A Mycobacterium abscessus subspécie abscessus é um pesadelo quando envolvida em infecção pulmonar que são incuráveis, a despeito do uso de antimicrobianos com atividade in vitro, caso o tratamento não inclua a ressecção cirúrgica da área afetada. É a micobactéria patogência de crescimento rápido mais frequentemente isolada de culturas de sítios pulmonares. Há um número reduzido de opções terapêuticas para o tratamento dessas infecções, e é ainda mais reduzido o número de antimicrobianos que atingem concentrações terapêuticas no compartimento intracelular, em particular no fagossomo. O número limitado de antimicrobianos disponíveis para tratamento apontam a necessidade de determinação do perfil de susceptibilidade frente a antimicrobianos isolados e em combinação, nos compartimentos intra e extracelular. Os objetivos deste estudo foram avaliar: a sensibilidade de M. abscessus estruturadas em biofilmes e presentes no interior dos macrófagos; a ocorrência de sinergismo quando da associação entre fármacos, inibidores de betalactamase e o anti-inflamatório. As combinações entre os antimicrobianos foram apenas indiferente quanto ao FIC e a atividade dos fármacos em biofilme e em macrófagos é bacteriostático. / Mycobacterium abscessus subspecies abscessus is a nightmare when involved in lung infection that is incurable, despite the use of antibiotics with in vitro activity, if the treatment does not include surgical resection of the affected area. It is a MCR - rapidly growing mycobacteria pathogenic most frequently isolated from cultures of lung sites. There are a small number of therapeutic options for the treatment of such infections is further reduced and the number of drugs that reach therapeutic concentrations in the intracellular compartment, particularly in the phagosome. The limited number of antimicrobials available for treatment indicate the need for determining the susceptibility profile against antimicrobials alone and in combination, in the intra and extracellular compartments. The objectives of this study were sensitivity of MCR structured biofilms and present in macrophages, the occurrence of synergism when the association between drugs, beta-lactamase inhibitors and anti-inflammatory. Combinations of antimicrobials were just indifferent and the activity of drugs on biofilms and macrophages was bacteriostatic.

O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrência de cepas de Staphylococcus aureus no ambiente de ordenha, analisar seu perfil genético e a produção de biofilme, provenientes de 10 propriedades localizadas nas regiões de Franca e Ribeirão Preto, estado de São Paulo, Brasil. Foram analisadas 220 amostras de leite individual de vacas positivas no teste CMT (California Mastitis Test), 120 amostras de leite de tanque de expansão, 389 swabs de utensílios e equipamento relacionados com ordenha e 120 swabs de mãos de manipuladores. As coletas de amostras foram realizadas mensalmente durante o período de agosto/2010 a janeiro/2011. Das 849 amostras analisadas, 56 cepas de S. aureus (6,6%) foram isoladas, sendo 12 (5,4%) de leite individual de vacas, 26 (21,6%) de leite de tanque de expansão, 14 (3,6%) de utensílios e equipamentos e 4 (6,9%) de mãos de manipuladores. Os resultados indicam uma baixa prevalência de S. aureus nas propriedades analisadas, não havendo diferença significativa entre as frequências encontradas nas duas regiões analisadas. A técnica de PFGE (pulsed-field gel electrophoresis) permitiu identificar 31 perfis genéticos (pulsotipos), utilizando-se a enzima de restrição SmaI. Nos ensaios de produção de biofilmes em microplaca, 19 (63,3%) de 30 pulsotipos avaliados foram considerados produtores de biofilme. Nos ensaios conduzidos em aço inox, 13 (43,3%, N=30) foram positivos e, para o silicone, não houve produção de biofilme. O elevado percentual de isolados no leite de tanque de expansão evidencia um problema de saúde pública, considerando que no Brasil muitas vezes o leite é consumido sem pasteurização. A ocorrência de pulsitipos de S. aureus formadores de biofilmes indica a persistência do patógeno em diversos pontos no ambiente de ordenha, bem como provável envolvimento dos mesmos com casos de mastite e sua eliminação no leite, ressaltando a necessidade de práticas higiênicas para prevenir a formação de biofilmes nas propriedades estudadas. / The objective of the present study was to evaluate the occurrence of biofilm-producing strains of Staphylococcus aureus in the milking environment from 10 farms located in the regions of Franca and Ribeirão Preto, state