo deste trabalho foi investigar o mecanismo de ação da Ucn2 no músculo esquelético de roedores para o aparecimento da resposta hipertrófica e a possível participação das vias de sinalização Akt/mTOR, Akt/Foxo e ERK1/2 neste efeito anabólico. Para isto foi utilizado o modelo de transfecção in vivo da Ucn2 pelo método da eletroporação em músculos tibialis anterior de camundongos. Nestes músculos foram quantificados: 1) o estado de fosforilação de componentes efetores destas vias; 2) moléculas sinalizadoras da via autofágica; 3) a taxa de síntese proteica in vivo e 4) a expressão de genes relacionados à atrofia muscular (atrogenes). Outra metodologia utilizada para verificar o efeito direto da Ucn2 na musculatura esquelética foi a incubação in vitro de músculos soleus e EDL isolados de roedores com este peptídeo a fim de investigar a taxa de degradação proteica total, bem como a atividade dos sistemas proteolíticos lisossomal¸ ubiquitina-proteassoma e dependente de Ca+2. A superexpressão in vivo da Ucn2 por 14 dias promoveu hipertrofia e preveniu a atrofia em músculos tibialis anterior de camundongos normais e submetidos ao modelo de desnervação motora isquiática.Resumo Este crescimento muscular induzido pela Ucn2 in vivo foi associado a ativação das vias de sinalização AMPc/PKA/CREB, AMPc/Epac, Akt/mTOR/S6, Akt/mTOR/4E-BP1 e ERK1/2/eIF4E com consequente estimulação da síntese proteica. Em concordância, utilizando uma técnica de manipulação genética in vivo, demonstramos que a hipertrofia promovida pela Ucn2 é dependente da estimulação das cascatas de sinalização ativadas por Akt e ERK1/2. Ademais, essa alteração fenotípica promovida pela Ucn2 induziu melhora da resistência à fadiga muscular, sendo este impacto funcional dependentente de ERK1/2, mas não de Akt. Além disso, a superexpressão da Ucn2 induziu \"shifting\" para o tipo de fibra oxidativa (tipo I), sendo esta plasticidade possivelmente mediada por PGC-1?, o que pode ter contribuído pelo menos em parte, para o efeito benéfico promovido pela Ucn2 na função muscular. O efeito antiatrófico da Ucn2 in vivo foi associado à estimulação da via Akt/Foxo1,3 concomitante com a redução da atividade transcricional de Foxo, resultando na diminuição da expressão da E3-ligase atrogin-1 e do gene autofágico LC3. Em paralelo, a Ucn2 in vivo promoveu inibição do fluxo autofágico, inferido pelo acúmulo das proteínas LC3-I, LC3-II e p62 nestes músculos. Corroborando os achados in vivo, os efeitos antiproteolíticos da Ucn2 in vitro parecem ser mediados pelo AMPc e envolvem a supressão da atividade do sistema lisossomal/autofágico em músculos EDL de ratos normais. Portanto, além da participação de efetores dowsntream do AMPc, como PKA e EPAC, diferentes quinases participam dos efeitos biológicos da Ucn2 na musculatura esquelética. Esses resultados são importantes para caracterizar novas estratégias terapêuticas capazes de atuar no combate à atrofia muscular em diversas situações catabólicas. / Urocortin 2 (Ucn2) is a peptide that belongs to corticotrophin releasing factors (CRF) family and, as well as its specific receptor CRF2R? (corticotropin releasing factor receptor type 2?), are expressed in skeletal muscle. Although it has been demonstrated that Ucn2 systemic treatment is able to induce hypertrophy and prevent loss of muscle mass, nothing is known about the molecular mechanisms through which Ucn2 plays its biological actions. The main objective of this work was to investigate the Ucn2 mechanism of action in rodent skeletal muscle for the appearance of the hypertrophic response and the possible participation of Akt/mTOR, Akt/Foxo and ERK1/2 signaling pathways in this anabolic effect. For this, an in vivo transfection model of Ucn2 was used by the electroporation method in tibialis anterior muscles of mice. Were quantified in these muscles: 1) the phosphorylation state of effector components of these pathways; 2) signaling molecules of the autophagic pathway; 3) the rate of protein synthesis in vivo and 4) the expression of genes related to muscle atrophy (atrogenes). Another methodology used to verify the direct effect of Ucn2 in skeletal muscle was the incubation of soleus and EDL muscles isolated from rodents with this peptide in vitro in order to investigate the total rate of protein degradation, as well as the activity of the lysosomal, ubiquitin-proteasome and Ca+2 dependent proteolytic systems. Ucn2 overexpression in vivo for 14 days promoted hypertrophy and prevented atrophy in tibialis anterior muscles of normal mice and submitted to the sciatic motor denervation model. This muscle growth induced by Ucn2 in vivo was associated with the activation ofAbstract cAMP/PKA/CREB, cAMP/Epac, Akt/mTOR/S6, Akt/mTOR/4E-BP1 and ERK1/2/eIF4E signaling pathways with consequent stimulation of protein synthesis. In agreement, using a genetic manipulation technique in vivo, we demonstrated that the hypertrophy promoted by Ucn2 is dependent on the stimulation of the signaling cascades activated by Akt and ERK1/2. In addition, this phenotypic alteration promoted by Ucn2 induced an improvement in muscle fatigue resistance, being this functional impact dependent on ERK1/2, but not on Akt. Moreover, Ucn2 overexpression in vivo induced the shift to type I oxidative fiber, and this plasticity is possibly mediated by PGC-1?, which may have contributed at least in part to the beneficial effect promoted by Ucn2 in muscle function. The anti-atrophic effect of Ucn2 in vivo was associated with the stimulation of Akt/Foxo1,3 pathway concomitant with the reduction of Foxo transcriptional activity, resulting in a decrease in the expression of the atrogin-1 E3-ligase and of the autophagic gene LC3. In parallel, Ucn2 in vivo promoted inhibition of autophagic flow, inferred by the accumulation of LC3-I, LC3-II and p62 proteins in these muscles. Corroborating the in vivo findings, the antiproteolytic effects of Ucn2 in vitro appear to be mediated by cAMP and involve the suppression of lysosomal/autophagic system activity in EDL muscles of normal rats. Thus, in addition to the participation of cAMP dowsntream effectors, such as PKA and EPAC, different kinases participate in the biological effects of Ucn2 on skeletal muscle. These results are important to characterize new therapeutic strategies able to prevent muscular atrophy in several catabolic situations.

