Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2016-10-19T13:18:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 337735.pdf: 10736659 bytes, checksum: 42e8e2ea8991b610be6a882697f3ee00 (MD5) Previous issue date: 2015 / A formação de vasos sanguíneos compreende processos fundamentaisna embriogênese, ocorrendo inicialmente por vasculogênese, seguidapor angiogênese. Falhas no equilíbrio fisiológico entre indutores pró- eantiangiogênicos podem contribuir com processos fisiopatológicos,referidos como doenças angiogênicas. Plantas medicinais como o Cissusverticillata L., sobre a qual foram reportadas ações antirreumática eantiinflamatória; hipoglicemiante; vasoconstrictora e antimitótica, sãoutilizadas pela medicina popular, no Brasil. Foram estudados os efeitosdos extratos foliares aquoso (EACv) e hidroalcóolico (EHCv) dessaespécie sobre a formação de vasos, por meio de ensaios in vivo(embriões de Gallus domesticus e Danio rerio; camundongos adultos daespécie Mus musculus). E in vitro (com células endoteliais da veiaumbilical humana-HUVEC). Os resultados mostram a presença deflavonoides na composição dos extratos, e ação antioxidante (29-59%).In vivo os extratos, isoladamente ou associados a FGFb ou VEGF-A,retardaram o crescimento dos embriões de D. rerio e G. domesticus, enestas espécies inibiram a vasculogênese e a angiogênese nasmembranas vitelínica e corioalantóica. Os extratos isolados não inibirama angiogênese em camundongos adultos, mas nos três modelos aassociação de extratos+FGFb ou VEGF-A foi capaz de reverter o efeitoangiogênico destes fatores. Em células HUVEC os extratos de C.verticillata reduziram a viabilidade celular e o brotamento vascularestimulado por FGFb e VEGF-A. No entanto, a não efetividade sobremecanismos de proliferação, migração, tubulogênese e modulação deVEGFR2, apontam a necessidade de estudos adicionais paradeterminação dos alvos moleculares do EACv e EHCv. É possívelconcluir que estes inibem vasculogênese e angiogênese embrionária, eque tais ações estariam relacionadas à inibição da viabilidade e aobloqueio do brotamento angiogênico sobre células endoteliais, bemcomo à capacidade dos EACv e EHCv de reverterem a potente atividadede fatores de crescimento angiogênicos, verificados no presente estudo.<br> / Abstract : The formation of blood vessels includes fundamental processes inembryogenesis, taking place through the vasculogenesis, followed ofangiogenesis. Failures in the physiological balance between pro- andantiangiogenic inductors can contribute to pathophysiological processesreferred as angiogenic diseases. Medicinal plants such as Cissusverticillata L. have been reported are used in folk medicine in Brazil asantirheumatic, anti-inflammatory hypoglycemic, vasoconstrictor andantimitotic actions. The effects of aqueous (AECv) and hydroalcoholic(HECv) leaf extracts of C. verticillata on the blood vessels formationwere studied by assaying in vivo (of Gallus domesticus and Danio rerioembryos as well in adults mice of Mus musculus). In vitro, assays withendothelial cells from human umbilical vein (HUVEC) experimentalmodels. The findings show the presence of flavonoids in both extractscomposition and also an antioxidant action (29-59%). Whenadministered in vivo the extracts, alone or associated with FGF orVEGF-A, have slowed the embryonic growth of D. rerio and G.domesticus, and (in this last species) inhibited vasculogenesis andangiogenesis in the yolk and chorioallantoic membranes. The extractsalone did not inhibited advanced angiogenesis, in M. musculus adults,however, in the three animal models the association of extracts + FGFbor VEGF-A was capable to reverse the angiogenic effect of theseexogenous growth factors. There was verified a decrease in cell viabilityand the vascular sprouting as stimulated by FGFb and VEGF-A, inHUVEC. However, the non-effectiveness of important angiogenicmechanisms, such as proliferation and cell migration; tubulogenesis andVEGFR2 receptor modulation, indicate that more studies in order todetermine the molecular targets of the extracts remains to be performed.In conclusion, the findings show that the extracts inhibit embryonicvasculogenesis and angiogenesis, and also that such actions are possiblyrelated with decrease of viability and the blockade of angiogenicsprouting on the endothelial cells, as well the capacity of both extracts toreverse the potent activity of angiogenic growth factors, as observed inthe present study.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento, Florianópolis, 2016. / Made available in DSpace on 2017-02-07T03:11:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 343951.pdf: 2276017 bytes, checksum: 73222d91ce2239bad67a45177bcd46ac (MD5) Previous issue date: 2016 / Os estudos dos mecanismos moleculares do desenvolvimento em crustáceos são importantes para entender a diversidade morfológica deste grupo. No entanto, poucos estudos foram realizados, se consideramos a diversidade deste grupo. Dentre os camarões de água doce, Macrobrachium olfersii surge como um modelo potencial para estudos de desenvolvimento e de toxicidade. Porém, os mecanismos moleculares durante o desenvolvimento ainda não foram descritos, pois poucas sequências são conhecidas nesta espécie. Neste contexto, o presente estudo teve os seguintes objetivos: 1) identificar transcritos com a finalidade de gerar um banco de sequências e contribuir no entendimento dos mecanismos moleculares nesta espécie; 2) identificar transcritos de genes relacionados ao desenvolvimento, em especial os genes Hox e genes de segmentação; 3) e analisar