Carrapatos são artrópodos hematófagos distribuídos por todo o mundo e vetores de diversas doenças. Como todos os hematófagos, os carrapatos possuem um arsenal de moléculas que inibe a resposta hemostática do hospedeiro, o que viabiliza o repasto sanguíneo bemsucedido. O carrapato bovino Rhipicephalus (Boophilus) microplus é um carrapato de um só hospedeiro e considerado o mais importante parasito de animais domésticos da América Latina. O R. microplus causa sérios danos aos bovinos, direta, e principalmente, devido à espoliação de sangue que leva à anemia e diminuição da produção de leite e do ganho de peso; e, indiretamente, via a transmissão de patógenos, como Babesia spp. e Anaplasma spp. O R. microplus é também um modelo interessante para o estudo das relações parasitohospedeiro, visto que ele permanece fixado ao mesmo hospedeiro durante toda a sua vida parasitária, o que leva em torno de três semanas. Os objetivos deste trabalho são explorar os mecanismos farmacológicos da saliva do carrapato R. microplus capazes de modular o sistema hemostático, bem como o papel que esta modulação desempenha na relação parasito-hospedeiro. Nesse sentido, este estudo foi organizado em duas partes. Primeiramente, foi realizada uma investigação sobre os parâmetros hemostáticos em bovinos infestados por carrapatos. Em um segundo momento, foram estudados os mecanismos da saliva do carrapato envolvidos na inibição da hemostasia, assim como a habilidade do soro de bovinos repetidamente infestados (que apresentam resistência imunológica naturalmente adquirida contra o carrapato bovino) em interferir na ação antihemostática da saliva do carrapato. Na primeira parte do estudo, foi demonstrado que bovinos experimentalmente infestados com 20.000 larvas de R. microplus apresentam uma diminuição na capacidade de agregação plaquetária (em resposta a colágeno e ADP), bem como na coagulação sanguínea (evidenciada por um aumento nos tempos de tromboplastina parcialmente ativado e de protrombina), enquanto a contagem de plaquetas e os níveis de fibrinogênio aumentaram significativamente ao longo da infestação. Na segunda parte, foi demonstrado que a saliva de R. microplus: (i) apresenta atividade inibitória in vitro sobre a agregação plaquetária induzida por colágeno; (ii) inibe a indução de ativação endotelial; e (iii) reduz a trombogênese in vivo. Ademais, o soro de bovinos repetidamente infestados (RIBS) foi capaz de bloquear parcialmente a atividade anticoagulante e antitrombótica da saliva e totalmente a modulação da ativação endotelial, ao passo que o RIBS não apresentou nenhum efeito sobre a inibição da agregação plaquetária. O conjunto dos dados apresentados permite um melhor entendimento dos fenômenos que ocorrem no hospedeiro durante o parasitismo, e também fornece mais subsídios para uma maior compreensão do processo de hematofagia e dos mecanismos fisiopatológicos que regem a relação parasitohospedeiro. / Ticks are blood-feeding arthropods widely distributed in the world and vectors of several diseases. Like all hematophagous animals, ticks resort to a variety of molecules in order to avoid the host hemostatic response, which in turn allow a successful blood-meal. The cattle tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus is an one-host tick, and is considered the most harmful parasite of domesticated animals in Latin America. R. microplus causes expressive injuries to bovines, directly, mainly due to blood spoliation, leading to anemia, and diminution of milk production and weight gain. Indirectly the tick is responsible for the transmission of pathogens such as Babesia spp. and Anaplasma spp. R. microplus is also a consistent model to study the parasite-host relationship, since it remains attached to the same host throughout the whole parasitic stage, which lasts around three weeks. This work aims at exploring the pharmacological mechanisms of R. microplus tick saliva able to modulate hemostasis, and the role of this modulation in tick-host relationship. In this sense, this study was organized in two parts: firstly, an investigation about the hemostatic parameters in tick infested bovines was performed. Secondly, the tick salivary mechanisms involved in the inhibition of hemostasis were studied, and the ability of serum from repeatedly infested bovines (which displays natural acquired immunological resistance to the cattle tick) to interfere in anti-hemostatic activity of tick saliva was also investigated. In the first part of this study it was shown that calves experimentally infested with 20,000 R. microplus larvae display a decrease in platelet aggregation (in response to collagen and ADP) as well as in coagulation ability (evinced by an increase in activated partial thromboplastin time and prothrombin time), whereas platelet blood count and fibrinogen level significantly increased during the course of infestation. In the second part of this work, it was demonstrated that R. microplus saliva: (i) displays in vitro inhibitory activity upon collagen-induced platelet aggregation; (ii) inhibits the induction of endothelial activation; and (iii) reduces thrombogenesis in vivo. Moreover, repeated infested bovine sera (RIBS) were shown to be able to partially block the delay of coagulation and the antithrombotic effect of saliva, and to totally abolish the modulation of endothelium activation, in spite of the fact that RIBS has no effect on the inhibition of platelet aggregation. The set of data presented in this work allows a better understanding of the phenomena occurring in the host during parasitism, and also gives more insights to improve the understanding of the hematophagy process and the pathophysiological mechanisms behind host-tick interaction.

