O Controle de qualidade de proteína (CQP) consiste na supervisão e no processamento de proteínas danificadas por meio de processos catalíticos (proteassoma e autofagia). Nesse estudo, caracterizamos o CQP, bem como os benefícios da ativação β2-adrenérgica (β2-AR) modulador positivo do CQP, em modelo animal de disfunção/atrofia muscular induzida por constrição crônica do nervo isquiático (CCI). Observamos que, apesar de um aumento na atividade catalítica, a atrofia está associada à um CQP insuficiente, detectado por um acúmulo de proteínas citotóxicas nessa musculatura. O tratamento com Formoterol (agonista β2-AR) aumentou a atividade proteassomal e restaurou o fluxo de degradação via autofagia, resultando na melhora do CQP e da miopatia esquelética. A inibição da autofagia, mas não do proteassoma, foi capaz de abolir os efeitos do Formoterol na CCI. Nossos resultados sugerem uma nova contribuição da sinalização β2-AR no quadro de miopatia esquelética, no qual sua ativação foi capaz de restaurar o CQP, contribuindo para a melhora do trofismo e função muscular. / The protein quality control (PQC) detects, repairs and disposes cytotoxic proteins through different proteolytic systems (proteasome and autophagy). Here, we characterized the PQC profile as well as the benefits of sustained β2-adrenoceptor activation (β2-AR) a positive PQC modulator, during skeletal muscle atrophy in a rat model of sciatic nerve constriction (SNC). PQC is disrupted in SNC rats, demonstrated by elevated proteasomal and lysosomal activities along with accumulation of cytotoxic proteins and pro-apoptotic factors. The β2-AR activation (Formoterol) promotes a further increase in proteasomal activity, along with autophagic flux reestablishment. Of interest, sustained autophagy inhibition, but not proteasomal inhibition, is sufficient to abolish Formoterol effects on skeletal muscle PQC, mass and strength. These findings suggest a new contribution of β2-AR signalling pathway to the pathophysiology of skeletal muscle where β2-AR restores the impaired PQC, therefore contributing to a better skeletal muscle morphology and function.

O patógeno Trichophyton rubrum é um fungo queratinofílico e o principal agente de micoses cutâneas humanas. O processo de degradação de substratos queratinizados por dermatófitos está relacionado com a alcalinização do ambiente, o que modula a expressão e a secreção de enzimas responsáveis pela captação e utilização dos nutrientes presentes no microambiente hospedeiro. Essa modulação do pH parece determinante para o sucesso do processo infeccioso, quando o fungo se depara com o pH ácido da pele humana. A hipótese deste trabalho foi verificar se há influência do pH e da fonte nutricional na modulação da expressão de genes de T. rubrum que codificam proteínas envolvidas nos processos de autofagia (atg8 e atg15), adesão celular (sowgp) e de alguns fatores de transcrição (pacC, bZIP/cys-3 e nuc-1), e se estes processos estão relacionados à patogenicidade deste dermatófito. De modo a avaliar a modulação da expressão destes genes na patogenicidade e sobrevivência fúngica, T. rubrum foi cultivado em meios de cultura tamponados (pH 5,0 e pH 8,0) e não tamponados, contendo glicose, glicina, glicose com glicina, ou queratina como fonte nutricional. Os genes envolvidos no processo de autofagia também foram avaliados na presença do inibidor de autofagia 3-metiladenina (3-MA). Além disso, o perfil transcricional destes genes de T. rubrum foi avaliado durante a interação ex vivo com unha e pele humana. As análises demonstraram a influência concomitante da fonte nutricional e do pH ambiente na modulação da expressão dos transcritos gênicos estudados nas diferentes linhagens de T. rubrum utilizadas neste trabalho (CBS, H6 e pacC-1). Nossos resultados revelaram que o crescimento destas linhagens é maior na fonte nutricional queratina, quando comparado com as outras fontes nutricionais (glicose e glicina), havendo uma diferença na taxa de crescimento entre as linhagens neste substrato preferencial. Os genes bZIP/cys-3 e nuc-1 apresentaram perfil de expressão semelhante, mais elevada durante cultivos longos, respondendo a condições de estresse nutricional e pH alcalino, sugerindo a participação dos mesmos nos processos de crescimento e sobrevivência do fungo. Além disso, mecanismos regulatórios diferentes destes genes devem ocorrer nas três linhagens de T. rubrum em relação ao crescimento na fonte nutricional queratina. A variação transcricional do gene pacC em resposta às diferentes fontes nutricionais sugere que sua expressão depende das condições nutricionais encontradas por esse fungo, sendo o pH uma resposta secundária. Nossos resultados sugerem ainda que a via de autofagia seja importante para o desenvolvimento e sobrevivência de T. rubrum nestes substratos, e que o FT PacC atue regulando um dos pontos deste processo, visto que o gene atg15 apresenta um perfil semelhante de expressão ao gene pacC, e o gene atg8 tem perfil antagônico de expressão nas linhagens H6 e pacC-1, nas condições avaliadas neste trabalho. 3-MA inibiu a transcrição dos genes atg8 e atg15 em T. rubrum de modo especifico, e por consequência a via de macroautofagia. Os dados de expressão de sowgp sugerem que essa molécula atue durante a privação nutricional e situações de estresse pelo dermatófito, provavelmente desempenhando seu papel na progressão e manutenção do processo infeccioso, permitindo a permanência do fungo em tecidos queratinizados, e auxiliando na fixação do fungo ao epitélio humano. Desta maneira, nossos resultados fornecem informações sobre os eventos moleculares envolvidos na regulação da expressão genica durante a adaptação de T. rubrum ao pH, à variação nutricional, e interação com células e moléculas do microambiente hospedeiro. Os resultados revelam o envolvimento do processo de autofagia e de moléculas de adesão no sensoriamento e resposta a variações ambientais, e a modulação dos fatores de transcrição bZIP/Cys-3, Nuc-1 e PacC durante a adaptação de T. rubrum ao pH e à fonte nutricional podem ser importantes na regulação de moléculas necessárias para sua patogenicidade. / The pathogen Trichophyton rubrum is a keratinophylic fungi and the major agent of cutaneous mycosis in humans. The process of degradation of keratinized substrates by dermatophytes is related with environment alkalinization, which modulates the expression and secretion of the enzymes responsible for the acquisition and utilization of nutrients from the host microenvironment. This pH modulation seems to be determinant for the success of the infectious process when the fungus encounters the acidic pH of the human skin. The hypothesis of this study was to determine whether there is influence of ambient pH and nutritional source in the modulation of gene expression of T. rubrum genes coding for proteins involved in the processes of autophagy (atg8 and atg15), cellular adhesion (sowgp) and some transcription factors (pacC, bZIP/cys-3 and nuc-1), and if they are related with the pathogenicity of this dermatophyte. To evaluate the modulation of the expression of these genes in fungal pathogenicity and survival, T. rubrum was cultivated in buffered (pH 5.0 and pH8.0) or non-buffered media, containing glucose, glycine, glucose and glycine, or keratin as nutrient source. The autophagy-related genes were also analyzed in the presence of 3- methyladenine (3-MA) autophagy inhibitor. Moreover, the transcriptional profile of these genes was evaluated during T. rubrum ex vivo interaction with human nail and skin. The analyses demonstrate the simultaneous influence of the nutritional source and environment pH in the modulation of gene transcription in the different T. rubrum strains evaluated here (CBS, H6 and pacC-1). Our results revealed that growth of these strains is higher in keratin source, compared with other nutrient sources (glucose or glycine), and that they present different growth rates in this preferential substrate. The genes bZIP/cys-3 and nuc-1 presented a similar expression profile, which is higher during longer periods of growth, responding to nutritional stress and alkaline pH, suggesting their involvement in fungal growth and survival. Also, different regulatory mechanisms of these genes in these three T. rubrum strains might be implicated during keratin degradation. The transcriptional variation in the pacC gene in response to different nutritional sources, suggests that its expression is dependent on the nutritional conditions, being the ambient pH a secondary response. Furthermore, our results indicate that the autophagy pathway is important for T. rubrum survival and development during nutrient and pH adaptation, and that PacC might regulates some points of this process, since atg15 and pacC genes presented a similar expression profile, and atg8 has antagonistic expression profiles in the H6 and pacC-1 strains, in the conditions evaluated here. 3-MA inhibited the transcription of atg8 and atg15 T. rubrum genes in a specific manner, and thus inhibited the macroautophagy process. The expression profile of the sowgp gene suggests that this molecule is important during nutrient starvation and stress situation, probably having a role in the progression and maintenance of the infectious process, allowing fungal maintenance in the host keratinized tissues, contributing to fungal adherence to human epithelia. Taken together, our results provide insights into the molecular events involved in the regulation of gene expression during T. rubrum adaptation to pH, nutritional variation and interaction with the host cells and molecules. Our data reveals the involvement of the autophagy process and adhesion molecules in sensing and response of environmental changes, and the modulation of the bZIP/Cys-3, Nuc-1 and PacC transcription factors during T. rubrum adaptation to pH and nutrient source might be important in the regulation of molecules required for its pathogenicity.