O diabetes mellitus tipo 1 é uma doença metabólica, caracterizada pela desregulação glicêmica, que ocorre devido a um ataque autoimune. A insulinoterapia é o tratamento clássico para o DM1. Contudo, alguns pacientes que apresentam essa doença não respondem de forma eficiente a este tratamento e apresentam episódios frequentes de hipoglicemia severa e despercebida (pacientes hiperlábeis). Essas complicações comprometem de forma significativa a qualidade de vida dessas pessoas. O transplante de ilhotas é uma importante alternativa para o tratamento de pacientes hiperlábeis com DM1. No entanto, essa terapia apresenta restrições como a necessidade de mais de um doador por transplante e significativa morte das ilhotas devido ao estresse provocado pelo procedimento de isolamento, além da morte promovida pelo sistema imune do paciente nos primeiros momentos pós-transplante. A autofagia é um mecanismo de reciclagem de componentes citoplasmáticos que é fundamental para a homeostase celular. Em condições de estresse, este mecanismo é ativado acima do seu nível basal, promovendo a degradação de agregados proteicos e organelas defeituosas, evitando assim, danos celulares que comprometam a viabilidade da célula. Trabalhos realizados por nosso grupo têm mostrado a citoproteção que PRL promove em células-beta, reduzindo a apoptose induzida por citocinas pró-inflamatórias. Também demonstramos o papel essencial de HSPB1 na inibição de apoptose induzida por PRL após o tratamento com citocinas. Além disso, resultados recentes de nosso laboratório mostraram um aumento nos níveis de autofagia em células-beta após sua exposição a citocinas, bem como uma restauração a níveis normais na presença de PRL. Visando um melhor entendimento do papel da PRL na modulação da autofagia em células-beta, o objetivo desse projeto foi estudar se HSPB1 também é essencial no mecanismo de regulação da autofagia induzido por PRL.Para tal, fizemos experimentos em modelos de células-beta MIN6, MIN6 silenciadas para HSPB1 (MIN6-shHSPB1) e MIN6 com sequencia short hairpin aleatória (MIN6- SsC), medindo a morte celular através de ensaios de viabilidade, e ensaios de western blot para avaliar os níveis de marcadores de autofagia e fluxo autofágico (degradação de autofagossomos), tratando as células com citocinas, prolactina e indutores ou inibidores de autofagia. Os resultados mostraram que a modulação da autofagia ocasionada pela prolactina em células-beta se dá, em parte, através de HSPB1. O tratamento com prolactina foi capaz de inibir a morte celular induzida por citocinas, mesmo na presença de cloroquina, um bloqueador de autofagia, o que nos levou a concluir que a autofagia não é uma via envolvida na citoproteção de células beta induzida por PRL. Os resultados gerados nesse estudo contribuíram para uma melhor compreensão dos eventos moleculares induzidos por PRL em células-beta, e poderão permitir a inferência de novas abordagens que melhorem a citoproteção, cultura e transplante dessas células em pacientes com diabetes tipo 1. / Type 1 diabetes mellitus is a metabolic disease characterized by glycemic dysregulation, which occurs due to an autoimmune destruction of beta-cells. Insulin therapy is the gold standard treatment for DM1. However, some DM1 patients do not respond efficiently to this treatment and suffer frequent episodes of severe hypoglycemia unawareness. Since this complication jeopardizes the quality of life of these people, Islet transplantation is a therapeutic alternative indicated to treat these patients. However, besides the lack of enough organ donors, the loss of beta cells during both the isolation as well as the infusion of islets into the recipient induce a great estresse and thus a significant cell death is one of the drawbacks of this procedure. Autophagy is a mechanism of recycling cytoplasmic components and is essential for cellular homeostasis. Under estresse conditions, this mechanism is activated above basal levels, promoting the degradation of protein aggregates and defective organelles, thus avoiding cell damage that could compromise cell viability. Studies carried out by our group have shown not only that PRL promotes cytoprotection in beta-cells, reducing pro-inflammatory cytokines-induced apoptosis, but also that HSPB1 plays an essential role in this inhibition of apoptosis mediated by PRL after treatment with cytokines. Moreover, recent results from our laboratory showed an increase in autophagy levels in beta-cells after exposure to cytokines, as well as a restauration to normal levels in the presence of PRL. In order to better understand the role of PRL in the modulation of autophagy in these cells, the aim of this project is to study whether HSPB1 is also essential in the mechanism of autophagy regulation induced by PRL. Using MIN6 beta cell models where HSPB1 was silenced (MIN6-shHSPB1) or not (MIN6-SsC), we studied cell death by viability assays. Moreover, western blot assays were performed in order to assess levels of autophagy and autophagic flux markers in the cells.Our results showed that HSPB1 in one of the mediators of PRL-induced modulation of autophagy. Nevertheless, since hormonal treatment was still able to inhibit cytokinesinduced cell death even in the presence of chloroquin, an autophagy blocker, we conclude that autophagy is not a signaling pathway involved in PRl-induced beta-cell cytoprotection. Altogether, the results shown in this study may help to increase the knowledge of the molecular events induced by PRL in beta-cells, and may allow to infer new approaches to improve cytoprotection, culture and transplantation of these cells into type 1 diabetic patients.