Orientadora : Drª. Lucélia Donatti / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 21/02/2014 / Inclui bibliografia / Área de concentração : Biologia celular e molecular / Resumo: Peixes antárticos são espécies adaptadas ao frio, consideradas estenotérmicas, sendo seu metabolismo eficiente em baixas temperaturas. Estudos recentes sobre alterações climáticas relatam que a Península Antártica apresenta aquecimento acelerado, é extremamente importante entender a plasticidade metabólica e os mecanismos bioquímicos envolvidos na aclimatação a altas temperaturas de peixes antárticos para a conservação destas espécies e do ecossistema Antártico. O presente trabalho teve o objetivo de analisar o efeito do estresse térmico sobre a morfologia e o sistema de defesa antioxidante em eritrócitos de Notothenia rossii e Notothenia coriiceps, expostos durante 1, 3 e 6 dias a 8+0.5°C e a 0+0.5°C. Variações morfológicas nos eritrócitos e nos níveis de atividade de alguns constituintes enzimáticos como a glutationa peroxidase (GPx); superóxido dismutase (SOD); glutationa S-transferase (GST); catalase (CAT); glutationa redutase (GR) e quantificação do constituinte não enzimático, glutationa reduzida (GSH) e lipoperoxidação lipídica (LPO), por dosagem de malonaldeído (MDA) foram analisados. Em N. coriiceps o aumento da temperatura a 8°C não modulou os níveis de SOD e GPx. Mas modulou negativamente os níveis de CAT em 1 (87% menor em 8°C quando comparado a 0°C) e 3 dias (90% menor em 8°C quando comparado a 0°C). A GST foi modulada positivamente em 3 dias (57,9% maior em 8°C quando comparado a 0°C) e negativamente em 6 dias (81,9% menor em 8°C quando comparados a 0°C). A GR foi modulada positivamente em 1 dia ( 69,9% maior em 8°C quando comparado a 0°C) e 3 dias (81% maior em 8°C quando comparado a 0°C). Em Notothenia rossii o aumento da temperatura não modulou os níveis de GPx e GR. Mas, a SOD foi modulada positivamente em 6 dias (68% maiores em 8°C quando comparados a 0°C) e a CAT foi modulada positivamente em 3 dias (97% maiores em 8°C quando comparados a 0°C) e negativamente em 6 dias (86% menores em 8°C quando comparados a 0°C). A GST também foi modulada negativamente em 6 dias (81,9% menor em 8°C quando comparados a 0°C). Os níveis de GSH não foram modulados pela temperatura em ambas as espécies. O níveis de MDA foram modulado negativamente em 3 dias a 8°C em ambas as espécies e houve modulação positiva em 1 dia para N. coriiceps pelo aumento da temperatura. Análises morfológicas dos eritrócitos indicaram que em N. coriiceps o aquecimento a 8°C determinou o aumento da frequência de alterações no formato celular, presença de vesículas na membrana plasmática, núcleo em Blebbed e fissura nuclear. Em N. rossii o estresse térmico influenciou o aumento da frequência de alterações no formato celular e a presença de núcleos em Blebbed. A proporção de eritrócitos maduros e imaturos, a frequência de micronúcleo, o deslocamento celular, volume celular e nuclear não foram influenciados pelo estresse térmico em ambas as espécies. Foi