A heterogeneidade entre as células tumorais e o suporte a elas proporcionado pelos componentes do microambiente tumoral (TME) são os dois principais responsáveis pela progressão do câncer e por tornar essas doenças essencialmente incuráveis. Assim, identificar as principais dependências das células malignas, sejam elas internas ou advindas do meio extracelular, é fundamental para entender seu comportamento e propor terapias mais eficientes. Nesta tese, abordamos aspectos destas duas questões separadamente. Em um primeiro trabalho, investigamos as interações de células tumorais com células-tronco mesenquimais (MSCs), um dos principais componentes do TME. MSCs participam ativamente do nicho tumoral, especialmente por serem capazes de liberar uma vasta gama de moléculas que, via sinalização parácrina, podem modular as células ao seu redor. No entanto, os principais mediadores e respectivos efeitos do secretoma dessas células nos tumores ainda precisam ser melhor elucidados. Ao investigar esses efeitos em glioblastomas (GBM), um dos tumores primários mais agressivos em adultos, mostramos que o secretoma de células-tronco mesenquimais derivadas de tecido adiposo humano (hADSCs) foi capaz de bloquear a autofagia das células malignas. Nossos dados revelaram que o secretoma de hADSCs ativou a via de sinalização de mTORC1 e reduziu a translocação nuclear de TFEB, um fator de transcrição chave que regula a autofagia e a a função lisossomal, nas células de GBM, impedindo que o fluxo autofágico fosse completado. Já em um segundo trabalho, no contexto da heterogeneidade celular em tumores, propusemos uma abordagem para análise de dados de céulas únicas focada em outliers. Minorias celulares com níveis anormalmente elevados, ou reduzidos, de expressão de determinados genes ou proteínas são em muitos casos responsáveis por resistir aos tratamentos e levar à recidiva da doença, ao mesmo tempo que, por serem outliers, são muitas vezes ignoradas ou excluídas das análises de dados. Assim, decidimos utilizar métodos estatísticos em dados de expressão de células únicas para detectar e analisar células outliers, comparando o seu comportamento com as demais células não-outliers. Denominamos essa abordagem de Single Cell OUTlier analysis (SCOUT) e a testamos em dados de células tumorais avaliadas por citometria de massas e por sequenciamento de RNA de células únicas (sc-RNA-seq). Como resultado, pudemos confirmar que, especialmente diante de determinados tratamentos, células outliers podem se comportar de maneira distinta de não-outliers, revelando informações potencialmente relevantes ao desenvolvimento de estretégias terapêuticas. Por fim, desenvolvemos uma ferramenta para automatizar a detecção e seleção de outliers em dados de célula única a fim de facilitar o estudo dessas células em diversos aspectos na pesquisa do câncer. / Intratumoral heterogeneity and the support provided by components of the tumor microenvironment (TME) to malignant cells are major contributors to cancer progression, and the two main factors that make this disease essentially incurable. Thus, identifying malignant cells dependencies, either in the intra- or extracellular environment, is fundamental to understand their behavior and propose more efficient therapies. In this thesis, we approached aspects of these two issues separately. In a first work, we investigated interactions between tumors and mesenchymal stem cells (MSCs), one of the main components in the TME. MSCs actively participate in the tumor niche, especially due to their capacity of releasing a wide range of molecules that can modulate cells in their surroundings. However, little is known about the effects of MSCs-derived molecules in tumor cells behavior. In investigating these effects on glioblastomas (GBM), one of the most aggressive primary tumors in adults, we found out that the secretome of human adipose-derived stromal cells (hADSCs) was able to block autophagy in malignant cells. Our data revealed that hADSCs secretome activated mTORC1 signaling pathway and reduced nuclear translocation of TFEB, a master transcription factor that regulates autophagy and lysosomal function, in GBM cells, preventing autophagic flux from being completed. In a second work, we addressed intratumoral heterogeneity by proposing an approach to analyze outliers in single cell data. Cellular minorities with abnormally high, or low, expression levels of certain genes or proteins are in many cases responsible for resisting treatments and lead to disease relapse, while for being outliers they are also frequently ignored or excluded from data analysis. Thus, we decided to apply statistical methods on single cell expression data to detect outliers and analyze them, comparing their behavior with the remaining non-outlier cells. We called this approach Single Cell OUTlier analysis (SCOUT) and tested it on tumor cell datasets obtained from mass cytometry and single cell RNA sequencing (scRNA-seq) experiments. Using SCOUT we were able to confirm that, especially upon specific treatments, outlier cells may behave differently from non-outliers, revealing potentially relevant information to aid in the development of novel therapeutic strategies. Finally, we developed a tool to automate detection and selection of outliers in single cell data with the aim to facilitate the study of these cells under different contexts in cancer research.