O presente trabalho teve como objetivo investigar o tipo de morte induzida nas linhagens de carcinoma mamário humano MCF-7 (ER+) e MDA-MB-435 (ER-), pela fração isolada do extrato de folhas de barbatimão. As folhas de Stryphnodendron adstringens (Martius) Coville (Fabaceae) foram coletadas, secas e utilizadas para o preparo do extrato acetônico, que foi particionado com acetato de etila. A fração aquosa remanescente foi liofilizada e fracionada por cromatografia em Sephadex LH 20. As frações coletadas foram submetidas à cromatografia em camada delgada e a fração eluída com metanol a 100% foi utilizada nos experimentos, por apresentar o maior conteúdo de proantocianidinas. A análise por HPLC permitiu verificar que a fração isolada contem procianidina dimérica B1, epigalocatequina-3-O-galato e ácido gálico. As células de adenocarcinoma mamário MCF-7 (ER+) e MDA-MB-435 (ER-) foram tratadas por 24 h com diferentes concentrações da fração (5 – 160 μg/mL) e com ciclofosfamida a 550 μg/mL. O tratamento das células com a fração isolada induziu redução da viabilidade celular e alterações morfológicas nas duas linhagens, incluindo perda da morfologia celular típica, condensação da cromatina e diminuição da área das colônias e das células. A DE50 para células MCF-7 foi de 12,35 μg/mL e para as células MDA-MB-435 foi de 34,43 μg/mL, sendo as células MCF-7 mais sensíveis ao tratamento. A análise por Western blotting mostrou que tratamento o com a fração induziu aumento da expressão de Bax e diminuição de Bcl-2 nas células, indicando apoptose. Houve ainda aumento da expressão de caspase-9, caspase-3-ativa e caspase-8, além da diminuição da expressão da caspase-3 e pró-caspase-8. Estas proteínas estão envolvidas na via intrínseca de indução da apoptose. Foi observado também aumento de proteínas marcadoras da autofagia, LC-3 nas duas linhagens e beclin-1 nas células MDA-MB-435. Assim, os resultados do presente trabalho permitem concluir que a fração isolada do extrato de folhas de barbatimão induziu a morte por apoptose com autofagia nas células MCF-7 e MDA-MB-435. Estes resultados são importantes, pois foram demonstradas a citotoxicidade e indução de morte das células MDA-MB-435, que são ER-, além das células MCF-7 (ER+). Tendo em vista que não há tratamento curativo para tumor mamário ER-, bem como para ER+ em estágio avançado, a fração isolada parece ser candidata promissora para o desenvolvimento de fármaco para o tratamento e prevenção do câncer de mama. / The aim of the present work was to investigate the type of cell death induced in the MCF-7 (ER+) and MDA-MB-435 (ER-) human mammary carcinoma cell lineages by the fraction isolated from the barbatimão leaf extract. Stryphnodendron adstringens (Martius) Coville (Fabaceae) leaves were collected, dried and the acetone extract was prepared. It was partitioned with ethyl acetate and the remaining aqueous solution was lyophilized and fractioned by Sephadex LH 20 chromatography. The collected fractions were analyzed by thin layer chromatography and the fraction eluted with 100 % methanol was used in the experiments, because it showed the highest proanthocyanidin content. The HPLC analysis showed that the isolated fraction is composed by procyanidin dimmer B1, epigallocatechin-3-O-gallate and gallic acid. The MCF-7 (ER+) and MDA-MB-435 (ER-) cells were treated for 24 h with different concentrations of the fraction (5 – 160 μg/mL) and with 550 μg/mL cyclophosphamide. The cell treatment with the isolated fraction induced cell viability reduction and morphologic alterations in both cell lines, including cell typical shape loss, chromatin condensation and a decrease in the colony and cell area. The ED50 dose for MCF-7 cells was 12.35 μg/mL and the ED50 dose for MDA-MB-435 cells was 34.43 μg/mL, being the MCF-7 cells more sensitive to the fraction treatment. The Western blotting analysis showed that the fraction treatment induced an increase in the Bax and a decrease in the Bcl-2 cell expression that is indicative of apoptosis. There were also an increase in the caspase-9, caspase-3-active and caspase-8 expression and a decrease in the caspase-3 and pro-caspase-8 expression. These proteins are involved in induction of the intrinsic apoptosis pathway. It was also observed an increase in the expression of autophagy protein markers: LC-3 expression increased in both cell lines and beclin-1 expression increased only in the treated MDA-MB-435. The results of the present work allowed the conclusion that the isolated fraction from barbatimão leaf extract induced apoptotic death with autophagy in both cell lines, MCF-7 and MDA-MB-435. These results are important because it was demonstrated the cytotoxic effect and the ER- MDA-MB-435 cell death induction, besides the cytotoxicity to ER+ MCF-7 cells. As there is no a curative treatment for ER- mammary tumors as well as ER+ tumors in an advanced stage, the isolated fraction seems to be a promising candidate to a drug development for breast cancer treatment and prevention. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

O aumento da capacidade oxidativa é considerado o fator central dos seus benefícios à saúde induzidos pelo exercício físico aeróbio (EFA). A musculatura esquelética é um dos tecidos mais envolvidos na realização de exercícios físicos, com capacidade notável de adaptação metabólica e estrutural frente ao estímulo mecânico. Os músculos esqueléticos são ricos em mitocôndrias e altamente dependentes da fosforilação oxidativa para a produção energia. Assim, o aumento da capacidade aeróbia induzido pelo EFA ocorre grande parte em função de adaptações mitocondriais. Inúmeros estudos demonstram a capacidade do EFA em induzir biogênese mitocondrial, onde o coativador de transcrição PGC-1?1 atua coordenando a expressão de genes nucleares e mitocondriais no contexto do EFA. No entanto, animais com deleção de PGC- 1?1 no músculo esquelético ainda apresentam remodelamento mitocondrial importante após período de treinamento físico aeróbio, evidenciando a existência de mecanismos ainda desconhecidos. Embora a formação de novas mitocôndrias seja fundamental, a manutenção de mitocôndrias saudáveis por meio de mecanismos de controle de qualidade parece ser de igual ou maior importância para uma adaptação mitocondrial adequada. Um desses mecanismos de controle de qualidade mitocondrial envolve a remoção de mitocôndrias danificadas/envelhecidas via autofagia mitocondrial (mitofagia). Contudo, os mecanismos envolvidos na mitofagia induzida pelo EFA são pouco conhecidos. Considerando o papel da adaptação mitocondrial sobre os efeitos benéficos do EFA, realizamos um estudo exploratório para buscar novos mecanismos envolvidos neste processo. Para isso, utilizamos uma abordagem proteômica direcionada à fração mitocondrial muscular de camundongos submetidos a uma única sessão de EFA. Num primeiro estudo, utilizamos os resultados de proteômica para procurar por proteínas envolvidas na ativação da mitofagia durante o EFA. A partir desse estudo, verificamos que uma sessão de EFA de fato induz sinais de mitofagia na musculatura esquelética. Além disso, propomos que as proteínas Phb2 e Mief2 podem acumular em mitocôndrias danificadas durante o EFA e colaborar para o recrutamento da maquinaria autofágica para a organela, auxiliando no controle de qualidade e adaptação mitocondrial induzidos pelo EFA. Em segundo estudo, tivemos como objetivo identificar nos resultados de proteômica possíveis reguladores de transcrição gênica envolvidos na adaptação mitocondrial induzida pelo EFA. Dessa maneira, identificamos que a proteína mitocondrial Spryd4, cuja função não havia sido estudada até então, parece aumentar na fração mitocondrial muscular durante o EFA. Observamos ainda que a expressão gênica muscular de Spryd4 diminui em camundongos idosos ou com distrofia muscular, aumenta em animais saudáveis após treinamento físico aeróbio e também parece aumentar em humanos treinados. In vitro, observamos que a atenuação da expressão de