of São Paulo, Brazil. Twohundred twenty samples of milk from individual cows previously tested for CMT (California Mastitis Test), 120 samples of bulk tank milk, 389 swabs of equipments and utensils related to milking and 120 swabs of milk\'s handlers hands were analyzed. A total of 56 (6.6%) S. aureus strains were isolated out of 849 samples analyzed, being 12 (5.4%) from milk samples from individual cows, 26 (21.6%) from bulk tank milk, 14 (3.6%) from swabs of equipments and utensils, and 4 (3.3%) from swabs hands of milk\'s handlers. Results indicated a low prevalence of S. aureus in the dairy farms analyzed, and there was no significant difference between the percentages found in the two regions evaluated. On the basis of PFGE results (using SmaI enzyme), 31 profiles (pulsotypes) were found. In the biofilm-production assay using microplates, 19 (63.3%) of 30 pulsotypes tested were considered positive (biofilm producers). For assays conducted in stainless steel, 13 (43.3%) of pulsotypes were biofilm producers, although no pulsotype was able to produce biofilms on the surface of silicon. Results of this trial showed a high percentage of bulk tank milk samples contaminated with S. aureus, hence indicating a public health problem especially in Brazil were milk is often consumed without pasteurization. The occurrence of S. aureus pulsotypes which were also biofilm-producers suggests the persistence of the pathogen in several sites at the milking environment, as well the probable involvement of S. aureus biofilms with mastitis and its excretion in the milk. The need for adoption of hygienic practices to prevent the formation of biofilms of S. aureus in the dairy farms evaluated is stressed.

By growing together in dense communities, microorganisms (microbes) have a huge impact on human life. Microbes also come in a wide variety of shapes, but we have yet to understand the importance of these shapes for community biology. How are multi- species communities, such as biofilms and colonies, affected by the morphologies of constituent cells? Which morphologies might these environments select for in turn? To address these questions, we use individual-based modelling to investigate the effects of cell shape on patterning and evolution within microbial communities. We develop a flexible simulation framework, coupling a continuum model of the biofilm chemical environment to a cellular-level description of biofilm growth mechanics. This modelling system allows competitions between different microbial cell shapes to be simulated and studied, in different community contexts. Our models predict that cell shape can strongly affect spatial structure and patterning within competitive communities. Rod cells perform better at colonising surfaces and the expanding edges of colonies, while round cells are better at dominating the upper surface of a community. Our predictions are supported by experiments using Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa bacteria, and demonstrate that particular shapes can confer a selective advantage in communities. In summary, the work presented in this thesis predicts and examines new mechanisms of self-organisation driven by cell shape, demonstrating a new significance for microbial morphology as a means for cells to succeed in a dense and competitive environment.

Bactérias podem formar comunidades bacterianas sésseis, conhecidas como biofilmes, os quais possuem um grande impacto tanto na indústria, por serem responsáveis pelo entupimento e corrosão de tubulações, quanto na saúde, por serem resistentes ao tratamento com antibióticos. Nos últimos anos, o mensageiro secundário c-di-GMP foi descoberto como um importante regulador nas vias de sinalização envolvidas na capacidade da bactéria alternar entre esses dois fenótipos: livre nadante ou em biofilme. Um dos alvos moleculares de c-di-GMP é FleQ, uma Enhancer binding protein bacteriana (bEBP), que regula a expressão dos genes flagelares de forma dependente do fator σ54, em um processo dependente de ATP. FleQ também atua no controle da transcrição dos genes envolvidos na síntese do exopolissacarídeo PEL, principal constituinte da matriz protetora que reveste o biofilme bacteriano em Pseudomonas aeruginosa, possivelmente em um processo dependente do fator σ70. A atividade de FleQ é regulada pelos níveis de c-di-GMP e por uma segunda proteína, FleN, que se liga diretamente à FleQ. Apesar do papel do complexo FleQ:FleN na regulação do operon pel ter sido estudado, seu efeito na transcrição dos genes flagelares ainda é desconhecido. Para