Made available in DSpace on 2013-08-07T18:42:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000449081-Texto+Completo-0.pdf: 619736 bytes, checksum: f49f3ff20314e610e563f984cfead299 (MD5) Previous issue date: 2013 / Salmonella Enteritidis is the most prevalent serotype isolated in Brazil, mainly associated with poultry products, which have been primarily involved in foodborne disease outbreaks. The high prevalence of reduced susceptibility to antimicrobial agents in various Salmonella serotypes isolated from samples related to livestock animal, animal foods and human has been reported worldwide. Therefore, has increased the interest in investigating the genetic mechanisms involved in resistance to antimicrobial agents, especially genetic elements capable of carrying resistance genes cassettes, which could be the origin of multi-resistant strains. Besides the genetically determined antimicrobial resistance, bacteria can also exhibit resistance by the ability to form biofilm, which protects bacteria from environmental stresses, favoring the colonization and persistence of these microorganisms in the environment. Thus, the aim of this study was to determine the antimicrobial susceptibility of S. Enteritidis strains and investigate the genes involved in the main resistance determined, as well as evaluate the ability of these strains in to produce biofilm. Forty-seven S. Enteritidis strains isolated from human, poultry, swine, and food were analyzed. Sixteen isolates (34%) were phenotypically resistant to at least one antibiotic tested. Of these, four isolates harbored class 1 integron. All strains resistant to sulfonamide had concomitantly genes sul1 and sul2. The genes strA, strB, aadA and aadB were identified in the majority of the aminoglycosides resistant isolates, whereas 92. 9% showed strA, 71. 4% strB, 7. 1% aadA and 50% aadB. The tetB gene was detected in two of the three strains resistant to tetracycline, and tetC in one. In the three strains resistant to ampicillin the blaTEM gene was detected. Overall, among the 47 S. Enteritidis tested, 89. 4% strains were able to form biofilm on polystyrene plates. Among these, 42. 4% were considered weak biofilm producers, 14. 9% moderate producers and 34% strong producers. It has been demonstrated that the majority of the S. Enteritidis strains that showed resistance to at least one antimicrobial agent were able to form biofilm, which increases concerns about food contamination, especially by the possibility of persistence of bacteria resistant to antibiotics on the environment and the subsequently dissemination of these strains to human. / A Salmonella Enteritidis tem sido o sorotipo mais prevalente no Brasil, principalmente associado a produtos de origem avícola, que têm sido prioritariamente envolvidos em surtos de doenças transmitidas por alimentos. A alta prevalência de suscetibilidade reduzida a antimicrobianos em diversos sorotipos de Salmonella isolados de amostras relacionadas a animais de produção, a humanos e a alimentos de origem animal vem sendo relatada no mundo inteiro. Com isto, tem aumentado o interesse em investigar os mecanismos genéticos envolvidos na resistência a antimicrobianos, especialmente elementos genéticos capazes de carrear cassetes de genes de resistência, o que pode constituir a origem de cepas multi-resistentes. Além da resistência a antimicrobianos determinada geneticamente, as bactérias também podem apresentar resistência pela habilidade de formar biofilme, protegendo-as de estresses ambientais, favorecendo a colonização e persistência desses microrganismos no ambiente. Deste modo, o objetivo deste estudo foi determinar a suscetibilidade a antimicrobianos de cepas de S. Enteritidis e investigar os genes envolvidos nas principais resistências determinadas, bem como avaliar a capacidade de formação de biofilme destas cepas. Para tanto, foram analisadas 47 cepas de S. Enteritidis isoladas de humanos, aves, suínos e alimentos. Dezesseis isolados (34%) se mostraram fenotipicamente resistentes a pelo menos um antimicrobiano testado. Destes, quatro apresentaram integron de classe 1. Todas as cepas resistentes à sulfonamida apresentaram concomitantemente os genes sul1 e sul2. Os genes strA, strB, aadA e aadB foram identificados na maioria dos isolados que apresentaram resistência a aminoglicosídeos, sendo que 92,9% apresentaram o gene strA, 71,4% strB, 7,1% aadA e 50% aadB. O gene tetB foi detectado em duas das três cepas resistentes à tetraciclina e o tetC em uma. Já as três cepas resistentes à ampicilina apresentaram o gene blaTEM. No total, dentre as 47 cepas de S. Enteritidis testadas, 89,4% foram capazes de formar biofilme em placas de poliestireno. Dentre estas, 42,4% foram consideradas fracas produtoras de biofilme, 14,9% produtoras moderadas e 34% fortes produtoras. Foi demonstrado que a maioria das cepas que mostraram resistência a pelo menos um antimicrobiano foram capazes de formar biofilme, o que aumenta a preocupação a respeito da contaminação de alimentos, especialmente pela possibilidade de persistência de microrganismos resistentes a antimicrobianos no ambiente e a subsequente disseminação destas cepas para humanos.