Spryd4 em miotubos primários promove disfunção mitocondrial, associada à diminuição da expressão de genes de complexos mitocondriais e envolvidos no transporte e metabolismo de lipídeos, além de promover atrofia de miotubos. Num contexto geral, a análise do proteoma mitocondrial muscular após uma sessão de EFA nos permitiu identificar proteínas que parecem estar envolvidas em adaptações mitocondriais, em especial, em mecanismos de mitofagia e controle do fluxo de substratos energéticos / Increased oxidative capacity induced by regular aerobic exercise (AE) is considered a major factor in health. Skeletal muscle is one of the most compromised tissues during exercise and has remarkable metabolic and structural plasticity upon mechanical stimuli. Muscles are rich in mitochondria and heavily reliant on oxidative phosphorylation for energy production. Thus, increased aerobic capacity induced by regular AE occurs largely due to mitochondrial adaptations. Many studies have shown that AE is able to induce mitochondrial biogenesis, and the transcription coactivator PGC-1?1 is known to coordinated gene expression both in nuclei and mitochondria. However, muscle-specific PGC-1?1 knockout mice still display major mitochondrial remodeling after AE training, supporting the existence of unknown mechanisms of AE-induced mitochondrial adaptations. Although making new mitochondria is crucial, the maintenance of a healthy pool of this organelle through mechanisms of quality control seems to be of equal or greater importance during mitochondrial adaptation. One mechanism for mitochondrial quality control comprises the removal of damaged/aged mitochondria via autophagy (mitophagy). Nonetheless, the mechanisms of AE-induced mitophagy are poorly understood. Given the importance of mitochondrial adaptation to the health benefits of AE, we conducted an exploratory study to uncover new mechanisms underlying this process. For this, we performed a proteomic analysis in the skeletal muscle mitochondria-enriched fractions of mice submitted to a single bout of AE. In a first study, we have used these proteomics data to seek for proteins that might be involved in AE-induced mitophagy. On this matter, we confirmed that a single bout of AE in mice increases skeletal muscle mitophagy signaling. Additionally, we suggest that Phb2 and Mief2 accumulate in damaged mitochondria in skeletal muscle during AE and might assist in the recruitment of the autophagic machinery to the organelle, thus aiding to mitochondrial quality control and AE-induced mitochondrial adaptation. In a second study, we have used the same proteomics data to identify transcriptional regulators that might have a role in AE-induced mitochondrial adaptation. Thereby, we have found that the mitochondrial protein Spryd4, whose function was so far unknown, seems to increase in the skeletal muscle mitochondria-enriched fractions following AE. Here we show that skeletal muscle Spryd4 gene expression decreases in aged and dystrophic mice, increases in healthy trained animals and also seems to increase in trained humans. In vitro, we have seen that Spryd4 loss of function in primary myotubes promotes mitochondrial dysfunction, decreases expression of genes involved in mitochondrial complex function, as in fatty acid oxidation and transport. Indeed, Spryd4 loss of function promoted myotube atrophy. Taken together, by analyzing the skeletal muscle mitochondrial proteome after a single bout of AE in mice, we have identified proteins that might participate in AE-induced mitophagy and substrate metabolism, and thus in skeletal muscle adaptation to AE

Uma série de três complexos de cobre(II) dinucleares, contendo ligantes nitrogenados e grupos aromáticos (compostos 2, 4 e 6), foi sintetizada e caracterizada por diversas técnicas espectroscópicas (UV/Vis, IV e EPR). Esses compostos tiveram sua atividade tirosinase avaliada à temperatura ambiente, através da oxidação de L-di-hidroxifenilalanina (L-dopa), e sua citotoxicidade investigada frente a células melanomas, comparada às de complexos análogos de cobre(II) mononucleares (compostos 1, 3 e 5). A influência da luz UVB, que estimula a melanogênese, também foi verificada. A exposição das células à radiação de intensidade (13 ± 2) mJ/cm2 aumentou os danos causados, principalmente em presença das espécies dinucleares. A citotoxicidade dos diferentes complexos foi determinada frente a duas linhagens de melanomas humanos (SKMEL-05 e SKMEL-147), após 24 e 48h de incubação. Células com maior teor de melanina foram mais sensíveis aos efeitos dos complexos. Verificou-se um aumento na porcentagem de células na fase sub-G1 do ciclo celular após tratamento por 24 ou 48h com estes complexos, ao contrário do verificado frente a queratinócitos não tumorais. Testes clonogênicos também indicaram maior atividade do composto (2) contendo dois centros de cobre em sua estrutura, com diminuição significativa no número de células sobreviventes após tratamento. Ensaios complementares mostraram a redução dos íons de cobre(II) nos compostos (1) e (2) em presença de melanina e a formação de espécies reativas de oxigênio (radicais hidroxil e ânions superóxido), através de espectroscopia EPR ou do uso de sondas fluorescentes. Adicionalmente, foi constatado um aumento no nível de vacúolos citoplasmáticos após tratamento com o complexo (2), indicando indução à autofagia, corroborada pelo monitoramento das proteínas LC3 e tubulina, implicadas neste processo de morte celular. Os resultados apontam para a ocorrência de pelo menos dois mecanismos de ação dos complexos frente aos melanomas, por processo apoptótico e autofágico. Indicam ainda que esta reatividade frente a melanomas é fortemente dependente da estrutura dos complexos de cobre, sendo mais significativa para os dinucleares / A series of dinuclear copper(II) complexes containing nitrogen ligands and aromatic groups (compounds 2, 4 and 6), were synthesized and characterized by various spectroscopic methods (UV/Vis, IR and EPR). These complexes had their tyrosinase activity evaluated at room temperature, through the oxidation of L-di-hidroxyphenylalanine (L-dopa), and its cytotoxicity toward melanoma cells investigated, in comparison with the toxicity of the corresponding mononuclear complexes (compounds 1, 3 and 5). The influence of UVB light, that stimulates melanogenesis, was also verified. The exposition of the cells to radiation of intensity (13 ± 2) mJ/cm2, increased the caused damage, especially in the presence of dinuclear species. The cytotoxicity of the different complexes was determined toward two cell lines of human melanomas (SKMEL-05 e SKMEL-147), after 24 and 48h incubation. Cells containing higher leveis of melanin were more sensitive to the effects of the complexes. An increasing in the percentage of cells in the sub-G1 phase of cellular cycle was verified after treatment for 24 or 48h with these complexes. On the contrary, this effect was not observed with non-tumor keratinocytes. Clonogenic tests also indicated higher activity of compound 2 containing two copper centers in its structure, with a significant decrease in the number of survival cells after the treatment. Complementary assays show the reduction of copper(II) ions in complexes (1) and (2), in the presence of melanin, as well as the formation of reactive oxygen species (hydroxyl radicais and superoxide anions) via EPR spectroscopy or the use of fluorescent labels. Further, an increase in the levei of cytoplasmatic vacuoles was verified after treatment with complex (2), indicating induction to autophagy, which was corroborated by monitoring the proteins LC3 and tubulin, implicated in this process of cell death. The results pointed to the occurrence of at least two mechanisms of action of these complexes toward melanomas, apoptotic and autophagic processes. Also, they indicated that the reactivity of the studied compounds is strongly dependent on its structural features, being more remarkable to the dinuclear ones.

