Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, 2015. / Submitted by Andrielle Gomes (andriellemacedo@bce.unb.br) on 2015-06-30T18:12:42Z No. of bitstreams: 1 2015_GislaineAparecidaFernandes.pdf: 1639286 bytes, checksum: 37466a8311751953891135ea5481a04a (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2015-10-14T16:52:49Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_GislaineAparecidaFernandes.pdf: 1639286 bytes, checksum: 37466a8311751953891135ea5481a04a (MD5) / Made available in DSpace on 2015-10-14T16:52:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_GislaineAparecidaFernandes.pdf: 1639286 bytes, checksum: 37466a8311751953891135ea5481a04a (MD5) / As espécies do gênero Amazona são consideradas monogâmicas sociais, não sendo identificado até o momento casos de fertilização extra-par (FEP). Outra característica importante em relação ao comportamento reprodutivo das espécies deste gênero é a fidelidade ao ninho, pois os indivíduos geralmente selecionam locais mais seguros para nidificar, como por exemplo, locais com baixos níveis de predação. O fato de que a maioria dos psitacídeos, em particular as espécies deste gênero, não apresenta dimorfismo sexual dificulta a análise de diversos aspectos relacionados ao sistema de acasalamento, exigindo do pesquisador a observação de comportamentos críticos. Uma das alternativas que vem sendo aplicada para superar estas limitações em estudos de comportamento reprodutivo em aves é o uso de marcadores moleculares co-dominantes e altamente polimórficos como os microssatélites. Neste contexto, ainda se conhece pouco a respeito da biologia reprodutiva do papagaio-de-cara-roxa (Amazona brasiliensis), necessitando uma atenção maior sobre esta questão. Neste trabalho nós contribuímos com mais informações para melhor compreensão acerca da biologia reprodutiva do papagaio-de-cara-roxa a partir da estimativa da relação de parentesco entre ninhegos encontrados em ninhos naturais e artificiais na região da Baia de Paranaguá, no estado do Paraná, com oito loci de microssatélite. Os resultados obtidos mostraram que 76% dos ninhegos analisados apresentaram relação de parentesco de irmãos, 20% de meio-irmãos e 4% de não relacionados. Os casos de irmandade foram interpretados como evidência de monogamia do casal, os de meio-irmãos como casos de FEP, enquanto os não-relacionados como casos de competição intra-específica de ninho. Os resultados também mostraram que esta espécie apresenta uma taxa de 83% de reocupação de cavidades, a maior já descrita para o gênero, sendo que a reocupação pelo mesmo casal foi de 71%. Portanto, nós concluímos que Amazona brasiliensis não pode ser considerada monogâmica genética já que há evidência de FEP. Por outro lado, apresenta um padrão de fidelidade ao sítio reprodutivo, já que a maior parte dos casais analisados ocuparam a mesma cavidade nas estações reprodutivas seguintes, mesmo havendo perda de ninhada na estação reprodutiva anterior. / The species of the genus Amazona are considered social monogamous, not being identified yet cases of extra-pair fertilization (EPF). Another important feature in relation to the reproductive behavior in species of this genus is fidelity to the nest, as a kind usually selects the safest places to nest, for example, sites with low levels of predation. The fact that most parrots, particularly species of this genus, do not show sexual dimorphism complicates the analysis of various aspects related to the mating system, requiring the researcher to observe critical behaviors. One alternative that has been applied to overcome these limitations in reproductive behavior studies in birds is the use of co-dominant and highly polymorphic molecular markers as microsatellites. In this context, little is known about the reproductive Red-tailed amazon biology (Amazona brasiliensis), requiring greater attention on this issue. In this work, we contribute more information to better understanding reproductive biology of Red-tailed amazon from the estimate of the kinship relation between nestlings found in natural and artificial nests in the region of Paranaguá Bay, in Paraná with eight microsatellite loci. The results showed that 76% of nestlings analyzed showed kinship relation of full-sibs, 20% of half-sibs and 4% unrelated. Cases of full-sibs were interpreted as evidence of couple monogamy, the half-sibs as cases of EPF, while unrelated as cases of intraspecific competition nest. The results also showed that this species has a rate of 83% cavity reoccupation, the largest ever reported to the genus, and the reoccupation by the same couple was 71%. Therefore, we conclude that Amazon brasiliensis can not be regarded as genetic monogamous since there is evidence of EPF. However, shows a pattern of the nest site fidelity, since most of analyzed couples occupied the same cavity in the following breeding seasons and the loss in previous breeding season does not seem to influence the cavity reoccupation at next station.