possível concluir que, nos nototenideos antárticos, N. rossii e N. coriiceps, espécies filogeneticamente muito próximas, os padrões de resposta frente ao aumento da temperatura ambiental foram diferentes. Palavras-chaves: eritrócitos, temperatura, estresse oxidativo, anormalidades celulares. / Abstract: Antarctic fish are cold-adapted species, considered stenothermal; the metabolism of this fishes is very efficient at low temperatures. Recent studies about climatic changes report accelerated warming in the Antartic Peninsula. For the conservation of Antartic ecosystem and species is extremely important to understand the metabolic plasticity and biochemical mechanisms involved in high temperatures acclimation of Antartic fishes. This study aimed to verify the effect of heat stress on the morphology and the antioxidant defense system in erythrocytes of Notothenia coriiceps and Notothenia rossii, exposed for 1, 3 and 6 days to 8 +0.5 +0.5 ° C and 0 ° C. Morphological changes in erythrocytes and activity levels of some enzymatic constituents like glutathione peroxidase ( GPx ), superoxide dismutase ( SOD ), glutathione S - transferase ( GST ), catalase ( CAT ), glutathione reductase ( GR ) and quantification of non-enzymatic constituent, reduced glutathione ( GSH ) and lipid peroxidation ( LPO ), by measurement of malondialdehyde (MDA) were analyzed. The temperature increase to 8ºC in N.coriiceps do not modulated levels of SOD and GPx, although, negatively modulates the levels of CAT 1 (87 % less than 8 ° C as compared to 0 ° C) and 3 days (90 % less than 8 ° C as compared to 0 ° C). GST was positively modulated in 3 days (57.9% 8 ° C higher in comparison to 0 ° C) and negatively within 6 days (81.9 % less than 8 ° C as compared to 0 ° C). The GR was positively modulated at 1 day ( 69.9% 8 ° C higher in comparison to 0 ° C) and 3 days (81 % increase at 8 ° C as compared to 0 ° C). The temperature increase in N. rossii do not modulate GPx levels of GR . However, SOD was positively modulated in 6 days (68 % higher when compared to 8C 0 ° C) and CAT was positively modulated in 3 days (97% at 8 ° C higher in comparison to 0 ° C) and negatively 6 days (86 % lower at 8 ° C as compared to 0 ° C). GST was also negatively modulated in 6 days (81.9 % less than 8 ° C as compared to 0 ° C). Morphological analysis of erythrocytes indicated that in N. coriiceps heating at 8 °C determined the increase frequency of changes in cell format, presence of vesicles in plasma membrane and Blebbed nucleus. Heat stress at 6 days in N. rossii influenced an increase frequency of changes in cell shape and presence of Blebbed nucleus. The proportion of mature and immature erythrocytes, frequency of micronucleus and cell displacement, cell and nuclear volume were not affected by heat stress in both species. In conclusion, N. rossii and N. coriiceps, phylogenetically close Antarctic nototenideos, have different patterns of response due to increased environmental temperature. Keywords: erythrocytes, temperature, oxidative stress, cellular abnormalities.