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:42:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000431141-Texto+Completo-0.pdf: 13187681 bytes, checksum: 1ec3202d47e45648161456f90fa14a9e (MD5) Previous issue date: 2011 / Resveratrol is a naturally occurrence polyphenol, widely studied in prevention and age related diseases. It was shown by increased lifespan of lower organisms and obese rodents, that its mechanism could be sirtuin 1 dependent. Thus, the compound was considered as an important mimicking calorie restriction agent, the only non-genetic intervention known to increase the lifespan. Sirtuins belong to a family of enzymes NAD+-dependent targeting histones and non-histones proteins, therefore regulating several cellular events related to metabolism. Despite the mechanism of resveratrol showed to be SIRT1-dependent, it is more complex than firstly reported and it is not yet clear. In this study, we investigated the gene expression of three sirtuins members and targets of these enzymes family, modulated by resveratrol in three different conditions: without stress or injury, with ethanol, - as a stressor compound and after caloric restriction, using adult zebrafish as a model organism. Although wild-type zebrafish is considered a consolidated experimental model, little have been explored conserning sirtuins mechanism, resveratrol modulation and caloric restriction. The mRNA expression was detected by semiquantitative RT-PCR in zebrafish liver after different time of exposure and concentrations of resveratrol, ethanol and, also in the muscle after caloric restriction. In our experimental model neither resveratrol nor caloric restriction modulated the SIRT1 gene expression. However we saw a similar profile between SIRT3 and SIRT4 transcription, a decrease in liver mRNA levels. Under this scenario we suggested that the resveratrol can exert health benefits similar to that presented by caloric restriction, modulating other sirtuins, rather than SIRT1, opening another perspective that must be exploited, since, in zebrafish, resveratrol altered the sirtuins and other genes (such as NAMPT) expression. This modulation should be better understood at physiological levels once resveratrol have been used by health subjects as a nutraceutical compound. Even though, here ethanol was used as stressor compound, we did not observed hepatic injury, especially in the animals subjected to chronic exposition. Nevertheless, was possible detected that resveratrol and ethanol showed different profiles of gene expression and protein acetylation but, when the compounds were administered together levels were reverted close to the control group. The results here described helps to consolidate the zebrafish as an experimental model for understanding the sirtuin modulation by resveratrol and caloric restriction. / Resveratrol é um polifenol de ocorrência natural amplamente estudado na prevenção de doenças associadas ao envelhecimento. Foi caracterizado por aumentar a longevidade em organismos menores e em roedores obesos, mecanismos relacionados a modulação de sirtuína 1. Desta forma, foi comparado e apresentado como um importante composto mimetizador de restrição calórica, única intervenção não genética conhecida por aumentar a longevidade. Sirtuínas compreendem uma família de enzimas NAD+ dependentes que têm como alvo proteínas histonas e não histonas, regulando uma série de eventos celulares relacionados ao metabolismo. Apesar do resveratrol ter sido apresentado por modular SIRT1, este mecanismo parece ser muito mais complexo e não está completamente elucidado. Neste estudo, nós investigamos o perfil de transcrição de SIRT1, SIRT3 e SIRT4 e genes alvos relacionados a estas enzimas, PGC1α, PPARγ e NAMPT, modulados por resveratrol, em um modelo sem injúria e estress; e na presença de um agente estressor, neste caso o etanol e; após restrição calórica. Para o estudo, foi utilizado zebrafish adulto tipo selvagem, por ser um modelo experimental consolidado, porém pouco explorado quanto ao mecanismo de sirtuinas, do composto resveratrol e restrição calórica. Para análise transcricional foi utilizado a técnica de RT-PCR semiquantitativo. Para determinação do estado de acetilação H3 lys9 foi utilizado a técnica de Western Blotting. As expressões de mRNA foram analisadas em fígado de zebrafish após exposição a diferentes tempos e concentrações de resveratrol, etanol e, também no músculo, após restrição calórica. Em nosso modelo experimental nem o resveratrol, nem a restrição calórica modularam a expressão de SIRT; porém, nós observamos que ambas intervenções apresentaram perfil similar na transcrição de SIRT3 e SIRT4, diminuindo os níveis de mRNA no fígado. Nós sugerimos que o composto pode exercer efeitos benéficos similar a RC por modulação de outras sirtuínas que não SIRT1 e, estas devem ser melhor exploradas. Ainda, nós demonstramos que resveratrol modula a expressão de sirtuínas