um melhor entendimento do mecanismo regulatório de FleQ, foram resolvidas as estruturas cristalográficas do domínio REC e do domínio AAA+ em seu estado apo e em complexo com ADP, ATPγS e c-di-GMP. Também foi identificado e confirmado o sítio ativo da proteína, as diferentes formas oligoméricas de FleQ, além da proposição de como a atividade da proteína é controlada por FleN. Esses resultados sugerem um mecanismo único na transcrição mediada por uma bEBP não convencional que atua tanto com o fator σ54 e σ70, no qual a oligomerização do complexo FleQ:FleN possui um papel essencial na regulação dos genes flagelares e de formação do biofilme. Estes estudos também levam à hipótese que outras bEBPs, associadas a diferentes fenótipos, podem ser reguladas por c-di-GMP. / Bacteria can form sessile communities known as biofilm, which has a major industrial impact, causing tubing obstruction and corrosion, and in the health, due to its resistance against antibiotic treatment. In recent years, a novel secondary messenger molecule named c-di-GMP has been discovered as a key regulator in signaling pathways related to the bacteria capacity to alternate between two distinct phenotypes: free-swimming cells and biofilm community. One of the molecular targets of c-di-GMP so far identified is FleQ, a bacterial enhancer binding protein (bEBP), which regulates flagellar gene expression in a σ54 dependent mechanism. FleQ acts also controlling transcription of genes involved in PEL exopolysaccharide synthesis, main component of the protective matrix, possibly in a σ70 dependent process. FleQ activity is regulated by a second protein, FleN, which directly interacts with FleQ. Although the role of FleQ:FleN complex in regulating pel operon has been studied, its effect in flagellar gene transcription has not. For a better understanding of FleQ regulatory mechanism, we obtained the crystallographic structure of the REC domain and the AAA+ domain in its apo state and bound to ADP, ATPγS and c-di-GMP. It has also been identified and confirmed c-di-GMP binding site, the distinct oligomers of FleQ, and also proposed a mechanism by which FleN regulates FleQ. These results suggest an unique mechanism in the transcription mediated by an unusual bEBP that acts in conjunction with both σ54 and σ70 factors, in which oligomerization of FleQ:FleN complex has a crucial role in the regulation of flagellar and biofilm formation genes. These studies also lead to the hypothesis that others bEBP, related to distinct phenotypes, may be regulated by c-di-GMP.

Orientador: Elisabeth Loshchagin Pizzolitto / Banca: Jonas Contiero / Banca: Cristina Paiva de Sousa / Resumo: Avaliou-se o perfil de suscetibilidade de Staphylococcus aureus ATCC 6538, Escherichia coli ATCC 25922 e Listeria monocytogenes ATCC 7644, em suspensão e em biofilme formado in vitro, frente à ação dos desinfetantes: ácido iodado, à base de biguanida, à base de quaternário de amônio, à base de ácido peracético e clorado, empregados comumente em indústrias alimentícias brasileiras. As técnicas de microscopia eletrônica de varredura e microbiológica de viabilidade celular foram utilizadas para esta pesquisa. Os resultados demonstraram que as células microbianas em suspensão foram suscetíveis a ação de todos os desinfetantes estudados, não apresentando células viáveis após 10 minutos de tratamento com os desinfetantes. O desinfetante clorado foi o mais eficaz na eliminação das células microbianas em biofilme, proporcionando baixos valores numéricos na contagem das células viáveis e poucas células aderidas à superfície do aço inoxidável após submetido ao tratamento de 10 minutos, enquanto o desinfetante à base de biguanida mostrou ser o menos eficaz na eliminação das células microbianas em biofilme após um tratamento de 10 minutos. A idade do biofilme em horas (24, 75, 120) não mostrou ser um fator influente na resistência das células microbianas aos desinfetantes testados. Comparando-se os resultados da suscetibilidade das células microbianas em suspensão e em biofilme, foi verificado que as células em biofilme são mais resistentes à ação dos desinfetantes. O conjunto dos resultados sugerem uma deficiência de todos os desinfetantes estudados na eliminação de S. aureus, E. coli e L. monocytogenes quando em biofilme. / Abstract: The susceptibility of Staphylococcus aureus ATCC 6538, Escherichia coli ATCC 25922 and Listeria monocytogenes ATCC 7644, in suspension and in biofilm formed in vitro, was studied against the action of disinfectants: iodine, biguanide, quaternary