Orientadora : Profa. Dra. Rosana Nogueira de Morais / Coorientadora: Prof. Dr. Anderson J. Martino Andrade / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 25/10/2012 / Inclui bibliografia / Resumo: O lobo-guará (Chrysocyon brachyurus, Illiger 1811) é uma das espécies mais conhecidas de canídeos que habitam as áreas de cerrado. A espécie é classificada pela IUCN - International Union for Conservation of Nature - na categoria "quase ameaçada". Esforços para a conservação de lobos-guará têm sido feitos, visando manter populações de cativeiro viáveis. Infelizmente, a população em cativeiro não é auto-sustentável devido à baixa taxa de prenhez e alta mortalidade neonatal. Especula-se que essa baixa eficiência reprodutiva possa estar associada com distúrbios endócrinos gonadais, como resultado do estresse crônico de cativeiro. Desta forma, nossos objetivos foram gerar dados básicos sobre a função gonadal e adrenocortical de lobos guará cativos em condições normais e submetidos a estimulação adrenocortical aguda e crônica. Foram coletadas amostras de fezes de lobos-guará e os metabólitos de corticóides (MCF), progestágenos (MPF), androgênios (MAF) e estrogênios (MEF) foram extraídos das fezes e quantificados por enzima imunoensaio. No primeiro manuscrito desse estudo, foram caracterizados os padrões de excreção de metabólitos hormonais fecais ao longo do ciclo reprodutivo normal de lobos-guará. Fezes de 9 lobos-guará adultos foram coletadas de 2-5 dias / semana durante período de 5-12 meses. Foram avaliadas as concentrações médias totais obtidas para todos os metabolitos hormonais fecais. As concentrações de todos os metabolitos gonadais fecais apresentaram-se baixas no anestro para ambos os gêneros. Nas fêmeas, durante o proestro observou-se aumento nas concentrações de MEF e MAF. Já as concentrações de MPF tiveram elevação no período peri-ovulatório, mantendo-se elevada durante todo o diestro. Os machos apresentaram aumento nas concentrações de todos os metabólitos gonadais fecais apenas no período referente à lactação e cuidado parental. Em relação à função adrenocortical, as concentrações de metabólitos de corticóides fecais nas fêmeas foram mais altas nos períodos de proestro, lactação e cuidado parental; enquanto que nos machos houve elevação de MCF apenas no período de cuidado parental, quando os mesmos participam do cuidado com os filhotes. No segundo manuscrito desse estudo, foram avaliados os efeitos da estimulação adrenocortical crônica e aguda nas concentrações de metabólitos gonadais fecais. Para melhor entendimento desse manuscrito, o mesmo foi subdividido em três partes, cujos objetivos foram: parte 1) avaliar como a estimulação adrenocortical crônica afeta a função gonadal; parte 2) analisar como a estimulação adrenocortical aguda, por meio da administração de hormônio adrenocorticotrópico (ACTH), afeta a função gonadal; e parte 3) avaliar as funções adrenocortical e gonadal de dois casais cativos de lobos-guará mantidos em recintos menores e com exposição à visitação pública. Nas partes 1 e 3 desse manuscrito, amostras fecais de 5 casais de lobos-guará foram coletadas de 2-5 dias / semana durante 10-21 meses. Na parte 2 foram analisadas amostras fecais de 11 lobos-guará foram coletadas por 3 -7 dias antes até 7-14 dias após os estímulos adrenocorticais agudos, pela administração do ACTH sintético de curta duração. Os resultados obtidos na parte 1 mostraram que machos e fêmeas tiveram evidências endócrinas de estimulação adrenocortical crônica. Os perfis longitudinais para metabólitos gonadais fecais mostraram padrões acíclicos. Na parte 2, o desafio ao ACTH mostrou diminuição nas concentrações de androgênios (MAF) e aumento em estrogênios (MEF) nos machos. Houve correlação positiva (r2 = 0,750, P <0,01) entre as concentrações de MCF e MPF em situações de estímulo agudo em ambos os gêneros. Na parte 3, os perfis longitudinais de metabólitos de corticóides fecais (MCF) não demonstraram claramente características de estresse crônico nos casais mantidos em recintos menores e sujeitos à visitação pública, no entanto todos os animais apresentaram os elevados níveis de metabólitos gonadais fecais. Em conclusão, o primeiro manuscrito (estudo de caracterização) demonstrou que fêmeas de lobos-guará apresentam flutuações hormonais típicas do ciclo reprodutivo normal de canídeos, enquanto que os machos apresentam aumento nas concentrações de androgênios durante o período de acasalamento e cuidado parental. Aumentos fisiológicos nos corticóides ocorrem na fase de proestro em fêmeas e no período de lactação e cuidado parental em ambos os gêneros. O manuscrito 2 (análise de estresse) demonstrou perda dos padrões hormonais normais durante o ciclo reprodutivo dos animais quando os mesmos estão