La sclérose en plaques est une maladie neuroinflammatoire idiopathique caractérisée par la formation de lésions focales de démyélinisation, qui apparaissent suite à l’infiltration périvasculaire de cellules immunitaires et à l’augmentation de la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique. L’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) est le modèle animal de cette maladie. Cependant, ce modèle présente des différences importantes avec la sclérose en plaques. L’objectif de ce projet de maîtrise était d’approfondir la caractérisation d’un nouveau modèle transgénique d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale spontanée, le modèle TCR1640, afin de valider celui-ci pour l’étude des phénomènes physiopathologiques qui surviennent à différents stades de la sclérose en plaques, ainsi que pour le développement de nouveaux traitements de la maladie. La souris TCR1640 porte un récepteur des cellules T (TCR) transgénique autoréactif, qui reconnaît un peptide de la myéline et déclenche une réaction auto-immune contre la myéline endogène au sein du système nerveux central (SNC). Des observations faites in situ et in vitro ont permis d’identifier des changements qui surviennent de façon très précoce dans l’unité neurovasculaire chez les animaux TCR1640 présymptomatiques, et qui sont liés à la présence d’un profil immunitaire périphérique proinflammatoire. Lors des phases actives de l’EAE spontanée, les animaux TCR1640 au stade chronique présentent une inflammation accrue du système nerveux central associée à une infiltration leucocytaire massive, par rapport aux animaux au stade aigu de la maladie. Une étude in vivo a également permis de moduler la maladie développée par des animaux ayant subi une immunisation passive avec des cellules T auxiliaires en provenance de souris TCR1640. Enfin, l’implication de nouvelles molécules d’adhésion cellulaire dans le développement et le maintien de l’EAE spontanée a été suggérée par des observations in vitro. L’ensemble de ces résultats suggère que le modèle TCR1640 présente plusieurs avantages pour l’étude de la physiopathologie de maladies neuroinflammatoires telles que la sclérose en plaques, et servira d’outil afin de valider de nouvelles stratégies thérapeutiques. / Multiple sclerosis is an idiopathic inflammatory disease of the central nervous system. It is characterized by the formation of focal perivascular lesions and demyelination of the surrounding area, which appear concomitantly to a massive immune cell infiltration and disruption of the blood brain barrier. Experimental autoimmune encephalomyelitis is the animal model most extensively used for the study of multiple sclerosis. Unfortunately, this model does not mimic many aspects of the human disease. The goal of this project is to further the characterization of a new transgenic model of spontaneous experimental autoimmune encephalomyelitis, the TCR1640 model, and to validate it as a relevant tool for the study of multiple sclerosis physiopathology and treatment. The TCR1640 mouse possesses a transgenic T cell receptor which recognizes a myelin peptide and triggers an autoimmune response against endogenous myelin in the central nervous system. In situ and in vitro observations have led to the identification of early changes which appear at the neurovascular unit in presymptomatic TCR1640 animals. This early disruption of blood brain barrier homeostasis is linked to the establishment of a proinflammatory immune profile in the periphery. Animals at the chronic stage show sustained inflammation of the central nervous system parenchyma and massive leukocyte infiltration, compared to animals in acute phase of disease. An in vivo experiment has allowed modulating the disease by treatment with a multiple sclerosis-approved therapy, in wild type mice which had received reactivated CD4+ T cells from TCR1640 animals. Finally, the implication of new cell adhesion molecules in the development and maintenance of spontaneous experimental autoimmune encephalomyelitis has been suggested by in vitro study of melanoma cell adhesion molecule (CD146) and activated leucocyte cell adhesion molecule (CD166). The results obtained in this study suggest that the TCR1640 model is a valuable asset in the study of neuroimmune diseases such as multiple sclerosis. It could also be used to validate new therapeutic strategies for the treatment of this disease.