O transplante de ilhotas pancreáticas constitui uma alternativa atraente para o tratamento de diabetes tipo 1 (DM1), contudo, é limitado devido à escassez de doadores de órgãos. O papel da prolactina humana recombinante (rhPRL), que apresenta efeitos benéficos em células-beta, e seu mecanismo de ação foram investigados neste estudo. O número de células apoptóticas diminui significativamente na presença de rhPRL. Essa citoproteção envolveu diminuição da razão BCL2/BAX e inibição de caspase-8, -9 e -3. Este estudo revelou, pela primeira vez, evidência direta do efeito protetor de lactogênios contra apoptose de células-beta humanas. Levando em consideração a relação conhecida entre citocinas e DM1 e observações recentes sugerindo o papel da autofagia no desenvolvimento e prevenção do DM1, foi investigada a conexão entre citocinas (IL-1β, TNFα e IFN-γ) e autofagia em células-beta. O co-tratamento com citocinas e rapamicina, um indutor de autofagia via inibição de mTOR, não aumentou os níveis de apoptose em células INS-1E. Contudo, exposição a citocinas levou ao aumento nos níveis de autofagossomos e na relação LC3-II/LC3-I, do mesmo modo que o tratamento com rapamicina. O tratamento com citocinas também levou à diminuição dos níveis de mTOR e 4E-BP1 fosforilados. Foi demonstrada aqui, pela primeira vez, uma relação direta entre o tratamento com citocinas e a indução de autofagia em células-beta. Recentemente, surgiram novas evidências mostrando ligação entre a morte de células-beta induzida por citocinas e indução de estresse de retículo endoplasmático. Em nosso modelo, foram observados níveis diminuídos de p-mTOR e aumento da formação de autofagossomos após o tratamento com indutores de estresse de retículo. Este estudo reforça também, resultados prévios sobre a hipótese da função de indutores de estresse de retículo em promover a autofagia. Além disso, o tratamento com rhPRL aumentou os níveis de p-mTOR e levou à diminuição na formação de autofagossomos após exposição a citocinas em células-beta. Estes resultados são relevantes para a caracterização mais aprofundada das funções dos lactogênios nessas células. Sabendo-se da necessidade de células-beta humanas para estudos detalhados em células-beta, nosso grupo gerou linhagens celulares derivadas de insulinomas humanos que secretam hormônios e expressam marcadores com o mesmo padrão de seu tecido original. Estas linhagens foram caracterizadas comparando-as com culturas primárias de células-beta através de eletroforese bidimensional acoplada a espectrometria de massa. Cerca de 1.800 spots foram detectados, sendo que menos de 1% apresentou expressão diferencial. As proteínas superexpressas em ilhotas, como Caldesmon, estão envolvidas em organização do citoesqueleto, influenciando a secreção hormonal. Contrariamente, quase todas as proteínas superexpressas nas células de insulinoma, como MAGE-A2, foram descritas aqui pela primeira vez, podendo estar relacionadas à sobrevivência celular e resistência à quimioterapia. Estes resultados mostram, pela primeira vez, mudanças na expressão de proteínas relacionadas ao fenótipo alterado dos insulinomas, direcionando a pesquisa ao estabelecimento de células-beta humanas bioengenheiradas e ao desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para insulinomas. Coletivamente, os dados obtidos neste estudo estendem o conhecimento molecular envolvido na citoproteção induzida por rhPRL e transformação maligna de células-beta pancreáticas, contribuindo para futuras aplicações na compreensão e no tratamento do DM1 / Transplantation of pancreatic islets constitutes an alternative for type 1 diabetes (DM1); however, it is limited by the shortage of organ donors. Here, we investigated the role of recombinant human prolactin (rhPRL), shown to have beneficial effects in beta-cells, and its mechanisms of action. Apoptotic beta-cells were decreased in the presence of rhPRL, with cytoprotection involving an increase of BCL2/BAX ratio and inhibition of caspase-8, -9 and -3. This study provides new direct evidence for a protective effect of lactogens in human beta-cell apoptosis. Taking into account the known relationship between cytokines and DM1 and recent observations suggesting a role for autophagy in the development and prevention of DM1, we investigated the connection between cytokines (IL-1β, TNF-α and IFN-γ) and autophagy in beta-cells. Co-treatment with cytokines and rapamycin, an inducer of autophagy through inhibition of mTOR, did not increase the apoptosis levels in INS-1E cells. However, exposure to cytokines increased the levels of autophagosome formation and LC3-II/LC3-I ratio. Treatment with cytokines also led to decreased levels of phosphorylated mTOR and 4E-BP1. We demonstrated for the first time, a direct relationship between cytokines treatment and induction of autophagy in beta-cells. Lately, new evidence point to a connection between cytokine-induced beta-cell death and endoplasmic reticulum stress. In our model, we observed that decreased levels of p-mTOR and increased autophagosome formation also ensued after treatment with endoplasmic reticulum stressors. This study also supports the previous hypothesis on the function of ER stressors in inducing autophagy. Furthermore, rhPRL treatment increased the levels of p-mTOR and decreased autophagosome formation after exposure to cytokines in beta-cells. These findings are also relevant for further characterization of lactogens functions in these cells. Considering the demand for human cells for further beta-cells studies, our group generated cell lines derived from human insulinomas which secrete hormones and express markers with the same pattern displayed by their original tissue. We set out to further characterize these lineages by comparing them to primary beta-cells using two-dimensional gel electrophoresis coupled to mass spectrometry. An average of 1,800 spots was detected with less than 1% exhibiting differential expression. Proteins upregulated in islets, such as Caldesmon, are involved in cytoskeletal organization thus influencing hormone secretion. In contrast, almost all proteins upregulated in insulinoma cells, such as MAGE-A2, first described here, could be related to cell survival and resistance to chemotherapy. Our results provide, for the first time, a molecular snapshot of the changes in expression of proteins correlated with the altered phenotype of insulinomas, prompting research towards the establishment of bioengineered human beta-cells, and the development of new therapeutic strategies for insulinomas. Collectively, the data obtained in this study extend the molecular knowledge involved in rhPRL-induced cytoprotection and malignant transformation of pancreatic beta-cells, contributing to future applications for understanding and treatment of DM1

