A desnutrição é um dos principais problemas de saúde pública do mundo, que contribui significativamente para o aumento da morbidade e mortalidade. Estima-se um total de 815 milhões de pessoas subnutridas no mundo, e apesar da melhoria dos recursos alimentares o número de pessoas desnutridas ainda é alarmante. Estudos de nosso laboratório tem demonstrado, em modelo murino de desnutrição proteica, hipoplasia medular com evidências histológicas de alterações na matriz extracelular (MEC) e permanência da célula-tronco hemopoética (CTH) na fase G0/G1 do ciclo celular em camundongos desnutridos. Dados deste trabalho evidenciaram alterações nas proteínas Akt /mTOR, que podem contribuir para o aumento da expressão autofágica nas CTHs e CTPHs (célula-tronco progenitora). A literatura demonstra que desequilíbrios nutricionais e metabólicos podem induzir ativação autofágica. Autofagia é um processo catabólico que participa da manutenção da homeostase celular, da MEC e na regulação das CTHs, dados deste trabalho demonstram diminuição da quantidade de CTH e CTPH em camundongos desnutridos sem a presença do gene Atg7, proteína participativa no processo autofágico. Já camundongos com deleção da transglutaminase 2 (TG2) e submetidos a privação de nutrientes por 24 horas , apresentou diminuição da quantidade de CTH e aumento da diferenciação da CTPH. A TG2 tem participação na impulsão e formação do fagóforo (processo inicial autofágico). Considerando que a desnutrição proteica leva a comprometimento da hemopoese, alterações no ciclo celular das CTHs e hipoplasia medular com pancitopenia periférica e que privação e ou jejum prolongado de nutrientes pode aumentar a atividade autofágica, concluímos nesse projeto que autofagia é importante para regulação da CTH e diferenciação da CTPH, entretanto a desnutrição proteica e privação de nutrientes estimula de maneira diversa o mecanismo de diferenciação da CTH. / Malnutrition is one of the world\'s major public health problems, which contributes significantly to increased morbidity and mortality. An estimated 815 million people are undernourished in the world, and despite the improvement in food resources the number of undernourished people is still alarming. Studies of our laboratory have demonstrated in murine model of protein malnutrition, medullary hypoplasia with histological evidence of extracellular matrix (ECM) changes and hemopoietic stem cell (HSC) stay in the G0/ G1 phase of the cell cycle in malnourished mice. Data from this work showed alterations in Akt / mTOR proteins, which may contribute to the increase of autophagic expression in HSC and HPC (progenitor stem cell). The literature demonstrates that nutritional and metabolic imbalances can induce autophagic activation. Autophagy is a catabolic process that participates in the maintenance of cellular homeostasis, ECM and in the regulation of HSC, data from this work demonstrate a decrease in the amount of HSC and HPC in malnourished mice without the presence of the Atg7 gene, a participatory protein in the autophagic process. Mice with transglutaminase 2 deletion (TG2) and submitted to nutrient deprivation for 24 hours showed a decrease in the amount of HSC and an increase in the differentiation of HPC. TG2 plays a role in the uptake and formation of phagophore (autophagic initial process). Considering that protein malnutrition leads to hemopoiesis, alterations in the cell cycle of HSC and spinal cord hypoplasia with peripheral pancytopenia, and that prolonged nutrient starvation or fasting may increase the autophagic activity, we conclude in this project that autophagy is important for regulation of HSC and differentiation of HPC, however, protein malnutrition and nutrient deprivation stimulate in a different way the mechanism of differentiation of HSC.

A doença de Parkinson é a doença motora neurodegenerativa mais comum do mundo. Agregados proteicos contendo principalmente alfa-sinucleína é a principal marca da doença. Recentemente, tem sido demonstrado que defeitos na dinâmica mitocondrial e da autofagia são causados pelo acúmulo da proteína. No nosso estudo, foram utilizados neurônios derivados de SH-SY5Y ou de hiPSC de pacientes com a doença de Parkinson hereditária, além de leveduras para analisar a dinâmica mitocondrial e da autofagia e o envolvimento de proteínas desses processos na toxicidade da alfa- sinucleína. Foi observado a diminuição do tráfego mitocondrial em neurônios derivados das células SH-SY5Y que expressavam alfa-sinucleína A53T. Além disso a proteína mutante ainda levou ao aumento de espécies reativas de oxigênio, perturbação da autofagia e aumento da sinalização apoptótica. Os neurônios então foram tratados com NAP, um peptídeo neuroprotetor, que preveniu os efeitos tóxicos da alfa-sinucleína mutante. Leveduras contendo deleções nos genes Gem (Miro), Ypt53 (Rab5) e Atg8 (LC3) e expressando alfa-sinucleína dos tipos A30P e A53T, demonstraram que a toxicidade da alfa-sinucleína é dependente das disfunções na mitocôndria e na autofagia. A agregação da alfa-sinucleína A53T foi prevenida na ausência de Gem. Além disso, a toxicidade da proteína envolvendo a disfunção mitocondrial e sinalização apoptótica causada pelo estresse do ER foi dependente dos genes Gem e Atg8, respectivamente. Neurônios derivados de hiPSC de pacientes contendo a triplicação do gene da alfa-sinucleína, mostraram diminuição do transporte de mitocôndrias e do potencial de membrana da mitocôndria. Análises sobre a quantidade de vesículas lisossomais desses neurônios, demonstraram acúmulos dessas vesículas, sugerindo que a autofagia está alterada. Em um ensaio sobre a sensibilidade dos neurônios dopaminérgicos, foi observado que os neurônios contendo a alpha-sinucleína mutante são mais susceptíveis à rotenona, quando