A desnutrição pode induzir lesão celular, comprometendo os mecanismos envolvidos de proliferação, diferenciação e morte celular. Estudos de nosso laboratório tem demonstrado, em modelo murino de desnutrição protéica e protéico-energética, hipoplasia medular com evidências histológicas de alteração da matriz extra celular. Nosso objetivo foi avaliar a eventual participação dos processos de apoptose, necrose e autofagia no desenvolvimento da hipoplasia medular observada nesse modelo. Para isso foram utilizados dois grupos de camundongos C57BL/6J machos, adultos, mantidos em gaioleiros metabólicos. O grupo controle (C) recebeu ração normoproteíca contendo 12% de proteína e o grupo desnutrido (D), alimentado com ração hipoprotéica contendo 2% de proteína. A fonte protéica utilizada foi a caseína. O período de indução da desnutrição foi cerca de cinco semanas, definido pela perda de 20 a 25 % de peso corpóreo por parte dos animais do grupo desnutrido. Após esse período, os animais de ambos os grupos foram anestesiados e realizada a coleta das amostras biológicas para avaliação nutricional e hematológica e coletadas células da medula óssea para avaliação da apoptose, necrose e autofagia. Para avaliação da apoptose e necrose as células foram duplamente marcadas com Annexina V, PI e caspase 3 que foram analisadas por citometria de fluxo . A expressão da protéina BCL-2 foi quantificada pela técnica de Western Blotting. A análise não demonstrou diferença estatística entre os grupos para esses parâmetros. Para avaliação da autofagia extraiu-se proteínas das células da medula óssea e avaliou-se a expressão das proteínas Akt e mTOR total e fosforilado , os complexos de mTor (Raptor, Rictor e Gβl) , Beclin-1 e LC3II. Os resultados demonstraram aumento significativo de mTOR total ,Raptor , Beclin-1 e LC3II e diminuição na fosforilação de mTOR nas células oriundas de animais desnutridos em relação ao grupo controle. A desnutrição não modificou a expressão de Akt total, porém houve diminuição da fosforilação de Akt e diminuição na expressão das proteínas Rictor e Gβl nas células analisadas. Como os processos apoptóticos e autofágicos podem ser de difícil detecção in vivo, também refizemos os experimentos in vitro, estimulando as células com compostos pró-apoptóticos (campotecina) e pró-autofágicos (tamoxifeno). Nesses experimentos observamos que, apenas quando estimulamos as células de animais desnutridos com camptotecina, as mesmas, no período de 12 horas apresentaram maior percentagem de apoptose inicial em relação a 0 horas , sugerindo que há um período em que as células desnutridas são sinalizadas para via apoptótica sendo mais susceptível ao estimulo. As células de animal desnutrido estimulado apresentaram após 12 horas aumento significativo da apoptose tardia em relação ao controle estimulado , indicando que nesse período há um aumento da apoptose tanto em processo inicial , tanto em processo tardio. Avaliamos a autofagia em uma cinética de 0, 2, 6, 18 e 24 horas in vitro e observamos aumento significativo da autofagia em células da medula óssea de animais desnutridos em 0 horas e após 18 horas de estímulo com tamoxifeno (20 µM) em relação ao respectivo controle, demonstrando que nesse período a autofagia começa a ser induzida através do estimulo mais facilmente do que o controle. Autofagia é um dos principais contribuintes para o metabolismo celular, fornecendo nutrientes quando os mesmos estão indisponíveis, e, portanto, no nosso modelo de desnutrição protéica a hipoplasia medular estaria em processo autofágico como mecanismo de reparo e sobrevivência. / Malnutrition can induce cell damage, compromising the mechanisms involved in proliferation, differentiation and cell death. Studies from our laboratory have demonstrated, in a murine model of protein malnutrition and protein-energy, marrow hypoplasia with histologic evidence of alteration of the extracellular matrix. Our objective was to evaluate the possible involvement of the processes of apoptosis, necrosis and autophagy in the development of bone marrow hypoplasia observed in this model. For this we used two groups of C57BL/6J adult male kept in metabolic gaioleiro. The control group (C) received normal protein diet containing 12% protein and undernourished group (D), fed low protein diet containing 2% protein. The protein source used was casein. The induction period of undernutrition was approximately five weeks, as defined by loss of 20 to 25% of body weight per part of group malnourished. After this period, the animals of both groups were anesthetized and held the collection of biological samples for nutritional assessment and hematology and bone marrow cells collected for evaluation of apoptosis, necrosis and autophagy. For assessment of apoptosis and necrosis of the cells were double labeled with Annexina V and PI caspase 3 were analyzed by flow cytometry. The expression of Bcl-2 was quantified by Western Blotting technique. The analysis revealed no statistical difference between the groups for these parameters. For evaluation of autophagy proteins extracted from bone marrow cells and evaluated the expression of proteins Akt and phosphorylated and total mTOR, complexes of mTOR (Raptor, and Rictor Gβl), Beclin-1 and LC3II. The results showed significant increase in overall mTOR, Raptor, and LC3II Beclin-1 and decreased phosphorylation of mTOR in cells derived from malnourished animals compared to the control group. Malnutrition did not modify the expression of Akt total, but decreased phosphorylation of Akt and decreased expression of the protein Rictor and Gβl cells analyzed. As apoptotic and autophagic processes can be difficult to detect in vivo, also redid the experiments in vitro, stimulating the cells with pro-apoptotic compounds (campotecina) and pro-autophagic (tamoxifen). In these experiments we observed that, when only stimulate cells with camptothecin malnourished, the same at 12 hours had a higher percentage of initial apoptosis compared to 0 hours, suggesting that there is a period in which cells are signaled to via malnourished being more susceptible to apoptotic stimuli. The animals starved cells stimulated after 12 h showed significant increase in apoptosis compared to control late stimulated, indicating that at that time there is an increase in apoptosis both in the initial process, both late process. Autophagy evaluated in kinetics of 0, 2, 6, 18 and 24 hours in vitro and observed a significant increase in autophagy in bone marrow cells of malnourished at 0 hours and after 18 hours stimulation with tamoxifen (20 microM) than the respective control, demonstrating that this period autophagy begins to be induced by stimulating more easily than the control. Autophagy is a major contributor to cellular metabolism, providing nutrients when they are unavailable, and therefore in our model of protein malnutrition in the marrow hypoplasia would autophagic process as a mechanism for survival and repair.