os níveis de seus transcritos durante o desenvolvimento embrionário de M. olfersii. Uma montagem de novo a partir de 25,6 milhões de reads e análise transcriptômica de pool de embriões (E4-E8) proporcionou 99.751 unigenes. Do total, 20,95% foram similares às sequências do banco de dados GenBank. Uma diversidade de transcritos foi classificada por ontologia gênica (21.845 unigenes) e em 129 vias (6.866 unigenes) do KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes). Os transcritos de genes codificados pelo DNA mitocondrial (22 tRNA, 2 rRNA e 13 genes codificantes de proteínas) também foram identificados. Na análise do transcriptôma utilizando ontologia gênica, 2.142 unigenes foram classificadas na categoria de processos do desenvolvimento e 553 unigenes na subcategoria do desenvolvimento embrionário, cujas sequências foram mais similares aos artrópodes Zootermopsis nevadensis e Limulus polyphemus. Além disso, os transcritos de genes do padrão ântero-posterior, do padrão dorso-ventral, de vias de sinalização envolvidas no desenvolvimento (TGF-ß, Wnt, Notch, MAPK, Hedgehog, Jak-STAT, VEGF) e dos receptores nucleares induzíveis por ecdiesteróides foram identificados. Através da PCR com iniciadores degenerados foram identificados transcritos dos genes Hox (Lab, Dfd, Antp, Ubx, AbdA, AbdB), genes de segmentação (Eve e Wg) e da família Wnt (Wnt2, Wnt4, Wnt5, Wnt7, Wnt11). Estes resultados indicam que os mecanismos moleculares em M. olfersii podem ser similares a outros crustáceos estudados. Além disso, parálogos dos genes En (En1 e En2) e Eve (Eve1 e Eve2) foram identificados, sendo que os de Eve foram pela primeira vez identificados em crustáceos. Ainda, isoformas de En (En1a e En1b) e de 4 genes Hox (Dfd1a e Dfd1b, Scr1a e Scr1b, Ubx1a e Ubx1b, AbdA-1a e AbdA-1b) foram identificados provavelmente resultantes de splicing alternativo. Para analisar os níveis de transcritos de genes Hox e de segmentação no desenvolvimento, primeiramente foi avaliada a estabilidade de 6 genes de referência utilizando programas computacionais e qPCR. A expressão dos genes Rpl8 e Rps6 foi mais estável durante o desenvolvimento e nos tecidos de animais adultos, respectivamente. Enquanto que, a expressão dos genes Gapdh e Ef-1a foi menos estável no desenvolvimento. Os genes Rpl8 ou Rps6 e suas combinações são mais indicados para serem utilizados como genes de referência, na análise durante o desenvolvimento, por RT-qPCR. Da análise dos níveis de transcritos de genes relacionados ao desenvolvimento, os transcritos de 3 genes Hox (Lab, Dfd e Ftz) diminuíram com o avanço do desenvolvimento, enquanto que os transcritos de 6 genes Hox (Pb, Scr, Antp, Ubx, AbdA e AbdB) aumentaram com o avanço do desenvolvimento, o que estaria relacionado com a função da identidade dos segmentos da cabeça, tórax e abdome. Os genes En1, En2 e Eve2 estariam relacionados com a segmentação, aumentando seus transcritos com a formação de novos segmentos do corpo durante o desenvolvimento. Enquanto que, os transcritos do gene Eve1 diminuíram, o que estaria relacionado com uma função em estágios mais inicias. No entanto, En e Eve também poderiam participar na neurogênese similar a outros artrópodes estudados. Os genes Wg e Hh funcionariam como genes de polaridade segmentar mantendo seus níveis de transcritos similares com o avanço do desenvolvimento. Os níveis de transcritos do gene Dll foi similar entre os estágios e estaria envolvido na formação dos apêndices durante o desenvolvimento como acontece em outros crustáceos. Assim, o presente estudo contribuiu com a primeira identificação em larga escala de transcritos presentes em embriões de M. olfersii, em especial os transcritos de 9 genes Hox e de outros genes relacionados ao desenvolvimento. Além disso, proporciona informação da avaliação de genes de referência para análises de qPCR nesta espécie, que permitirá resultados mais precisos para entender os mecanismos moleculares durante o desenvolvimento embrionário. Da mesma forma, a identificação destas sequências em M. olfersii contribuirá para futuros estudos em diferentes linhas de pesquisa e poderá ainda servir como referência para identificar genes em outros camarões de água doce. <br> / Abstract : Studies of the molecular mechanisms of development in crustaceans are important to understand the morphological diversity of this group. However, few studies have been conducted if we consider the diversity of this group. Among the freshwater prawns, Macrobrachium olfersii emerges as a potential model for development and toxicity studies. However, the molecular mechanisms during development were not described because few sequences are known in this species. In this context, this study had the following objectives: 1) to identify transcripts in order to generate a sequence data bank and contribute to the understanding of the molecular mechanisms in this species, 2) to identify transcripts of gene related to the development, in particular Hox genes and segmentation gene, and 3) analyze the levels of their transcripts during embryonic development of M. olfersii. De novo assembly from 25.6 million reads and transcriptomic analysis of embryos pool (E4-E8) provided 99.751 unigenes. Of the total, 20.95% were similar to sequences of GenBank database. A diversity of transcripts were classified by gene ontology (21.845 unigenes) and 129 KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) pathways (6.866 unigenes). The transcripts of genes encoded by mitochondrial DNA (22 tRNA, 2 rRNA and 13 protein-coding genes) were also identified. In the transcriptome analysis