La première étape de ce travail visait à caractériser l’impact du calcium sur les interactions entre la β-lactoglobuline (β-lg) et l’epigallocatéchine-3-gallate (EGCG). Il a été démontré que le calcium avait un impact important sur la taille des agrégats formés et leur potentiel-zêta (ζ). De plus, l’analyse de la composition de ces complexes a démontré un impact important du calcium sur la rétention d’EGCG par ces particules. Différents types d’interactions entre la protéine, la catéchine et le calcium (par exemple. électrostatiques, hydrophobes et hydrogènes) sont suggérés comme étant responsables des caractéristiques observées. La deuxième étape visait à déterminer l’impact de différentes concentrations de calcium sur les interactions entre la β-lg et l’EGCG. Cette deuxième étape a permis de démontrer que l’effet du calcium sur l’augmentation de la taille de particule ainsi que sur le changement de potentiel-ζ était seulement possible en présence d’EGCG. Cet effet serait principalement dû à la formation de ponts calciques (EGCG/calcium/EGCG) pouvant créer un réseau responsable de l’augmentation de la taille des particules. La troisième et dernière étape de ce travail visait à déterminer si les complexes formés par la β-lg, l’EGCG et le calcium pouvaient améliorer la réponse glycémique chez des souris C57BL/6 soumis à un test oral de tolérance au glucose. Il a pu être démontré que la β-lactoglobuline seule avait un effet bénéfique sur la glycémie postprandiale. L’ensemble de ces résultats démontre que la présence du calcium a un effet important sur les interactions entre la protéine laitière et la catéchine du thé vert et sur la taille des agrégats résultants. Par ailleurs, la protéine seule semblait avoir le plus grand effet sur la réponse métabolique indiquant que des interactions avec l’EGCG et le calcium n’avaient que peu d’effet sur l’activité métabolique de la β-lg. / The first step of this work aimed to determine the impact of calcium on the interactions between β-lactoglobulin (β-lg) and epigallocatechin-3-gallate (EGCG) and it was shown that calcium had an important impact on particle size and zeta(ζ)-potential values. Moreover, the analysis of the formed complexes’ composition revealed that the presence of calcium could greatly influence the quantity of EGCG retained by the complexes. Various interactions between the protein, the catechin and calcium (eg. electrostatic, hydrophobic, and hydrogen) are suggested as being responsible for the characteristics of the complexes observed. The second step aimed to determine the impact of various calcium concentrations on the interactions between β-lg and EGCG. This second step allowed us to demonstrate that the impact of calcium on particle size and ζ-potential was only possible when in the presence of EGCG. This effect would primarily be due to the formation of calcium bridging capable of creating a large network responsible for the increased particle size. The third and last step of this work aimed to determine if the formed complexes between β-lg, EGCG and calcium reduce the glycemic response of C57BL6 mice. It was demonstrated that β-lg alone had a beneficial effect on postprandial glycaemia. Together, these results demonstrate that the presence of calcium has an important effect on the interactions between the milk protein and green tea catechins. However, these interactions do not appear to modulate the metabolic response associated with the consumption of β-lg.

De nombreuses études ex vivo et in vivo ont montré que certaines protéines du lactosérum (β-lactoglobuline, α-lactalbumine et lactoferrine) et que des ingrédients à base de protéines du lactosérum (WPC, WPI) peuvent influencer la réponse immunitaire. Plusieurs études ex vivo ont aussi montré que des hydrolysats enzymatiques des protéines du lactosérum possèdent une activité immunomodulante, suggérant ainsi la libération de peptides bioactifs. Dans cette étude, des peptides issus de la β-lactoglobuline (β-Lg) et de l'α-lactalbumine (α-La) ont été sélectionnés sur la base de leurs propriétés physico-chimiques, puis préparés par synthèse chimique. Les propriétés immunomodulantes de ces peptides ont ensuite été évaluées ex vivo, en mesurant leurs effets à différentes concentrations (10-2000 ug.mL⁻¹) sur la prolifération de splénocytes murins, en absence et en présence d'un mitogène (Concanavaline A). L'effet sur la sécrétion des cytokines (IL-4, IL-2, IL-10 et IFN-γ) de certains peptides (β-Lg f 15-20, f55-60, fl 39-148) a aussi été étudié, avec et sans ConA. Les résultats ont montré que le peptide β-Lg 178-83 ne possède aucun effet sur la prolifération des cellules, alors que d'autres peptides (β-Lg fl 5-20, f55-60, f84-91, f92-105, H39-148, fl42-148 et α-La 10-16) stimulent plus ou moins fortement la prolifération des splénocytes. Trois peptides ont montré un effet inhibiteur sur la croissance des cellules: le β-Lg fl-8 semble affecter l'intégrité des cellules à fortes concentrations, alors que l'effet inhibiteur des peptides β-Lg f"102-105 et α-La f 104-108 semble plutôt associé à leur faible solubilité à fortes concentrations, ce qui affecterait la croissance des cellules. L'étude des corrélations entre les caractéristiques physico-chimiques et les propriétés immunostimulantes des peptides a suggéré que la charge positive, l'hydrophobicité et la taille des peptides pourraient jouer un rôle important dans leurs propriétés immunomodulantes. Le dosage des cytokines a révélé un effet différent de chacun des peptides étudié sur la sécrétion cytokinique, suggérant un mode d'action différent de ces derniers sur la stimulation de la prolifération des splénocytes. Ces résultats suggèrent donc que certains peptides trouvés dans la séquence primaire des protéines majeures du lactosérum posséderaient un effet sur la réponse immunitaire spécifique.