comparado com os neurônios dopaminérgicos do controle. A exposição à rotenona também causou mudanças na distribuição de mitocôndrias, sugerindo que o tráfego retrógrado da organela está alterado / Parkinson\'s disease (PD) is the most common motor neurodegenerative disease in the world. Protein aggregates containing mainly alpha-synuclein are a hallmark of disease. Mitochondria and autophagy defects have been suggested to be caused by alpha-synuclein toxicity. In this study, we investigated mitochondria and autophagy dynamics related to alpha-synuclein toxicity in neurons derived form SH-SY5Y cells, hiPSC from patients with familial PD or yeast. We found that SH-SY5Y neuroblastoma cells expressing A53T alfa- synuclein showed significantly inhibited mitochondrial trafficking. A53T alfa- synuclein also caused the highest increase in ROS production in the dysmobilized mitochondria in comparison to wild-type or A30P alfa- synuclein. Treatment with NAP, the 8 amino acid peptide identified as the active component of activity dependent neuroprotective protein (ADNP), completely annihilated the adverse effects of A53T on mitochondrial dynamics. During disruption of retrograde transport, we found disturbed autophagy and increased apoptosis signalization in neurons expressing A53T alpha-synuclein, suggest activation of the apoptosis pathway. Curiously, all groups expressing alpha-synuclein showed decreased levels of BCL-XL, revealing that mitochondria are susceptible to changes in the membrane potential in the presence of alphasynuclein. Nevertheless, treatment with NAP was effective in blocking the apoptosis pathway and restore autophagy. We created a model to study A30P and A53T alpha-synuclein toxicity related to Gem (Miro), Ypt53 (Rab5) and Atg8 (LC3) genes in Saccharomyces cerevisiae in which these genes were knocked down. We found that A30P alpha-synuclein toxicity was dependent on mitochondrial and autophagy dysfunction. A53T alpha-synuclein was more toxic than A30P alpha-synuclein, and its aggregation was dependent on Gem expression. A53T alpha-synuclein toxicity involving damaged mitochondrial and apoptotic signaling caused by ER stress was dependent on Gem and Atg8 genes, respectively. In a study involving dopaminergic neurons derived from hiPSCs from patients containing triplicated alpha-synuclein gene (SNCA3), we reported decreased mitochondrial trafficking and mitochondrial membrane potential, besides accumulation of lysosome vesicles. In a sensitivity assay, SNCA3 neurons demonstrated more susceptibility to rotenone toxicity, which alters intracellular mitochondrial distribution, impairing retrograde transport of the organelle

O diabetes mellitus (DM) é caracterizado por hiperglicemia associada à falta ou à ineficiência da insulina. DM também é marcado por alterações em diversos processos celulares que precisam ser mais bem entendidos. Estudou-se a via da autofagia em diferentes macrófagos, verificando se o tratamento com insulina é capaz de modular esse processo. Foram estudados macrófagos derivados da medula óssea (BMM), do lavado broncoalveolar (LBA) e do tecido esplênico de ratos Wistar, machos, diabéticos (aloxana, 42 mg/kg, i.v., 10 dias), ratos diabéticos tratados (insulina 4UI, s.c.) e respectivos controles. Para caracterização do modelo e avaliação do efeito da insulina sobre o processo autofágico, as seguintes análises foram realizadas: (a) glicemia, número de leucócitos no sangue periférico, número de células do LBA; (b) concentrações de citocinas: interleucina (IL)-1beta, fator de necrose tumoral (TNF)-alfa, IL-6, IL-4, IL-10, cytokine-induced neutrophil chemoattractant (CINC)-1 e CINC-2 no sobrenadante do LBA pela técnica de ELISA; (c) caracterização de macrófago alveolar (MA) do LBA quanto a antígenos de superfície (MHCII, pan-macrophage KiM2R, CD11b) e marcadores autofágicos (proteína de cadeia leve associada a microtúbulo (LC)3 , gene/proteína relacionado à autofagia (ATG) pela técnica de citometria de fluxo e microscopia confocal ; (d) estudo dos macrófagos diferenciados, a partir da medula óssea, por citometria de fluxo e microscopia confocal; (e) estudo da arquitetura do baço pela técnica de imuno-histoquímica associada à microscopia confocal. Avaliando os resultados em conjunto, a via autofágica parece ser de extrema importância e de capacidade inovadora para alvo terapêutico. Observou-se que a insulina exerceu efeitos antagônicos sobre os macrófagos de tecidos diferentes: aumentou a expressão LC3 nos macrófagos recuperados por LBA e não conseguiu alterar a atividade autofágica em macrófagos da polpa vermelha do baço em ratos diabéticos. Os BMM originários de ratos diabéticos comportaram-se de maneira contrária aos do animal controle: os BMM tipo M1 tiveram o conteúdo de LC3 diminuído, enquanto os M2 tiveram o conteúdo autofágico aumentado. O tratamento com insulina nos ratos diabéticos não alterou o nível do conteúdo LC3 dos BMM, mesmo após uma semana de cultura in vitro. Concluímos, assim, que o tratamento com dose única de insulina foi capaz de induzir a autofagia em macrófagos alveolares, mas insuficiente para resgatar os níveis basais da autofagia em macrófagos da medula óssea e da polpa vermelha do baço / Diabetes mellitus (DM) is characterized by hyperglycemia associated to a lack or ineffectiveness of insulin. DM is marked by changes in several cellular processes that need to be better understood. Autophagy pathway in macrophages from different tissues was studied with the purpose to verify whether treatment with insulin is capable of modulating this process. Bone marrow derived macrophages (BMM), bronchoalveolar lavage (BAL), and splenic tissue macrophages from Wistar rats, diabetic (alloxan, 42 mg/kg, iv, 10 days) and diabetic rats treated with insulin were