using gene ontology, 2,142 unigenes were assigned to the development processes category and 553 unigenes in embryonic development subcategory, whose sequences were more similar to the Zootermopsis nevadensis e Limulus polyphemus arthropods. Furthermore, transcripts of anterior-posterior pattern genes, of dorsal-ventral pattern genes and signaling pathways involved in the development (TGF-ß, Wnt, Notch, MAPK, hedgehog, Jak-STAT VEGF) and ecdysteroid-inducible nuclear receptors were identified. Moreover, by PCR with degenerate primers were identified transcripts of Hox genes (Lab Dfd, Antp, Ubx, AbdA, AbdB), segmentation genes (Eve and Wg) and Wnt family (Wnt2, Wnt4, Wnt5, Wnt7, Wnt11). These results indicate that the molecular mechanisms in M. olfersii could be similar to other crustaceans studied. Moreover, paralogs of genes En (En1 and En2) and Eve (Eve1 and Eve2) were identified, and the Eve paralogs were first identified in crustaceans. In addition, isoforms of En (En1a and En1b) and of 4 Hox genes (Dfd1a and Dfd1b, Scr1a and Scr1b, Ubx1a and Ubx1b, AbdA-1a and AbdA-1b) were identified probably resulting from alternative splicing. To analyze transcript levels of Hox genes and segmentation genes in development, it was first evaluated the expression stability of reference genes using computer programs and qPCR. Expression of Rpl8 and Rps6 genes was more stable embryonic development and in the adult animal tissues, respectively, whereas the expression of Gapdh and Ef-1a genes was less stable in development. Rpl8 and Rps6 genes or its combinations are most appropriate for use as reference gene for RT-qPCR analysis in development. In the analysis of transcript levels of genes related to the development, the transcripts of 3 Hox genes (Lab, Dfd and Ftz) decreased and the transcripts 6 Hox genes (Pb, Scr, Antp, Ubx, AbdA and AbdB) increased its expression with the progress of the development, which is related to its function in the identity of the segments of the head, thorax and abdomen. The genes En1, En2 and Eve2 would be related to the segmentation, increasing its transcripts with formation of new segments of the body during the development. Whereas the transcripts of Eve1 gene decreased that would be related to a function in most early stages. However, En and Eve could also participate in neurogenesis similar to other arthropods studied. The Wg and Hh gene would function as segment polarity genes, maintaining similar their transcript levels with the progress of development. The transcript levels of gene Dll was very similar between the stages and would be involved in the formation of appendages during development as in other crustaceans studied. Thus, this study contributed with the first large-scale identification of transcripts in M. olfersii embryos, in particular transcripts of 9 Hox genes and other genes related to development. It also provides information of the reference genes evaluation for qPCR analysis in this species, allowing more accurate results to understand the molecular mechanisms during embryonic development. In addition, the identification of these sequences in M. olfersii will contribute in future studies in different lines of research and could serve as a reference to identify genes in other freshwater prawns.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento, Florianópolis, 2016. / Made available in DSpace on 2017-02-07T03:14:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 343972.pdf: 2649254 bytes, checksum: fd64b01fedb1c00ade7f63f898892b65 (MD5) Previous issue date: 2016 / Proteínas relacionadas ao fibrinogênio (FREPs) compreendem uma grande família gênica envolvidas no reconhecimento microbiano e atuam em muitas funções biológicas nos animais vertebrados e invertebrados. Pesquisas em banco de dados de sequências não anotadas (EST) apresentaram uma sequência homóloga de FREP-like de L. vannamei denominada no presente estudo como LvFrep. A sequência obtida possui um domínio conservado relacionado com o fibrinogênio (FReD) e apresenta similaridade com as proteínas FREP-like de outros invertebrados e ficolinas de crustáceos. A expressão de LvFrep mostrou-se majoritária nos hemócitos circulantes e foi constitutivamente expresso nos hemócitos de camarões apenas em resposta a uma infecção por Vibrio harveyi, mas não para o vírus da síndrome da mancha branca (WSSV). Além disso, níveis transcricionais de LvFrep foram detectados no início do desenvolvimento, desde os ovos fertilizados, sugerindo que este gene relacionado a imunidade possa participar nas defesas antimicrobianas durante o desenvolvimento do camarão.<br> / Abstract : Fibrinogen-related proteins (FREPs) comprise a large family of microbial recognition proteins involved in many biological functions in both vertebrate and invertebrate animals. By taking advantage of publicly accessible databases, we have identified a FREP-like homolog in the most cultivated penaeid shrimp, Litopenaeus vannamei (LvFrep). The obtained sequence showed a conserved fibrinogen-related domain (FReD) and displayed significant similarities to FREP-like proteins from other invertebrates and to ficolins from crustaceans. The expression of LvFrep appeared to be limited to circulating hemocytes. Interestingly, LvFrep gene expression was induced in shrimp hemocytes only in response to a Vibrio infection but not to the White spot syndrome virus (WSSV). Moreover, LvFrep transcript levels were detected early in fertilized eggs, suggesting the participation of this immune-related gene in the antimicrobial defenses during shrimp development.