Os retardantes de chama bromados são substâncias utilizadas em bens de consumo para aumentar sua resistência ao fogo e/ou altas temperaturas. Para este fim os Éteres Difenílicos Polibromados (PBDEs do inglês polybrominated diphenyl ether) representam a classe mais utilizada tendo em vista sua eficiência no controle da propagação da chama e baixo custo. Estes compostos são considerados persistentes, bioacumuláveis, podem ser transportados para longas distâncias e apresentam toxicidade podendo causar desregulação endócrina, entretanto os mecanismos de toxicidade ainda não foram bem estabelecidos. Desta forma, o presente projeto utilizou linhagens celulares de Hepatoblastoma Humano (HepG2), HeLa, Hepatócitos e linfócitos humanos a fim de elucidar seus mecanismos de toxicidade. Os resultados significativos demonstram a capacidade destes compostos em induzir dano primário no DNA (0,5 ?mol/L para o BDE-153 e 5 ?mol/L para o BDE-100) monitorado pelo teste do cometa, que não foi reparado após 24 horas de exposição. No entanto, não se observou um aumento de micronúcleos em HepG2 e linfócitos após exposição aos congêneres (0,1 - 25 ?mol/L) nem mesmo mutagenicidade no ensaio de Salmonella typhimurium. Contudo, os compostos apresentam capacidade de diminuir a redução do brometo de 3-(4,5 dimetiltiazol-2il)-2,5 difenil tetrazólio (MTT), proliferação e interferem no ciclo celular nos cultivos celulares avaliados. Estes efeitos de citotoxicidade estão relacionados com a disfunção mitocondrial, uma vez que ambos PBDEs geram dissipação do potencial de membrana mitocondrial, formação e acúmulo de espécies reativas, culminando em morte celular apoptótica, demonstrada pela manutenção da fosfatidil serina na face externa da membrana celular, pela condensação e fragmentação nuclear, presença de fatores pró-apoptóticos no citosol da célula, tais como citocromo C e AIF além da ativação de caspases 3 e 9. Estes dados corroboram com o fato de não ter liberação de lactato desidrogenase intracelular, excluindo a morte celular por necrose. E por fim, foi possível observar que a exposição aos compostos ativa o processo autofágico, a princípio como um mecanismo de citoproteção observado pela conversão de LC3I em LC3II e acúmulo de p62 (marcadores autofágicos) além de marcações imunicitoquímicas para LC3II e co-localização de lisossomos no padrão pontuado, indicanto acúmulos da proteína LC3 e lisossomos, formando os autofagossomos. Em conjunto nossos resultados apresentam a capacidade de induzir instabilidade genômica e citotoxicidade desta classe de compostos, reforçando a idéia de que os PBDEs representam risco à população exposta / The brominated flame retardants are substances used in consumer goods to increase its fire resistance and/or high temperatures. Due to, the polybrominated diphenyl ethers (Polybrominated diphenyl ether) are the most commonly used class in view of its efficiency in controlling the spread of flame and low cost. These compounds are considered persistent, bioaccumulative, can be transported over long distances and have toxicity. However the toxic mechanisms of action have not been well established. Thus, this project held cytotoxic, genotoxic and mutagenic assays in HepG2, HeLa, hepatocytes and human lymphocytes cells in order to elucidate the mechanisms of toxicity. The results demonstrate the ability of these compounds to induce primary DNA damage (0.5 ?M for BDE-153 and 5 ?M for BDE-100) monitored by the comet assay, it was not repaired after 24 hours of exposure. However, there was not observed nether increase in micronuclei in HepG2 cells and lymphocytes after exposure to the congeners (0.1 - 25 ?M) even in the Salmonella typhimurium mutagenicity assay. However, the compounds show the ability to reduce MTT reduction, proliferation, and interfere with cell cycle evaluated in cell cultures. These cytotoxic effects are related to mitochondrial dysfunction, since both PBDE generate dissipation of the mitochondrial membrane potential, accumulation of reactive oxygen species, resulting in apoptotic cell death, demonstrated by the maintenance of serine phosphatidyl on the external surface of the cell membrane, by condensation and nuclear fragmentation, the presence of pro-apoptotic factors in the cytosol of the cell, such as cytochrome c and AIF plus activating caspase 3 and 9. These data corroborate the fact of not having to intracellular lactate dehydrogenase release, excluding death cell necrosis. Finally, it was observed that exposure to the active compounds the autophagic process, at first as a cytoprotective mechanism observed by LC3I conversion in LC3II and accumulation of p62 (autophagic markers) plus imunicitoquímicas markings for LC3II and co-location lysosomes in dotted pattern, indicanto accumulations of LC3 protein and lysosomes, forming autophagosomes. Together our results show the ability to induce genomic instability and cytotoxicity of this class of compounds, reinforcing the idea that PBDEs pose a risk to the exposed population

Un estil de vida saludable, on la pràctica d’exercici físic hi és present, millora diferents aspectes relacionats amb el deteriorament cognitiu i fisiològic associat a l’envelliment. Malgrat que els estudis en rosegadors confirmen aquests beneficis, els mecanismes moleculars implicats tant a nivell cerebral com a nivell perifèric no estan del tot ben establerts. Per aquest motiu en aquesta tesi doctoral s’ha volgut avaluar tant a nivell cerebral (hipocamp i còrtex cerebral) com a nivell perifèric (múscul esquelètic, fetge i cor) en rates mascle Sprague-Dawley als 10 mesos de vida (rates adultes) el procés d’envelliment sobre algunes de les vies moleculars que s’han relacionat i resulten alterades amb l’edat, com són la via de sirtuïna 1, el procés d’autofàgia i la via Wnt (via canònica). D’altra banda, s’ha volgut determinar la possible modulació de les anteriors vies amb la realització d’exercici físic moderat de llarg termini (dut a terme durant 36 setmanes des de les 5 setmanes de vida, 4-5 dies a la setmana, durant 30 minuts al dia). Els resultats obtinguts a nivell cerebral mostren com l’exercici físic és capaç d’activar la via de sirtuïna 1 (via de supervivència cel•lular) i la biogènesi mitocondrial, el que contribuiria tot plegat al manteniment de la supervivència, la funcionalitat i l’estructura neuronal. També l’exercici, al disminuir els nivells de tau fosforilada a més d’augmentar els nivells de sinaptofisina, estaria implicat en el manteniment de la transmissió sinàptica. D’altra banda, l’activació tant del procés d’autofàgia a nivell del còrtex cerebral com de la via de la Wnt a nivell de l’hipocamp, contribuiria al manteniment de l’homeòstasi i supervivència neuronal. Cal destacar la implicació de sirtuïna 1 en l’activació tant del procés d’autofàgia com de la via Wnt. Així, amb els nostres resultats podem considerar a sirtuïna 1 com un dels elements clau en la regulació de les diferents vies moleculars i processos estudiats en aquesta tesi doctoral, i que la pràctica d’exercici moderat de llarg termini és capaç de modular. Pel que fa als resultats obtinguts a nivell perifèric (múscul esquelètic, fetge i cor), també es va determinar una activació de la via de sirtuïna 1 amb l’exercici en tots els teixits. En canvi, l’estimulació de la biogènesi mitocondrial tan sols es va produir a nivell muscular. També l’exercici va augmentar els nivells proteics dels enzims SOD i CAT en el múscul, revertint així l’augment del dany oxidatiu de proteïnes i lípids amb l’edat a nivell muscular (també en el fetge l’exercici va disminuir el dany oxidatiu de proteïnes), contribuint així tot plegat a la millora funcional a nivell perifèric. L’exercici físic també va incrementar els nivells de VEGF en fetge i cor, fet que podria estimular l’angiogènesi en aquests òrgans. I pel que fa al mecanisme d’autofàgia, solament es van observar alguns canvis destacats a nivell hepàtic, els quals podrien estar relacionats amb la disminució del contingut lipídic en aquest òrgan. Com a conclusió que se’n deriva d’aquesta tesi doctoral és que la realització d’exercici físic des que un és jove, sinònim d’un estil de vida saludable, podria ser una bona estratègia terapèutica amb l’objectiu de prevenir i/o retardar el deteriorament cognitiu i fisiològic que es produeix amb l’envelliment, el qual conduiria al desenvolupament de les malalties neurodegeneratives i metabòliques, ambdues molt presents actualment en la societat actual dels països desenvolupats. / Exercise is known to have beneficial effects on the organism and is increasingly recognized as determinant of successful aging. However, the molecular and cellular mechanisms underlying these