e outros genes analisados como NAMPT, em um modelo sem injúria, e esta modulação deve ser compreendida a níveis fisiológicos uma vez que o composto vem sendo utilizado como composto nutracêutico por indivíduos saudáveis. Etanol, aqui utilizado como um agente estressor, não causou dano hepático, principalmente nos animais que receberam tratamento crônico. Porém, foi possível observar que resveratrol e etanol apresentaram padrão diferente no perfil de expressão gênica e acetilação de proteína e, que a associação dos dois compostos reverteu aos níveis próximos do controle estas alterações. Estes resultados consolidam o zebrafish como modelo experimental a ser utilizado na compreensão da modulação de sirtuínas modulado por resveratrol e restrição calórica.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:42:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000432437-Texto+Completo-0.pdf: 10723389 bytes, checksum: d0fa4e1abb05919515c5199dcf4ecc73 (MD5) Previous issue date: 2011 / The inhA gene from Mycobacterium tuberculosis (Mtb), encodes for an enoyl acyl carrier protein reductase, InhA, a key enzyme of the mycobacterial type II fatty acid elongation cycle and has been validated as an effective target for the development of anti-microbial agents. InhA catalyzes the NADH-dependent reduction of trans double bond between positions C2 and C3 of fatty acyl substrates. It is the target of isoniazid, a first line drug in the tuberculosis treatment. Mutations in InhA structural gene are associated with isoniazid resistance in vivo. Even though mutations within the inhA gene are known to facilitate isoniazid resistance, InhA remains a good candidate for drug design because: (i) the vast majority of the mutations found in isoniazid-resistant clinical isolates are associated with the isoniazid activator (KatG catalase-peroxidase); (ii) only one enoyl-ACP reductase is found in Mtb, unlike some of the other enzymes of bacterial FAS-II systems; (iii) the longer substrate chain length specificity of InhA distinguishes it from the enoyl-ACP reductases from other sources. Our goal with this work was to analyze in detail the structural and physicochemical available information about Mtb InhA using bioinformatics tools. As a result, we developed a pharmacophoric model based on the InhA substrate binding cavity that allowed the application of a virtual screening methodology focused in selecting ligands that satisfied these features, allowing so, a best complementarity with the target protein. Besides we tested the hability of four docking algorithms to find similar conformation to a molecule, providing clues that this would be the conformation closest that adopted in vivo. Finally, molecular dynamics simulations were employed to achieve a better comprehension of the interaction between InhA and a known inhibitor. / O gene inhA de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) codifica a enzima enoil redutase, InhA, uma enzima chave no ciclo de alongamento de ácidos graxos tipo II e têm sido validada como um alvo efetivo para o desenvolvimento de agentes antimicrobianos. A InhA catalisa a redução NADH-dependente da ligação dupla trans entre as posições C2 e C3 de substratos de ácidos graxos. Ela é o alvo da isoniazida, uma droga de primeira linha no tratamento da tuberculose. Mutações no gene estrutural da InhA estão associadas com a resistência à isoniazida in vivo. Mesmo que mutações no gene inhA sejam conhecidas por facilitar a resistência à isoniazida, InhA ainda é uma excelente candidata a alvo para o planeamento de fármacos porque: (i) a grande maioria das mutações encontradas em isolados clínicos de cepas resistentes à isoniazida estão associadas com o ativador da isoniazida (KatG catalase-peroxidase); (ii) apenas uma enoil-ACP redutase é encontrada em M. tuberculosis, ao contrário de outras enzimas dos sistemas FAS-II de bactérias; (iii) a especificidade da InhA por substratos de cadeia mais longa a distingue das enoil-ACP redutases de outros tipos. Nosso objetivo com este trabalho foi de analisar em detalhe as informações estruturais e físico-químicas disponíveis sobre a InhA de Mtb utilizando ferramentas de bioinformática. Como resultado, foi desenvolvido um modelo farmacofórico baseado na estrutura do sítio de ligação ao substrato da InhA, permitindo a aplicação de uma metodologia de triagem virtual focada em selecionar ligantes que satisfizessem essas características, permitindo assim, a melhor complementariedade com a proteína alvo. Além disso testamos a habilidade de quatro algoritmos de docagem molecular em encontrar conformações semelhantes para uma mesma molécula, fornecendo indícios de que esta seja a conformação mais próxima àquela adotada in vivo. Por fim, simulações de dinâmica molecular foram empregadas para melhor compreensão da interação da enzima InhA com um inibidor já conhecido desta enzima.