Orientador : Prof. Dr. Alexander W. Biondo / Orientador : Prof. Albert Icksang Ko / Coorientador : Prof. Dr. Marco Aurélio Krieger / Coorientador : Dr. Alex Hoffmaster / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 27/02/2012 / Inclui referências : f. 150-169 / Resumo: cuja sintomatologia é inespecífica. Humanos desenvolvem formas graves de leptospirose e os métodos diagnósticos atuais não são eficazes para a detecção precoce da doença. O uso de um método de PCR em tempo real pode permitir o diagnóstico precoce e a quantificação das bactérias em amostras clínicas; além da quantificação do risco ambiental em amostras de água. Foi demonstrado que o método permite a detecção das leptospiras em amostras de sangue total coletadas nos primeiros seis dias de doença, após os quais a carga bacteriana decai de modo inversamente proporcional ao título de anticorpos. O limite mínimo de detecção foi estimado em 280 GEq/mL. O ponto de corte prognóstico foi estimado em 159 GEq/mL para o desenvolvimento de LPHS, com sensibilidade de 64,3% (IC 95% 35,1-87,2%), especificidade de 68,8% (IC 95% 62,8-74,3%) e acurácia 68,0%. Para óbito, o ponto de corte prognóstico foi definido em 1.181 GEq/mL, com sensibilidade de 76,5% (IC 95% 50,1-93,2%), especificidade de 89,3% (IC 95% 85,0-92,8%) e acurácia de 88,3%. A seleção do kit para extração do DNA e estabelecimento de parâmetros de concentração, volume inicial de amostra e limite mínimo de detecção permitiu a adaptação do método de qPCR para a quantificação das leptospiras em amostras ambientais. O método adaptado foi validado em estudo conduzido com amostras ambientais coletadas na comunidade de Pau da Lima, em Salvador (Bahia, Brasil). Os resultados apontaram maior positividade entre as amostras coletadas em baixa altitude (50% das amostras positivas), bem como entre as amostras coletadas pela manhã em comparação com a tarde (17,7% vs. 5,8%). A positividade foi maior entre amostras de esgoto do que entre amostras de água empoçada (17,7% vs. 5,6%). Também houve diferença de positividade entre as amostras coletadas nos períodos úmido e com umidade intermediária (16,0% vs. 9,7%). Assim, concluímos que o método de qPCR é uma ferramenta útil para o diagnóstico e avaliação prognóstica em pacientes com suspeita clínica de leptospirose. O método também foi eficaz na identificação de possíveis focos de infecção a partir da avaliação de amostras de água coletadas em área endêmica. Palavras-chave: Leptospira, leptospirose, PCR em tempo real, sangue total, carga bacteriana, prognóstico, amostra ambiental de água. / Abstract: are non-specific. Humans develop severe forms of leptospirosis and the current diagnostic methods are not suited for the early diagnosis of the disease. The use of a real-time PCR method allowed for an early diagnosis and bacterial quantification in clinical samples, as well as quantification of environmental burden in water samples. It has been shown that this method allows for the detection of leptospires in whole blood samples obtained during the first six days of illness, after which the bacterial load decrease is inversely proportional to the raise in antibody titer. The lower limit of detection was estimated to be 280 GEq/mL. The prognostic threshold was estimated at 159 GEq/mL for the development of LPHS, with sensitivity of 64.3% (95% CI 35.1- 87.2%), specificity of 68.8% (95% CI 62.8-74.3%) and accuracy of 68.0%. For death, the prognostic threshold was set at 1.181 GEq/mL, with sensitivity of 76.5% (95% CI 50.1-93.2%), specificity of 89.3% (95% CI 85.0-92.8%) and accuracy of 88.3%. Selection of the commercial kit for DNA extraction, and establishment of concentration parameters, initial sample volume and lower limit of detection led to the adaption of the qPCR method to allow for the quantification of leptospires in environmental samples. The adapted method was validated in a study conducted with environmental samples collected in the slum community of Pau da Lima, in Salvador (Bahia, Brazil). Results showed a higher positivity for samples collected at low altitudes (positivity of 50%), as well as for samples collected in the morning when compared to those collected in the afternoon (17.7% vs. 5.8%). Positivity was also higher for sewage than for puddle water (17.7% vs. 5.6%). There was also difference in positivity for samples collected during the wet season when compared to those collected during the period with intermediate humidity (16.0% vs. 9.7%). Therefore, we conclude that the qPCR method is a useful tool for the diagnosis and prognostic evaluation of patients with a clinical suspicion of leptospirosis. The method was also reliable in identifying possible infection sites through the evaluation of water samples collected from an endemic area. Keywords: Leptospira, leptospirosis, real time PCR, whole blood, bacterial load, prognosis, environmental water sample.