effects remain to be elucidated. For this reason, we studied the effects of the aging process on the sirtuin 1 pathway, the autophagy (macroautophagy) and the canonical Wnt pathway, all of which related with the aging process, in adult male Sprague-Dawley rats (10 months), both in the brain (hippocampus and cortex) and peripheral tissues (skeletal muscle, liver and heart). Moreover, we examined the effects of long-term moderate treadmill exercise (30 min, 4-5 days per week for 36 weeks from 5 weeks) on the above pathways. At cerebral level, our results showed a sirtuin 1 pathway activation and an increase in mitochondrial biogenesis induced by exercise. In addition, exercise increased synaptophysin levels and reduced both levels of phospho-tau and GSK3β activation. On the other hand, exercise induced the macroautophagy in the cortex and Wnt signaling pathway in the hippocampus. Thus, in our rodent model, long-term moderate exercise leads to neuroprotection trough the upregulation of several pathways related with homeostasis and neuronal survival, and also the prevention of signs of neurodegeneration. It is noteworthy to consider the important role of sirtuin 1 modulating the different pathways studied. In peripheral tissues, long-term moderate exercise induced the sirtuin 1 pathway activation in all rat tissues studied, but only increased mitochondrial biogenesis in the muscle. On the other hand, SOD and CAT protein levels were increased by exercise in the muscle, together with a reduction of oxidative damage of lipids and proteins (the latter also reduced in liver with exercise). Increased VEGF protein levels were found in the liver and the heart, which could induce the angiogenic process in these organs. As for macroautophagic process, only important changes were observed in liver, which could be related with metabolic effects, reducing lipid content. Therefore, these results support that exercise also contributes to functional improvement in peripheral tissues. To conclude, our results show several benefits related to long-term moderate exercise from young ages on different pathways and parameters related with aging, which reinforce the beneficial role of exercise to prevent or delay the age-related cognitive and physiological impairments.

A juçara, Euterpe oleracea Mart., fruta indígena da Amazônia Legal, é rica em fitoquímicos com atividades anti-oxidante, antiinflamatória e anti-câncer. Este estudo tem por objetivo analisar os efeitos do extrato hidroalcoólico da casca, caroço e fruto total da juçara em diferentes linhagens de células malignas humana. Os frutos foram coletados no Parque da Juçara, localizado no Maracanã, município de São Luís, seguida da confecção da excicata que se mantém registrada no Herbário Rosa Mochel do Núcleo de Estudos Biológicos da Universidade Estadual do Maranhão. Os extratos hidroalcoólicos da casca, caroço e fruto total foram extraidos no Laboratório de Farmacologia e Psicobiologia da UERJ. As linhagens celulares utilizadas nos ensaios foram MCF-7 (adenocarcinoma de mama), CACO-2 e HT-20 (adenocarcinoma colo retal) e adenocarcinoma na mama (MDA-MB-468). As linhagens foram tratadas com 10, 20 e 40g/mL dos extratos por 24 e 48 horas e feitas às análises. Células MCF-7 controle apresentaram núcleo proeminente com nucléolos evidentes. Após tratamento com o extrato hidroalcoólico da casca da juçara, as células mostraram morfologia arredondada com retração do citoplasma. O ensaio de viabilidade com MTT ((3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)) demonstrou uma redução na viabilidade das células. Após 48 horas, o tratamento das células com 20g/mL do extrato da casca reduziu a viabilidade sendo que o efeito citotóxico do tratamento com 40g/mL do extrato da casca foi potencializado. Células tratadas com 10g/mL do extrato do caroço de juçara apresentavam-se arredondadas com consequente redução no volume celular. A concentração 20g/mL de extrato hidroalcoólico do caroço, causou severa redução no volume das células e ocasionou o surgimento de vacúolos intracelulares. O mesmo foi observado após tratamento com 40g/mL. O tratamento com 40g/mL do extrato hidroalcoólico do fruto total, modificou drasticamente a morfologia das células MCF-7 causando vacuolização e aparente lise com perda do conteúdo citoplasmático e o ensaio da viabilidade com MTT demonstrou redução na viabilidade das células MCF-7 tratadas com 20 e 40g/mL após 24 horas de tratamento. Análises por MET (Microscopia Eletrônica de Transmissão) demonstraram o surgimento de vesículas autofágicas, cuja comprovação deu-se com a identificação da expressão da proteína LC3BII na membrana do autofagossoma pela técnica de Western Blotting. Mediante o demonstrado pelos experimentos, com as linhagens MCF-7 e MDA-MB-468, confirma-se que as frações isoladas do extrato do caroço da juçara, promove modificações celulares indicativas de autofagia a partir de 10g/mL, em 24 horas. O núcleo permaneceu íntegro, não apresentando características de núcleo apoptótico. Os dados são conclusivos para ocorrência de morte celular por autofagia em linhagem celulares de carcinoma de mama MCF-7 quando tratadas com extrato hidroalcoólico da casca, caroço e fruto total da juçara do Maranhão, agente quimiopreventivo no câncer de mama estrogênio-dependente. / Juçara, Euterpe oleracea Mart., an indigenous fruit from Amazon, is rich in phytochemicals with antioxidant, anti-inflammatory and anti-cancer activity. This study aims to analyze the effects of the hydroalcoholic extract of the bark, seed and total fruit of juçara in different human malignant cell lines. Fruits were collected at the Maracana Ecological Park, in São Luís, followed by excicata manufacturing that remains registered in the Herbarium Rosa Mochel from the Nucleus of Biological Studies at the State University of Maranhão. The hydroalcoholic extracts of bark, seed and fruit were all obtained in the Laboratory of Pharmacology and Psychobiology UERJ. The cell lines used in the tests were MCF-7 and MDA-MB-468 (breast adenocarcinoma) and CACO-2 and HT-20 (colorectal adenocarcinoma). Strains were treated with 10, 20 and 40μg/mL of extracts for 24 and 48 hours. Control MCF-7 cells showed prominent nucleus with evident nucleoli. After treatment with the hydroalcoholic extract from the bark of juçara, the cells showed rounded morphology with retraction of the cytoplasm. The MTT viability assay showed a reduction in cell viability. After 48 hours, treatment of cells with 20μg/mL of bark extract reduced cell viability and the cytotoxic effect of treatment with 40μg/mL extract of the bark was potentiated. Cells treated with 10μg/mL of the bark extract were rounded with consequent reduction in cell volume. The concentration of 20μg/mL of bark extract caused severe reduction in volume of the cells and caused the appearance of intracellular vacuoles. The same was observed after treatment with 40μg/mL. Treatment with 40μg/mL of the hydroalcoholic extract of total fruit dramatically changed the morphology of the MCF-7 cells causing vacuolization and lysis with apparent loss of cytoplasmic contents. MTT assay showed a reduction in viability of MCF-7 cells treated with 20 and 40μg/mL after 24 hours of treatment. Analysis by electron microscopy showed the appearance of autophagic vacuoles. Autophagosome protein LC3BII was identified by Western Blotting technique. It is confirmed that the isolated fractions of the bark extract from juçara promotes cellular changes indicative of autophagy from 10μg/mL in 24 hours. The nuclei remained intact, showing no apoptotic features. The data are conclusive for the occurrence of autophagy in carcinoma cell line MCF-7 breast treated with hydroalcoholic bark, seed and fruit from juçara.