em condições de hiperestimulação adrenocortical prolongada e, ainda, alterações nas concentrações de metabólitos gonadais fecais nas condições de estimulação adrenocortical aguda, confirmando que tanto a estimulação aguda como, e principalmente, crônica do eixo HHA pode comprometer a eficiência reprodutiva em lobos-guará. / Abstract: The maned wolf (Chrysocyon brachyurus, Illiger 1811) is one of the most typical canid species that inhabits the Brazilian grassland areas (known as Cerrado). This species is recognized by the IUCN - International Union for Conservation of Nature - as 'nearly threatened'. Efforts for conservation of maned wolves have been done in order to maintain a viable and self-sustaining captive population. Unfortunately, the captive population is not self-sustained due to low pregnancy success and high neonatal mortality. It is speculated that their low reproductive efficiency may be associated with endocrine gonadal disorders as a result of chronic captivity stress. Thus, our aims were to generate basic data about gonadal and adrenocortical function in captive maned wolves under normal conditions and subjected to chronic and acute adrenocortical stimuli. Fecal samples of captive maned wolves were collected and metabolites of corticoid (FCM), progestagens (FPM), androgens (FAM) and estrogens (FEM) were extracted from feces and quantified by enzyme immunoassay. In the first manuscript of this study, excretion patterns of fecal hormones metabolites throughout normal reproductive cycle in maned wolves were investigated. Feces from 9 adult animals were collected 2-5 days/week for 2-12 months. The overall concentration mean of fecal hormones metabolites was analyzed. Anestrus showed lower concentration of fecal gonadal metabolites in both genders. At proestrus there was an increase on the level of FAM and FEM in female. FPM concentration begins to rise at the periovulatory period, maintaining a high level during diestrus. In males, after the pups' birth, during lactation and parental care period, fecal gonadal metabolites means have a significant increase. Regarding adrenocortical function, fecal corticoid metabolites on females showed higher concentration during proestrus and lactation and parental care period, while in males this elevation was observed only during parental care, as they participate in the care of the pups. In the second manuscript of this study, effects of chronic and acute adrenocortical stimulation on fecal gonadal metabolites were evaluated. To better understand this manuscript it was subdivided in three parts, whose the aims were: part 1) evaluate how a chronic stimulation on adrenocortical activity affects the gonadal function; part 2) analyze how the acute adrenocortical stimulation (by administration of adrenocorticotropic hormone - ACTH) affects the excretion of fecal sex steroid metabolites; and part 3) evaluate fecal adrenocortical and gonadal metabolites concentrations in two couples captive maned wolves kept in smaller enclosures and exposure to public visitation. In parts 1 and 3 of this manuscript, fecal samples of five maned wolf couples were collected 2-5 days/week for 10-21 months. On part 2, fecal samples of 11 maned wolves were collected during 3-7 days before up to 7-14 days after adrenocortical stimuli, by the administration of a short-acting synthetic ACTH. On part 1, male and female demonstrated endocrine evidences of adrenocortical chronic stimulation and gonadal longitudinal profiles showed an acycling pattern. On part 2, the ACTH challenge led to a decrease of androgens and increase of estrogens levels in male. There were positive correlations (r2=0.750; P<0.01) between FCM and FPM concentration on acute stress for both genders. In part 3, longitudinal profiles did not clearly demonstrate characteristics of chronic stress on couples kept in smaller enclosures subject to public visitation, however all animals presented higher fecal gonadal metabolites levels. In conclusion, the first manuscript (characterization study) demonstrated that female maned wolves present typical hormonal fluctuations of a normal canine reproductive cycle, while male show increased androgens concentrations during mating and parental care periods. Corticoids normally rise during proestrus in female and lactation / parental care period in both genders. The manuscript 2 (study of stress) demonstrated loss of normal reproductive cycle profiles, when the animals were in conditions of prolonged adrenocortical hyperstimulation; and also, changes on fecal gonadal metabolites concentration in conditions of acute adrenocortical stimulation; confirming that both chronic and acute stimulation of the HPA axis can compromise reproductive efficiency in captive maned wolves.