Orientadora : Profª. Drª. Andrea Senff Ribeiro / Coorientador : Prof. Dr. Silvio Sanches Veiga / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 27/02/2017 / Inclui referências : f. 73-83 / Resumo: O tumor do tipo melanoma da pele apresenta baixa incidência contudo, sua letalidade é extremamente elevada. As linhagens B16 constituem um modelo de melanoma murino muito útil na oncologia experimental. A linhagem B16F10 apresenta alta capacidade de invasão e metastização enquanto que a linhagem B16-F1 apresenta menor motilidade in vitro e, portanto, baixo potencial metastático. A TCTP (Translationally Controlled Tumor Protein) é expressa em diversos organismos e tecidos, o que aponta um papel biológico fundamental. Diferentes estudos já estabeleceram seu envolvimento na regulação do ciclo e proliferação celular, bem como na malignidade e como fator protetor contra estresse e apoptose. Dessa forma, o objetivo desse trabalho foi avaliar o papel da TCTP em melanoma murino (B16F1 e B16F10). O perfil proteico bidimensional apresentado pelas linhagens foi diferente: a linhagem B16-F10 apresentou 201 spots e a linhagem B16-F1 126 spots. Essa diferença pode estar relacionada à complexidade celular da B16-F10, mais maligna e metastática. Em ambos os extratos foi identificada uma proteína com mobilidade eletroforética de 20 kDa e pI de 4,8 (valores esperados para TCTP). Além disso, a TCTP foi imunodetectada por western blotting. A linhagem B16- F1 apresentou um menor sinal de detecção quando comparada à B16-F10., Essa diferença poderia estar associada a uma maior expressão de TCTP em células tumorais mais metastáticas e invasivas e, consequentemente, a B16F10 apresentaria níveis superiores de TCTP. Esta hipótese foi confirmada por PCR em tempo real: B16-F10 apresentou níveis de RNAm para TCTP superiores aos encontrados para B16-F1. Esses dados corroboram com os resultados do western blotting e com dados da literatura que relacionam a TCTP à linhagens malignas, devido ao seu papel anti-apoptótico e seu antagonismo com a p53. A fim de avaliar o papel biológico da TCTP no melanoma, esta foi silenciada na linhagem B16-F10, utilizando a técnica de RNAi. O silenciamento diminuiu os níveis de TCTP em 50 a 70% quando utilizado 50 nM e 60 a 80% quando utilizado 100 nM do duplex após 24, 48 e 72 horas de transfecção. As linhagens transfectadas com RNAi para TCTP apresentaram menor proliferação, menor migração e maior adesão celular às moléculas da matriz extracelular quando comparadas às linhagens transfectadas com o controle negativo. Porém, não houve qualquer alteração significativa da viabilidade celular. O aumento da proliferação celular e do potencial migratório são dois eventos muito importantes para a tumorigênese, e estão intimamente relacionados à malignidade. Portanto, o silenciamento foi capaz de regredir o fenótipo de malignidade da linhagem B16-F10, deixando esse mais próximo da B16-F1. Dessa forma, nosso estudo caracterizou os perfis celulares das duas linhagens e demonstrou uma diferença no número de proteínas e parceiros moleculares entre ambas linhagens. Além disso, nossos dados sugerem que o silenciamento da TCTP tornou a linhagem B16-F10 menos metastática e maligna, com um fenótipo mais próximo ao de uma célula normal. Mais estudos são necessários com o intuito de identificar possíveis parceiros e melhor entender o papel dessa proteína multifuncional no melanoma murino. Palavras-chave: TCTP, melanoma, B16-10, B16-F1, câncer / Abstract: Skin melanoma tumor displays low incidence, however, its lethality is extremely high. B16 cell lines typify a murine melanoma model very useful on the experimental oncology field. B16-F10 cell line exhibits high invasion and metastization capacities while B16-F1 cell line depicts lower in vitro motility and, therefore, low metastasis potential. TCTP (translationally controlled tumor protein) is expressed in several organisms and tissues, which suggests a fundamental biological role. Different studies have already settled its participation in cell cycle regulation and cell proliferation, as well as in malignancy and as a protective factor against stress and apoptosis. Thus, this study aimed to assess the TCTP role in in murine melanoma (B16-F1 and B16- F10). Two-dimensional electrophoresis profiles of proteins from the two cell lines were different: B16-F10 cells presented 201 electrophoresis spots while B16-F1 originated 126 spots. This difference may be related to the B16-F10 cell complexity, since this cell line is more malignant and metastatic. In both cell extracts was identified a protein with electrophoretic mobility about 20 kDa and deduced pI of 4.8 (expected parameters for TCTP). Furthermore, TCTP was immunodetected by western blotting analysis. B16-F1 cells produced low detection signals when compared to the B16-F10 cells. This difference may be associated to the higher TCTP expression in more metastatic and invasive tumoral cells and, consequently, B16-F10 would present higher TCTP levels. This hypothesis was confirmed by Real-Time PCR, since B16-F10 revealed RNAm levels for TCTP higher than the B16-F1. These data corroborate with western blotting results and the specific literature, which connect TCTP and malignant cell lines due to the anti-apoptotic function and its p53 antagonism. In order to evaluate the biological role of TCTP in melanoma, it was performed the TCTP silencing in B16-F10 cell line by using RNA interference (RNAi) method. The gene silencing reduced TCTP levels in 50% to 70% when used 50 nM and 60% to 80% when used 100 nm of the duplex after 24, 48 and 72 hours of transfection. The transfected cell lines with RNAi for TCTP presented lower proliferation, lower migration and higher cell adhesion to extracellular matrix molecules when compared to the cell lines transfected with negative control. However, there was no significant change in cell viability. Increasing cell proliferation and migration potential are two events very important for the tumorigenesis process and they are closely related to the malignancy. Therefore, gene silencing was able to recede the malignant phenotype of B16- F10 cell line, resulting in a similar aspect to the B16-F1 cells. Thus, this study characterized the profile of two cell lines and it demonstrated differences in protein number and molecular partners between these two cell lines. Moreover, the generated data suggest that TCTP gene silencing became B16-F10 cells less metastatic and malignant, resembling the normal cell phenotype. Further studies are necessary in order to identify possible partners and to better understand the TCTP role in the murine melanoma. Key-words: TCTP, melanoma, B16-10, B16-F1, cancer.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2017. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2018-04-09T20:12:20Z No. of bitstreams: 1 2017_DanielaCarrilhodeJesus.pdf: 5106356 bytes, checksum: 57fd4c08be8f1f54edf8e2e5d3799eae (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-04-17T19:54:52Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_DanielaCarrilhodeJesus.pdf: 5106356 bytes, checksum: 57fd4c08be8f1f54edf8e2e5d3799eae (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-17T19:54:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_DanielaCarrilhodeJesus.pdf: 5106356 bytes, checksum: 57fd4c08be8f1f54edf8e2e5d3799eae (MD5) Previous issue date: 2018-04-17 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). / O conhecimento a respeito de complexas redes de comunicação e interação celular alcançou muitos avanços graças a estudos de fluorescência aplicados à biologia das células. Embora muito progresso tecnológico empregado no imageamento celular tenha sido alcançado, os fluorocromos continuam desempenhando papel central para análises de condições fisiológicas e patológicas. O desenvolvimento de agentes fluorescentes é um processo laborioso que visa a criação de moléculas providas simultaneamente de diversas características favoráveis, tais como, amplos desvios de Stokes, altos coeficientes de extinção molar, permeabilidade a membranas celulares, ausência de citotoxicidade e alta especificidade. Moléculas derivadas do núcleo fluorescente benzotiadiazol (BTD), por apresentarem muitos desses aspectos, encontram várias aplicações no âmbito do imageamento celular. Neste contexto, o presente trabalho inicia uma série de aplicações em modelos biológicos de duas estruturas inéditas derivadas de BTD. O fluoróforo 2,1,3- benzotiadiazol triazol galactose, ou G2, e a molécula 2,1,3- benzotiadiazol triazol xilose, ou X2. Algumas linhagens tratadas com os compostos apresentaram considerável redução de viabilidade celular. Esse fato revelou ação citotóxica dos fluorocromos para determinados tipos de células, o que dificulta aplicações dessas moléculas em células vivas. Contudo os resultados de aplicações em diferentes modelos biológicos fixados foram excelentes para a sonda G2. Esta apresentou alta especificidade, sinal fluorescente intenso e ausência de marcação de fundo. Sabe-se que a recomendação de sondas fluorescentes apenas para material fixado é um aspecto comum a muitos marcadores de referência no mercado. Já o fluoróforo X2 não teve sua especificidade definida pois apresentou possíveis marcações em organelas como complexo de golgi, lisossomos, vesículas do sitema endossomal entre outras. Contudo, a partir de estudos de comarcação com Lysotracker (específico para organelas ácidas), de experimentos em C. elegans e de ensaios utilizando um sistema “baculovírus – células de inseto” foi observada certa preferência do composto por organelas ácidas ou organelas com alta quantidade de membranas, levando-nos também à hipótese de que o X2 possui afinidade por um tipo / um grupo de fosfolipídios. O composto G2 apresenta especificidade para corpúsculos lipídicos. Esta constatação ficou bem determinada através de estudos de comparação ou de colocalização em diferentes modelos, como células de insetos e C. elegans, com os corantes de referência para essas organelas: Oil Red O e BODIPY®. Também demonstramos que esta sonda é eficaz para avaliar dinâmica de lipídios, para isso utilizamos o sistema “baculovírus – células de inseto” em conjunto com o composto G2. Os resultados levaram a hipótese de que o G2 pode marcar um grupo mais seleto entre os lipídios, em comparação ao marcador BODIPY®. Por fim, este trabalho fundamenta a proteção intelectual e posterior divulgação da sonda G2 e ainda traz novos esclarecimentos para melhorias da molécula X2. / The knowledge about cellular communications and complexes networks interactions has been constantly developing thanks to fluorescence studies applied to cell biology. Although a good technological progress has been achieved in cell imaging, fluorochromes continue to play a central role in the analysis of physiological and pathological conditions. The development of fluorescent dyes is a difficult process, which aims create molecules provided simultaneously with several favorable characteristics. This physical or chemical features include wide Stokes shift, high molar extinction coefficients, permeability to cell membranes, absence of cytotoxicity and high specificity. The fluorescent molecule benzothiadiazole (BTD) have been used as a core in the synthesis of fluorophores that usually presents the chemical and physical mentioned characters and have a large of applications in the field of cellular imaging. In this context, the present work initiates a series of applications in biological models of two unpublished structures derived from BTD. The fluorophore 2,1,3-benzothiadiazole triazole galactose, or G2, and the molecule 2,1,3-benzothiadiazole triazole xylose, or X2. Some cell lines treated with the compounds presented considerable reduction of cell viability. This fact revealed cytotoxic action of the fluorochromes for certain cell types, which makes it difficult to apply these molecules to living cells. However, the results of applications in different fixed biological models were excellent for the G2 probe. This showed high specificity, intense fluorescent signal and absence of background. For this reason, the G2 is a fluorophore with potential for commercial application, even if it is only used in fixed materials. But the fluorophore X2 did not have its specificity determined because it showed possible labeling in vesicles of the endosomal system, lysosomes, Golgi complex and other organelles. However, studies of colocalization between X2 and Lysotracker (which one is specific for acidic organelles), experiments in C. elegans and assays using a system "baculovirus - insect cells" revealed a certain preference of the compound by acidic organelles or organelles with a high amount of membranes, leading us to hypothesize that X2 has affinity for a type or a group of phospholipids. The fluorophore G2 has specificity for intracellular lipid droplets. This finding was well determined through comparative studies or fluorescence colocalization in different models, such as insect cells and C. elegans, using the specific dyes for these organelles: Oil Red O and BODIPY®. We also demonstrated that this probe is effective for evaluation of lipid dynamics, for which we use the "baculovirus - insect cells" system together with the compound G2. The results led to the hypothesis that G2 are selecting a group within the lipids, in comparison to the BODIPY® dye. Finally, this work bases the intellectual protection and subsequent disclosure of the G2 probe and still brings new clarifications for improvements of the molecule X2.