L’induction de la tolérance orale est une des stratégies intéressantes pour prévenir les allergies alimentaires chez les enfants classés à risque. D’autre part, la composition de la microflore intestinale des enfants est un facteur important pour le développement de la tolérance. L’effet des bactéries probiotiques sur la tolérance orale a été très peu étudié et leurs mécanismes d’action sont mal documentés. Nous avons comparé l’effet de trois souches probiotiques sur l’induction et le maintien de la tolérance orale à la β-lactoglobuline chez la souris. Il a été observé que l’effet des probiotiques dépend de la souche utilisée et que la tolérance orale est bien induite et maintenue, aux niveaux humoral et cellulaire, en présence de Lactobacillus paracasei NCC2461. Les mécanismes d’action des probiotiques semblent être reliés à leur activité métabolique puisque des peptides issus de la β-lactoglobuline bovine, et libérés par L. paracasei ou Bifidobacterium lactis NCC362, modulent la réponse immune. Par contre, la stimulation de la voie de la cyclooxygénase-2 par les probiotiques n’a pas été observée, alors que l’implication de cette enzyme dans les mécanismes de la tolérance orale a clairement été démontrée. / Inducing oral tolerance to commonly allergenic food proteins is seen as a promising means to prevent food allergy in newborn population diagnosed as at risk of allergy. The intestinal microbiota has been shown to play a key role in oral tolerance development. Recently, a great interest has been focused on probiotic bacteria for their purported beneficial effects on human health but their effects on oral tolerance induction have been poorly investigated. The effect of three probiotic strains (Lactobacillus paracasei NCC2461, Lactobacillus johnsonii NCC533 and Bifidobacterium lactis NCC362) has been investigated and oral tolerance to bovine β-lactoglobulin (BLG) has been better induced and maintained in mice mono-colonized with L. paracasei. B. lactis and L. paracasei might induce oral tolerance through the hydrolysis of BLG and releasing of peptides with modified immunological properties. L. paracasei enzymes mainly hydrolyze acidic BLG-derived peptides and release smaller ones, which suppress splenocyte proliferation, down-regulate IFN-γ and IL-4 production and up-regulate IL-10 secretion. In contrast, hydrolysis of acidic BLG-derived peptides by B. lactis enzymes releases peptides, which stimulate splenocyte proliferation, IFN-γ and IL-10 production and down-regulate IL-4. Moreover, the residual allergenicity of released peptides is significantly reduced after B. lactis hydrolysis. These results suggest that L. paracasei and B. lactis might promote oral tolerance by activating different cellular mechanisms: L. paracasei stimulating the active suppression pathway, whereas B. lactis stimulating T helper type 1 lymphocytes downregulating T helper type 2 lymphocytes, implicated in allergy. On the other side, neither L. paracasei nor B. lactis was shown to stimulate the cyclooxygenase-2 pathway while its implication in oral tolerance induction has been clearly demonstrated.