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Concomitantemente, mecanismos moleculares que agem na manutenção celular como a autofagia podem estar relacionados ao “turnover” ósseo no período do envelhecimento, sendo estes mecanismos relacionados ao processo de osteopenia/osteoporose. Neste estudo foram avaliados os efeitos do treinamento de força (TF) na microestrutura do colo do fêmur de ratas Wistar adultas (7 meses) e velhas (21 meses) submetidas ou não ao programa de exercício físico e distribuídas nos grupos: adultas não exercitadas (A/NEX); adultas exercitadas (A/EX); velhas não exercitadas (V/NEX) e velhas exercitadas (V/EX). O treinamento de força foi realizado utilizando-se escada com carga atrelada à cauda dos animais; 3 vezes por semana durante período de 120 dias. Resultados obtidos por microtomografia computadorizada (μCT) após este período demonstraram que o TF foi capaz de aumentar a espessura (Ct. Th (mm); V/EX vs A/EX p = 0,7863), momento polar de inércia médio (pMOI (mm4); A/NEX vs A/EX p = 0,0362; V/NEX vs V/EX p = 0,0032) e reduzir a porosidade da região cortical do colo do fêmur (Ct. Po (%); V/NEX vs V/EX p = 0,0406), causando aumento na área cortical total (Tt.Ar (mm²); V/NEX vs V/EX p = 0,0406). No osso trabecular notou-se maior fração do volume ósseo (BV/TV (%); V/NEX vs V/EX p = 0,006); espessura trabecular (Tb.Th (mm); V/NEX vs V/EX p = 0,0069; V/EX vs A/EX p<0,0001); número de trabéculas (Tb.N (1/mm) V/NEX vs V/EX p = 0,0004) e grau de anisotropia ( DA V/NEX vs V/EX p = 0,0088). Estas modificações resultaram em redução do espaçamento trabecular (Tb.Sp (mm) V/EX vs A/EX p = 0,0382) e porosidade trabecular (Tb.Po (%) V/NEX vs V/EX p = 0,0006). Além destes parâmetros da estrutura cortical e trabecular, foram avaliados: capacidade de carregamento voluntário máximo (CCVM); peso corporal, do útero e do tecido adiposo retroperitoneal; biomarcadores para fosfatase alcalina plasmática (FAL) e fosfatase ácida resistente à tartarato sérica (TRAP); densidade mineral óssea areal (DMOa), Western blot para beclina-1, LC3, sequestossoma-1/p62 (SQSTM-1/p62), AKT, ERK1//2, pAKT (Ser473), pERK (Thr202/ Tyr204); e imunoistoquímica (IHQ) para RUNX-2, FAL, TRAP, Osteocalcina (OCN) e beclina-1. As dosagens plasmáticas evidenciaram aumento na atividade da FAL após a realização do TF (A/NEX vs A/EX p = 0,0002). Concentrações plasmáticas de TRAP não apresentaram alterações significantes. Análises de marcadores autofágicos mostraram maior expressão para beclina-1 em A/EX e V/EX. LC3 também obteve elevada expressão em A/EX, mas em V/EX sua expressão foi menor. A expressão de SQSTM1/p62 foi reduzida após a realização do TF nas ratas A/EX e V/EX. AKT total (t-AKT) e AKT fosforilada (pAKT-Ser473) demonstrou expressão mais alta em A/EX comparados à A/NEX. Por outro lado, em V/EX, a fosforilação foi reduzida em Ser473 quando comparados à V/NEX, mas t-AKT permaneceu inalterada em ambos. Resultados para ERK1/2 demonstraram redução na expressão em A/EX comparados à A/NEX, mas em V/EX sua expressão foi melhorada comparados à V/NEX. A fosforilação de ERK em Thr202 foi aumentada em A/EX em relação à A/NEX, mas em ratas velhas não houveram modificações. No sítio Tyr204 também houve elevada fosforilação em A/EX comparados à A/NEX, mas foi reduzida em V/EX comparados à V/NEX. A imunomarcação de RUNX-2, FAL, OCN e beclina-1 foi menor em V/NEX mas em V/EX a marcação aumentou assemelhando -se à A/EX. TRAP, elevada em V/NEX, mostrou -se reduzida em V/EX. Em suma, neste estudo nós demonstramos a atuação do TF no metabolismo ósseo de ratas no período da periestropausa com resposta integrada entre exercício e idade. Este estudo também demonstrou que proteínas importantes relacionadas à regulação autofágica e metabolismo ósseo podem ser potencialmente alteradas pelo TF. Nossos resultados evidenciam atuação do TF na manutenção da massa óssea mostrando que essa modalidade de exercício pode prevenir e/ou diminuir danos causados pela osteoporose durante o estágio do envelhecimento. / The decrease in bone mass concomitant with the progression of age results in a higher incidence of fractures, due to microarchitectural changes that are important determinants of bone quality. Concomitantly, molecular mechanisms that act in cellular maintenance such as autophagy may be related to bone turnover in the aging period, and these mechanisms are related to the osteopenia/osteoporosis process. In this study were evaluated, the effects of strength training (ST) on the femoral neck microstructure of adult (7 months) and old (21 months) female Wistar rats submitted or not to the physical exercise program and distributed in the following groups: non-exercised adult groups (A/NEX); exercised adults (A/EX); non-exercised old (O/NEX) and old exercised (O/EX). Strength training was performed using a ladder with load attached to the tail of the animals; 3 times a week for a period of 120 days. Results obtained by computerized microtomography (μCT) after this period demonstrated that the ST was able to increase the thickness (Ct.Th (mm), O/EX vs A/EX p = 0.7863), mean polar moment of inertia (mm4), A/NEX vs A/EX p = 0.0362, O/NEX vs O/EX p = 0.0032) and reduce the porosity of the cortical region of the femoral neck (Ct Po (%); O/NEX vs O/EX p = 0.0406), causing increase in the total cortical area (Tt.Ar (mm²); O/NEX vs O/EX p = 0.0406). In trabecular bone, a higher fraction of bone volume was observed (BV / TV (%), O/NEX vs O/EX p = 0.006); (Tb.Th (mm); O/NEX vs O/EX p = 0.0069; O/EX vs A/EX p <0.0001); number of trabeculae (Tb.N (1/mm) O/NEX vs O/EX p = 0.0004) and degree of anisotropy (DA O/NEX vs O/EX p = 0.0088). These changes resulted in a reduction in trabecular spacing (Tb.Sp (mm) O/EX vs A/EX p = 0.0382) and trabecular porosity (Tb.Po (%) O/NEX vs O/EX p = 0.0006 ). In addition to these parameters of the cortical and trabecular structure, the following were evaluated: maximum voluntary carrying capacity (MVCC); body weight, uterus and retroperitoneal adipose tissue; biomarkers for plasmatic alkaline phosphatase (ALP) and serum tartrate resistant acid phosphatase (TRAP); Western blot for beclin-1, LC3, sequestosome-1/p62 (SQSTM-1 / p62), AKT, ERK1/2, pAKT (Ser473), pERK (Thr202/Tyr204) and immunohistochemistry (IHC) for RUNX-2, ALP, TRAP, osteocalcin (OCN) and beclin-1. Plasma dosages showed an increase in ALP activity after ST (A/NEX vs A/EX p = 0.0002). Plasmatic concentrations of TRAP did not show significant alterations. Analyzes of autophagic markers showed higher expression for beclin-1 in A/EX and O/EX. LC3 also had higher expression in A/EX, but in O/EX its expression was lower. Expression of SQSTM1/p62 was reduced after ST in the A/EX and O/EX rats. Total AKT (t-AKT) and