ammonium, peracetic acid and chlorine, commonly used in Brazilian food industries. The scanning electron microscopy and cellular viability techniques were used in this research. The results showed that the microbiological suspension cells were susceptible after 10 minutes of treatment with the disinfectants. The chlorine disinfectant was the most effective against microbiological cells in biofilm, showed low numbers of viable cells and few adhered cells on stainless steel surface after 10 minutes of treatment, while the biguanide disinfectant showed to be the least effective against microbiological cells in biofilm after 10 minutes of treatment. The biofilm age in hours (24, 72 and 120) didn't show to be an influential factor on resistance of microbiological cells to studied disinfectant. The comparison between the results of susceptibility of microbiological suspension cells and microbiological biofilm cells showed that the biofilm cells are more resistant to disinfectants action. The results suggest that the studied disinfectants could not eliminate S. aureus, E. coli and L. monocytogenes biofilms. / Mestre

Bacteria can actively communicate and interact with each other to establish multicellular communities. Many of these processes involve functional differentiation of cells into specialised subpopulations by expression of varying genetic programmes. This leads to division of labour between the arising subpopulations of cells in the community. One type of such community is the biofilm, which is composed of microbial cells enclosed in a biopolymeric matrix. Such biofilms can be formed in a large range of environments from sea beds to animal tissues. Bacillus subtilis is a soil dwelling Gram-positive rod that was shown to closely interact with plants and establish a protective symbiosis by formation of biofilms on the roots. The biofilm matrix synthesised by B. subtilis is composed of the exopolysaccharide, for which the chemical structure is not yet established, and a protein TasA that forms amyloid-like fibres spanning between the cells and anchored to the cells by an accessory protein TapA. A third protein of unknown function, YuaB, has also been shown to be necessary for establishment of a biofilm. However, the mechanism of function for YuaB has not been elucidated. The data presented in this report focus on the role played by YuaB during formation of the biofilm. By analysis of cell differentiation patterns YuaB was shown to be required for maturation of the biofilm. The localisation of YuaB is identified in two “subtypes” of biofilm, a biofilm pellicle floating on the air-liquid interface and complex colonies formed on solid surfaces. This is achieved using a combination of biofilm fractionation combined with Western blotting and a newly developed method for immuno-fluorescent labelling of biofilm proteins. YuaB acts in synergy with the exopolysaccharide and TasA, as both components of the biofilm matrix are synthesised in the absence of YuaB but the biofilm is not made. The initial structural characterisation of YuaB is presented based on in silico predictions and physiological and biophysical analysis of the mutations introduced into the sequence of YuaB. The experimental data is concluded with a hypothesis that YuaB forms a hydrophobic protective layer necessary for support of the structure of the matured biofilm.

Candida glabrata, geralmente comensal, surgiu como uma causa comum de infecções fúngicas graves com risco de morte. Dada a resistência crescente aos azóis, a orientação recente é utilizar as equinocandinas como a primeira escolha para o tratamento de infecções sistêmicas por C. glabrata. No entanto, esta é a primeira espécie de Candida que foi detectada com resistência significativa às equinocandinas. Esta levedura é capaz de colonizar tecidos do hospedeiro, bem como superfícies abióticas (catéteres, próteses) onde desenvolve um crescimento em multicamadas caracterizado como biofilme. A natureza da estrutura do biofilme e os atributos fisiológicos a ele conferidos resultam em uma resistência inerente a agentes antimicrobianos, impactando negativamente na saúde do paciente. Este estudo teve como objetivo a indução in vitro de resistência à anidulafungina em células planctônicas e sésseis de sete cepas sensíveis de C. glabrata, além da verificação do desenvolvimento de resistência cruzada com fluconazol. A indução de resistência foi realizada submetendo as cepas a concentrações sub-inibitórias do antifúngico. A determinação de concentração inibitória mínima através de microdiluição em caldo