As fosfodiesterases do tipo 2A (PDE2A) hidrolisam os nucleotídeos cíclicos cAMP e cGMP e por isso desempenham papel importante na sinalização intracelular. PDE2A é composta por uma região N-terminal, que ao contrário de outras famílias de PDEs, não possui função conhecida, dois domínios regulatórios, GAF A e GAF B, e um domínio catalítico localizado na porção C-terminal. Sabe-se que a hidrólise dos nucleotídeos cíclicos, pela PDE2A, é ativada pela ligação de cGMP ao domínio regulatório GAF B. Em uma triagem dois híbridos, identificamos XAP2 como a principal proteína interatora de PDE2A. XAP2 é um componente crucial do complexo multiprotéico do receptor Aril hidrocarboneto (Ahr), o principal fator de transcrição que controla a expressão de múltiplos genes envolvidos em detoxificação. Neste trabalho, foi determinado que XAP2 liga o domínio GAF B da enzima PDE2A. Ensaios de atividade fosfodiesterásica, utilizando proteínas purificadas, mostram que a ligação de XAP2 não interfere na atividade enzimática de PDE2A. Para analisar se PDE2A afeta a função de XAP2, foi investigado o deslocamento de Ahr para o núcleo. Sabe-se que a regulação da expressão dos genes alvos de Ah é iniciada pela ligação de tetraclorodibenzodioxina (TCDD) e por uma via, ainda pouco entendida, dependente de cAMP. Verificamos que a ligação de PDE2A à XAP2 inibe o deslocamento de Ahr para o núcleo, induzido por TCDD e por cAMP em células hepáticas Hepa1c1c7 em cultura. Em conclusão, mostramos neste trabalho que XAP2 recruta PDE2A para o complexo Ahr, causando a inibição da mobilidade de Ahr, possivelmente pela redução local da concentração de cAMP. Esses dados suportam o papel de cAMP no controle da função de Ahr. / Phosphodiesterase type 2A (PDE2A) hydrolyzes cyclic nucleotides cAMP and cGMP thus efficiently controlling cNMP-dependent signaling pathways. PDE2A is composed of an N-terminal region, two regulatory GAF domains and a catalytic domain. Cyclic nucleotide hydrolysis is known to be activated by cGMP binding to GAF-B, however, other mechanisms may operate to fine-tune local cyclic nucleotide levels. In a yeast-two-hybrid screening we identified XAP2, a crucial component of the aryl hydrocarbon receptor (AhR) complex, as a major PDE2A-interacting protein. We mapped the XAP2 binding site to the GAF-B domain of PDE2A. PDE assays with purified proteins showed that XAP2 binding does not change the enzymatic activity of PDE2A. To analyze if PDE2A could affect the function of XAP2 we studied nuclear translocation of AhR, i.e. the master transcription factor controlling the expression of multiple detoxification genes. Notably, regulation of AhR target gene expression is initiated by tetrachlorodibenzodioxin (TCDD) binding to AhR and by a poorly understood cAMP-dependent pathway, followed by the translocation of AhR from the cytosol into the nucleus. Binding of PDE2A to XAP2 inhibited TCDD- and cAMP-induced nuclear translocation of AhR in Hepa1c1c7 hepatocytes. We conclude that XAP2 targets PDE2A to the AhR complex thereby restricting AhR mobility, possibly by a local reduction of cAMP levels. Our results provide first insights into the elusive cAMP-dependent regulation of AhR.

Resumo não disponível.

Ureases (EC 3.5.1.5) são metaloenzimas que hidrolisam uréia para produzir amônia e dióxido de carbono. Estas enzimas, que são amplamente encontradas em fungos, bactérias e plantas, compartilham de estruturas similares. A presença de urease em várias bactérias patogênicas (Helicobacter pylori e Proteus mirabilis, p.e) está fortemente correlacionada com a patogênese em doenças humanas. Muitos fungos de importância médica possuem atividade ureásica, entre eles citamos Cryptococcus neoformans, Coccidioides immitis, Histoplasma capsulatum, Sporothrix schenckii, e espécies de Trichosporon e Aspergillus. C. neoformans é uma levedura que produz vários fatores de virulência conhecidos, como presença de cápsula polisacarídica, produção de melanina e capacidade de desenvolvimento a 37ºC. A maioria de isolados clínicos produz grandes quantidades de urease e muitos autores sugerem que a urease de Cryptococcus exerça uma função importante na patogênese, porém com mecanismos ainda não esclarecidos. Cryptococcus gattii – sorotipo B, tipo molecular VGII, linhagem R265, com capacidade de infectar pacientes imunocompetentes, causou uma epidemia na Ilha de Vancouver (Canadá) entre 1999 e 2003. Neste trabalho desenvolvemos um procedimento de purificação e apresentamos a caracterização físico-química e cinética da urease de C. gattii, cepa R265, após ter sido purificada na razão de 539 vezes. A massa molecular estimada foi de 120 kDa, Km 2,0 mM para uréia, pH ótimo 8,0. O ácido acetohidroxâmico demonstrou ser um bom inibidor em concentrações micromolares, enquanto ρ-hidroximercuriobenzoato causou inibição em concentrações mais altas, comparado a outras ureases. Espera-se que estudos adicionais com essa urease purificada permitam investigar propriedades biológicas independentes da atividade ureolítica e estabelecer sua contribuição para a patogênese da criptococose. / Ureases (EC 3.5.1.5) are metalloenzymes that hydrolyze urea to produce ammonia and carbon dioxide. These enzymes, which are found in fungi, bacteria, and plants show very similar structures. The presence of urease in many pathogenic bacteria (Helicobacter pylori and Proteus mirabilis) is strongly correlative with pathogenesis in human diseases. Many medically important fungi have urease activity, among which are Cryptococcus neoformans, Coccidioides immitis, Histoplasma capsulatum, Sporothrix schenckii, and species of Trichosporon and Aspergillus. C. neoformans is a heterothallic yeast with several known virulence factors, including a polysaccharide capsule, melanin production, and the ability to grow at 37°C.The majority of clinical isolates produce large amounts of urease and several authors suggest that Cryptococcal urease play an important role in pathogenesis but with unclear mechanisms but probably by different routes dependent and independent of ureolytic activity, althought many questions are unclear. We wanted to further investigate the role of urease in biological properties by using Cryptococcus gattii as a pathogen model. C. gatti – serotype B, molecular type VGII, R265 strain, which has capacity to infect immunocompetent individuals, caused an outbreak on Vancouver Island in Canada from 1999 to 2003. This work presents the physicochemical characterization of a urease from C. gatti strain R265 after a 539 fold purification. The estimated native molecular mass was 120 kDa, Km 2.0 mM urea, pH optimum 8.0. Aceto hydroxamic acid was a strong inhibitor at low concentration while ρ-hidroxy mercuribenzoate needed higher concentrations for inhibition compared to other ureases.