phosphorylated AKT (pAKT-Ser473) demonstrated higher expression in A/EX compared to A/NEX. On the other hand, in O/EX, phosphorylation was reduced in Ser473 when compared to O/NEX, but t-AKT remained unchanged in both. Results for ERK1/2 demonstrated reduction in A/EX expression compared to A/NEX, but in O/EX their expression was improved compared to O/NEX. ERK phosphorylation in Thr202 was increased in A/EX relative to A/NEX, but in old rats there were no changes. At the Tyr204 site there was also high A/EX phosphorylation compared to A/NEX, but was reduced in O/EX compared to O/NEX. Immunostaining of RUNX-2, FAL, OCN and beclin-1 was lower in O/NEX but in O/EX the labeling increased resembling A/EX. TRAP, high in O/NEX, was reduced in O/EX. In summary, in this study we demonstrated the action of ST in bone metabolism of rats in periestropause period with integrated response between exercise and age. This study also demonstrated that important proteins related to autophagic regulation and bone metabolism may be potentially be altered by ST. Our results demonstrate the role of ST in maintaining bone mass, showing that this exercise modality can prevent and/or reduce osteoporosis damage during the aging stage.

A juçara, Euterpe oleracea Mart., fruta indígena da Amazônia Legal, é rica em fitoquímicos com atividades anti-oxidante, antiinflamatória e anti-câncer. Este estudo tem por objetivo analisar os efeitos do extrato hidroalcoólico da casca, caroço e fruto total da juçara em diferentes linhagens de células malignas humana. Os frutos foram coletados no Parque da Juçara, localizado no Maracanã, município de São Luís, seguida da confecção da excicata que se mantém registrada no Herbário Rosa Mochel do Núcleo de Estudos Biológicos da Universidade Estadual do Maranhão. Os extratos hidroalcoólicos da casca, caroço e fruto total foram extraidos no Laboratório de Farmacologia e Psicobiologia da UERJ. As linhagens celulares utilizadas nos ensaios foram MCF-7 (adenocarcinoma de mama), CACO-2 e HT-20 (adenocarcinoma colo retal) e adenocarcinoma na mama (MDA-MB-468). As linhagens foram tratadas com 10, 20 e 40g/mL dos extratos por 24 e 48 horas e feitas às análises. Células MCF-7 controle apresentaram núcleo proeminente com nucléolos evidentes. Após tratamento com o extrato hidroalcoólico da casca da juçara, as células mostraram morfologia arredondada com retração do citoplasma. O ensaio de viabilidade com MTT ((3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)) demonstrou uma redução na viabilidade das células. Após 48 horas, o tratamento das células com 20g/mL do extrato da casca reduziu a viabilidade sendo que o efeito citotóxico do tratamento com 40g/mL do extrato da casca foi potencializado. Células tratadas com 10g/mL do extrato do caroço de juçara apresentavam-se arredondadas com consequente redução no volume celular. A concentração 20g/mL de extrato hidroalcoólico do caroço, causou severa redução no volume das células e ocasionou o surgimento de vacúolos intracelulares. O mesmo foi observado após tratamento com 40g/mL. O tratamento com 40g/mL do extrato hidroalcoólico do fruto total, modificou drasticamente a morfologia das células MCF-7 causando vacuolização e aparente lise com perda do conteúdo citoplasmático e o ensaio da viabilidade com MTT demonstrou redução na viabilidade das células MCF-7 tratadas com 20 e 40g/mL após 24 horas de tratamento. Análises por MET (Microscopia Eletrônica de Transmissão) demonstraram o surgimento de vesículas autofágicas, cuja comprovação deu-se com a identificação da expressão da proteína LC3BII na membrana do autofagossoma pela técnica de Western Blotting. Mediante o demonstrado pelos experimentos, com as linhagens MCF-7 e MDA-MB-468, confirma-se que as frações isoladas do extrato do caroço da juçara, promove modificações celulares indicativas de autofagia a partir de 10g/mL, em 24 horas. O núcleo permaneceu íntegro, não apresentando características de núcleo apoptótico. Os dados são conclusivos para ocorrência de morte celular por autofagia em linhagem celulares de carcinoma de mama MCF-7 quando tratadas com extrato hidroalcoólico da casca, caroço e fruto total da juçara do Maranhão, agente quimiopreventivo no câncer de mama estrogênio-dependente. / Juçara, Euterpe oleracea Mart., an indigenous fruit from Amazon, is rich in phytochemicals with antioxidant, anti-inflammatory and anti-cancer activity. This study aims to analyze the effects of the hydroalcoholic extract of the bark, seed and total fruit of juçara in different human malignant cell lines. Fruits were collected at the Maracana Ecological Park, in São Luís, followed by excicata manufacturing that remains registered in the Herbarium Rosa Mochel from the Nucleus of Biological Studies at the State University of Maranhão. The hydroalcoholic extracts of bark, seed and fruit were all obtained in the Laboratory of Pharmacology and Psychobiology UERJ. The cell lines used in the tests were MCF-7 and MDA-MB-468 (breast adenocarcinoma) and CACO-2 and HT-20 (colorectal adenocarcinoma). Strains were treated with 10, 20 and 40&#956;g/mL of extracts for 24 and 48 hours. Control MCF-7 cells showed prominent nucleus with evident nucleoli. After treatment with the hydroalcoholic extract from the bark of juçara, the cells showed rounded morphology with retraction of the cytoplasm. The MTT viability assay showed a reduction in cell viability. After 48 hours, treatment of cells with 20&#956;g/mL of bark extract reduced cell viability and the cytotoxic effect of treatment with 40&#956;g/mL extract of the bark was potentiated. Cells treated with 10&#956;g/mL of the bark extract were rounded with consequent reduction in cell volume. The concentration of 20&#956;g/mL of bark extract caused severe reduction in volume of the cells and caused the appearance of intracellular vacuoles. The same was observed after treatment with 40&#956;g/mL. Treatment with 40&#956;g/mL of the hydroalcoholic extract of total fruit dramatically changed the morphology of the MCF-7 cells causing vacuolization and lysis with apparent loss of cytoplasmic contents. MTT assay showed a reduction in viability of MCF-7 cells treated with 20 and 40&#956;g/mL after 24 hours of treatment. Analysis by electron microscopy showed the appearance of autophagic vacuoles. Autophagosome protein LC3BII was identified by Western Blotting technique. It is confirmed that the isolated fractions of the bark extract from juçara promotes cellular changes indicative of autophagy from 10&#956;g/mL in 24 hours. The nuclei remained intact, showing no apoptotic features. The data are conclusive for the occurrence of autophagy in carcinoma cell line MCF-7 breast treated with hydroalcoholic bark, seed and fruit from juçara.