Orientador: José Roberto Sartori / Resumo: Avaliou-se o efeito da suplementação de protease na digestibilidade e desempenho de frangos de corte em ambiente termoneutro e estresse cíclico pelo calor. Foram utilizados 320 pintos machos Cobb de um dia distribuídos casualmente em esquema fatorial 2x2x2 [ambiente termoneutro ou ambiente quente x dieta atendendo as exigências nutricionais (controle positivo, CP) ou reduzida 6% em proteína bruta e aminoácidos (controle negativo, CN) x protease: 0 ou 200ppm] com 8 repetições. De 1 a 7 dias de idade, a conversão alimentar (CA) foi melhor em frangos CN quando em ambiente termoneutro, e quando em ambiente quente, a CA melhorou com a dieta CP. Frangos em ambiente termoneutro apresentaram melhor CA e maior ganho de peso no período de 1 a 14 dias. Maior consumo de ração e ganho de peso foram observados em frangos mantidos em ambiente termoneutro nos períodos de 1 a 21 dias e 1 a 35 dias de idade. No período de 1 a 35 dias de idade houve interação entre dieta e protease, sendo que frangos que receberam dietas CP apresentaram melhor CA quando receberam protease. Frangos que receberam protease melhoraram a conversão alimentar quando consumiram CP comparados aos que receberam CN. A suplementação de protease favoreceu balanço de nitrogênio, coeficiente de metabolizabilidade da proteína bruta e da matéria seca e a energia metabolizável aparente e energia metabolizável aparente corrigida pelo nitrogênio em frangos de corte em ambiente quente com dieta controle positivo. Concluindo, o estr... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The objective of the current study was to evaluate the effects of protease supplementation on diet digestibility and growth performance of broilers raised under thermoneutral condition and cyclic heat stress. In a 2x2x2 factorial system [thermoneutral condition or heat stress vs. diets formulated to meet nutritional (positive control, PC) or diets with crude protein and amino acids below requirements by 6% (negative control, NC) x Protease: 0.200ppm], 320 one-day-old male Cobb broilers were distributed in 8 replicates. From 1 to 7 days of age, feed conversion ratio (FCR) was better in thermoneutral condition, and in heat stress, feed conversion ratio (FCR) was better when consume PC. Broilers in thermoneutral environment presented best FCR and greater weight gain during the period from 1 to 14 days. Increased feed consumption and weight gain were observed in broilers kept in thermoneutral environment in periods of 1 to 21 days and 1 to 35 days old. During the period from 1 to 35 days of age there was interaction between diet and protease, and broilers that were given diets CP presented best FCR when they received protease. Broilers receiving protease improved feed conversion when consumed PC compared to those receiving NC. Protease supplementation favored nitrogen balance, metabolizable crude protein, dry matter, apparent metabolizable energy and nitrogen-corrected apparent metabolizable energy in broiler chickens in heat stress with positive control diet. In conclusion, heat... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Reginaldo José Donatelli / Banca: Luiz dos Anjos / Banca: Sérgio Roberto Posso / Banca: Maria Cecilia Toledo / Banca: Wilson Uieda / Resumo: O Pantanal é a maior área úmida do planeta e responsável por deter uma porção representativa da biodiversidade da América do Sul. Ao longo do seu processo histórico de ocupação humana, o fogo foi intensamente utilizado como a principal forma de manejo dos solos, e atualmente representa uma das principais ameaças para o ecossistema. O presente estudo avaliou o impacto do fogo sobre as aves e sobre a vegetação em três fitofisionomias florestais do Pantanal (duas matas secas ‐ acurizal e tabocal; e uma mata inundável ‐ cambarazal), e determinou como a estrutura da vegetação influenciou a avifauna dessas formações antes e depois do fogo. O estudo foi realizado na RPPN SESC Pantanal, situada na porção norte do Pantanal. Em cada floresta foram selecionadas duas áreas de amostragem da avifauna, uma queimada em 2005 e outra sem ação do fogo. Uma