A doença de Parkinson é a doença motora neurodegenerativa mais comum do mundo. Agregados proteicos contendo principalmente alfa-sinucleína é a principal marca da doença. Recentemente, tem sido demonstrado que defeitos na dinâmica mitocondrial e da autofagia são causados pelo acúmulo da proteína. No nosso estudo, foram utilizados neurônios derivados de SH-SY5Y ou de hiPSC de pacientes com a doença de Parkinson hereditária, além de leveduras para analisar a dinâmica mitocondrial e da autofagia e o envolvimento de proteínas desses processos na toxicidade da alfa- sinucleína. Foi observado a diminuição do tráfego mitocondrial em neurônios derivados das células SH-SY5Y que expressavam alfa-sinucleína A53T. Além disso a proteína mutante ainda levou ao aumento de espécies reativas de oxigênio, perturbação da autofagia e aumento da sinalização apoptótica. Os neurônios então foram tratados com NAP, um peptídeo neuroprotetor, que preveniu os efeitos tóxicos da alfa-sinucleína mutante. Leveduras contendo deleções nos genes Gem (Miro), Ypt53 (Rab5) e Atg8 (LC3) e expressando alfa-sinucleína dos tipos A30P e A53T, demonstraram que a toxicidade da alfa-sinucleína é dependente das disfunções na mitocôndria e na autofagia. A agregação da alfa-sinucleína A53T foi prevenida na ausência de Gem. Além disso, a toxicidade da proteína envolvendo a disfunção mitocondrial e sinalização apoptótica causada pelo estresse do ER foi dependente dos genes Gem e Atg8, respectivamente. Neurônios derivados de hiPSC de pacientes contendo a triplicação do gene da alfa-sinucleína, mostraram diminuição do transporte de mitocôndrias e do potencial de membrana da mitocôndria. Análises sobre a quantidade de vesículas lisossomais desses neurônios, demonstraram acúmulos dessas vesículas, sugerindo que a autofagia está alterada. Em um ensaio sobre a sensibilidade dos neurônios dopaminérgicos, foi observado que os neurônios contendo a alpha-sinucleína mutante são mais susceptíveis à rotenona, quando comparado com os neurônios dopaminérgicos do controle. A exposição à rotenona também causou mudanças na distribuição de mitocôndrias, sugerindo que o tráfego retrógrado da organela está alterado / Parkinson\'s disease (PD) is the most common motor neurodegenerative disease in the world. Protein aggregates containing mainly alpha-synuclein are a hallmark of disease. Mitochondria and autophagy defects have been suggested to be caused by alpha-synuclein toxicity. In this study, we investigated mitochondria and autophagy dynamics related to alpha-synuclein toxicity in neurons derived form SH-SY5Y cells, hiPSC from patients with familial PD or yeast. We found that SH-SY5Y neuroblastoma cells expressing A53T alfa- synuclein showed significantly inhibited mitochondrial trafficking. A53T alfa- synuclein also caused the highest increase in ROS production in the dysmobilized mitochondria in comparison to wild-type or A30P alfa- synuclein. Treatment with NAP, the 8 amino acid peptide identified as the active component of activity dependent neuroprotective protein (ADNP), completely annihilated the adverse effects of A53T on mitochondrial dynamics. During disruption of retrograde transport, we found disturbed autophagy and increased apoptosis signalization in neurons expressing A53T alpha-synuclein, suggest activation of the apoptosis pathway. Curiously, all groups expressing alpha-synuclein showed decreased levels of BCL-XL, revealing that mitochondria are susceptible to changes in the membrane potential in the presence of alphasynuclein. Nevertheless, treatment with NAP was effective in blocking the apoptosis pathway and restore autophagy. We created a model to study A30P and A53T alpha-synuclein toxicity related to Gem (Miro), Ypt53 (Rab5) and Atg8 (LC3) genes in Saccharomyces cerevisiae in which these genes were knocked down. We found that A30P alpha-synuclein toxicity was dependent on mitochondrial and autophagy dysfunction. A53T alpha-synuclein was more toxic than A30P alpha-synuclein, and its aggregation was dependent on Gem expression. A53T alpha-synuclein toxicity involving damaged mitochondrial and apoptotic signaling caused by ER stress was dependent on Gem and Atg8 genes, respectively. In a study involving dopaminergic neurons derived from hiPSCs from patients containing triplicated alpha-synuclein gene (SNCA3), we reported decreased mitochondrial trafficking and mitochondrial membrane potential, besides accumulation of lysosome vesicles. In a sensitivity assay, SNCA3 neurons demonstrated more susceptibility to rotenone toxicity, which alters intracellular mitochondrial distribution, impairing retrograde transport of the organelle

Submitted by Priscila Rezeck Nunes null (priscilarezeck@aluno.ibb.unesp.br) on 2017-03-08T14:58:45Z No. of bitstreams: 1 Versão final dissertação Priscila Rezeck Nunes.pdf: 4789833 bytes, checksum: 772d289b789606f7e85653d2c289a43a (MD5) / Approved for entry into archive by LUIZA DE MENEZES ROMANETTO (luizamenezes@reitoria.unesp.br) on 2017-03-13T14:38:45Z (GMT) No. of bitstreams: 1 nunes_pr_me_bot.pdf: 4789833 bytes, checksum: 772d289b789606f7e85653d2c289a43a (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-13T14:38:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 nunes_pr_me_bot.pdf: 4789833 bytes, checksum: 772d289b789606f7e85653d2c289a43a (MD5) Previous issue date: 2017-02-17 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Introdução: A gestação é uma condição fisiológica que pode apresentar maior suscetibilidade ao desequilíbrio entre fatores pró e antioxidativos, evoluindo assim com dano celular e resposta inflamatória. A autofagia é um processo que elimina organelas e proteínas danificadas do citoplasma, com potente mecanismo anti-inflamatório responsável pela manutenção da homeostase celular. A autofagia pode controlar a inflamação por meio da inibição da ativação do inflamassoma, complexo essencial para a liberação de citocinas pró-inflamatórias. Assim, alterações nesses processos podem relacionar-se com disfunções celulares e doenças sistêmicas. Objetivos: Este projeto teve como objetivo avaliar se a