O transplante de ilhotas pancreáticas constitui uma alternativa atraente para o tratamento de diabetes tipo 1 (DM1), contudo, é limitado devido à escassez de doadores de órgãos. O papel da prolactina humana recombinante (rhPRL), que apresenta efeitos benéficos em células-beta, e seu mecanismo de ação foram investigados neste estudo. O número de células apoptóticas diminui significativamente na presença de rhPRL. Essa citoproteção envolveu diminuição da razão BCL2/BAX e inibição de caspase-8, -9 e -3. Este estudo revelou, pela primeira vez, evidência direta do efeito protetor de lactogênios contra apoptose de células-beta humanas. Levando em consideração a relação conhecida entre citocinas e DM1 e observações recentes sugerindo o papel da autofagia no desenvolvimento e prevenção do DM1, foi investigada a conexão entre citocinas (IL-1&#946;, TNF&#945; e IFN-&#947;) e autofagia em células-beta. O co-tratamento com citocinas e rapamicina, um indutor de autofagia via inibição de mTOR, não aumentou os níveis de apoptose em células INS-1E. Contudo, exposição a citocinas levou ao aumento nos níveis de autofagossomos e na relação LC3-II/LC3-I, do mesmo modo que o tratamento com rapamicina. O tratamento com citocinas também levou à diminuição dos níveis de mTOR e 4E-BP1 fosforilados. Foi demonstrada aqui, pela primeira vez, uma relação direta entre o tratamento com citocinas e a indução de autofagia em células-beta. Recentemente, surgiram novas evidências mostrando ligação entre a morte de células-beta induzida por citocinas e indução de estresse de retículo endoplasmático. Em nosso modelo, foram observados níveis diminuídos de p-mTOR e aumento da formação de autofagossomos após o tratamento com indutores de estresse de retículo. Este estudo reforça também, resultados prévios sobre a hipótese da função de indutores de estresse de retículo em promover a autofagia. Além disso, o tratamento com rhPRL aumentou os níveis de p-mTOR e levou à diminuição na formação de autofagossomos após exposição a citocinas em células-beta. Estes resultados são relevantes para a caracterização mais aprofundada das funções dos lactogênios nessas células. Sabendo-se da necessidade de células-beta humanas para estudos detalhados em células-beta, nosso grupo gerou linhagens celulares derivadas de insulinomas humanos que secretam hormônios e expressam marcadores com o mesmo padrão de seu tecido original. Estas linhagens foram caracterizadas comparando-as com culturas primárias de células-beta através de eletroforese bidimensional acoplada a espectrometria de massa. Cerca de 1.800 spots foram detectados, sendo que menos de 1% apresentou expressão diferencial. As proteínas superexpressas em ilhotas, como Caldesmon, estão envolvidas em organização do citoesqueleto, influenciando a secreção hormonal. Contrariamente, quase todas as proteínas superexpressas nas células de insulinoma, como MAGE-A2, foram descritas aqui pela primeira vez, podendo estar relacionadas à sobrevivência celular e resistência à quimioterapia. Estes resultados mostram, pela primeira vez, mudanças na expressão de proteínas relacionadas ao fenótipo alterado dos insulinomas, direcionando a pesquisa ao estabelecimento de células-beta humanas bioengenheiradas e ao desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para insulinomas. Coletivamente, os dados obtidos neste estudo estendem o conhecimento molecular envolvido na citoproteção induzida por rhPRL e transformação maligna de células-beta pancreáticas, contribuindo para futuras aplicações na compreensão e no tratamento do DM1 / Transplantation of pancreatic islets constitutes an alternative for type 1 diabetes (DM1); however, it is limited by the shortage of organ donors. Here, we investigated the role of recombinant human prolactin (rhPRL), shown to have beneficial effects in beta-cells, and its mechanisms of action. Apoptotic beta-cells were decreased in the presence of rhPRL, with cytoprotection involving an increase of BCL2/BAX ratio and inhibition of caspase-8, -9 and -3. This study provides new direct evidence for a protective effect of lactogens in human beta-cell apoptosis. Taking into account the known relationship between cytokines and DM1 and recent observations suggesting a role for autophagy in the development and prevention of DM1, we investigated the connection between cytokines (IL-1&#946;, TNF-&#945; and IFN-&#947;) and autophagy in beta-cells. Co-treatment with cytokines and rapamycin, an inducer of autophagy through inhibition of mTOR, did not increase the apoptosis levels in INS-1E cells. However, exposure to cytokines increased the levels of autophagosome formation and LC3-II/LC3-I ratio. Treatment with cytokines also led to decreased levels of phosphorylated mTOR and 4E-BP1. We demonstrated for the first time, a direct relationship between cytokines treatment and induction of autophagy in beta-cells. Lately, new evidence point to a connection between cytokine-induced beta-cell death and endoplasmic reticulum stress. In our model, we observed that decreased levels of p-mTOR and increased autophagosome formation also ensued after treatment with endoplasmic reticulum stressors. This study also supports the previous hypothesis on the function of ER stressors in inducing autophagy. Furthermore, rhPRL treatment increased the levels of p-mTOR and decreased autophagosome formation after exposure to cytokines in beta-cells. These findings are also relevant for further characterization of lactogens functions in these cells. Considering the demand for human cells for further beta-cells studies, our group generated cell lines derived from human insulinomas which secrete hormones and express markers with the same pattern displayed by their original tissue. We set out to further characterize these lineages by comparing them to primary beta-cells using two-dimensional gel electrophoresis coupled to mass spectrometry. An average of 1,800 spots was detected with less than 1% exhibiting differential expression. Proteins upregulated in islets, such as Caldesmon, are involved in cytoskeletal organization thus influencing hormone secretion. In contrast, almost all proteins upregulated in insulinoma cells, such as MAGE-A2, first described here, could be related to cell survival and resistance to chemotherapy. Our results provide, for the first time, a molecular snapshot of the changes in expression of proteins correlated with the altered phenotype of insulinomas, prompting research towards the establishment of bioengineered human beta-cells, and the development of new therapeutic strategies for insulinomas. Collectively, the data obtained in this study extend the molecular knowledge involved in rhPRL-induced cytoprotection and malignant transformation of pancreatic beta-cells, contributing to future applications for understanding and treatment of DM1