terceira área foi amostrada no cambarazal, queimada em 2010. As aves foram amostradas entre 2011‐2013 pelo método de pontos de contagem e capturas com redes‐ornitológicas. Em cada ponto amostral, parâmetros relacionados à estrutura da vegetação foram estimados e relacionados com a avifauna. O fogo promoveu a redução do número de espécies e da abundância total de aves no acurizal, enquanto no tabocal e no cambarazal não houve diferenças significativas. Mais aves foram prejudicadas pelo fogo no acurizal (31%), enquanto no tabocal e no cambarazal essa proporção foi menor (15 e 10%). Insetívoros especialistas e frugívoros foram os grupos mais prejudicados nos três ambientes. Proporcionalmente, poucas espécies foram beneficiadas pelo fogo, na sua maioria aves generalistas e características de áreas mais abertas, enquanto a maioria diferiu significativamente entre os tratamentos. O fogo promoveu a mortalidade de árvores grandes e alterações em diversas estruturas do ambiente, que por sua vez influenciaram de maneira distinta ... / Abstract: Pantanal is the largest wetland on the planet and supports a considerable portion of the South American biodiversity. Throughout its history of human occupation, fire was widely used as the main method of soil management, and currently is one of the main threats to the ecosystem. The present study evaluated the impact of fire on birds and on the vegetation of three physiognomies of Pantanal (two dry forests ‐ acurizal and tabocal; and a floodplain forest - cambarazal), and determined how the vegetation structure influenced the bird assemblage of these plant formations pre and post‐fire. The study was conducted at the RPPN SESC Pantanal, located in north Pantanal. In each forest, the bird assemblage was sampled in two areas, one area burned in 2005 and an unburned one. A third area, burned in 2010, was sampled in cambarazal. Birds were sampled between 2011‐2013 by point counts and mist netting. In each sampling point, parameters associated with the vegetation structure were estimated and correlated with bird assemblage. Fire reduced the number of species and the total bird abundance in acurizal, while in tabocal and cambarazal, no significant differences were found. More birds were affected in acurizal (31%), while in tabocal and cambarazal, this proportion was lower (15 and 10%). Specialist insectivores and frugivores were the most affected groups in the three habitats. Proportionally, few species benefited by the fire, mainly generalist birds and typical of more open areas, while most were significantly different among treatments. The fire burned large trees and changed several structures in the habitat, that in turn affected the bird assemblage of each type of forest differently. Thus, the fire was a defining factor in the bird assemblage of the tree forests examined. However parameters such as richness and abundance did not provide a clear picture of these effects. In future management actions, mature forests should ... / Doutor

Orientador: Otto Mack Junqueira / Banca: Antonio Carlos de Laurentiz / Banca: Rosemeire da Silva Filardi / Resumo: Avaliou-se os efeitos da adição da fitase em rações formuladas com alimentos alternativos sobre o desempenho, qualidade dos ovos e características químicas das excretas de poedeiras comerciais. Em cada experimento foram utilizadas 180 aves, distribuídas em um DIC com cinco tratamentos e seis repetições de seis aves cada. O tratamento 1, controle, constituiu-se em uma ração de milho e farelo de soja, sem fitase e alimentos alternativos, e os demais foram arranjados em esquema fatorial 2x2, com 2 níveis de adição de fitase (0 e 500 FTU/kg de ração) e, respectivamente, 2 níveis de inclusão do farelo de girassol (4% e 8%) e 2 níveis de substituição do milho pelo sorgo (50 e 100%) nos experimentos 1 e 2. O período experimental foi dividido em quatro períodos de 28 dias, e ao final de cada período foram avaliados índices de desempenho e qualidade dos ovos. Foi realizado um ensaio para verificar a quantidade de fósforo (P) e nitrogênio nas excretas, além disso, foi realizada a análise econômica de