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:42:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000431172-Texto+Completo-0.pdf: 1194899 bytes, checksum: 952b6d1718311a7687aedbe05f823d2b (MD5) Previous issue date: 2010 / The zebrafish is one of the most important vertebrate models for studying genetics, developmental biology, neurophysiology, and biomedicine, and it is used as a model of human diseases and for the development of new therapeutic drugs, including drugs for Alzheimer's disease treatment. Alzheimer's disease is a neurodegenerative disease characterized by amyloid plaques deposition, development of neurofibrillary tangles, inflammation and neuronal loss in different parts of the brain that contribute to the cognitive impairment characteristic of the disease. The cholinergic system, the main system involved in this disease, presents acetylcholine (ACh) as a neurotransmitter and is strongly related to processes of learning and memory formation. Besides the cholinergic system, other neurotransmitter systems, such as the purinergic system are involved in Alzheimer’s pathology. The purine-derived nucleosides and nucleotides display a role as extracellular signaling molecules in various tissues via purinergic receptors. ATP has its extracellular levels controlled by a group of enzymes called ectonucleotidases, which includes ecto-nucleoside triphosphate diphosphohydrolases (E-NTPDases) and ecto-5'- nucleotidase, which carry out the degradation of purine nucleotides to adenosine, a nucleoside neuromodulator of cellular homeostasis. Polyphenols, compounds derived from plants, can act as modulators of cholinergic and purinergic signaling, present known antioxidant effects and no severe side effects, showing great potential as a treatment for Alzheimer's disease. Therefore, the aim of this study was to evaluate the potential neuroprotective role of polyphenols quercetin and rutin in the prevention of cognitive impairment caused by scopolamine, a cholinergic antagonist widely used for testing new drugs that facilitate cognitive abilities, as well as to analyze their effects on the enzymes responsible for modulation of neurotransmitters levels, such as ATP and acetylcholine. Our results have shown that administration of quercetin or rutin intraperitoneal (50 mg/kg) in zebrafish prevents cognitive deficits caused by exposure to scopolamine (200 μM), as demonstrated by increased latency to cross to the dark side of the inhibitory avoidance apparatus. None of the compounds in which the animals were exposed are able to alter the locomotor activity of the animals. Moreover, it has been observed that treatment with rutin followed by water exposure inhibited acetylcholine hydrolysis whereas the treatment with rutin followed by scopolamine exposure reduced ATP hydrolysis. Regarding the effects of quercetin, it has inhibited the AMP hydrolysis when its administration was followed by water or scopolamine exposure. Therefore, these results have demonstrated that polyphenols may display protective potential on to the cognitive impairment induced by scopolamine. Moreover, our findings have shown that rutin and quercetin per se are able to modulate the levels of acetylcholine, ATP, and adenosine in zebrafish brain. These results are promising regarding the possibility of preventive therapy to be carried throughout lifespan to avoid the occurrence of cognitive decline associated with aging. / O peixe zebra é um dos modelos vertebrados mais importantes para estudos de genética, biologia do desenvolvimento, neurofisiologia e biomedicina, sendo utilizado como um modelo de doenças humanas e para triagem de novas drogas, tais como fármacos para o tratamento da doença de Alzheimer. A doença de Alzheimer é uma doença neurodegenerativa que se caracteriza pela deposição de placas amilóides, desenvolvimento de emaranhados de neurofibrilas, inflamação e perda neuronal em diversas partes do cérebro que contribuem para os déficits cognitivos característicos da doença. O sistema colinérgico, o principal sistema envolvido nesta doença, apresenta a acetilcolina (ACh) como neurotransmissor e está fortemente relacionado à processos de aprendizado e formação da memória. Além do sistema colinérgico, outros sistemas, como o sistema purinérgico, estão envolvidos na patologia da doença de Alzheimer. Os nucleosídeos e nucleotídeos derivados de purinas exercem um papel de moléculas sinalizadoras extracelulares em vários tecidos, através dos receptores purinérgicos. O ATP tem seus níveis extracelulares controlados por enzimas da família das ectonucleotidases, entre elas as ectonucleosídeo trifosfato difosfoidrolases (E-NTPDases) e a ecto-5´-nucleotidase, que realizam a degradação de nucleotídeos púricos até adenosina, um nucleosídeo neuromodulador da homeostase celular. Os polifenóis, os quais são compostos derivados de plantas, podem atuar como moduladores da sinalização purinérgica e colinérgica, além de apresentarem efeitos antioxidantes, com ausência de efeitos colaterais severos, apresentando um grande potencial como tratamento para a doença de Alzheimer. Portanto, o objetivo deste estudo foi avaliar o potencial neuroprotetor dos polifenóis quercetina e rutina na prevenção dos déficits