studied. To characterize the model and evaluate the effect of insulin upon the autophagic process, the following analyzes were performed: (a) glucose levels, number of leukocytes in peripheral blood, BAL cell number; (b) concentrations of cytokines (interleukin (IL)-1beta, tumor necrosis factor (TNF)-alfa, IL-6, IL-4, IL-10, cytokineinduced neutrophil chemoattractant (CINC)-1 and CINC-2 in the supernatant of BAL fluid by ELISA; (c) characterization of BAL alveolar macrophage (AM) surface antigens (MHCII, pan macrophage marker KiM2R, CD11b) and autophagic markers (microtubule-associated protein light chain (LC)3, gene/protein associated to autophagy (ATG) by flow cytometry and confocal microscopy (d) study of macrophages diferenciated from bone marrow by flow cytometry and confocal microscopy; (e) the architecture of spleen and macrophages from red pulp by immunohistochemical techniques associated to confocal microscopy. Evaluating these results together, the autophagic pathway appears to be innovative for therapeutic target. In this study, it was observed that insulin exerted diverse effects on macrophages from different tissues: increased expression of LC3 in AM recovered from BAL and was unable to change the autophagic activity of macrophages from the red pulp of the spleen in diabetic rats. BMM from diabetic rats behaved in an antagonistic way compared to control animals: BMM M1 type decreased their autophagy content while M2 macrophages increased autophagic levels and insulin treatment did not alter the level of LC3 expression. In conclusion, treatment with a single dose of insulin was able to induce autophagy in alveolar macrophages, but insufficient for recovering baseline levels of autophagy in bone marrow derived macrophages and macrophages from the red pulp of the spleen

RAS é a oncoproteína mutada mais encontrada em tumores sólidos, o que mostra seu grande potencial transformador. Não obstante, células que carregam essa mutação apresentam estresse oncogênico gerado por excessiva sinalização mitogênica, o que direciona preferencialmente as células portadoras para a morte em detrimento da transformação maligna. Basicamente a transformação direcionadapela proteína RAS mutada age sinergicamente com deficiência em supressores de tumor para evitar o destino celular preferencial frente ao estresse oncogênico. Este é o caso da interação observada entre HRASG12V e E6E7 de HPV, sendo que a infecção pelo vírus aparentemente é condição necessária em cânceres cervicais e muito presente em cânceres de cabeça e pescoço. A sinergia entre HRASG12V e queratinócitos imortalizados por E6E7 desequilibra o balanço homeostático entre subsistemas pró-morte, devido ao estresse oncogênico, ou pró-sobrevivência, que garante viabilidade por meio de novos padrões de robustez celular. Em ambos os casos, o processo que gera uma célula transformada, ou as elimina pelo caminho, apresenta pistas de vulnerabilidades às quais os queratinócitos são expostos uma vez que carreguem tal combinação de fatores. Apresentamos nesse trabalho os principais atores que compõem o estresse oncogênico deletério desencadeado pela atividade de HRASG12V: estresse mitogênico, replicativo e oxidativo; todos eles são responsáveis por provocar dano no DNA, que por sua vez promove parada no ciclo celular até que as células não possam mais suportar tamanha injúria, o que acaba levando-as maciçamente a morte. Mostramos que a alta intensidade mitogênica gerada pela atividade de HRASG12V provoca um desequilíbrio metabólico que leva ao aumento de espécies oxidantes e ao estresse replicativo. Todavia, um tratamento exógeno com o antioxidante NAC restaurou parcialmente a proliferação celular assim como a sobrevivência, agindo como um amenizador do dano no DNA gerado pelas espécies oxidantes. Já uma suplementação com nucleosídeos exógenos restaurou fortemente a sobrevivência celular, sugerindo que o desequilíbrio metabólico pode estar agindo no pool de nucleotídeos, o que poderia ser uma das causas do estresse replicativo. Como mecanismo intrínseco de sobrevivência, a autofagia se intensifica em resposta ao desequilíbrio sistêmico desencadeado pela atividade de HRASG12V. Por meio de sublinhagens defectivas para autofagia, mostramos que o processo retarda o aparecimento de espécies oxidantes, além de evitar sua elevação a níveis ainda mais drásticos, o que consequentemente ameniza o dano no DNA observado. Além disso, hipotetizamos que o processo poderia também estar contribuindo fortemente para a reciclagem de substratos básicos tais como nucleotídeos, assim acarretando em menor estresse replicativo. Na literatura atual, debate-se a noção de que, dependendo do contexto celular, a autofagia poderia promover tanto morte celular como transformação maligna. Entretanto, nesta tese mostramos que, na interação entre queratinócitos, E6E7 e HRASG12V, a autofagia é um mecanismo pró-sobrevivência: se por um lado a demanda autofágica é recrutada além de sua capacidade de processamento, fazendo com que seu fluxo seja bloqueado, por outro a eliminação do sistema se torna demasiadamente deletério, direcionando as células expostas ao estresse oncogênico causado pela atividade de HRASG12V necessariamente à morte. / Mutated RAS is the oncoprotein most found in solid tumors, which shows its huge tumorogenic potential. Despite of that, mutated RAS triggers a strong oncogenic stress, which very often drives cells to death instead of malignant transformation. Basically, the success of the Ras malignant transformation driving activity depends on a synergy between that mutated protein and inhibition of tumor suppression genes. This is the case of the interaction between HRASG12V and E6E7 proteins of HPV: It seems that HPV infection is an initial necessary condition for cervical cancer