exposição de explantes placentários a diferentes concentrações de peróxido de hidrogênio (H2O2) é capaz de induzir autofagia e levar a ativação do inflamassoma NLRP3. Métodos: Explantes placentários de gestantes normais obtidos após o parto foram cultivados em diferentes concentrações de H2O2 por 4 e 24 h após a avaliação da viabilidade dos mesmos nesses períodos. As enzimas superóxido dismutase (SOD) e catalase foram avaliadas nos sobrenadantes das culturas após 4 h. As expressões gênicas de marcadores de autofagia (LC3-II, beclin-1 e p62), do inflamassoma (NLRP3 e caspase-1) e das citocinas IL-1β, IL-10 e TNF-α foram avaliadas por RT-qPCR. Os níveis de gonadotrofina coriônica (hCG), proteína de choque térmico 70 (Hsp70) e citocinas IL-1β, IL-10 e TNF-α foram determinados por ensaio imunoenzimático (ELISA) após 24 h de cultura. Resultados: Os níveis de LDH foram crescentes conforme o tempo de cultura, sendo que as culturas de 24 h apresentaram-se com viabilidade celular adequada para o estudo. Os níveis proteicos de catalase e Hsp70, bem como a expressão gênica de LC3-II, beclin-1 e p62 apresentaram níveis crescentes e relacionados às maiores concentrações de H2O2. As concentrações proteicas de SOD, hCG e TNF-α foram maiores nas culturas com 100 µM de H2O2. A expressão gênica de TNF-α, IL-1β, NLRP3 e caspase-1 foram elevadas em 1000 µM de H2O2. Além disso, a expressão proteica de IL-1β também foi maior nessa concentração. As concentrações gênicas e proteicas de IL-10 decresceram de acordo com o aumento da concentração de H2O2. Conclusões: Os resultados obtidos demonstraram que o H2O2 é capaz de induzir o estado de estresse oxidativo placentário, induzir autofagia, ativar o inflamassoma e assim aumentar a produção de citocinas inflamatórias. / Introduction: Pregnancy is a physiological condition characterized by increased susceptibility to oxidative stress, which can lead to cell damage and inflammatory response. Autophagy is a process that removes damaged organelles and proteins from the cytoplasm. It works as potent anti-inflammatory mechanism, responsible for maintaining cellular homeostasis. Autophagy can control inflammatory responses by regulating the activation of inflammasome, an essential complex for pro-inflammatory cytokine release. Objectives: The aim of this study was to evaluate whether placental explants exposure to hydrogen peroxide (H2O2) is able to induce autophagy and inflammasome activation. Methods: Placental explants achieved from normal pregnant women after delivery were cultured in different concentrations of H2O2 for 4 and 24 h after viability evaluation for these periods. Superoxide dismutase (SOD) and catalase were evaluated in culture supernatants after 4 h. Gene expressions of autophagy markers (LC3-II, beclin-1 and p62), inflammasome (NLRP3 and caspase-1) and IL-1β, IL-10 and TNF-α were assessed by RT-qPCR. Levels of chorionic gonadotrophin (hCG), heat shock protein (Hsp70) and IL-1β, IL-10 and TNF-α were determined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) after 24 h of culture. Results: LDH levels were increased according to culture time, and the 24 h cultures presented adequate cell viability for the study. The protein levels of catalase and Hsp70, as well as the gene expression of LC3-II, beclin-1 and p62 presented increasing levels and related to the higher concentrations of H2O2. Protein concentrations of SOD, hCG and TNF-α were higher in cultures with 100 μM of H2O2. Gene expression of TNF-α, IL-1β, NLRP3 and caspase-1 were raised in 1000 μM of H2O2. In addition, IL-1β protein expression was also higher at this concentration. Gene and protein concentrations of IL-10 decreased as the H2O2 concentration increased. Conclusions: Our results demonstrate that H2O2 is able to induce a state of placental oxidative stress, induce autophagy, activate the inflammasome and then increase the production of inflammatory cytokines. / FAPESP: 2014/25611-5

Neste estudo foram avaliados os efeitos farmacológicos do vemurafenibe (inibidor BRAFV600E) e da cloroquina (inibidor de autofagia) na viabilidade celular e crescimento tumoral das sublinhagens de melanoma:G361 pLKO que expressa dermicidina e G361 IBC I com silenciamento da expressão. As células G-361 responderam a vemurafenibe (2 μM) e cloroquina (100 μM), isoladamente ou combinadas, com aumento apoptose, e redução das taxas de senescência. Vemurafenibe (50 mg/kg / 21 dias) inibiu o crescimento tumoral em camundongos imunodeficientes independente da expressão da DCD. A combinação com Cloroquina (30 mg/kg) a cada 24 horas, acelerou, enquanto a cada 72 horas, reduziu o crescimento tumoral. Os tumores apresentaram alterações morfológicas e núcleos atípicos; e não expressaram os marcadores S100, HMB-45, Mela-A ou citoqueratinas. Este trabalho confirmar a eficácia do vemurafenibe e sugere o potencial adjuvante da cloroquina no tratamento de melanomas. O estudo também confirma o papel da dermcidina como oncogne e fator de crescimento de células de melanoma maligno. / In this study we evaluated the pharmacological effects of vemurafenib ( inhibitor BRAFV600E) and chloroquine (autophagy inhibitor) in cell viability and tumor growth of two melanoma cell lines identified as G-361 pLKO, which expresses dermcidin, and G361 IBC I which silenced DCD expression. G-361 melanoma cells responded to vemurafenib (1-2 μM) and chloroquine (50-100 μM) alone or combined, with increased apoptosis rates, while decreasing senescent cells. Vemurafenib (50 mg/kg / 21 days) inhibited melanoma growth in immunodeficient mice independent of dermicidin. Chloroquine (30 mg/kg) in combination with vemurafenib, accelerated (at 24 hour interval), and reduced (at 72 hours interval), melanoma growth. Tumor tissues showed atypical cell morphology and nuclear histological patterns and melanocytic differentiation biomarkers S100, HMB-45, Melan-A or pancytokeratins were not. This work confirms the efficacy of vemurafenib and suggests potential adjuvant effect of chloroquine. It also confirms the role of dermcidin as growth factor and oncogene for melanoma cells.