La sclérose en plaques (SEP) est caractérisée par des infiltrations périvasculaires de cellules immunitaires et par de la démyélinisation au sein du système nerveux central (SNC). Ces deux paramètres de la maladie sont associés à la fragilisation de la barrière hémato-encéphalique (BHE). En ce sens, le recrutement des cellules présentatrices d’antigène (CPA) myéloïdes, telles que les monocytes, les macrophages et les cellules dendritiques, dans le SNC à travers la BHE, est une étape cruciale dans l’initiation et la persistance de l’inflammation cérébrale. Nerve injury-induced protein (Ninjurin)-1 est une nouvelle molécule d’adhérence qui médie une interaction de type homophilique et dont l’expression sur l’endothélium vasculaire de la BHE humaine fut identifiée grâce à une analyse protéomique des protéines associées à la BHE. Les résultats présentés dans ce mémoire montrent que l’expression de Ninjurin-1 augmente dans un contexte inflammatoire dans les cultures primaires de cellules endothéliales de la BHE (CE-BHE) et sur les CPA myéloïdes humaines ex vivo et générées in vitro. De plus, les CPA infiltrantes retrouvées dans les lésions cérébrales de patients atteints de SEP et dans le SNC des souris atteintes d’encéphalomyélite autoimmune expérimentale (EAE), le modèle murin de la SEP, expriment de hauts niveaux de Ninjurin-1. À l’aide du modèle in vitro de la BHE, la neutralisation de Ninjurin-1 restreint spécifiquement la migration des monocytes à travers les CE-BHE sans affecter le recrutement des lymphocytes, ni la perméabilité des CE-BHE. Enfin, les souris atteintes d’EAE et traitées avec un peptide bloquant dirigé contre Ninjurin-1 présentent une maladie moins sévère ainsi qu’une diminution des CPA infiltrant le SNC et ce comparé au groupe contrôle. Ces résultats suggèrent que Ninjurin-1 est une molécule d’adhérence de la BHE impliquée dans le recrutement de CPA myéloïdes au sein du SNC et qu’elle peut être considérée comme une cible thérapeutique potentielle en SEP. / Multiple Sclerosis (MS) is characterized by perivascular infiltrations of immune cells and by demyelination in the central nervous system (CNS). These two hallmarks of the disease are associated with the disruption of the blood-brain barrier (BBB). The recruitment of monocytes, macrophages and dendritic cells, the so-called myeloid antigen-presenting cells (APCs), in the CNS through the BBB is thought to play a crucial role in the initiation and the persistence of the disease. Therefore the identification of the molecular mechanisms involved in the migration of myeloid APCs into the CNS is considered a valid therapeutic option in MS. Nerve injury-induced protein (Ninjurin)-1, a novel adhesion molecule that mediates homophilic binding, was found to be expressed in the vascular endothelium of the BBB following a proteomic screen of human BBB-associated proteins. Ninjurin-1’s expression increases during an inflammatory context in primary cultures of endothelial cells of the BBB (BBB-ECs) and on ex vivo and in vitro generated myeloid APCs. In addition, infiltrating APCs in human MS lesions and in the CNS of the murine model of MS, the mice affected with experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), express high levels of Ninjurin-1. Using an experimental model of the BBB, the neutralization of Ninjurin-1 specifically restricts the migration of monocytes across the BBB-ECs without affecting the recruitment of lymphocytes or the permeability of the BBB-ECs. Finally, EAE mice treated with a Ninjurin-1 blocking peptide have reduced disease severity and a reduced infiltration of myeloid APCs in the CNS, as compared to the control group. Our results show that Ninjurin-1 is an adhesion molecule of the BBB involved in the recruitment of myeloid APCs to the CNS and is also a potential therapeutic target to dampen CNS inflammatory processes, as occurs in MS.