development and is also very frequent in head and neck carcinomas. The synergy between HRASG12V and E6E7, in pre-malignant keratinocytes, imbalances the homeostasis between pro-death subsystems, due oncogenic stress, and pro-survival subsystems that ensure new patterns of cellular robustness. In both cases, the process responsible for generating a malignant transformed cell or, more frequently, eliminating those cells carrying the combined characteristics, exposes the keratinocytes vulnerabilities. We showed in this work that the main actors of deleterious oncogenic stress triggered by HRASG12V activity are: Mitogenic, replicative and oxidative stresses; all of them induce DNA damage, hence cell cycle arrests until the cell cannot resist such injury any further, which leads to massive cell death. The intense mitogenic activity triggered by HRASG12Vcauses metabolic imbalance, which is responsible for an increase of oxidative species and replicative stress levels; the exogenous treatment with antioxidant NAC partially restored cell growth and cell survival, acting as a softener of the DNA damage caused by oxidative species. On the other hand, nucleoside supplementation strongly restored cell survival, suggesting that the aforementioned metabolic imbalance might be acting in the pool of nucleotides, hence it might be a possible cause of replicative stress. As an intrinsic survival mechanism, the autophagy is intensified in response to systemic imbalance triggered by HRASG12V activity. Through the autophagy defective subline, we showed that that mechanism both delays the increase of oxidative species and avoids their elevation to catastrophic highlevels. Furthermore, autophagy could strongly contribute to the recycling of basic substrates such as nucleotides, which might be mitigating the replicative stress. Nowadays, there is a debate on the role of autophagy promoting either malignant transformation or cell death depending on metabolic context. In this work, we showed an instance of the interaction between E6E7 and HRASG12V triggering autophagy pro-survival mechanisms and hence increasing general cell viability

O reconhecimento de bactérias invasoras pelas células hospedeiras através do processo autofágico é um fator chave na determinação da infecção bacteriana. Escherichia coli enteroinvasora (EIEC) possui uma proteína, denominada IcsB, que em estudos em Shigella, é responsável pela inativação deste processo de degradação bacteriana. Uma vez que EIEC expressa menos IcsB do que S. flexneri, nos propusemos a investigar o processo autofágico na infecção por EIEC, utilizando as técnicas de mutação gênica por inserção, western-blot, microscopia de fluorescência e eletrônica de transmissão e microarray. Verificamos que a proteína IcsB é um fator de virulência importante na camuflagem de EIEC, pois quando pouco ou nada expresso, há um maior reconhecimento da bactéria pelas células hospedeiras, favorecendo sua menor disseminação. Isto corrobora não somente com a transcrição gênica, mas com a importância da sequência de nucleotídeos deste gene, uma vez que a cepa de E. coli SM124/13 complementada com o icsB de Shigella se mostrou mais eficiente na disseminação dentro da célula hospedeira. De forma interessante, IcsB apresentou um papel inédito na regulação da resposta inflamatória das células HeLa, onde a ausência de IcsB em EIEC promoveu uma intensa perturbação na homeostase da célula hospedeira, com aumento da secreção de IL-6, IL-8 e morte celular. Adicionalmente, ficou evidente que a célula eucariótica responde de maneira distinta frente a infecção por EIEC e Shigella flexneri. EIEC provavelmente ativou o processo autofágico em células humanas de forma não canônica. Nossa hipótese seria de que EIEC é reconhecida pelo processo autofágico, podendo ser este um importante fenômeno de reconhecimento bacteriano que colabore para a menor disseminação intracelular de EIEC, e assim tornar sua doença mais branda, quando comparada com a infecção por Shigella. / The invasive bacteria recognition by host cells through autophagy is a key factor for determining bacterial infection. Enteroinvasive Escherichia coli (EIEC) express a protein IcsB, which in Shigella, is known for inactivating the bacterial degradation process. Once EIEC showed less expression of icsB when compared to S. flexneri, we proposed to investigate the autophagy caused by EIEC infection, using techniques such as gene mutation by insertion, western blot, fluorescence microscopy, transmission electron microscopy and microarray. Our results showed that IcsB protein is an important virulence factor in EIEC because it causes a camouflage of the bacteria in the eukaryotic cell. When there is a low expression of the protein, the cell recognition of the invasive bacteria is high, decreasing the bacteria dissemination. This found confirms the importance of the gene transcription and the gene sequence, since the strain E. coli SM124/13, complemented with icsB from Shigella, showed higher dissemination efficiency inside of the host cell. Interestingly, IcsB showed a new role on regulating the inflammatory response in Hela cells. The absence of IcsB in EIEC generated an intense disturbance of the cell homeostasis, increased the secretion of IL-6 and IL-8, and caused cell death. Additionally, our results revealed that eukaryotic cell infected by EIEC or Shigella flexneri showed distinguish responses. In EIEC infection, the autophagy was activated in human cells, but not in a conventional mode. Our hypothesis is that EIEC is recognized by autophagy, being an important cell process for bacterial recognition. This process can cause a decrease in the intracellular spread of EIEC making the infection less severe when compared to the infection caused by Shigella.