En raison des restrictions législatives de plus en plus sévères sur la pollution de l'environnement, les industries laitières font face au fil des dernières années à un défi crucial de valorisation des grandes quantités de lactosérum générées. Ainsi, grâce aux récents progrès technologiques et scientifiques ainsi que la forte croissance du marché d'ingrédients biofonctionnels, une voie de valorisation plus efficiente et prometteuse du lactosérum a émergé. En effet, au cours des dernières années, plusieurs études ont démontré que les attributs nutritionnels et biofonctionnels du lactosérum sont particulièrement liés à ses protéines qui constituent une source optimale d'ingrédients alimentaires fonctionnels et de peptides bioactifs. Ainsi, la β-lactoglobuline (β-lg), protéine majeure du lactosérum est un additif fréquemment utilisé dans une large gamme de produits alimentaires en raison de ses excellentes propriétés biofonctionnelles, de sa valeur nutritionnelle élevée et de son faible coût. Ces propriétés biofonctionnelles de la β-lg peuvent être améliorées par différentes méthodes de traitement, notamment les traitements physiques, chimiques et enzymatiques. Cependant, en raison de sa structure globulaire compacte, la β-lg sous sa forme native est relativement résistante aux modifications. Bien que les traitements conventionnels soient efficaces pour améliorer les propriétés structurelles et fonctionnelles des protéines ainsi que la production de peptides biologiquement actifs, ils sont cependant consommateurs de ressources et peuvent affecter négativement la qualité des produits finaux. Par conséquent, l'application de méthodes de traitement physique non thermique émergentes s'avère nécessaire. Ainsi, dans le cadre de ce projet doctoral, les traitements électriques à hauts voltages (TEHV) respectueux de l'environnement, notamment les champs électriques pulsés (CEP) et les arcs électriques (ARC) ont été utilisés comme méthode de prétraitement de la β-lg. Un prétraitement thermique de la β-lg a été effectué afin de comparer l'efficacité des prétraitements par TEHV avec l'approche conventionnelle. De ce fait, les échantillons de β-lg préchauffés étaient considérés comme témoin positif et ceux de la forme native, comme témoin négatif. L'effet des prétraitements sur les propriétés fonctionnelles de la β-lg a été évalué. De même, l'impact des TEHV et du prétraitement thermique sur la structure de la β-lg et sa susceptibilité à l'hydrolyse trypsique et chymotrypsique a été étudié. La chromatographie liquide ultra-performante couplée à la spectrométrie de masse en tandem (UPLC-MS/MS) a été utilisée afin d'analyser et de caractériser les fractions peptidiques issus des différents hydrolysats de la β-lg. De plus, les scores d'éco-efficience (EE) de génération de peptides après hydrolyses trypsique et chymotrypsique ont été calculés dans le but de déterminer laquelle des méthodes de prétraitement était la plus efficiente. Les résultats ont démontré une amélioration des propriétés fonctionnelles (propriétés moussantes, émulsifiantes et d'hygroscopicité) de la β-lg favorisée par l'impact positif des TEHV sur sa structure secondaire. En effet, les analyses structurales ont montré que les TEHV ont induit une modification partielle de la conformation de la β-lg. Une telle modification structurelle a eu pour conséquence une augmentation du degré d'hydrolyse (DH) de près de 2 fois après prétraitement par TEHV comparée à la protéine native. Dans le cas du prétraitement par chauffage conventionnel, l'augmentation du DH était d'environ 1,2 fois comparée à la protéine native. Ces résultats ont été confirmés par l'amélioration des paramètres cinétiques de la β-lg à l'état d'équilibre, après les TEHV. Par ailleurs, une différence significative a été observée entre la trypsine et la chymotrypsine quant au DH et l'efficacité catalytique des deux enzymes. En effet, les constantes d'efficacité catalytique de la chymotrypsine étaient plus élevées que celles de la trypsine, suggérant une meilleure affinité de la chymotrypsine pour la protéine par rapport à la trypsine. En outre, l'analyse des échantillons prétraités en UPLC-MS/MS a démontré que l'application des TEHV a conduit à la libération de peptides à partir des molécules de β-lg avant même l'ajout de trypsine et de chymotrypsine aux milieux réactionnels. De plus, les TEHV ont généré en moyenne 37 à 50 % plus de peptides que les protéines natives et préchauffées. Enfin, l'analyse de l'EE a révélé que les TEHV constituaient une méthode de prétraitement plus éco-efficiente que la méthode conventionnelle car leurs scores EE étaient plus élevés tant pour les procédés d'hydrolyse que pour les peptides bioactifs résultant de l'hydrolyse. Cette thèse apporte également de nouveaux éléments de compréhension quant à la valorisation multidirectionnelle des protéines du lactosérum. / Due to increasingly severe legislative restrictions on environmental pollution, dairy industries have faced over the past few years a crucial challenge of valuing the large quantities of whey generated. Thus, thanks to recent technological and scientific progress as well as the important growth of the biofunctional ingredients market, a more efficient and promising way of whey valorization has emerged. Indeed, in recent years, several studies have demonstrated that the nutritional and biofunctional attributes of whey are particularly linked to its proteins, which constitute an optimal source of functional food ingredients and bioactive peptides. Therefore, ß-lactoglobulin (β-lg), a major whey protein is an additive frequently used in a wide range of food products due to its excellent biofunctional properties, its high nutritional value and its low cost. These biofunctional properties of β-lg can be improved by different treatment methods, including physical, chemical and enzymatic ones. However, due to its compact globular structure, β-lg in its native form is relatively resistant to modifications. Although conventional treatments are effective in improving the structural and functional properties of proteins as well as the production of biologically active peptides, they are nonetheless resource intensive and can negatively affect the quality of final products. Therefore, the application of emerging non-thermal physical treatment methods is necessary. Thus, in the frame of this doctoral project, sustainably high-voltage electrical treatments (HVET), namely pulsed electric fields (PEF) and electric arcs (ARC) were used as pretreatment method of β-lg. Thermal pretreatment of β-lg was