cada tratamento. Os dados foram submetidos à análise de variância e as médias foram comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. A matriz nutricional da fitase permitiu o atendimento das exigências das aves, onde mesmo alimentadas com dietas com níveis nutricionais reduzidos não tiveram o desempenho e qualidade dos ovos comprometidos. A adição de fitase nas rações possibilitou decréscimo na excreção do P e redução de todos os parâmetros econômicos avaliados. A produção de ovos foi afetada negativamente quando utilizado o nível 8% de inclusão do farelo de girassol. O sorgo pode ser utilizado como o único grão energético da dieta. / Abstract: The aim of the study was to evaluate the effects of adding phytase to feeds formulated with alternative ingredients on the performance, egg quality, and feces chemical composition of laying hens. Each experiment analyzed 180 hens. Experiments were arranged in completely randomized design with five treatments and six replications of six hens. Treatment 1 (control), consisted of a regular feed of corn and soybean meal, without phytase and alternative ingredientes, and the other treatments were arranged in a 2x2 factorial with 2 levels of phytase (0 and 500 FTU/kg of feed), and, respectively, 2 levels of sunflower meal (4% e 8%) and 2 levels of corn replacement with sorghum (50 and 100%) in the experiments 1 and 2. The experiment was divided in 4 periods of 28 days. Performance indices and egg quality parameters were determined. After this experiment, a trial was conducted to determine the quantity of phosphorus and nitrogen in feces. An economical evaluation was also performed. Data were subjected to an ANOVA and means were compared by TUKEY test at 5% of probability. The nutritional matrix with phytase completely met the requirements of hens, and even in diets with lower nutritional levels the performance and egg quality were not compromised. Adding phytase to feeds decreased phosphorus levels in feces and all economical parameters were reduced. Egg production was negatively affected when 8% of sunflower was added. Sorghum can be used to partially or totally replace corn, and can be the only energy grain in the diet. / Mestre

Orientador: Hélio José Montassier / Banca: José Moacir Marin / Banca: Camillo Del Cistia Andrade / Resumo: A glicoproteína S1 do vírus da broquite infecciosa (VBI) além de ser altamente variável é responsável pela adsorção com os receptores das células hospedeiras e pela indução de anticorpos vírus-neutralizantes e inibidores da hemaglutinação em galinhas. A disponibilidade desse tipo de proteína pode contribuir com o imunodiagnóstico e com a imunoprofilaxia da bronquite infecciosa aviária. O presente estudo foi conduzido com a finalidade de fazer a clonagem e a expressão do gene da glicoproteína S1 derivada da estirpe M41 do VBI no sistema constituído pelo vetor pFLDa - Picchia pastoris. O cDNA completo do gene S1 foi preparado a partir do RNA extraído do líquido alantóide infectado com a estirpe M41 do VBI e o amplicon obtido pela PCR foi clonado no vetor de expressão pFLDa. O plasmídeo foi linearizado e usado na transformação da linhagem GS115 de Picchia pastoris por eletroporação. Foi avaliada a influência da composição do meio de cultura sobre a produção de biomassa e a expressão da proteína recombinante S1 durante a fase de indução. A produção da proteína S1 recombinante foi detectada somente no compartimento intracelular, embora o vetor pFLDa seja capaz de direcionar a síntese de uma proteína heteróloga para a via secretora. A proteína recombinante foi caracterizada imunoquimicamente como uma banda de aproximadamente 90 kDa e com reatividade específica para os anticorpos monoclonais anti-polihistidina. Concluindo, o sistema hospedeiro de células da levedura P. pastoris com o vetor pFLDa usado nesse estudo comprovou ser um método eficaz para a produção no compartimento intracelular da proteína recombinante S1 da estirpe M41 do VBI, com potencial para futura utilização em técnicas de imuno-diagnóstico da bronquite infecciosa aviária. / Abstract: The glycoprotein (S1) of infectious bronchitis