Orientador: Sara Teresinha Olalla Saad / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-26T00:22:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Maso_Victor_D.pdf: 2835269 bytes, checksum: f3165794df6b39b4fa01215914687cc9 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Síndromes mielodisplásicas (SMD) abrangem um espectro de doenças hematológicas caracterizadas por hematopoese ineficaz e risco de evolução para leucemia mielóide aguda (LMA). As leucemias agudas apresentam altas taxas de mortalidade devido, principalmente, à sua capacidade de resistir a diversos tipos de quimioterápicos, sendo necessário buscar novos compostos capazes de interferirem no crescimento tumoral. Deste modo, o objetivo deste trabalho foi verificar os efeitos da quercetina in vitro e in vivo, na linhagem celular P39/Tsugane, a qual foi estabelecida a partir de células leucêmicas do sangue periférico de paciente que possuía síndrome mielodisplásica, como modelo. O desenho experimental compreendeu o tratamento in vitro e in vivo com quercetina das células leucêmicas, verificando-se vias de apoptose, ciclo celular e autofagia. O modelo xenográfico de tumor de células leucêmicas subcutâneo foi utilzado para os ensaios in vivo. A quercetina induziu pronunciada apoptose das células leucêmicas P39, seguida por supressão da expressão de BcL-2, BclxL, Mcl-1, aumento da expressão de Bax e modulação do potencial de membrana mitocondrial com liberação de citocromo c e ativação de caspases. O tratamento com quercetina resultou em retenção das células na fase G1 do ciclo celular, com pronunciada diminuição das proteínas CDK2, CDK6, ciclina D, ciclina E e ciclina A, diminuição na fosforilação de Rb e aumento na expressão de p21 e p27. Quercetina induziu a formação do autofagossomo nas células P39, com ativação de PI3K classe III, Beclina 1, Atg5-Atg12, Atg7, conversão de LC3-I em LC3-II e desfosforilação de Akt e mTOR. A inibição da autofagia induzida por cloroquina juntamente com quercetina viii desencadeou aumento na apoptose, mas não alterou a modulação da fase G1 do ciclo celular induzida por quercetina. As células P39 tratadas com a combinação de quercetina e inibidores seletivos de ERK1/2 e/ou JNK (PD184352 e SP600125, respectivamente) apresentaram diminuição na retenção em fase G1 do ciclo, Este tratamento combinado, entretanto, não alterou a percentagem de células apoptóticas. Além disso, administração in vivo de quercetina reduziu significativamente o volume tumoral em camundongos inoculados com células P39 e confimar os resultados in vitro relacionados com apoptose, autofagia e ciclo celular. Assim, quercetina demonstra uma potente atividade antileucêmica através de sinalizações que causam parada do ciclo celular, apoptose e indução da autofagia. Esta última, por sua vez, parece proteger as células do alto grau de apoptose / Abstract: This study proposes to investigate quercetin antitumor efficacy in vitro and in vivo, using P39 cell line as a model. The experimental design comprised leukemic cells or xenografts of P39 cells, treated in vitro or in vivo, respectively, with quercetin; apoptosis, cell cycle and autophagy activation were then evaluated. Quercetin caused pronounced apoptosis in P39 leukemia cells, followed by Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1 downregulation, Bax upregulation and mitochondrial translocation, triggering cytochrome c release and caspases activation. Quercetin also induced the expression of FasL protein. Furthermore, our results demonstrated an antioxidant activity of quercetin. Quercetin treatment resulted in an increased cell-arrest in G1 phase of the cell cycle, with pronounced decrease in CDK2, CDK6, cyclin D, cyclin E and cyclin A proteins, decreased Rb phosphorylation and increased p21 and p27 expression. Quercetin induced autophagosome formation in P39 cell line, with upregulation of PI3K class III proteins, Beclin-1, Atg5-Atg12, Atg7, conversion of LC3-I to LC3-II, and dephosphorylation of Akt and mTOR. Autophagy inhibition induced by quercetin with chloroquine triggered apoptosis but did not alter quercetin modulation in the G1 phase. P39 cell treatment with a combination of quercetin and selective inhibitors of ERK1/2 and/or JNK (PD184352 or SP600125 respectively), significantly decreased cells in G1 phase, this treatment however did not change the apoptotic cell number. Furthermore, in vivo administration of quercetin significantly reduced tumor volume in P39 xenografts and confirmed in vitro results regarding apoptosis, autophagy and cell cycle arrest / Doutorado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Doutor em Fisiopatologia Medica