Orientador : Prof. Dr. Francisco Filipak Neto / Co-orientador : Prof. Dr. Ciro Alberto de Oliveira Ribeiro / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 27/02/2015 / Inclui referências / Área de concentração : Biologia celular e molecular / Resumo: O aumento das atividades antropogênicas vem sendo causa de uma crescente eutrofização dos ambientes aquáticos, levando a floração de cianobactérias, dentre as quais algumas produtoras de cianotoxinas potencialmente tóxicas à vida animal e à saúde humana. Desta forma, fazem-se necessárias a avaliação dos principais danos causados pelas toxinas assim como a investigação os mecanismos de toxicidade da cilindrospermopsina (CYN) em células. Particularmente, modelos in vitro empregando a linhagem de hepatocarcinoma humano (HepG2) são importantes para a investigação dos mecanismos de toxicidade das cianotoxinas nas células. O objetivo do presente estudo foi investigar as respostas de células HepG2 frente à exposição a diferentes concentrações da cilindrospermopsina (CYN) através de ensaios de viabilidade celular; atividade das enzimas de biotransformação de fase II (Glutationa S-transferase - GST); sistema de resistência a multidrogas (MDR); ambiente redox celular, quantificação da produção de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio; danos oxidativos a biomoléculas; e alterações na morfologia das células. Além disso, determinou-se se a indução de isoformas do citocromo P450 aumenta a sensibilidade das células à CYN e avaliou-se a expressão diferencial de proteínas (proteoma). A CYN não se apresentou tóxica na concentração de 10 ?g l-1, levando a um aumento da viabilidade e toxicidade celular em células cultivadas com 10% de soro bovino fetal (SBF). A redução da concentração de SBF para 2% e a indução das isoformas do citocromo P450 (CYP) tornaram o metabolismo das células HepG2 mais próximas das células "normais". Após a indução, poucos parâmetros foram alterados, como a peroxidação lipídica. No entanto, baixas concentrações de CYN (inferior ou igual a 10 ?g l-1) induziram um aumento da proliferação e toxicidade celular. Analisando o proteoma das células expostas a CYN, identificaram-se 26 proteínas, as quais estão envolvidas em diferentes processos biológicos como enovelamento de proteínas, efluxo de xenobióticos, defesa antioxidante, metabolismo energético, anabolismo, sinalização, potencial tumorigênico e estrutura do citoesqueleto. Este perfil de proteínas indica que a exposição à CYN leva a um aumento da absorção e oxidação da glicose para proporcionar energia às células responder ao estresse químico. Aumento da proteína G (GPCRs), heterogeneous nuclear ribonucleoprotein (hnRNP) e dos níveis das espécies reativas de oxigênio (EROs) podem estar provocando o aumento da proliferação celular, e aumento do potencial tumorigênico das células HepG2. O excesso de espécies reativas de oxigênio ativou mecanismos de proteção celular como a multidrug resistance protein (MRP3) e a glutationa peroxidase. As alterações provocadas pela CYN nas proteínas do citoesqueleto também podem estar associadas com a proliferação celular bem como a reposição das proteínas danificadas pelas EROs. Palavras-chave: cianotoxina, cilindrospermopsina, HepG2, CYPs, proteômica, imunofluorescência / Abstract: The increase of anthropogenic activities has been causing eutrophication of aquatic environments, leading to bloom of cyanotoxin-producer cyanobacteria that can thread wildlife and human health. The evaluation of the toxic effects and the mechanisms of toxicity of cyanotoxins such as cylindrospermopsin (CYN) are important issues in toxicology. For these purposes, cell lines such as human hepatocellular carcinoma (HepG2) are very useful in vitro models. The aim of the current study was to investigate the responses of HepG2 cells after exposure to different concentrations of CYN through assays of cell viability; activities of glutathione S-transferase (GST, a phase II biotransformation enzyme) and the efflux transporters involved in multidrug resistance phenotype (MDR); oxygen and nitrogen reactive species levels; oxidative damage to biomolecules; and alterations of cell morphology. In addition, the possibility of increased toxicity to CYN due to cytochrome P450 (CYP) induction and the differential expression of proteins (proteome) have been investigated. CYN at 10 ?g l-1 was not toxic to HepG2 cells, leading to increased cell viability and metabolism in cells cultured with 10% fetal bovine serum (FBS). Decrease of