cognitivos causados pela escopolamina, um antagonista colinérgico muito utilizado para testes de novos fármacos facilitadores da capacidade cognitiva, bem como seus efeitos sobre as enzimas responsáveis pela modulação dos níveis dos neurotransmissores ATP e acetilcolina. Os resultados obtidos demonstram que a administração intraperitonial de quercetina ou rutina (50 mg/kg) em peixe zebra previniu o déficit cognitivo causado pela exposição à escopolamina (200 μM), como demonstrado pelo aumento da latência para cruzar para o lado escuro do aparato da tarefa de esquiva inibitória. A exposição a estes compostos não promoveu alterações na locomoção dos animais. Além disso, foi observado que o tratamento com rutina seguido de exposição à água inibiu a hidrólise de acetilcolina enquanto que o tratamento com rutina seguido pela exposição à escopolamina diminuiu a hidrólise de ATP. Com relação aos efeitos da quercetina, esta inibiu a hidrólise de AMP quando sua administração foi seguida pela exposição à água ou escopolamina. Portanto, estes resultados demonstram que os polifenóis podem apresentar potencial protetor com relação ao prejuízo cognitivo induzido pela escopolamina. Além disso, nossos resultados demonstram que rutina e quercetina per se são capazes de modular os níveis de acetilcolina, ATP e adenosina em encéfalo de peixe zebra. Estes resultados são promissores em relação à possibilidade de terapia preventiva a ser realizada ao longo da vida, visando a não ocorrência de declínio cognitivo associado ao envelhecimento.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:42:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000383071-Texto+Completo-0.pdf: 1037097 bytes, checksum: 64845ab6c2bfb968dc78afc6dab91fc8 (MD5) Previous issue date: 2006 / A avaliação da citotoxicidade dos materiais dentais é de grande importância na Odontologia. O formocresol (FC) e o tricresol formalina (TC) são duas medicações utilizadas na odontologia para desinfecção do canal radicular, que contém formaldeído na sua formulação. Estes produtos são considerados bons antimicrobianos, mas pesquisas a respeito da toxicidade destes medicamentos ainda são necessárias. O presente estudo avaliou in vitro a citotoxicidade do formaldeído, do FC e do TC, utilizando três linhagens celulares estabelecidas, as células HeLa, NIH3T3 e Hep2, cultivadas em condições padrão. As células foram deixadas em contato com cada produto durante 1, 2, 3, 4 ou 5 minutos, sendo então incubadas por 24 horas, 48 horas ou 7 dias. O teste de citotoxicidade utilizado foi o ensaio MTT. Os resultados deste estudo mostraram que os produtos testados foram tóxicos às diferentes linhagens celulares estabelecidas, em todas as condições testadas. O formocresol foi o produto que apresentou menor citotoxicidade, sendo este resultado estatisticamente significante quando comparado com o tricresol formalina e o formaldeído.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:42:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000431855-Texto+Completo-0.pdf: 3947634 bytes, checksum: 7beba45e84b6a9adcafc79eb9a9e0deb (MD5) Previous issue date: 2011 / The HLA (Human Leukocyte Antigen) molecules are proteins encoded by genes highly polymorphic located in the MHC (Major Histocompatibility Complex) region on the short arm of Human chromosome 6. They are involved in immune response processes, being responsible for presenting antigens to T lymphocytes. The HLA system is highly informative in studies of population genetics because of its high polymorphism and strong linkage disequilibrium between loci. Among different populations we can observe differences in both frequency and in the presence of alleles and haplotypes in certain groups. Therefore, knowledge of HLA is an important tool for studies of the origin of populations. Moreover, its determination is important for understanding mechanisms associated with susceptibility or resistance to certain diseases and in processes of allocation of organs for transplantation. The investigation of the HLA compatibility between donor and recipient is crucial for the success of transplantation. In Brazil, the high rate of miscegenation of the population complicates the search for a compatible donor. Information about the diversity of these alleles in our population offer us the ability to estimate the chance of a patient in list to find a donor with a better immunological compatibility. In Brazil, there are previous studies of HLA frequency, however, in Rio Grande do Sul, this information is very scarce. In this study the HLA A, B and DRB1 allelic, phenotypic and haplotypic distribution was determined using a sample of 5000 volunteer bone marrow donors registered in REDOME (Brazilian Registry of Bone Marrow Donors Volunteers).The study subjects reside in the state of Rio Grande do Sul and were classified according to ethnic group (4428 caucasians, 324 mestizos and 248 blacks). The HLA typing was performed by PCR-SSO and Luminex technology. In the total sample, we identified 21 allelic groups HLA-A, 33 HLA-B and 13 