La supervivencia celular frente a los cambios ambientales requiere el mantenimiento de un equilibrio dinámico entre la síntesis y la degradación de proteínas. La degradación de proteínas, además de regular diferentes procesos celulares, tiene como función principal la eliminación de productos que no son útiles para la célula en determinadas situaciones o cuya acumulación puede ser tóxica. Los productos de esta degradación, es decir los aminoácidos, son reutilizados para la síntesis de nuevas moléculas o son metabolizados para la obtención de energía. La alteración de esta proteólisis intracelular puede llevar a la acumulación en el citoplasma de orgánulos defectuosos o de moléculas que se pueden agrupar en agregados insolubles y que pueden así desencadenar diferentes patologías. Aunque se ha avanzado bastante durante los últimos años en los conocimientos sobre la degradación intracelular de proteínas y de sus principales mecanismos, existen bastantes detalles moleculares todavía desconocidos. Por este motivo es necesario aportar nueva información sobre estos procesos que además podría ser relevante para identificar nuevas dianas terapéuticas y desarrollar tratamientos más eficaces para las enfermedades derivadas de alteraciones en los mismos. La degradación de proteínas ocurre por diferentes mecanismos que pueden clasificarse generalmente en dependientes o no de unos orgánulos citoplásmicos, los lisosomas. La macroautofagia (a la que se denomina generalmente con el término más simple de autofagia) y el sistema ubicuitina-proteasomas son, respectivamente, los más importantes de esos dos grupos. Básicamente, el sistema ubicuitina-proteasomas consiste en la poliubicuitinación de proteínas que son después degradadas por los proteasomas. La autofagia en cambio se inicia con el secuestro de porciones del citoplasma en estructuras de doble membrana que se cierran formando los autofagosomas. Posteriormente, los autofagosomas se fusionan con endosomas y con lisosomas dando lugar a los autolisosomas, en los que por la acción de las proteasas o catepsinas lisosomales se degrada el material encerrado. La autofagia está regulada por una amplia variedad de vías de señalización que responden a multitud de factores ambientales. Entre estos últimos, la situación de ayuno de nutrientes es la inductora más potente de la autofagia. Durante la privación de nutrientes como los aminoácidos, la célula sufre un estrés energético que debe tratar de reducir produciendo ATP a partir de nuevas fuentes. Para ello activa la autofagia para degradar los componentes de la célula, como las proteínas, hasta producir sus unidades básicas que después son metabolizadas. Por el contrario, se ha demostrado que cuando se proporcionan aminoácidos a la célula la autofagia es inhibida. Aunque el efecto sobre la autofagia de los aminoácidos ha sido estudiado ampliamente en muchos laboratorios, no estaba tan claro ese efecto en el caso de otro nutriente, la glucosa, ya que cuando planteamos ese estudio los datos eran contradictorios. En este trabajo hemos podido establecer claramente que la glucosa tiene un papel inductor sobre la autofagia empleando técnicas muy variadas que incluyen: la cuantificación por ¿Western-blot¿ de los niveles del marcador de autofagia LC3-II en presencia o en ausencia de inhibidores lisosomales, la cuantificación de la proteína degradada, total y por la vía autofágica, mediante experimentos de pulso y caza, la cuantificación morfométrica de estructuras autofágicas (equivalentes a autofagosomas y autolisosomas) por microscopia electrónica y la cuantificación de la masa lisosomal por fluorescencia. Además, hemos comprobado que la glucosa también induce la ubicuitinación de proteínas y la degradación de estas por los proteasomas. Con estos y otros datos obtenidos durante el desarrollo de esta tesis doctoral, hemos podido concluir que la glucosa induce la autofagia en todos los tipos celulares estudiados y en todas las condiciones ensayadas. Este efecto disminuye o se enmascara cuando están presentes a la vez otros factores que son inhibidores de la autofagia, como los aminoácidos o el suero bovino fetal, lo que podría explicar algunos de los datos contradictorios en la literatura. La glucosa aporta la energía necesaria para el correcto funcionamiento de la autofagia a partir de unos niveles mínimos de ATP. Un descenso en la disponibilidad energética a través de la inhibición de la glucólisis reprime la autofagia inducida por la glucosa. Sin embargo, la estimulación de la autofagia por glucosa no parece depender únicamente de la disponibilidad de ATP, sino que hemos identificado una vía de señalización en la que no interviene AMPK a pesar de responder al descenso de los niveles de ATP y al aumento de los niveles de calcio durante la incubación en un medio carente de glucosa. Esta vía tampoco implica a mTORC1 y en ella sí interviene en cambio la MAPK p38¿, como hemos comprobado con diferentes inhibidores de esta quinasa, con el uso de siRNAs o empleando MEFs p38-/-. Consideramos que estos resultados contribuyen a clarificar más la regulación de la autofagia por nutrientes y, más concretamente, por uno tan relevante como es la glucosa. / Moruno Manchón, JF. (2013). Regulación de la degradación intracelular de proteínas por glucosa [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/34775 / TESIS