performed in order to compare the efficiency of HVET pretreatments with the conventional approach. Therefore, the preheated β-lg samples were considered as positive control and those of the native one as negative control. The effect of pretreatments on the functional properties of β-lg was evaluated. Likewise, the impact of HVET and heat pretreatments on the structure of β-lg and its susceptibility to tryptic and chymotryptic hydrolyses was investigated. Ultra-performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) was used to analyze and characterize the peptide fractions from the various hydrolysates of β-lg. In addition, the eco-efficiency (EE) scores of peptide generation after tryptic and chymotryptic hydrolyses were calculated in order to determine which of the performed pretreatment methods was the most efficient. The results demonstrated an improvement in the functional properties (foaming, emulsifying and hygroscopicity properties) of β-lg promoted by the positive impact of HVET on its secondary structure. Indeed, structural analyzes have shown that HVET induced a partial modification of the conformation of β-lg. Such structural modification resulted in almost 2-times increase in the degree of hydrolysis (DH) after HVET pretreatments compared to the native protein. In the case of the conventional heating pretreatment, the increase in DH was approximately 1.2-times compared to native protein. These results were confirmed by the improvement in the kinetic parameters of β-lg at steady state after HVET. Furthermore, a significant difference was observed between trypsin and chymotrypsin with regard to DH and the catalytic efficiency of the two enzymes. Indeed, the catalytic efficiency constants of chymotrypsin were higher than those of trypsin, suggesting a better affinity of chymotrypsin with the protein compared to trypsin. In addition, the UPLC-MS MS analysis of pretreated samples demonstrated that the application of HVET led to the release of peptides from β-lg molecules even before the addition of trypsin and chymotrypsin to the reaction media. Additionally, the HVET have generated in average 37-50% more peptides than native and preheated proteins. Finally, the EE analysis revealed that HVET were the most efficient pretreatment method than the conventional one as their EE scores were higher for both hydrolysis processes and bioactive peptides generated from performed hydrolyses. This thesis highlights new understanding elements regarding the multidirectional valorization of whey proteins.

L’interaction associative entre la β-lactoglobuline et le xanthane (natif ou traité par hautes pressions hydrodynamiques) résultant en la formation de complexes électrostatiques a été étudiée par diverses techniques chimiques et physiques. L’objectif principal était d’approfondir les connaissances fondamentales au niveau moléculaire sur les interactions protéines – polysaccharides anioniques. Il a été trouvé que le mécanisme de séparation de phases associative suivi par ce système est une nucléation et croissance qui résultant en la formation de diverses structures fractales. Notamment, des différences de taille, de structure interne (compacité) et de solubilité ont été obtenues selon, entre autres, le pH et le ratio protéine – xanthane qui dirigent les processus de structuration dans le système en gouvernant, respectivement, la densité de charge des molécules et les effets d’équilibre de masse. L’importance et l’effet des forces de cisaillement appliquées (ou non) ainsi que la méthode d’acidification utilisée pendant la séparation de phases ont aussi été démontrés. Ainsi, lorsque la complexation a lieu sous cisaillement, la taille et la structure des complexes sont déterminées par un processus de restructuration induit par une compétition entre les forces électrostatiques attractives et les forces de rupture dues à l’écoulement. D’autre part, il a été démontré que le degré d’agrégation du xanthane est responsable des différentes structures formées puisque c’est le polysaccharide qui agit comme support lors de la complexation. Particulièrement, à des taux d’acidification lents, la taille des complexes peut être contrôlée en modifiant le poids moléculaire du xanthane. Les propriétés fonctionnelles des complexes obtenus peuvent ainsi être modifiées et façonnées en ajustant divers paramètres initiaux (ratio protéine – xanthane, poids moléculaire du xanthane) ainsi que les conditions présentes lors de leur fabrication (cisaillement, vitesse d’acidification). La fonctionnalité des complexes comme substituts de matière grasse a été évaluée dans des formulations modèles de garniture à biscuit ou glaçage à gâteaux. Les complexes ont conféré de bons attributs de viscosité et de texture aux échantillons faibles en gras. / The associative interaction between β-lactoglobulin and xanthan gum (native or treated by high hydrodynamic pressures) resulting in the formation of electrostatic complexes was studied by several chemical and physical techniques. The main objective was to develop a fundamental knowledge of this system at a molecular level, to better understand the interactions between proteins and anionic polysaccharides. The associative phase separation in this system proceeded via a nucleation and growth mechanism that resulted in the formation of distinct fractal structures. Namely, differences in size, internal structure (compactness), and solubility were obtained depending principally on the pH and initial protein to polysaccharide ratio; which, in turn governed molecular charge density and mass action equilibrium effects determining the structuration processes. The important effects of the acidification method and the shearing forces applied during complexation were also identified. Particularly, it was revealed that when shear forces were applied during complexation the size and the structure of interpolymeric complexes were determined by restructuring processes set by a competition between attractive electrostatic forces and rupture forces caused by flow. Moreover, it was found that the aggregation pattern of xanthan gum was responsible for the formation of the different structures since it is the polysaccharide that acts as the support during complexation. Accordingly, at slow rates of acidification, a modification of the molecular weight of xanthan gum can control the size of the complexes. Therefore, the characteristics and functional properties of the complexes can be modified and tailored by adjusting the initial parameters and the conditions present during their manufacture.