La sclérose en plaques est une maladie neuroinflammatoire idiopathique caractérisée par la formation de lésions focales de démyélinisation, qui apparaissent suite à l’infiltration périvasculaire de cellules immunitaires et à l’augmentation de la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique. L’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) est le modèle animal de cette maladie. Cependant, ce modèle présente des différences importantes avec la sclérose en plaques. L’objectif de ce projet de maîtrise était d’approfondir la caractérisation d’un nouveau modèle transgénique d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale spontanée, le modèle TCR1640, afin de valider celui-ci pour l’étude des phénomènes physiopathologiques qui surviennent à différents stades de la sclérose en plaques, ainsi que pour le développement de nouveaux traitements de la maladie. La souris TCR1640 porte un récepteur des cellules T (TCR) transgénique autoréactif, qui reconnaît un peptide de la myéline et déclenche une réaction auto-immune contre la myéline endogène au sein du système nerveux central (SNC). Des observations faites in situ et in vitro ont permis d’identifier des changements qui surviennent de façon très précoce dans l’unité neurovasculaire chez les animaux TCR1640 présymptomatiques, et qui sont liés à la présence d’un profil immunitaire périphérique proinflammatoire. Lors des phases actives de l’EAE spontanée, les animaux TCR1640 au stade chronique présentent une inflammation accrue du système nerveux central associée à une infiltration leucocytaire massive, par rapport aux animaux au stade aigu de la maladie. Une étude in vivo a également permis de moduler la maladie développée par des animaux ayant subi une immunisation passive avec des cellules T auxiliaires en provenance de souris TCR1640. Enfin, l’implication de nouvelles molécules d’adhésion cellulaire dans le développement et le maintien de l’EAE spontanée a été suggérée par des observations in vitro. L’ensemble de ces résultats suggère que le modèle TCR1640 présente plusieurs avantages pour l’étude de la physiopathologie de maladies neuroinflammatoires telles que la sclérose en plaques, et servira d’outil afin de valider de nouvelles stratégies thérapeutiques. / Multiple sclerosis is an idiopathic inflammatory disease of the central nervous system. It is characterized by the formation of focal perivascular lesions and demyelination of the surrounding area, which appear concomitantly to a massive immune cell infiltration and disruption of the blood brain barrier. Experimental autoimmune encephalomyelitis is the animal model most extensively used for the study of multiple sclerosis. Unfortunately, this model does not mimic many aspects of the human disease. The goal of this project is to further the characterization of a new transgenic model of spontaneous experimental autoimmune encephalomyelitis, the TCR1640 model, and to validate it as a relevant tool for the study of multiple sclerosis physiopathology and treatment. The TCR1640 mouse possesses a transgenic T cell receptor which recognizes a myelin peptide and triggers an autoimmune response against endogenous myelin in the central nervous system. In situ and in vitro observations have led to the identification of early changes which appear at the neurovascular unit in presymptomatic TCR1640 animals. This early disruption of blood brain barrier homeostasis is linked to the establishment of a proinflammatory immune profile in the periphery. Animals at the chronic stage show sustained inflammation of the central nervous system parenchyma and massive leukocyte infiltration, compared to animals in acute phase of disease. An in vivo experiment has allowed modulating the disease by treatment with a multiple sclerosis-approved therapy, in wild type mice which had received reactivated CD4+ T cells from TCR1640 animals. Finally, the implication of new cell adhesion molecules in the development and maintenance of spontaneous experimental autoimmune encephalomyelitis has been suggested by in vitro study of melanoma cell adhesion molecule (CD146) and activated leucocyte cell adhesion molecule (CD166). The results obtained in this study suggest that the TCR1640 model is a valuable asset in the study of neuroimmune diseases such as multiple sclerosis. It could also be used to validate new therapeutic strategies for the treatment of this disease.