virus (IBV) has been shown to be highly variable and responsible for attachment to the receptor in host cellular membrane, induction of neutralizing and haemagglutination-inhibiting antibodies in chickens. Thus, the availability of such protein can contribute to the immuno-diagnosis and immunoprofilaxis of avian infectious bronchitis. The present study was carried out aiming to clone and to express the gene of S1 glycoprotein from M41 strain fo IBV in the system constituted by pFLDa vector - Picchia pastoris. Full length cDNA of IBV S1 glycoprotein was prepared from RNA extracted from infected allantoic fluid and the amplicon generated by PCR was cloned into yeast expression vector pFLDa to construct the plasmid of pFLDa - S1 - IBV. This plasmid was linearized and then transformed in Picchia pastoris GS115 by electroporation. The recombinant yeast clones were cultivated and selected. The influence of media composition on biomass and in the production of recombinant S1 during induction phase was studied. The production of recombinant S1 protein was detected only in the intra-cellular compartment, though the pFLDa vector would direct the synthesis for the secretor pathway. The recombinant protein was characterized by SDS-PAGE and Western-Blotting as a band of a molecular weight of approximately 90 kDa with specific reactivity against anti-Histidina monoclonal antibodies. The use of complex media promotes an increase in biomass, but no soluble S1 recombinant protein was produced. Concluding, the yeast system composed by pFLDa - P. pastoris was efficient to express intra-cellularly the recombinant S1 protein of M41 strain of IBV which has a potential to be used in the immuno-diagnosis of avian infectious bronchitis. / Mestre

Resumo: Objetivou-se estimar parâmetros genéticos e fenotípicos da produção de ovos total e parcial em aves de postura por meio de modelos de dimensão finita e infinita, visando à seleção das aves para a característica produção de ovos. Utilizou-se dados de fêmeas, nascidas a partir de três incubações, provenientes de uma geração de uma linhagem de poedeiras, desenvolvida pela EMBRAPA Suínos e Aves em Concórdia, SC. A produção de ovos foi avaliada individualmente por meio do número de ovos, a partir de 20 até 70 semanas de idade. As produções foram divididas em períodos, sendo que cada período consistiu em três semanas de produção. As características estudadas foram os registros parciais nos períodos e o registro total da produção de ovos (PTOTAL). Para análise em modelo animal uni e bicaracterística, utilizou-se o programa computacional MTDFREML. Maior herdabilidade foi estimada para o período de 20 a 22 semanas de idade (P1) e PTOTAL (0,33 ± 0,07 e 0,23 ± 0,06). Correlações genéticas entre os períodos parciais e PTOTAL variaram de 0,42 ± 0,15 (PTOTAL com P2, de 20 a 22 semanas de idade) até 1,00 (PTOTAL com P9 e P11, de 44 a 46 e 50 a 52 semanas de idade, respectivamente). A correlação de Spearman entre as ordens dos 43 galos quanto aos valores genéticos para produção de P9, P10 (de 47 a 49 semanas de idade) e de P11 com PTOTAL foi significativa (p<0,001) para P9 e P11, igual a 1,00 e para P10 (p<0,0028), igual a 0,99. Concluiu-se que o registro parcial de ovos para os períodos P9, P10 e P11 poderiam ser considerados no processo de seleção visando à produção total de ovos. Porém, devido os mesmos apresentarem baixas estimativas de herdabilidade (0,06; 0,12 e 0,10, respectivamente para P9, P10 e P11) a seleção seria mais eficiente considerando o PTOTAL. Portanto, seria recomendada a seleção baseada na produção total de ovos, pois a mesma... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The aim was to estimate genetic and phenotypic parameters for total and partial records of egg production of laying hens using finite and infinite-dimension models, with a view to selecting birds for egg production. Data on females born from three incubations, from a generation of an egg-laying strain developed by EMBRAPA Suínos e Aves, Concórdia, SC, were used. Egg production was evaluated individually as the number of eggs produced between the ages of 20 and 70 weeks. The production was divided into three-week periods. The traits studied were the partial records for each period (P1 to P17) and the total recorded egg production (PTOTAL). For analysis in one and two-trait animal models, the MTDFREML software was used. Higher heritabilities were estimated for the periods of 20 to 22 weeks of age (P1) (0.33 ± 0.07) and PTOTAL (0.23 ± 0.06). The genetic correlations between the partial periods and PTOTAL ranged from 0.42 ± 0.15 (P1) to 1.00 (for P9 and P11, representing 44-46 and 50-52 weeks of age, respectively). Spearman's correlation between the ranks of the 43 sires, regarding the genetic values for production in P9, P10 (47-49 weeks of age) and P11 in relation to PTOTAL, was significant and equal to 1.00 (P<0.001) for P9 and P11 and equal to 0.99 (P<0.0028) for P10. Although highly correlated with PTOTAL, these periods had low heritability estimates in two-trait analysis (0.06, 0.12 and 0.10, respectively for P9, P10 and P11). Thus, selection based on these partial periods would be inefficient and basing it on total egg production would be recommended, since this presented higher heritability estimates. To estimate the covariance functions using random regression models, the DXMRR option in the DFREML statistical software was used. The most appropriate model regarding goodness-of-fit of the egg production data in these laying hens was the one composed of third-order... (Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Danísio Prado Munari / Coorientadora: Lenira El Faro Zadra / Coorientadora: Mônica Côrrea Ledur / Banca: João Ademir de Oliveira / Banca: Claudia Cristina Paro de Paz / Mestre

Orientador: Silvia Regina Lucas de Souza / Banca: Elvio Gilberto da Silva / Banca: Douglas D'Alessandro Salgado / Resumo: O Brasil encontra-se entre os líderes em exportação no setor avícola, mas ainda apresenta instalações inadequadas para a produção e manejo de frangos de corte, acarretando problemas na qualidade do ar e conforto térmico do animal. Frequentemente o produtor, pensando no lucro da sua produção, não prioriza o bem-estar dos animais dentro das instalações em que estão confinados, esquecendo-se que nessa situação necessitam do conforto térmico para que possam apresentar melhores resultados na produção. Visando ao bem-estar dos frangos de corte, o projeto propôs estudos com base em CFD (Computational Fluid Dynamics) que apresenta simulações que imitam a realidade, por meio do desenho em 3D da instalação em que os frangos são confinados e, assim, obtendo resultados visuais sobre o estado atual da instalação, identificando quais regiões afetam o conforto térmico, a qualidade do ar e quais as melhores opções para contornar essa situação. O projeto foi realizado na Fazenda Experimental Lageado, que possui todo o suporte necessário para as simulações, disponibilizando dados do ambiente de instalação adquiridos pelos data logger's, responsáveis por coletar dados microclimáticos e inseridos no Simulation CFD da Autodesk®. Após a coleta e inserção dos dados no simulador, foi possível realizar as simulações estudando a condição das instalações das aves, tanto na parte de poluentes (amônia) bem como conforto térmico, com temperaturas de 27, 28, 29 e 32ºC até alcançar a situação ideal para as ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Brazil is among the leaders in the poultry sector exportation, but it still presents inadequate facilities for the production and management of broilers, resulting in problems with the air quality and thermal comfort of the animal. Often when the producer thinks about the profit of his production, he does not prioritize the well-being of the animals inside the premises in which they are confined, forgetting that the animals in this situation need the thermal comfort so that the production can present better results. Thinking about the welfare of broilers, the project proposed studies based on CFD (Computational Fluid Dynamics) that presents simulations that mimic reality from the 3D design of the facility, where the chickens are confined and thus obtaining visual results on the current