El alcohol es un compuesto neurotóxico y su abuso puede causar daño cerebral y neurodegeneración. Sin embargo, los procesos neuropatológicos que producen estos efectos no se conocen con exactitud. Nuestro grupo demostró por primera vez que el etanol induce gliosis, neuroinflamación, daño cerebral y neurodegeneración mediante la activación del sistema inmune innato en cerebro a través de los receptores TLR4 de las células gliales. Además, evidencias recientes apuntan a que el alcohol altera los procesos de degradación de proteínas en patologías como la hepatopatía alcohólica, pero se desconoce si estos procesos proteolíticos también participan en el daño cerebral inducido por el consumo de alcohol. Mediante esta tesis, pretendemos evaluar la relación de los dos principales complejos proteolíticos, el sistema ubicuitina-proteasoma y la vía de la autofagia, con el daño producido por el alcohol en el cerebro, así como la implicación de los receptores TLR4 en este proceso. Para ello, usaremos ratones WT y TLR4-/- tratados crónicamente con etanol en agua durante 5 meses y los compararemos con los respectivos controles mediante técnicas como el western blot, PCR cuantitativa, inmunofluorescencia, inmunohistoquímica o citometría. Del mismo modo, trabajaremos también con cultivos primarios de células gliales para evaluar el efecto del alcohol en dosis agudas in vitro. Nuestra hipótesis de partida es que al activar la señalización por TLR4, el etanol causa inflamación en el cerebro, estrés oxidativo y acumulación de proteínas por disfunción de los sistemas proteolíticos. Esta acumulación de agregados proteicos podría a su vez estimular la activación de los receptores TLR4, amplificando los efectos del etanol en la producción de daño cerebral y neurodegeneración. / Pla Rodríguez, A. (2014). IMPORTANCIA DE LOS MECANISMOS DE DEGRADACIÓN DE PROTEÍNAS EN LA NEURODEGENERACIÓN CAUSADA POR EL ABUSO DE ALCOHOL: PAPEL DE LOS RECEPTORES TLR4 [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/36532 / TESIS

Este estudo apresenta: (1) uma revisão atualizada sobre o desenvolvimento oocitário em teleósteos, as vias de involução no processo de regressão ovariana e a espécie modelo Astyanax altiparanae; (2) a descrição da morfologia ovariana e das células garminativas de A. altiparanae e a caracterização do seu ciclo reprodutivo; (3) a caracterização dos processos de involução de atresia folicular e complexos pós-ovulatórios de A. altiparanae e a localização de proteínas envolvidas nas vias de apoptose e autofagia ao longo desses processos. Foram apresentados neste estudo novos detalhes da oogênese para espécies de Astyanax, sendo que esses novos dados parecem ter aplicação na piscicultura. Além disso, A. altiparanae apresenta um período de desova longo, com pico reprodutivo de outubro a fevereiro, e desenvolvimento oocitário assíncrono. Por fim, parece haver uma interrelação entre as vias de autofagia e apoptose nos processos de involução ovarianos e as vias regulatórias desses processos parecem ser conservadas entre espécies de teleósteos com fertilização externa. / This study presents: (1) an updated review on oocyte development in teleosts, the involution pathways during the process of ovarian regression, and the model species Astyanax altiparanae; (2) the description of the ovarian and germ cell morphology of A. altiparanae and the characterization of its reproductive cycle; (3) the characterization of the involution processes of follicular atresia and post-ovulatory complexes of A. altiparanae and the localization of proteins involved in the apoptosis and autophagy pathways throughout these processes. New details of the oogenesis for Astyanax species were presented in this study, and these new data seem to be applied in fish culture. In addition, A. altiparanae presents a long spawning period, with reproductive peak from October to February, and asynchronous oocyte development. Finally, there seems to be a crosstalk between autophagy and apoptosis pathways in ovarian involution processes and the regulatory pathways of these processes seem to be conserved among species of teleosts with external fertilization.