Chez les patients atteints de la sclérose en plaques (SEP), les lymphocytes T autoréactifs utilisent des molécules d'adhérence (CAM) pour traverser la barrière hémo-encéphalique (BHE), pénétrer dans le système nerveux central (SNC) et médier la détérioration de la myéline. Les lymphocytes T régulateurs (Treg) constituent l’un des éléments clés de la tolérance immunitaire, protégeant contre les réactions auto-immunes. Cependant, l'entrée et la fonction des Treg dans le SNC restent largement inconnues. Notre laboratoire a démontré la contribution de plusieurs CAM, dont la molécule melanoma cell adhesion molecule (MCAM), dans la migration des lymphocytes pathogéniques à travers la BHE. L'objectif de cette étude est de déterminer si les Treg migrent dans le SNC en utilisant MCAM et s’ils exercent des fonctions anti-inflammatoires qui pourraient atténuer l'inflammation du SNC. L'expression de MCAM, des marqueurs fonctionnels de Treg (CTLA-4, CCR6, CCR5), ainsi que leur sécrétion de cytokines (IL-10, GrzmB, TGF-ß, IFN-γ, TNF α, GM-CSF, IL-17a), ont été étudiées sur des Treg du sang périphérique, du liquide céphalo-rachidien (LCR) et de la culture in vitro, provenant de patients atteints de SEP et d’individus sains (HC), par cytométrie de flux, en corroboration avec qPCR et ELISA. De plus, la présence de MCAM+ Treg dans le SNC a été évaluée par immunohistofluorescence (CD4, CD25, Foxp3, MCAM, noyaux) sur des souris atteintes d'encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE). Nos données ont montré une augmentation de l'expression de MCAM sur les Treg de patients atteints de la forme cyclique de SEP (RRMS) par rapport aux HC. Nous avons observé une tendance vers une fréquence plus élevée de MCAM+ Treg dans le LCR par rapport au sang périphérique des patients atteints de SEP, ce qui suggère que MCAM pourrait jouer un rôle important dans la migration des Treg. Ces cellules MCAM+ Treg semblent avoir un phénotype plus fonctionnel et anti-inflammatoire que leurs contreparties MCAM-. De plus, nous avons trouvé des niveaux plus élevés de MCAM+ Treg dans les périodes de rémission de l'EAE, ce qui souligne leur implication durant cette phase de la maladie. Dans l'ensemble, nos données montrent que MCAM est une CAM essentielle pour la migration des Treg vers le SNC. / In multiple sclerosis (MS), autoreactive T cells upregulate cellular adhesion molecules (CAMs) to cross the blood brain barrier (BBB), enter the central nervous system (CNS) and mediate damage to myelin. Regulatory T cells (Treg) are one of the key components of immune tolerance, protecting against autoimmune reactions. However, Treg's entry and function in the CNS remains largely unknown. Our lab has demonstrated the contribution of several CAMs, including melanoma cell adhesion molecule (MCAM), in the migration of pathogenic lymphocytes across the BBB. The goal of this study is to determine whether Treg migrate into the inflamed CNS using MCAM and exert anti-inflammatory functions, possibly dampening CNS inflammation. The expression of MCAM and Treg functional markers and chemokine receptors (CTLA-4, CCR6, CCR5,), as well as cytokine secretion (IL-10, GrzmB, TGF-ß, IFN-γ, TNF α, GM-CSF, IL-17a), were studied on MS patients and healthy individuals (HC) Treg from the peripheral blood, cerebrospinal fluid (CSF), and in vitro culture, by flow cytometry, in corroboration with qPCR and ELISA. Moreover, the presence of MCAM+ Treg in the CNS was assessed by immunohistofluorescence (CD4, CD25, Foxp3, MCAM, nuclei) on experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) affected mice. Our data showed an increase in the expression of MCAM on Treg during relapse-remitting MS patients (RRMS) compared to HC. We observed a trend for a higher frequency of MCAM+ Treg cells in the CSF versus the peripheral blood of MS patients, suggesting that MCAM might play an important role in the migration of Treg. These MCAM+ Treg seem to have a more functional and anti-inflammatory phenotype than their MCAM- counterparts. Moreover, we found higher levels of MCAM+ Treg in periods of EAE remission, underlining their involvement during this disease phase. Overall, our data depicts MCAM as an essential CAM for Treg homing to the CNS.