foi realizada previamente e posteriormente à indução de resistência e, também, para a verificação de resistência cruzada com fluconazol. O método de indução de resistência resultou em cepas fortemente resistentes à anidulafungina, com concentrações inibitórias mínimas variando de 1 a 2 μg/mL. Antes da indução da resistência, as formas planctônica e séssil das cepas eram todas sensíveis ou sensíveis dose-dependente ao fluconazol. Após a indução de resistência à anidulafungina esta sensibilidade ao fluconazol não foi mantida, tornando as cepas resistentes a este antifúngico. Clinicamente, esta resistência cruzada poderia implicar em falha terapêutica ao utilizar o fluconazol em pacientes previamente expostos a concentrações sub-inibitórias de anidulafungina por longos períodos. / Candida glabrata, usually commensal, has emerged as a common cause of serious life threatening fungal infections. Given the increasing resistance to azoles, the recent guidance is to use echinocandins as the first choice for the treatment of systemic infections by C. glabrata. However, C. glabrata is the first species of Candida that has been detected with significant resistance to echinocandins. This yeast is able to colonize host tissues as well as abiotic surfaces (catheters, prostheses) where it develops a multi-layer growth characterized as biofilm. The nature of the biofilm structure and the physiological attributes conferred on it, result in an inherent resistance to antimicrobial agents, negatively impacting the patient's health. This study aimed to induce in vitro resistance to anidulafungin in planktonic and sessile cells of seven sensitive C. glabrata strains, as well as to verify the development of cross-resistance with fluconazole. The induction of resistance was performed by subjecting the isolates to sub-inhibitory concentrations of the antifungal. The determination of minimum inhibitory concentration by broth microdilution was performed before and after induction of resistance and also for fluconazole cross-resistance verification. The resistance induction test resulted in strains strongly resistant to anidulafungin, with minimum inibitory concentrations ranging from 1 to 2 μg mL-1. Prior to induction of resistance, the planktonic and sessile forms of the strains were all sensitive or sensitive dose-dependent to fluconazole. However, after the induction of resistance to anidulafungin, this sensitivity to fluconazole was not maintained, making the strains resistant to this antifungal. Clinically, this cross-resistance could lead to therapeutic failure when using fluconazole in patients previously exposed to sub-inhibitory concentrations of anidulafungin for long periods.

Organismos de mar profundo encontram limitações na disponibilidade de alimentos e exploram enriquecimentos orgânicos esporádicos que chegam ao assoalho oceânico. O objetivo deste trabalho foi descrever a diversidade das comunidades bacterianas associadas a parcelas sintéticas e orgânicas (vértebras de baleia e blocos de madeira) no Espírito Santo, Rio de Janeiro e São Paulo a 3.300 m de profundidade, avaliando a influência dos substratos e da localização geográfica sobre essas comunidades. Foi realizada a extração de DNA e amplificação do gene RNAr 16S para sequenciamento por Illumina Miseq e análises estatísticas pelo Qiime. Os Gêneros dominantes nos substratos sintéticos, madeira e vértebras foram Psychroserpens (Flavobacteriia), Phaeobacter, (Alphaproteobacteria), Desulfobacter, (Deltaproteobacteria), respectivamente. Com base nos resultados obtidos, afirma-se que o tipo de substrato teve maior influência do que a localização geográfica sobre a estrutura das comunidades bacterianas. / Deep sea organisms found limitations in the availability of food and exploit sporadic organic enrichments that reach the ocean floor. The aim of this study was to describe the diversity of bacterial communities associated with synthetic and organic substrate (whale bone and wood blocks) in Espírito Santo, Rio de Janeiro and Sao Paulo to 3,300 m deep, assessing the influence of substrates and location geographical about these communities. 16S rRNA sequencing was performed by Illumina Miseq and statistical analysis by Qiime. The dominant genera in synthetic substrates, wood and vertebrae were Psychroserpens (Flavobacteriia), Phaeobacter (Alphaproteobacteria) and Desulfobacter, (Deltaproteobacteria), respectively. Based on these results, it is stated that the substrate type had greater influence than geographic location on the structure of bacterial communities.