A urocortina 2 (Ucn2) é um peptídeo que pertence à família dos fatores liberadores de corticotrofina (CRF) e, assim como seu receptor específico CRF2R? (corticotropin releasing factor receptor type 2?), encontram-se expressos no músculo esquelético. Embora tenha sido demonstrado que o tratamento sistêmico com Ucn2 seja capaz de induzir hipertrofia e prevenir a perda de massa muscular, nada se conhece acerca dos mecanismos moleculares através dos quais a Ucn2 desempenha suas ações biológicas. O principal objetivo deste trabalho foi investigar o mecanismo de ação da Ucn2 no músculo esquelético de roedores para o aparecimento da resposta hipertrófica e a possível participação das vias de sinalização Akt/mTOR, Akt/Foxo e ERK1/2 neste efeito anabólico. Para isto foi utilizado o modelo de transfecção in vivo da Ucn2 pelo método da eletroporação em músculos tibialis anterior de camundongos. Nestes músculos foram quantificados: 1) o estado de fosforilação de componentes efetores destas vias; 2) moléculas sinalizadoras da via autofágica; 3) a taxa de síntese proteica in vivo e 4) a expressão de genes relacionados à atrofia muscular (atrogenes). Outra metodologia utilizada para verificar o efeito direto da Ucn2 na musculatura esquelética foi a incubação in vitro de músculos soleus e EDL isolados de roedores com este peptídeo a fim de investigar a taxa de degradação proteica total, bem como a atividade dos sistemas proteolíticos lisossomal¸ ubiquitina-proteassoma e dependente de Ca+2. A superexpressão in vivo da Ucn2 por 14 dias promoveu hipertrofia e preveniu a atrofia em músculos tibialis anterior de camundongos normais e submetidos ao modelo de desnervação motora isquiática.Resumo Este crescimento muscular induzido pela Ucn2 in vivo foi associado a ativação das vias de sinalização AMPc/PKA/CREB, AMPc/Epac, Akt/mTOR/S6, Akt/mTOR/4E-BP1 e ERK1/2/eIF4E com consequente estimulação da síntese proteica. Em concordância, utilizando uma técnica de manipulação genética in vivo, demonstramos que a hipertrofia promovida pela Ucn2 é dependente da estimulação das cascatas de sinalização ativadas por Akt e ERK1/2. Ademais, essa alteração fenotípica promovida pela Ucn2 induziu melhora da resistência à fadiga muscular, sendo este impacto funcional dependentente de ERK1/2, mas não de Akt. Além disso, a superexpressão da Ucn2 induziu \"shifting\" para o tipo de fibra oxidativa (tipo I), sendo esta plasticidade possivelmente mediada por PGC-1?, o que pode ter contribuído pelo menos em parte, para o efeito benéfico promovido pela Ucn2 na função muscular. O efeito antiatrófico da Ucn2 in vivo foi associado à estimulação da via Akt/Foxo1,3 concomitante com a redução da atividade transcricional de Foxo, resultando na diminuição da expressão da E3-ligase atrogin-1 e do gene autofágico LC3. Em paralelo, a Ucn2 in vivo promoveu inibição do fluxo autofágico, inferido pelo acúmulo das proteínas LC3-I, LC3-II e p62 nestes músculos. Corroborando os achados in vivo, os efeitos antiproteolíticos da Ucn2 in vitro parecem ser mediados pelo AMPc e envolvem a supressão da atividade do sistema lisossomal/autofágico em músculos EDL de ratos normais. Portanto, além da participação de efetores dowsntream do AMPc, como PKA e EPAC, diferentes quinases participam dos efeitos biológicos da Ucn2 na musculatura esquelética. Esses resultados são importantes para caracterizar novas estratégias terapêuticas capazes de atuar no combate à atrofia muscular em diversas situações catabólicas. / Urocortin 2 (Ucn2) is a peptide that belongs to corticotrophin releasing factors (CRF) family and, as well as its specific receptor CRF2R? (corticotropin releasing factor receptor type 2?), are expressed in skeletal muscle. Although it has been demonstrated that Ucn2 systemic treatment is able to induce hypertrophy and prevent loss of muscle mass, nothing is known about the molecular mechanisms through which Ucn2 plays its biological actions. The main objective of this work was to investigate the Ucn2 mechanism of action in rodent skeletal muscle for the appearance of the hypertrophic response and the possible participation of Akt/mTOR, Akt/Foxo and ERK1/2 signaling pathways in this anabolic effect. For this, an in vivo transfection model of Ucn2 was used by the electroporation method in tibialis anterior muscles of mice. Were quantified in these muscles: 1) the phosphorylation state of effector components of these pathways; 2) signaling molecules of the autophagic pathway; 3) the rate of protein synthesis in vivo and 4) the expression of genes related to muscle atrophy (atrogenes). Another methodology used to verify the direct effect of Ucn2 in skeletal muscle was the incubation of soleus and EDL muscles isolated from rodents with this peptide in vitro in order to investigate the total rate of protein degradation, as well as the activity of the lysosomal, ubiquitin-proteasome and Ca+2 dependent proteolytic systems. Ucn2 overexpression in vivo for 14 days promoted hypertrophy and prevented atrophy in tibialis anterior muscles of normal mice and submitted to the sciatic motor denervation model. This muscle growth induced by Ucn2 in vivo was associated with the activation ofAbstract cAMP/PKA/CREB, cAMP/Epac, Akt/mTOR/S6, Akt/mTOR/4E-BP1 and ERK1/2/eIF4E signaling pathways with consequent stimulation of protein synthesis. In agreement, using a genetic manipulation technique in vivo, we demonstrated that the hypertrophy promoted by Ucn2 is dependent on the stimulation of the signaling cascades activated by Akt and ERK1/2. In addition, this phenotypic alteration promoted by Ucn2 induced an improvement in muscle fatigue resistance, being this functional impact dependent on ERK1/2, but not on Akt. Moreover, Ucn2 overexpression in vivo induced the shift to type I oxidative fiber, and this plasticity is possibly mediated by PGC-1?, which may have contributed at least in part to the beneficial effect promoted by Ucn2 in muscle function. The anti-atrophic effect of Ucn2 in vivo was associated with the stimulation of Akt/Foxo1,3 pathway concomitant with the reduction of Foxo transcriptional activity, resulting in a decrease in the expression of the atrogin-1 E3-ligase and of the autophagic gene LC3. In parallel, Ucn2 in vivo promoted inhibition of autophagic flow, inferred by the accumulation of LC3-I, LC3-II and p62 proteins in these muscles. Corroborating the in vivo findings, the antiproteolytic effects of Ucn2 in vitro appear to be mediated by cAMP and involve the suppression of lysosomal/autophagic system activity in EDL muscles of normal rats. Thus, in addition to the participation of cAMP dowsntream effectors, such as PKA and EPAC, different kinases participate in the biological effects of Ucn2 on skeletal muscle. These results are important to characterize new therapeutic strategies able to prevent muscular atrophy in several catabolic situations.