La sclérose en plaques (SEP) est une maladie auto-immune du système nerveux central (SNC) caractérisée par de l’infiltration leucocytaire et de la démyélinisation axonale. Les cellules présentatrices d’antigènes (APC) jouent un rôle primordial dans ce processus en activant dans la périphérie les lymphocytes T réactifs contre la myéline. Les lymphocytes activés peuvent traverser la barrière hémo-encéphalique (BHE) et infiltrer le SNC. Les lymphocytes sont ensuite réactivés dans l’espace périvasculaire par les APC, suite à quoi ils contribuent à la démyélinisation et aux dommages axonaux. Nétrine-1 (N1) est une protéine de guidance axonale possédant d’importantes propriétés anti-inflammatoires. L’importance de N1 dans le maintien de la BHE et l’inhibition de l’infiltration leucocytaire dans le SNC a été bien démontrée, mais son implication dans la présentation antigénique et la régulation de l’activation lymphocytaire n’a jamais été étudiée. Le présent ouvrage propose l’hypothèse que N1 est produite par les APC afin de réguler la neuro-inflammation. Il cherche à caractériser l’expression de N1 par les APC, déterminer l’influence de N1 sur l’activation lymphocytaire et explorer le rôle de la production de N1 par les APC dans la neuro-inflammation. Les expériences menées à terme dans le cadre de ce projet démontrent que N1 est exprimée par les cellules dendritiques matures et les macrophages de type M1. De plus, N1 a pour effet de stimuler la prolifération des lymphocytes TH1, TH17 et CD8+. N1 inhibe également la production de cytokines par les lymphocytes TH17 et diminue l’expression de perforine par les lymphocytes T CD8+. N1 n’a toutefois pas d’influence sur l’expression des molécules d’adhérence par les lymphocytes T. Enfin, les cellules dendritiques, macrophages et cellules microgliales n’expriment pas N1 dans le SNC des souris dans le cadre de l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale, un modèle animal de SEP. En somme, les résultats ici présentés suggèrent que N1 est produite par les APC afin d’influencer le fonctionnement des lymphocytes T. / Multiple Sclerosis (MS) is an autoimmune disorder of the central nervous system (CNS) characterized by leukocytic infiltration and axonal demyelination. Antigen presenting cells (APCs) play a crucial role in this process by activating myelin-reactive lymphocytes in the periphery. Activated lymphocytes subsequently cross the blood-brain barrier (BBB) and infiltrate the CNS. These lymphocytes are reactivated in the perivascular space by APCs, following which they contribute to demyelination and axonal damage. Netrin-1 (N1) is an axonal guidance protein with considerable anti-inflammatory properties. The relevance of N1 in maintaining BBB function has been thoroughly established, but its involvement in antigen presentation and T cell activation has yet to be studied. This project investigates the hypothesis that N1 is produced by APCs to regulate neuroinflammation and aims to characterize N1 production by APCs, delineate the impact of N1 on T cell activation and clarify the role of APC-derived N1 in neuroinflammation. The results presented in this thesis demonstrate that N1 is produced by mature dendritic cells and M1 macrophages. Furthermore, N1 is shown to increase T cell proliferation, decrease TH17 cell cytokine production and decrease CD8+ T cell perforin expression. N1 does not alter T cell expression of adhesion molecules. Finally, N1 is not expressed by the CNS dendritic cells, macrophages or microglial cells of mice undergoing experimental autoimmune encephalomyelitis, an animal model for MS. In summary, these results suggest that N1 is produced by APCs to modulate T cell function.