Nos últimos anos, um estilo de vida celular vem ganhando destaque no mundo científico: o biofilme. O biofilme é uma comunidade celular em que as células permanecem aderidas a um substrato e envoltas em uma matriz de biopolímeros. Bactérias no estado de biofilme possuem algumas características alteradas, como o aumento da resistência a antibióticos e a facilidade de troca de genes de resistência, sendo um grande inconveniente na área médica e industrial. O patógeno humano Pseudomonas aeruginosa é uma bactéria gram-negativa causadora de infecções associadas a pacientes que apresentam o sistema imune debilitado, sendo muito comum em casos de fibrose cística. Além disso, P. aeruginosa é um organismo modelo no estudo de formação de biofilme, podendo produzir três tipos distintos de exopolissacarídeos: alginato, PSL e PEL. Devido ao pouco conhecimento do polissacarídeo PEL, a cepa P. aeruginosa PA14 vem sendo amplamente estudada, uma vez que essa é a única cepa em que PEL é o principal polímero responsável pela estabilidade da matriz de polissacarídeos. No processo de produção e exportação de PEL, sete proteínas são necessárias: Pel(A-G). Segundo predições computacionais e comparações com outros tipos de complexos biossintéticos de exopolissacarídeos, um modelo de arranjo molecular das proteínas Pel foi proposto, embora algumas proteínas não possuam uma função bem determinada no processo de síntese de PEL. Nesse contexto, o trabalho buscou estudar as proteínas envolvidas na formação de PEL para a melhor elucidação do mecanismo de ativação, produção e exportação desse polissacarídeo, com destaque para a enzima glicosiltransferase PelF e a investigação de uma possível interação de PelF com a proteína reguladora de produção do polissacarídeo, PelD, e a transportadora de membrana interna, PelG. Foram realizados diversos testes de interação entre PelF, PelG e construções solúveis de PelD por cromatografia de exclusão molecular, crosslinking e pull-down que não apresentaram interações entre tais construções, indicando que frações de membrana de PelD ou outros parceiros de interação podem ser necessários para a formação do complexo de síntese e exportação de PEL da membrana interna. Adicionalmente, mutantes de PelD sítio-dirigidos foram construídos em P. aeruginosa PA14 e tiveram sua capacidade de formação de biofilme avaliadas para investigação do mecanismo de ativação de PelD. A diminuição da formação de biofilme de mutantes de algumas regiões de PelD como a hélice S (resíduos 158-176), o core hidrofóbico ocupado pela hélice S e resíduos que estabilizam a ligação de c-di-GMP nos levou a propor um mecanismo de ativação desse importante regulador proteico de formação de biofilme em P. aeruginosa nunca descrito anteriormente. / In the last years, a cellular lifestyle has been in the spotlight in the scientific world: the biofilm. Biofilm is a cellular community in which cells are attached to a substrate and surrounded by a biopolymeric matrix. Bacteria in a biofilm lifestyle has some altered characteristics, as a higher antibiotics tolerance and facility in resistance genes exchange, turning them into a big problem in medical and industrial fields. The human pathogen Pseudomonas aeruginosa is a gram-negative bacterium which causes infections associated to patients with an impaired immune system, as frequently found in patients with cystic fibrosis. Moreover, P. aeruginosa is a model organism in biofilm formation studies, producing three distinct types of exopolysaccharides: alginate, PSL and PEL. Since there is few information about PEL polysaccharide, the strain PA14 has been broadly studied because this is the unique strain in which PEL is the main polymer that gives stability of the polysaccharide matrix. In the process of PEL production and exportation, seven proteins are required: Pel(A-G). Computational predictions and comparison with other similar exopolysaccharides biosynthetic complexes led to a model of molecular complex of Pel proteins, though some proteins do not have a clear role in the PEL synthesis process. In this context, the work aimed to study the proteins related to PEL synthesis for a better understanding of the mechanism of production and exportation of this polysaccharide, focusing on the glycosyltransferase PelF and the investigation of its possible interaction with PelD, the regulatory protein of the polysaccharide production, and PelG, the putative inner membrane transporter. Several interaction assays were performed with PelF, PelG and soluble constructs of PelD using size exclusion chromatography, crosslinking and pull-down. No interaction was detected, showing that membrane fractions of PelD or other interaction partners can be required to the inner membrane complex of synthesis and export of PEL. Additionally, site-directed mutants of PelD in P. aeruginosa PA14 were constructed to evaluate their biofilm formation ability and investigate PelD activation mechanism. Mutants in regions as S-helix (residues 158-176), hydrophobic core occupied by the S-helix and residues of c-di-GMP stabilization presented a decrease of biofilm formation compared to the wild type strain. Those results allowed us to propose an activation mechanism of this important regulator of biofilm formation in P. aeruginosa never described before.

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