A terapia fotodinâmica (TFD) é uma modalidade de tratamento que utiliza um fotossensibilizador, luz e oxigênio para gerar espécies reativas de oxigênio capazes de induzir a morte de células indesejadas, como tumores e micro-organismos infecciosos. Nosso foco está na morte induzida por 1,9-dimetil azul de metileno fotoativado (TFD-DMMB). Este fotossensibilizador foi previamente estudado por nosso grupo. Foi mostrado que o DMMB se acumula em lisossomos e mitocôndrias, e danifica essas organelas após fotoativado. O DMMB em concentração nanomolar promove uma morte celular eficiente, que parece ser resultante do bloqueio da conclusão do processo autofágico, enquanto outros fotossensibilizadores geralmente são empregados na faixa de micromolar. Nosso objetivo neste trabalho foi investigar o mecanismo molecular da TFD-DMMB através do estudo do papel da proteína p53 nas respostas celulares à TFD-DMMB. Sendo uma proteína supressora tumoral, p53 participa de vários processos celulares em resposta a diferentes estresses. Para atingir nosso objetivo, utilizamos linhagens celulares HEK293T que expressam diferentes quantidades de p53, sendo uma linhagem knockdown para p53 (HEK293T-p53KD) e outra com expressão normal de p53 (HEK293T-SC, scramble). Após o tratamento com DMMB fotoativado, avaliamos a fototoxicidade, apoptose, dano no DNA, ciclo celular e autofagia. Nossos resultados mostram que, apesar de não observarmos a estabilização de p53, a TFDDMMB parece induzir a localização citoplasmática de p53, sugerindo que p53 citoplasmática participa da resposta celular à TFD-DMMB. A linhagem HEK293T-p53KD mostrou-se menos sensível à TFD-DMMB. Essa diferença foi explicada pelo acúmulo de células em sub- G1, indicativo de morte por apoptose, apenas na linhagem HEK293T-SC, que foi mais sensível ao tratamento. É possível que a atividade citoplasmática de p53 esteja relacionada com a indução de apoptose no nosso modelo. Em contraste aos efeitos de p53 na morte celular, encontramos respostas à TFD-DMMB independentes de p53 na parada do ciclo celular e autofagia. Observamos acúmulo de células na fase S do ciclo celular associado à fosforilação de CHK1 e H2AX, indicativo da ocorrência de estresse replicativo. A relação com a autofagia foi confirmada pelo acúmulo de vesículas ácidas e aumento dos níveis proteicos de LC3-II. Esses resultados indicam a indução ou o bloqueio da autofagia, entretanto não observamos um aumento simultâneo nos níveis de BECLIN-1, proteína importante para a iniciação da autofagia. Além disso, DMMB fotoativado resultou em dano seletivo no DNA mitocondrial (mtDNA), que não foi reparado em 24 horas. Desse modo, e baseado nos resultados preliminares do nosso grupo, propomos que a morte celular induzida por DMMB fotoativado é decorrente principalmente do bloqueio da resolução da via autofágica, comprometendo a eliminação de mitocôndrias danificadas e levando a alterações na dinâmica do ciclo celular. Nossos resultados sugerem que há respostas celulares à TFDDMMB dependentes e independentes de p53. Resultados similares foram obtidos para a linhagem HEK293, que é a linhagem parental de HEK293T. Do nosso conhecimento, a relocalização de p53 para o citoplasma, a habilidade em induzir dano seletivo no mtDNA e o bloqueio da progressão do ciclo celular na fase S são resultados inéditos decorrentes da TFDDMMB. O dano seletivo ao mtDNA torna o DMMB um modelo útil para estudos de mecanismos de resposta a dano no DNA específicos para a mitocôndria. / Photodynamic Therapy (PDT) is a treatment modality that uses a photosensitizer, light and oxygen to generate reactive oxygen species capable of inducing death of unwanted cells, such as cancer cells and infectious microorganisms. In this work, we are interested in studying death induced by 1,9-dimethylmethylene blue as a photosensitizer by PDT (DMMB-PDT). This photosensitizer has been previously studied by our group. It has been shown that DMMB accumulates within lysosomes and mitochondria, and damages these organelles after photoactivation. In this case, cell death is believed to be a result from the impairment of autophagy. DMMB at nanomolar concentration promotes efficient cell death, while other photosensitizers are usually employed in the micromolar range. The aim of this work is to investigate the molecular mechanism of DMMB-PDT action through the study of p53 protein role over the cell response to DMMB-PDT. Being a tumor suppressor protein, p53 participates in several cellular processes in response to different stresses. To achieve our goal, we used HEK293T cell lines that express different amounts of p53: a p53 knockout cell line (HEK293T-p53KD) and a normal cell line (HEK293T-SC, scramble). After treatment with photoactivated DMMB, we evaluated phototoxicity, apoptosis, DNA damage, cell cycle, and autophagy. Our results showed that, although we did not observe p53 stabilization, DMMBPDT seems to induce the cytoplasmic localization of p53, suggesting that cytoplasmic p53 participates in the cell response to DMMB-PDT. The HEK293T-p53KD cell line was less sensitive to DMMB-PDT. This difference could be explained by the level of sub-G1 accumulation suggestive of apoptosis that was only observed for HEK293T-SC cell line, which was more sensitive to the treatment. It is possible that the cytoplasmic activity of p53 was related to apoptosis induction according our model. In contrast to p53 effects on cell death, we found that there are p53-independent responses to DMMB-PDT on cell cycle arrest and autophagy. We observed a significant increase in the fraction of cells in the S phase of the cell cycle associated with phosphorylation of the CHK1 and H2AX proteins, indicating induction of replicative stress. The relationship of DMMB-PDT and autophagy was confirmed by the accumulation of acidic vesicles and the increased LC3 conversion (LC3-I to LC3-II). These results indicated that DMMB-PDT induces and/or impairs autophagy. However, we did not observe a simultaneous increase in BECLIN-1 levels, which is an important protein to autophagy initiation. Photoactivated DMMB resulted in selective damage in mitochondrial DNA (mtDNA) that was not repaired in 24 hours. According to these results, we propose that cell death induced by photoactivated DMMB is mainly related to blockade of a late stage of the autophagy pathway. It could compromise the elimination of damaged mitochondria and might lead to cell cycle dynamics alterations. Our results suggested that there are p53-dependent and p53-independent cell responses to DMMB-PDT. Similar results were obtained from HEK293 cell line, which is the parental cell line of HEK293T. To the best of our knowledge, the p53 relocalization to the cytoplasm, the ability to induce selective mtDNA damage, and the S arrest represent new insights in the DMMB-PDT field. The selective mtDNA damage makes DMMB a useful model for studies on mechanisms of DNA damage responses in mitochondria.