HLA-DRB1. The most frequent allelic groups for each locus were A*02, B*35 and DRB1*13. The most frequent haplotypes were A*01 B*08 DRB1*03 in caucasians and mestizos, and A*02 B*15 DRB1*04 in blacks. Allele frequencies were compared with samples from different regions. Most of the comparisons were not statistically different. The most significant differences were observed in the comparison of the groups of our sample, showing the HLA contribution from different ethnic groups. These data provide information on the knowledge of HLA diversity in the population of Rio Grande do Sul and in the search for a better match for transplantation. / As moléculas HLA (Human Leucocyte Antigens) são proteínas codificadas por genes altamente polimórficos localizados na região do MHC (Major Histocompatibility Complex) no braço curto do cromossomo 6 humano. Elas estão envolvidas em processos de resposta imunológica, sendo responsáveis pela apresentação de antígenos aos linfócitos T. O sistema HLA é altamente informativo em estudos de genética de populações, devido ao seu elevado polimorfismo e ao forte desequilíbrio de ligação entre loci próximos. Entre diferentes populações podemos observar variação tanto na freqüência, como na presença de alelos e haplótipos em determinados grupos. Portanto, o conhecimento de alelos HLA é uma ferramenta importante para os estudos da origem das populações. Além disso, sua determinação contribui para a compreensão de mecanismos associados à suscetibilidade ou resistência a determinadas doenças e em processos de alocação de órgãos para transplante. A investigação da compatibilidade HLA entre doador e receptor é determinante no sucesso do transplante. No Brasil a elevada taxa de miscigenação dificulta a busca por um doador compatível. Informações sobre a diversidade desses alelos na nossa população nos permitem estimar a chance de um paciente em lista encontrar um doador com uma melhor compatibilidade imunológica. No Brasil, existem estudos prévios de freqüência HLA, porém, no Rio Grande do Sul, essa informação é muito escassa. Nesse trabalho a distribuição das freqüências alélicas, fenotípicas e haplotípicas de HLA A, B e DRB1 foi determinada utilizando uma amostra de 5000 doadores voluntários de medula óssea cadastrados no REDOME (Registro Brasileiro de Doadores Voluntários de Medula Óssea).Os indivíduos estudados residem no estado do Rio Grande do Sul e foram classificados com base no grupo étnico (4428 caucasianos, 324 mestiços e 248 negros). A tipagem HLA foi realizada pelo método de PCR-SSO aliado à tecnologia Luminex. Na amostra total foram identificados 21 grupos alélicos HLA-A, 33 HLA-B and 13 HLA-DRB1. Os grupos alélicos mais freqüentes para cada locus foram: A*02, B*35 e DRB1*13. Os haplótipos mais freqüentes foram: A*01 B*08 DRB1*03 nos caucasianos e mestiços, e A*02 B*15 DRB1*04 nos negros. As freqüências alélicas foram comparadas com amostras de diferentes regiões brasileiras. Na maioria das comparações não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas. Foram observadas maiores diferenças na comparação entre os grupos da nossa amostra, mostrando a contribuição HLA dos diferentes grupos étnicos. Esses dados oferecem informações para o conhecimento da diversidade HLA na população do Rio Grande do Sul e na busca por um doador mais compatível para transplante.

As fosfodiesterases do tipo 2A (PDE2A) hidrolisam os nucleotídeos cíclicos cAMP e cGMP e por isso desempenham papel importante na sinalização intracelular. PDE2A é composta por uma região N-terminal, que ao contrário de outras famílias de PDEs, não possui função conhecida, dois domínios regulatórios, GAF A e GAF B, e um domínio catalítico localizado na porção C-terminal. Sabe-se que a hidrólise dos nucleotídeos cíclicos, pela PDE2A, é ativada pela ligação de cGMP ao domínio regulatório GAF B. Em uma triagem dois híbridos, identificamos XAP2 como a principal proteína interatora de PDE2A. XAP2 é um componente crucial do complexo multiprotéico do receptor Aril hidrocarboneto (Ahr), o principal fator de transcrição que controla a expressão de múltiplos genes envolvidos em detoxificação. Neste trabalho, foi determinado que XAP2 liga o domínio GAF B da enzima PDE2A. Ensaios de atividade fosfodiesterásica, utilizando proteínas purificadas, mostram que a ligação de XAP2 não interfere na atividade enzimática de PDE2A. Para analisar se PDE2A afeta a função de XAP2, foi investigado o deslocamento de Ahr para o núcleo. Sabe-se que a regulação da expressão dos genes alvos de Ah é iniciada pela ligação de tetraclorodibenzodioxina (TCDD) e por uma via, ainda pouco entendida, dependente de cAMP. Verificamos que a ligação de PDE2A à XAP2 inibe o deslocamento de Ahr para o núcleo, induzido por TCDD e por cAMP em células hepáticas Hepa1c1c7 em cultura. Em conclusão, mostramos neste trabalho que XAP2 recruta PDE2A para o complexo Ahr, causando a inibição da mobilidade de Ahr, possivelmente pela redução local da concentração de cAMP. Esses dados suportam o papel de cAMP no controle da função de Ahr. / Phosphodiesterase type 