FBS concentration to 2% and induction of CYP isoforms have made HepG2 cells more sensitive to exposure to CYN. After induction, few parameters have changed, e.g., lipid peroxidation. However, CYN at low concentrations (bellow or equal 10 ?g l-1) has induced increases of cell proliferation and metabolism. A total of 26 proteins have been differentially expressed in CYN-exposed cells versus control. These proteins are involved in different biological processes like protein folding, xenobiotic efflux, antioxidant defense, energy metabolism, anabolism, cell signaling, tumorigenic potential and cytoskeleton structure. This protein profile indicates that the exposure to CYN leads to an increased absorption and breakdown of glucose as to provide energy for the cells to respond to chemical stress. Increased G protein (GPCRs), nuclear ribonucleoprotein heterogeneous (hnRNP) and the levels of reactive oxygen species (ROS) may be associated with increased cell proliferation, and increased tumorigenic potential of HepG2 cells. The excess ROS has activated cellular protection mechanisms such as MRP3 and glutathione peroxidase. The changes caused by CYN in cytoskeletal proteins may also be associated with cell proliferation as well as replacement of proteins damaged by ROS. Keywords: cyanotoxin, Cylindrospermopsin, HepG2, CYP, proteomics, immunofluorescence

Orientador: Maria Teresa Barros Schutz Co-orientadora: Dirnei Seli F.Baroni / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular / Resumo: Ratos das gerações P, F1, F2, foram contaminados com uma solução do herbicida Tordon 0,1% na água de beber. O processo de contaminação pelo Tordon foi efetuado sobre os filhotes, através de suas mães, durante o período de gestação e amamentação. Nas três gerações foram quantificados: a proporção sexual em cada ninhada, número de dias para o nascimento dos filhotes, número de filhotes que morriam após o nascimento em cada ninhada e em cada grupo experimental. Na geração F1 foram quantificados o reflexo de endireitamento, o tempo de abertura palpebral, e o peso corporal, bem como, foram feitos testes comportamentais (movimentação espontânea, teste do "Rota-Rod", teste do "Open-Field", teste do "Plus-Maze" e esquiva ativa). Após todos estes processos, foi feito um estudo histológico a nível de sistema nervoso central e de testículos. Nossos resultados mostraram que a proporção sexual entre os filhotes de mães contaminadas (1 macho : 1 fêmea) é diferente (p<0,05) da proporção observada entre os filhotes do grupo controle (6 machos : 5 fêmeas). As fêmeas contaminadas demoraram mais (p<0,05) para dar cria que as fêmeas do grupo controle. Os animais contaminados nasceram com uma tendência de peso corporal menor, que se manteve até, aproximadamente, os 49 dias de idade. Aos 53 dias de idade o peso corporal destes animais tornou-se maior que os dos controles, permanecendo assim até a idade adulta. O reflexo de endireitamento levou mais tempo para ser adquirido no grupo Tordon, enquanto que o tempo de abertura palpebral é igual nos dois grupos. Nos testes comportamentais, verificamos que a movimentação espontânea aos 40 e aos 90 dias de idade é maior no grupo Tordon, sendo que no grupo controle há um decréscimo e no grupo Tordon um aumento da movimentação espontânea dos 40 para os 90 dias de idade. Por outro lado, no teste do "Rota-Rod" não se observou diferença entre os grupos experimentais. No teste do "Open-Field" os animais contaminados ambularam menos, tiveram um tempo de "freezing" maior, um número de "rearing-up" menor e um tempo de "grooming" maior. Em relação aos parâmetros de defecação e micção, não foram observadas diferenças. No teste de "Plus-Maze", os parâmetros %TA e T/NEA foram maiores no grupo Tordon. No teste de esquiva ativa os animais Tordon mostraram tendência a um desempenho maior. Apesar de todos estes resultados, o material histológico corado com H.E e/ou impregnado por prata não apresentou nenhuma alteração morfológica, quer seja a nível de S.N.C. ou a nível de testículos. Assim, devido a todas as alterações comportamentais observadas, podemos inferir que o herbicida Tordon contamina os filhotes através da barreira placentária, hemato-encefáfica e mesmo através do leite na amamentação. Podendo, com isto, causar alterações funcionais irreversíveis no S.N.C. Alterações estas que foram observadas na idade adulta do animal, quando foram feitos os testes comportamentais e não havia contato com o herbicida há, pelo menos, 40 dias. / Abstract: Three generation