state of the facility, identifying which regions are affecting thermal comfort, air quality and what are the best options to circumvent this situation. The project was carried out at the Fazenda Experimental Lageado farm, with all the necessary support for the simulations, providing data from the installation environment acquired by the data logger's, responsible for collecting microclimatic data and inserted into the Autodesk® CFD Simulation. After the collection and insertion of the data in the simulator, it was possible to carry out the simulations by studying the condition of the birds installations in both the pollutants part (ammonia) as well as thermal comfort, with temperatures of 27, 2... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

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Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:21Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2003-07-04Bitstream added on 2014-06-13T18:31:25Z : No. of bitstreams: 1 luciano_rl_me_jabo.pdf: 288271 bytes, checksum: 77640cc158f0c12048ecdaf245801057 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Um método de diagnóstico baseado na associação entre as técnicas de RT-PCR e ELISA foi desenvolvido para a detecção do vírus da bronquite infecciosa das aves (VBI). Inicialmente, a especificidade e a sensibilidade analíticas dessa técnica, bem como dos métodos de RT-PCR e Nested-RT-PCR, foram determinadas, tendo-se demonstrado, para o primeiro parâmetro, apenas a detecção do VBI, enquanto que outros vírus heterólogos aviários testados, tais como pneumovírus aviário (APV / estirpe do grupo B), vírus da doença de Newcastle (NDV / estirpe La Sota) e vírus da doença de Gumboro (GDV - estirpe Lukert), não foram detectados. Quanto à avaliação da sensibilidade analítica dos métodos empregados neste estudo foi constatado que o RT-PCR-ELISA demonstrou ser 10 vezes mais sensível do que a RT-PCR, enquanto que a reação de Nested-PCR foi 100 vezes mais sensível que a RT-PCR e 10 vezes mais sensível que o RT-PCR-ELISA. A técnica de RT-PCR-ELISA, juntamente com os outros dois métodos de biologia molecular, foram aplicadas para a detecção das estirpes H-120 e A034 do VBI, em amostras de pulmão e traquéia obtidas de aves experimentalmente infectadas com essas duas estirpes virais. Os resultados obtidos nos diferentes métodos de biologia molecular foram comparados entre si e com a técnica padrão de isolamento viral em ovos embrionados, verificando-se que o RT-PCR-ELISA revelou-se tão específico quanto as técnicas de isolamento viral e Nested-PCR, porém foi menos sensível do que esses mesmos métodos na detecção do VBI. A técnica de RT-PCR-ELISA, utilizada pela primeira vez para o VBI, demonstrou o potencial de se constituir uma alternativa viável para um diagnóstico direto mais rápido e específico do VBI. / A molecular biology method for the detection of avian infectious bronchitis virus (IBV) was developed combining the reverse transcription and polymerase chain reaction (RT-PCR) with the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Firstly, the analytical specificity and sensitivity of RT-PCR-ELISA, RT-PCR and Nested-RT-PCR were assessed. The specificity of these methods were confirmed since only IBV was detected, while other heterologous avian viral pathogens such as pneumovirus (Group B), Newcastle disease virus (LaSota strain) and gumboro disease virus (Lukert strain) were not detected by these techniques. The sensitivity of these methods was established, indicating that the RT-PCR-ELISA was about ten times more sensitive than conventional RT-PCR, while Nested-PCR was a hundred more sensitive than RT-PCR and ten times more sensitive than PCR-ELISA. The RT-PCR-ELISA and the two molecular biology methods were also applied for the detection of IBV strains H-120 and A034, in lung and tracheal tissue samples collected from experimentally infected chickens. The results of these different methods were also compared with the standard diagnostic technique, the virus isolation in chicken embryonated eggs, showing that RT-PCR-ELISA was as specific as virus isolation and Nested-PCR, however it was less sensitive than these methods for the IBV detection. The RT-PCR-ELISA, applied for the first time for IBV detection and direct diagnosis in tissue samples, can be potentially applied as an useful alternative for the rapid and specific diagnosis of IBV.