2A (PDE2A) hydrolyzes cyclic nucleotides cAMP and cGMP thus efficiently controlling cNMP-dependent signaling pathways. PDE2A is composed of an N-terminal region, two regulatory GAF domains and a catalytic domain. Cyclic nucleotide hydrolysis is known to be activated by cGMP binding to GAF-B, however, other mechanisms may operate to fine-tune local cyclic nucleotide levels. In a yeast-two-hybrid screening we identified XAP2, a crucial component of the aryl hydrocarbon receptor (AhR) complex, as a major PDE2A-interacting protein. We mapped the XAP2 binding site to the GAF-B domain of PDE2A. PDE assays with purified proteins showed that XAP2 binding does not change the enzymatic activity of PDE2A. To analyze if PDE2A could affect the function of XAP2 we studied nuclear translocation of AhR, i.e. the master transcription factor controlling the expression of multiple detoxification genes. Notably, regulation of AhR target gene expression is initiated by tetrachlorodibenzodioxin (TCDD) binding to AhR and by a poorly understood cAMP-dependent pathway, followed by the translocation of AhR from the cytosol into the nucleus. Binding of PDE2A to XAP2 inhibited TCDD- and cAMP-induced nuclear translocation of AhR in Hepa1c1c7 hepatocytes. We conclude that XAP2 targets PDE2A to the AhR complex thereby restricting AhR mobility, possibly by a local reduction of cAMP levels. Our results provide first insights into the elusive cAMP-dependent regulation of AhR.

Resumo não disponível.

Ureases (EC 3.5.1.5) são metaloenzimas que hidrolisam uréia para produzir amônia e dióxido de carbono. Estas enzimas, que são amplamente encontradas em fungos, bactérias e plantas, compartilham de estruturas similares. A presença de urease em várias bactérias patogênicas (Helicobacter pylori e Proteus mirabilis, p.e) está fortemente correlacionada com a patogênese em doenças humanas. Muitos fungos de importância médica possuem atividade ureásica, entre eles citamos Cryptococcus neoformans, Coccidioides immitis, Histoplasma capsulatum, Sporothrix schenckii, e espécies de Trichosporon e Aspergillus. C. neoformans é uma levedura que produz vários fatores de virulência conhecidos, como presença de cápsula polisacarídica, produção de melanina e capacidade de desenvolvimento a 37ºC. A maioria de isolados clínicos produz grandes quantidades de urease e muitos autores sugerem que a urease de Cryptococcus exerça uma função importante na patogênese, porém com mecanismos ainda não esclarecidos. Cryptococcus gattii – sorotipo B, tipo molecular VGII, linhagem R265, com capacidade de infectar pacientes imunocompetentes, causou uma epidemia na Ilha de Vancouver (Canadá) entre 1999 e 2003. Neste trabalho desenvolvemos um procedimento de purificação e apresentamos a caracterização físico-química e cinética da urease de C. gattii, cepa R265, após ter sido purificada na razão de 539 vezes. A massa molecular estimada foi de 120 kDa, Km 2,0 mM para uréia, pH ótimo 8,0. O ácido acetohidroxâmico demonstrou ser um bom inibidor em concentrações micromolares, enquanto ρ-hidroximercuriobenzoato causou inibição em concentrações mais altas, comparado a outras ureases. Espera-se que estudos adicionais com essa urease purificada permitam investigar propriedades biológicas independentes da atividade ureolítica e estabelecer sua contribuição para a patogênese da criptococose. / Ureases (EC 3.5.1.5) are metalloenzymes that hydrolyze urea to produce ammonia and carbon dioxide. These enzymes, which are found in fungi, bacteria, and plants show very similar structures. The presence of urease in many pathogenic bacteria (Helicobacter pylori and Proteus mirabilis) is strongly correlative with pathogenesis in human diseases. Many medically important fungi have urease activity, among which are Cryptococcus neoformans, Coccidioides immitis, Histoplasma capsulatum, Sporothrix schenckii, and species of Trichosporon and Aspergillus. C. neoformans is a heterothallic yeast with several known virulence factors, including a polysaccharide capsule, melanin production, and the ability to grow at 37°C.The majority of clinical isolates produce large amounts of urease and several authors suggest that Cryptococcal urease play an important role in pathogenesis but with unclear mechanisms but probably by different routes dependent and independent of ureolytic activity, althought many questions are unclear. We wanted to further investigate the role of urease in biological properties by using Cryptococcus gattii as a pathogen model. C. gatti – serotype B, molecular type VGII, R265 strain, which has capacity to infect immunocompetent individuals, caused an outbreak on Vancouver Island in Canada from 1999 to 2003. This work presents the physicochemical characterization of a urease from C. gatti strain R265 after a 539 fold purification. The estimated native molecular mass was 120 kDa, Km 2.0 mM urea, pH optimum 8.0. Aceto hydroxamic acid was a strong inhibitor at low concentration while ρ-hidroxy mercuribenzoate needed higher concentrations for inhibition compared to other ureases.