La protéine majeure du lactosérum, la β-lactoglobuline (βlg) est bien reconnue pour ses propriétés structurales intéressantes lui permettant d’établir des interactions avec des ligands de taille et de caractéristiques différentes. La riboflavine (RF) et la vitamine D3 (D3) ont été sélectionnées comme modèles de petits nutraceutiques amphiphiles et hydrophobes, respectivement, et le lysozyme (Lyso), comme ligand protéique de plus grande taille. La capacité de la βlg à lier la RF a été étudiée par des méthodes spectroscopiques. La βlg et la RF forment le complexe βlg-RF dont la photoactivation génère une activité antiproliférative contre les cellules cancéreuses de la peau, démontrée en utilisant le protocole du NCI/NIH Developmental Therapeutics Program. La cytotoxicité serait probablement due à la génération d’espèces oxydatives réactives résultant de l’interaction entre la RF et la βlg. L’impact de la formation du βlg-D3 sur la solubilité et stabilité de la D3 a été étudié en utilisant des méthodes spectroscopiques et de chromatographie. Les résultats ont démontré que le complexe βlg-D3 était stable aux pHs gastrique et intestinal et augmentait la solubilité de la D3. De plus, une matrice protéique appelée coagulum enrichie en D3 (94.5 ± 1.8 % de taux d’encapsulation) été formée à partir du complexe βlg-D3 grâce à l’aptitude de la βlg à s’auto-associer. Les images de microscopie électronique ont montré que les interactions électrostatiques entre la βlg et Lyso ont pour leur part, abouti à la formation de microsphères pouvant encapsuler la D3 à un taux élevé (90.8 ± 4.8 %). La capacité des matrices à base de βlg à transporter, protéger et à améliorer la solubilité, la stabilité et la biodisponibilité de la D3 a été évaluée en effectuant des expériences in vitro et in vivo chez des modèles animaux. Les matrices protéiques à base de βlg ont significativement augmenté la solubilité, stabilité et biodisponibilité de la D3 (p < 0.001). Ces études prouvent que la βlg, grâce à ses caractéristiques suturales, pourrait former des matrices protéiques compatibles avec une administration orale et les aliments, tout en préservant l’activité biologique de la RF, de la D3 et donc possiblement d’autres molécules bioactives / The major whey protein, β-lactoglobulin (βlg) is well recognized for its interesting structural properties and ability to interact with ligands with varying size and characteristics. Riboflavin (RF) and vitamin D3 (D3) were selected as small amphiphilic and hydrophobic nutraceutical models, respectively, and Lysozyme, as a larger size ligand model. Spectroscopic methods were used to demonstrate interaction between βlg and RF. βlg and RF form a complex, which was irradiated according to the NCI/NIH Developmental Therapeutics Program. The βlg-RF complex exhibited an important anti-proliferative activity against skin melanoma cancer cell lines, probably due to the generation of reactive oxygen species as the result of the interaction between RF and βlg. The impact of the βlg-D3 complex on the solubility and stability of the D3 was studied using spectroscopic methods and chromatography. The findings indicate that the βlg-D3 complex is stable at the gastric and intestinal pHs and increases the solubility of the vitamin. A βlg-based scaffold, named coagulum, enriched with D3 (94.5 ± 1.8 % of encapsulation efficiency) was prepared by using the capacity of βlg to self-aggregate. Electronic microscopy images showed that microspheres, with high D3 encapsulation efficiency (90.8 ± 4.8 %), were formed as the result of electrostatic interactions between βlg and Lyso. The efficiency of βlg-based scaffolds to improve the solubility, stability and bioavailability of the D3 was evaluated by performing in vitro and in vivo experiments using animal model. The βlg-based scaffolds significantly increased the solubility, stability bioavailability of D3 (p < 0.001). Overall, the present study showed that βlg, due to its structural properties, can be used to form protein-based matrices compatible with a food and an oral administration while preserving the biological activity of RF, D3 and possibly other bioactive molecules.