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:22Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-02-26Bitstream added on 2014-06-13T20:16:38Z : No. of bitstreams: 1 goncalves_mcm_me_jabo.pdf: 755871 bytes, checksum: 00a7ca290b99eaeb7742fdd22cdc3c6c (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A glicoproteína S1 do vírus da broquite infecciosa (VBI) além de ser altamente variável é responsável pela adsorção com os receptores das células hospedeiras e pela indução de anticorpos vírus-neutralizantes e inibidores da hemaglutinação em galinhas. A disponibilidade desse tipo de proteína pode contribuir com o imunodiagnóstico e com a imunoprofilaxia da bronquite infecciosa aviária. O presente estudo foi conduzido com a finalidade de fazer a clonagem e a expressão do gene da glicoproteína S1 derivada da estirpe M41 do VBI no sistema constituído pelo vetor pFLDa – Picchia pastoris. O cDNA completo do gene S1 foi preparado a partir do RNA extraído do líquido alantóide infectado com a estirpe M41 do VBI e o amplicon obtido pela PCR foi clonado no vetor de expressão pFLDa. O plasmídeo foi linearizado e usado na transformação da linhagem GS115 de Picchia pastoris por eletroporação. Foi avaliada a influência da composição do meio de cultura sobre a produção de biomassa e a expressão da proteína recombinante S1 durante a fase de indução. A produção da proteína S1 recombinante foi detectada somente no compartimento intracelular, embora o vetor pFLDa seja capaz de direcionar a síntese de uma proteína heteróloga para a via secretora. A proteína recombinante foi caracterizada imunoquimicamente como uma banda de aproximadamente 90 kDa e com reatividade específica para os anticorpos monoclonais anti-polihistidina. Concluindo, o sistema hospedeiro de células da levedura P. pastoris com o vetor pFLDa usado nesse estudo comprovou ser um método eficaz para a produção no compartimento intracelular da proteína recombinante S1 da estirpe M41 do VBI, com potencial para futura utilização em técnicas de imuno-diagnóstico da bronquite infecciosa aviária. / The glycoprotein (S1) of infectious bronchitis virus (IBV) has been shown to be highly variable and responsible for attachment to the receptor in host cellular membrane, induction of neutralizing and haemagglutination-inhibiting antibodies in chickens. Thus, the availability of such protein can contribute to the immuno-diagnosis and immunoprofilaxis of avian infectious bronchitis. The present study was carried out aiming to clone and to express the gene of S1 glycoprotein from M41 strain fo IBV in the system constituted by pFLDa vector – Picchia pastoris. Full length cDNA of IBV S1 glycoprotein was prepared from RNA extracted from infected allantoic fluid and the amplicon generated by PCR was cloned into yeast expression vector pFLDa to construct the plasmid of pFLDa - S1 - IBV. This plasmid was linearized and then transformed in Picchia pastoris GS115 by electroporation. The recombinant yeast clones were cultivated and selected. The influence of media composition on biomass and in the production of recombinant S1 during induction phase was studied. The production of recombinant S1 protein was detected only in the intra-cellular compartment, though the pFLDa vector would direct the synthesis for the secretor pathway. The recombinant protein was characterized by SDS-PAGE and Western-Blotting as a band of a molecular weight of approximately 90 kDa with specific reactivity against anti-Histidina monoclonal antibodies. The use of complex media promotes an increase in biomass, but no soluble S1 recombinant protein was produced. Concluding, the yeast system composed by pFLDa - P. pastoris was efficient to express intra-cellularly the recombinant S1 protein of M41 strain of IBV which has a potential to be used in the immuno-diagnosis of avian infectious bronchitis.