O arroz é umas das mais importantes plantas cultivadas no mundo, sendo constituinte da dieta básica de mais da metade da população humana, inclusive no Brasil. Entretanto, o arroz é um cereal nutricionalmente pobre, apresentando baixas concentrações de metais essenciais, como o ferro e o zinco. Programas de melhoramento e de engenharia genética têm sido empregados na tentativa de melhorar o teor nutritivo dos grãos de arroz. Entretanto, para se alcançar este objetivo é essencial conhecer os mecanismos que envolvem a aquisição de metais, transporte interno e armazenamento nas plantas. A literatura recente tem revelado a existência de diversas famílias de genes candidatos a desempenharem função na homeostase de metais em arroz (genes Yellow Stripe Like, IRT, FRO, MTP, etc). Entre estes, a família Yellow Stripe Like é forte candidata a possuir genes envolvidos na alocação de ferro para o grão, visto que é uma família numerosa (18 genes) de transportadores de ferro, com diferentes isoformas capazes de transportar ferro ligado a fitossideróforos ou a nicotiamina (o principal quelante de ferro intracelular), e com expressão comprovada de pelo menos uma isoforma em células de floema. No entanto, a alocação de minerais para o grão é um processo altamente regulado, que provavelmente requer a atividade de outros genes, com funções ainda desconhecidas. Neste estudo visamos avaliar a contribuição de genes YSL em plantas de arroz e identificar novos genes potencialmente envolvidos com o transporte de metais aos grãos de arroz utilizando diferentes ferramentas: análise de plantas mutantes no gene OsYSL15 por inserção do retroelemento TOS17; avaliação da expressão de genes YSL em folhas bandeira e panículas de arroz em dois estádios de desenvolvimento; construção de uma biblioteca de hibridização subtrativa (SSH) de panículas em dois estádios de desenvolvimento, visando identificar genes com expressão induzida no enchimento dos grãos. Estas diferentes abordagens nos permitiram concluir que: o gene OsYSL15 é fortemente induzido em raízes sob deficiência de ferro, mas não necessário para o desenvolvimento das plantas nas condições estudadas; a função do gene OsYSL15 provavelmente possui sobreposição com as de outros transportadores de ferro, que podem compensar a sua falta; o gene OsYSL18 é um forte candidato a participar dos processos de alocação de minerais para os grãos de arroz. Além disso, foi possível identificar um novo gene, com função ainda desconhecida, com alta expressão em panículas de arroz durante o enchimento do grão. / Rice is one of the most important crops worldwide. Although being a poor source of nutrients, such as iron and zinc, rice is the dietary basis of over half the world's population, including Brazil. Breeding and genetic engineering programs have been employed with the intent to improve the nutritive characteristics in rice grains, including the increase of mineral nutrients, such as iron and zinc. To reach this objective, it is necessary to understand how metal homeostasis occurs in plants, including rhizosphere uptake, internal transport and storage. The recent literature has revealed several families of genes which are candidates to be involved in metal homeostasis in rice (Yellow Stripe Like, IRT, FRO, MTP, etc). Among them, the Yellow Stripe Like family is a strong candidate to contain genes involved with iron allocation to the grain. This is a large family (18 genes) of iron transporters, with different isoforms being able to transport iron chelated to siderophores or to nicotianamine (the main intracellular iron ligand in plants), and with at least one isoform being expressed in phloem cells. However, mineral allocation to the grain is a highly regulated process, which probably requires the activity of other genes, with functions that are still unknown. This study aimed at the evaluation of the contribution of YSL genes and at the identification of new genes potentially involved with metal transport to the rice grain, making use of three different tools: analysis of OsYSL15 mutant plants, containing TOS17 retroelement insertion; gene expression evaluation of YSL genes in rice flag leaves and panicles during two reproductive stages; construction of a panicle subtractive library (SSH) comparing two reproductive stages, in order to identify genes up-regulated during grain filling. These diverse approaches allowed us to reach the following conclusions: the OsYSL15 gene is strongly induced in roots under iron deficiency, but is not necessary for plant development under control conditions; probably there is function overlap between the OsYSL15 gene and other iron transporters, which can compensate for its absence; the OsYSL18 gene is a strong candidate to participate in mineral allocation to the rice grain. Moreover, it was possible to identify a new gene, with still unknown function, which is highly up-regulated in panicles after anthesis.