La β-lactoglobuline (β-Lg) bovine contient plusieurs séquences peptidiques à activité biologique qui présentent un intérêt à titre d’ingrédients nutraceutiques. Toutefois, des études ont démontré que certains de ces peptides, actifs lors de tests in vitro, sont inefficaces suite à leur ingestion orale chez l’animal, suggérant leur dégradation lors du transit gastro-intestinal. L’objectif de ce travail était d’étudier les interactions β-Lg:peptide bioactif et d’évaluer l’impact de ces interactions sur la digestibilité in vitro des complexes. Premièrement, il a été démontré que l’hydrolyse pepsique et chymotrypsique de certains peptides bioactifs varie en fonction de la longueur de la chaîne peptidique, la nature du peptide et la présence d’autres peptides dans le milieu réactionnel. Par la suite, il a été démontré à l’aide d’une méthode d’ultrafiltration que les peptides β-Lg f102-105, f142-148 et f69-83 se lient en quantité significative à la β-Lg A, avec des taux de fixation de 1.5, 1.1 et 0.7 moles de peptides par mole de protéine respectivement. Ces résultats ont été validés par spectroscopie de fluorescence frontale. Les spectres d’émission de fluorescence ont démontré que la liaison de ces peptides à la β-Lg A modifie l’environnement des résidus tryptophane dans la structure de la protéine. De plus, une analyse par calorimétrie à titration isothermique a démontré que le peptide antihypertensif β-Lg f142-148 se lie à la β-Lg A selon un modèle de liaison séquentielle à trois sites. Pour ce peptide, les isothermes de liaison ont révélé des constantes d’association de 2 X 103, 1 X 103 et 0.4 X 103 M-1 pour le 1ier, 2ième et 3ième site de liaison, avec une enthalpie de liaison exothermique dans le cas des deux premiers sites, mais endothermique pour le troisième site. Enfin, l’hydrolyse in vitro de la protéine et des complexes à l’aide de pepsine, trypsine, chymotrypsine et pancréatine a démontré que le les complexes sont hydrolysés plus lentement que la protéine native par la chymotrypsine ou un mélange pepsine/chymotrypsine. L’ensemble de ces résultats supporte donc l’hypothèse que la liaison de peptides bioactifs à la β-Lg A pourrait permettre d’améliorer leur résistance à la protéolyse et ainsi, maintenir leur intégrité structurale et leur bioactivité lors du transit gastro-intestinal. / Bovine β-lactoglobulin (β-Lg) contains numerous peptide sequences with biological activities, which have a high potential as nutraceutical ingredients. However, studies have demonstrated that some of these peptides, which are active during in vitro tests, loose their activity in animal models following oral ingestion, suggesting their enzymatic degradation during gastrointestinal transit. The aim of this work was to study β-Lg:bioactive peptide interactions and to investigate the in vitro digestibility of the resulting complexes. Firstly, it was shown that pepsic and chymotryptic digestions of some bioactive peptides varied according to the peptide chain length, the nature of the peptide and the presence of other peptides in the reaction medium. Using an ultrafiltration method, it was demonstrated that peptides β-Lg f102-105, f142-148 and f69-83 bind to β-Lg A in significant amounts corresponding to 1.5, 1.1 and 0.7 moles of peptides per mole of protein respectively. These results were validated by front-face fluorescence spectroscopy, which also provided evidences that the binding of the three peptides to β-Lg A modified the polarity of tryptophan environment in the protein structure. In addition, binding isotherms obtained by isothermal titration calorimetry showed that the binding of the antihypertensive peptide β-Lg f142-148 to β-Lg A followed a sequential three-site binding model with constants of associations of 2 X 103, 1 X 103 and 0.4 X 103 M-1 for the 1st, 2nd, and 3rd binding sites respectively. The enthalpy of binding was exothermic for the 1st and 2nd binding sites and endothermic for the 3rd binding site. Lastly, the in vitro digestibility of the protein and the complexes with pepsin, trypsin, chymotrypsin, and pancreatin showed that the complexes were hydrolyzed more slowly than the native protein by chymotrypsin or pepsin/chymotrypsin. The overall results support the hypothesis that the binding of bioactive peptides to β-Lg A could improve their resistance to proteolysis, and thus could contribute to maintain their structural integrity and bioactivity during gastrointestinal transit.