O arroz é umas das mais importantes plantas cultivadas no mundo, sendo constituinte da dieta básica de mais da metade da população humana, inclusive no Brasil. Entretanto, o arroz é um cereal nutricionalmente pobre, apresentando baixas concentrações de metais essenciais, como o ferro e o zinco. Programas de melhoramento e de engenharia genética têm sido empregados na tentativa de melhorar o teor nutritivo dos grãos de arroz. Entretanto, para se alcançar este objetivo é essencial conhecer os mecanismos que envolvem a aquisição de metais, transporte interno e armazenamento nas plantas. A literatura recente tem revelado a existência de diversas famílias de genes candidatos a desempenharem função na homeostase de metais em arroz (genes Yellow Stripe Like, IRT, FRO, MTP, etc). Entre estes, a família Yellow Stripe Like é forte candidata a possuir genes envolvidos na alocação de ferro para o grão, visto que é uma família numerosa (18 genes) de transportadores de ferro, com diferentes isoformas capazes de transportar ferro ligado a fitossideróforos ou a nicotiamina (o principal quelante de ferro intracelular), e com expressão comprovada de pelo menos uma isoforma em células de floema. No entanto, a alocação de minerais para o grão é um processo altamente regulado, que provavelmente requer a atividade de outros genes, com funções ainda desconhecidas. Neste estudo visamos avaliar a contribuição de genes YSL em plantas de arroz e identificar novos genes potencialmente envolvidos com o transporte de metais aos grãos de arroz utilizando diferentes ferramentas: análise de plantas mutantes no gene OsYSL15 por inserção do retroelemento TOS17; avaliação da expressão de genes YSL em folhas bandeira e panículas de arroz em dois estádios de desenvolvimento; construção de uma biblioteca de hibridização subtrativa (SSH) de panículas em dois estádios de desenvolvimento, visando identificar genes com expressão induzida no enchimento dos grãos. Estas diferentes abordagens nos permitiram concluir que: o gene OsYSL15 é fortemente induzido em raízes sob deficiência de ferro, mas não necessário para o desenvolvimento das plantas nas condições estudadas; a função do gene OsYSL15 provavelmente possui sobreposição com as de outros transportadores de ferro, que podem compensar a sua falta; o gene OsYSL18 é um forte candidato a participar dos processos de alocação de minerais para os grãos de arroz. Além disso, foi possível identificar um novo gene, com função ainda desconhecida, com alta expressão em panículas de arroz durante o enchimento do grão. / Rice is one of the most important crops worldwide. Although being a poor source of nutrients, such as iron and zinc, rice is the dietary basis of over half the world's population, including Brazil. Breeding and genetic engineering programs have been employed with the intent to improve the nutritive characteristics in rice grains, including the increase of mineral nutrients, such as iron and zinc. To reach this objective, it is necessary to understand how metal homeostasis occurs in plants, including rhizosphere uptake, internal transport and storage. The recent literature has revealed several families of genes which are candidates to be involved in metal homeostasis in rice (Yellow Stripe Like, IRT, FRO, MTP, etc). Among them, the Yellow Stripe Like family is a strong candidate to contain genes involved with iron allocation to the grain. This is a large family (18 genes) of iron transporters, with different isoforms being able to transport iron chelated to siderophores or to nicotianamine (the main intracellular iron ligand in plants), and with at least one isoform being expressed in phloem cells. However, mineral allocation to the grain is a highly regulated process, which probably requires the activity of other genes, with functions that are still unknown. This study aimed at the evaluation of the contribution of YSL genes and at the identification of new genes potentially involved with metal transport to the rice grain, making use of three different tools: analysis of OsYSL15 mutant plants, containing TOS17 retroelement insertion; gene expression evaluation of YSL genes in rice flag leaves and panicles during two reproductive stages; construction of a panicle subtractive library (SSH) comparing two reproductive stages, in order to identify genes up-regulated during grain filling. These diverse approaches allowed us to reach the following conclusions: the OsYSL15 gene is strongly induced in roots under iron deficiency, but is not necessary for plant development under control conditions; probably there is function overlap between the OsYSL15 gene and other iron transporters, which can compensate for its absence; the OsYSL18 gene is a strong candidate to participate in mineral allocation to the rice grain. Moreover, it was possible to identify a new gene, with still unknown function, which is highly up-regulated in panicles after anthesis.