La sclérose en plaques (SEP) est une maladie inflammatoire du système nerveux central (SNC). Le système immunitaire joue un rôle clé en SEP, cependant la contribution de molécules spécifiques reste à élucider. Nous avons identifié NKG2D, un récepteur immunitaire, comme joueur clef dans les interactions entre les cellules neurales et les lymphocytes dans la SEP. L’expression de ULBP4, un ligand de NKG2D, est élevée dans le cerveau des patients SEP, et présente sous forme soluble dans le liquide céphalorachidien (LCR). NKG2D joue un rôle délétère dans l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale passive (EAE), un modèle de la SEP. MULT1, un ligand NKG2D, est élevé dans le SNC et le LCR au pic de la maladie EAE. Ainsi, nous avons émis l’hypothèse que la voie NKG2D module l’interaction entre les cellules neurales et les lymphocytes T. A l’aide d’imagerie en temps réel, nous avons montré que le blocage de NKG2D diminue les interactions stables entre les lymphocytes T CD8+ et les astrocytes humains in vitro. L’ajout d’ULBP4 soluble diminue les interactions stables entre ces lymphocytes et les astrocytes et ce avec une plus grande importance chez les patients SEP. Finalement, dans l’EAE, augmenter l’expression de MULT1 par injection intrathécale d’un vecteur viral augmente la sévérité des déficits moteurs. Cela corrèle avec une augmentation de la production d’IFNγ par les lymphocytes T infiltrants le SNC. Somme toute, NKG2D et ses ligands participent aux interactions entre les lymphocytes T et les cellules neurales en contexte de SEP et sont des cibles thérapeutiques potentielles à investiguer. / Multiple sclerosis is an inflammatory disease of the central nervous system (CNS). Although the key role of the immune system in MS is well established, the contribution of immune molecules remains incompletely unresolved. We identified NKG2D, an activating immune (co)receptor, as a key factor shaping the interactions between CNS and lymphocytes in MS. We have shown that expression of ULBP4, an NKG2D ligand, is elevated in brain from MS patients and increased in cerebrospinal fluid (CSF) as a soluble form. We have demonstrated that NKG2D contributes to disease progression in passive experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). We showed that one NKG2D ligand called MULT1 is upregulated in the CNS and in the CSF of EAE mice at disease peak. Thus, we hypothesized that the NKG2D pathway impacts the interactions between CNS cells and infiltrating T lymphocytes. Using our live-imaging co-culture model, we show that blocking NKG2D reduces stable interactions between CD8+ T lymphocytes and human astrocytes in vitro. Moreover, we observed that soluble ULBP4 decreases CD8 T cell-astrocyte stable interactions and modifies their behaviour with a stronger effect in MS patients. Finally, we saw in active EAE that increasing the expression of MULT1 in the CNS with an intrathecal injection of a viral vector increases motor deficits in mice. This correlates with a higher production of IFNγ by T lymphocytes. Thus, NKG2D and its ligands play important role in the interactions of CNS cells and T lymphocytes in the context of MS and are potential therapeutic targets to further investigate.

Indiana University-Purdue University Indianapolis (IUPUI) / Multiple sclerosis (MS) is a disabling disease that afflicts an estimated two million people worldwide. The disease is characterized by degradation of the myelin sheath that insulates neurons of the central nervous system manifesting as a heterogeneous collection of symptoms. Two enzymes, protein arginine deaminases type 2 and 4 (PAD2 and PAD4) have been implicated to play an etiologic role in demyelination and neurodegeneration by catalyzing a post-translational modification of arginine peptide residues to citrulline. The pathogenesis of MS is poorly understood, though vitamin D deficiency is a well-associated risk factor for developing the disorder. Using the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model of MS we demonstrate vitamin D treatment to attenuate over-expression of PAD 2 and 4 in the brain and spine during EAE. In addition, we identify two molecules produced by peripheral immune cells, IFNɣ and IL-6, as candidate signaling molecules that induce PAD expression in the brain. We demonstrate vitamin D treatment to inhibit IFNɣ mediated up regulation of PAD2 and PAD4 both directly within the brain and by modulating PAD-inducing cytokine production by infiltrating immune cells. These results provide neuroprotective rational for the supplementation of vitamin D in MS patients. More importantly, these results imply an epigenetic link between vitamin D deficiency and the pathogenesis of MS that merits further investigation.