Le peptide f1-8 (Pf1-8) obtenu par hydrolyse trypsique de la β-lactoglobuline a démontré plusieurs caractéristiques d'intérêt. En effet, outre sa capacité d'auto-assemblage et son caractère hydrophobe, il fait partie d'un groupe de peptides (tels que les peptides f9-14, f15-40, f142-148 de la β-lactoglobuline) ayant la capacité de se lier à certaines protéines du lait et de modifier le profil de dénaturation thermique de la β-lactoglobuline, probablement par des interactions hydrophobes avec le noyau hydrophobe de la protéine. Les caséines (CN) représentent à elles seules près de 80% de la totalité des protéines de lait bovin. Leur acidification à pH 4,6 engendre des changements structurels majeurs dans la micelle qui précipite au voisinage du point isoélectrique. L'objectif de ce projet était d'étudier les changements des propriétés physicochimiques des CN micellaires en présence du peptide Pf1-8. Ce peptide a été produit par hydrolyse trypsique d'un isolat de protéines de lactosérum, isolé par ultrafiltration, concentré par osmose inverse et purifié par lavages successifs et par centrifugation (pureté de 91%). Différentes solutions modèles (pH 6,6) avec des ratio CN: Pf1-8 de 1: 1, 5: 1 et 10: 1 (concentrations respectives de 2,5: 2,5, 2,5: 0,5 et 2,5: 0,25 mg / mL) ont été testées. Pour chaque solution dont les pHs variaient de 6,6 à 2,6, la solubilité de la CN, la taille et la potentielle interaction des protéines avec le Pf1-8 ont été déterminées par SEC-HPLC et SDS-PAGE. Aucune précipitation de la CN n'a été observée dans toute la plage de pH testée pour la solution à un ratio de 1: 1. Cependant, pour des échantillons à un ratio de 10: 1 et 5: 1 de CN: f1-8, une précipitation a été observée à pH 4,6. Les analyses par SDS-PAGE et SEC-HPLC ont démontré la formation d'agrégats impliquant le Pf1-8 et une ou plusieurs espèces caséiques pour tous les pHs testés, et une augmentation de la solubilité ainsi qu’une diminution de la taille des CN micellaires. Par conséquent, ces résultats démontrent que le peptide Pf1-8 est capable de modifier les propriétés physicochimiques de la CN, représentant ainsi un stabilisant potentiel des protéines dans les formulations laitières. / The peptide f1-8 (Pf1-8) obtained by tryptic hydrolysis of β-lactoglobulin has demonstrated several characteristics of interest. Indeed, in addition to its capacity for self-assembly and its hydrophobicity, it is part of a group of peptides (such as peptides f9-14, f15-40, f142-148 of β-lactoglobulin) having the ability to bind to some milk proteins (like β-lactoglobulin and α-lactalbumin) and change the thermal denaturation profile, probably by hydrophobic interactions with the hydrophobic core of β-lactoglobulin. Caseins (CNs) alone account for nearly 80% of the total bovine milk protein. Their acidification at pH 4.6 causes major structural changes in the micelle and are precipitated in the vicinity of isoelectric point. The goal of this project was to study the changes in the physicochemical properties of micellar CN in the presence of peptide Pf1-8. This peptide was produced by tryptic hydrolysis of a whey protein isolate, isolated by ultrafiltration, concentrated by reverse osmosis and water washed by centrifugation to purify (91% purity). Different model solutions (pH 6.6) with CN:Pf1-8 ratios of 1:1, 5:1 and 10:1 (respective concentrations of 2.5:2.5, 2.5:0.5, and 2.5:0.25 mg/mL) were tested. For each solution, the solubility of the CN, size by SEC-HPLC, and protein-interaction by SDS-PAGE were determined at various pHs ranging from 6.6 to 2.6. No CN precipitation was observed in the whole range of pH tested for the solution at 1:1 ratio. However, for samples at ratio 10:1 and 5:1 of CN:f1-8, the precipitation was observed at pH 4.6. Analyses by SDS-PAGE and SEC-HPLC demonstrated the formation of aggregates involving Pf1-8 and one or more CNs for all tested pHs, and increase in the solubility, and decrease in the size. Consequently, our results demonstrate that Pf1-8 peptide can modify the physicochemical properties of CN thus representing as a potential protein stabilizer in dairy formulations.

L’hydrolyse enzymatique de la β-lactoglobuline (β-LG) génère un nombre conséquentdepeptides dont certains possèdent desactivités biologiques. Cependant, l’étape d’hydrolyse peut être améliorée en diminuant le temps de réaction tout en générant unrendementpeptidique plus important. Ainsi, plusieurs travauxse sont intéressés à l’utilisation des hautes pressions hydrostatiques (HPH)afin d’engendrer une dénaturation de la β-LG et ainsi accélérer l’étape d’hydrolyse enzymatique et la production de peptides bioactifs. Cependant, les HPHimpactent également surles profils peptidiques par une modification du ratio peptideshydrophiles/hydrophobes. Une telle modification est ainsi susceptible d’avoir une répercussion négative sur les performances de l’ultrafiltration (UF) lors du fractionnement et de la concentration des peptides bioactifs. Par conséquent, ce projetvisaità étudier l’impact d’un prétraitement de la β-LG parlesHPH (400 et 600 MPa, 10 min) sur les performances du procédé d’UFlors de la séparation d’un hydrolysat trypsiquede β-LG. Suite aux étapes d’UF en mode recirculation et concentration, il a été démontré qu’un prétraitement de la β-LG à 400 MPaa permisde générer des hydrolysats dont les abondances peptidiques, y compris celles de certains peptides bioactifs (VAGTWY et ALPMHIR) étaient supérieures comparativement aux autres conditions(0.1 et 600 MPa).Cependant, à 400 MPa, les flux de perméationétaient inférieursde 31%. La désorption peptidique des membranes d’UFa permis d’identifierle peptide antihypertenseur ALPMHIRcomme l’espèce colmatante majeure. Cependant, et spécifiquement à 400 MPa, d’autres peptides chargés négativement ont été caractérisés, notamment VAGTWY (peptide antidiabèteet antioxydant). Par conséquent, bien qu’un prétraitement par les HPH à 400 MPa permette une augmentation des rendements peptidiques, les performances de l’UF sont considérablement réduites. / Enzymatic hydrolysis of β-lactoglobulin (β-LG) generates a large amount of peptide species including some bioactive peptides.However, the stepof protein hydrolysis can be improved by decreasing the digestion time while increasing the peptide yield. Several studies focused on the use of high hydrostatic pressure (HHP) to improve the denaturationof the native β-LG structure and thus to accelerate its enzymatic hydrolysis and yieldof bioactive peptides.Nevertheless, HHP is reported to affect the resulting peptide profiles by modifying hydrophobic/hydrophilic peptides ratiowhich may negatively affect the performance of ultrafiltration (UF) used to fractionate and concentrate bioactive peptides.Therefore, the aim of this project was to evaluate the performances of UF forthe filtration of tryptic hydrolysates generated after pre-pressurization ofβ-LGat 400 and 600 MPafor10min.After hydrolysate fractionation by UF in total recirculation modeand concentration modes, it has been demonstrated that β-LGpre-pressurization at 400 MPainduced the recovery ofhigher peptide relative abundance in the hydrolysates, including several bioactive peptides (VAGTWY and ALPMHIR), compared to other conditions(0.1 and 600 MPa).At the same time, permeate fluxes were 31% lower at 400 MPa. Characterization of peptide desorbedfrom UF membranes has shown that the antihypertensive peptide (ALPMHIR) was identified as the main fouling peptide.However, other negatively charged peptides were specifically identified at 400 MPa, including VAGTWY (an antioxidant and antidiabetic peptide). Consequently, while pre-pressurization of β-LGat400 MPa improved the recoveryof bioactive peptidescompared to other conditions, UF performances were negatively impacteddue to thisHHP pretreatment.

Le but de ce projet était d'étudier l'impact du débit de la solution d'alimentation, de la surface membranaire effective et de la force du champ électrique sur un procédé d'électrodialyse avec membrane d'ultrafiltration pour le fractionnement de peptides issus d'un hydrolysat trypsique de P-lactoglobuline. L'évolution des paramètres électrodialytiques, soit le pH des solutions d'alimentation et de perméation de même que leur conductivité électrique a été suivie. La migration peptidique dans le temps a été quantifiée par spectrophotométrie et qualifiée par RP-HPLC et par spectrométrie de masse. Les résultats ont montré que le débit des solutions n'influençait pas la productivité et que très peu les paramètres électrodialytiques, mais qu'il pouvait moduler la sélectivité du procédé. Il a aussi été montré que l'augmentation de la surface membranaire permet d'augmenter de façon linéaire la productivité du procédé, en ne modifiant pas sa sélectivité. La hausse de la valeur du champ électrique s'est aussi avérée importante pour améliorer la migration peptidique. Le pH et la conductivité des solutions ont aussi été fortement influencés par ces paramètres d'opération. Une bonne combinaison de surface, débit et champ électrique permet d'améliorer la rapidité et la productivité de l’électrodialyse avec membrane d'ultrafiltration pour la séparation sélective de peptides d'hydrolysats protéiques. / The aim of this study was to evaluate the influence of three process parameters (flow rate of the feed solution, effective membrane area, electrical field strength) on electrodialysis with ultrafiltration membrane for the fractionation of peptides from a tryptic P-lactoglobulin hydrolysate. To achieve this, the evolution of electrodialytic parameters such as the pH. of the feed and permeation solutions as well as their electrical conductivity was followed. Peptide migration over time was evaluated by spectrophotometry and the molecular profiles of both solutions were determined by RP-HPLC and mass spectrometry. Results of the first part of the study have shown that the flow rate had no impact on the productivity, a slight influence on the electrodialytic parameters but could modify the selectivity of the process. On the other hand, the increase of the membrane effective area resulted in a linear increase of the peptide concentration in the permeation solution without influencing the selectivity. The raise of the electrical field strength also resulted in an important increase of the productivity of the process. Modification of those parameters also modified the behaviour of pH and conductivity over time. A combination of the optimal flow rate, membrane area and electrical field strength allows to improve the productivity and the speed of electrodialysis with ultrafiltration membrane for the selective fractionation of peptides derived from protein hydrolysates.