of rats P, F1, F2 was contaminated with "Tordon" 0,1% solution in water drink. The offspring Tordon contamination was done via their mothers during pregnancy and lactation. At the three generation was quantified the sexual ratio in each progeny; number of days for bird offspring and number of dead offspring in each experimental group. The F1 was used for quantified the time to respond stand upright reflex; eyelid opening time; body weight and behavioral tests (spontaneous movement, "Rota-Rod" time, "Open-Field" test, "Plus-Maze" test and active avoidance) and histological studies of C.N.S and testicles. Our experimental results demonstrated a sexual ratio 1 male : 1 female at the contaminated animal (TA) and 6 males : 5 females in control group (CA); contaminated females had longer gestational period than the control females; the (TA) were born with non significant lower body weight in comparison the (CA). However from 53 days old their average body weight become higher than the mean of non contaminated group; the contaminated rats were able to responsed to the stand upright reflex later than (CA) in spite of eyelid opening time being the same for both groups. At behavioral tests we have found that : Tordon group spontaneous movement rate was higher than the (CA) at 40 and 90 days old with a increasing rate in (TA) and decreasing rate in (CA) between first and second measurement. The results from "Rota-Rod test" were similar to both groups. Contaminated animals at the Open-Fields test, ambulated less, had a higher time of freezing, lower number of rearing-up and a higher time of grooming. Number of boluses and miction equal to control group. Plus-Maze test showed higher TA% and T/NEA for (TA), while active-avoidance test demonstrated a tendency of worse of performance for (TA). In spite of morphological alteration of C.N.S. and testicles were not observed at histological examinations, the behavioral changes found led us to condud that probably Tordon herbicide was able to cross the placentary and hemato-encephalic barrier and were present at the milk, causing irreversible functional alterations at C.N.S. that stayed until adult age when the behavior test occurred.

Gliomas são os tumores mais comuns no SNC, apresentando altas taxas de invasibilidade e proliferação, resistência à quimio e radioterapias, e elevados índices de recorrência e morte. As células-tronco tumorais constituem uma minoria dentre as células do tumor, apresentam características de células tronco neurais podendo sofrer diferenciação e auto-renovação. Linhagens celulares de gliomas, como U87, são capazes de produzir tumoresferas quando em alta confluência, que são similares às neuroesferas produzidas por células tronco neurais, e são ricas em células tronco tumorais (CSCs). Em gliomas, CSCs podem ser identificadas por expressarem o marcador de superfície CD133. Receptores purinérgicos estão envolvidos em diversos processos biológicos. O ATP induz respostas celulares como proliferação e diferenciação, e a degradação deste nucleotídeo por células de glioma é lenta, o que resulta no seu acúmulo no espaço extracelular. O objetivo deste trabalho é identificar a população de CSCs em U87 bem como o efeito do ATP na formação de esferas, expressão do marcador CD133, a expressão de genes de receptores purinérgicos e de genes marcadores de células diferenciadas (GLAST e CAMKII) e de células indiferenciadas (CD133 e OCT-4). U87 foram mantidas em condições padrão com 5% de SFB e esferas foram obtidas através de crescimento sobre ágar 1%. RNA total foi extraído de esferas e monocamada, e os genes de interesse foram amplificados em reação de RT-PCR com primers específicos. Esferas apresentam uma maior expressão de CD133, visto por citometria e imunodetecção. O mRNA de OCT-4 também foi mais expresso em esferas do que em monocamada, que expressa mais CAMKII e GLAST. ATP em uma concentração final de 100 µM reduz significativamente o número de esferas formadas (P<0.05) durante um período de 7 dias e também reduz a expressão de CD133. Dentre os receptores purinérgicos, a expressão de P2X4 foi maior em esferas, e P2X6 em monocamada. Estes resultados indicam que as esferas possuem componentes de células tronco e que a sinalização purinérgica pode estar envolvida em importantes aspectos da biologia de CSCs. / Glioblastoma multiformes are the most aggressive tumors in the CNS and are characterized by high invasion and proliferation rates, as well as for being resistant to chemo and radiotherapies. This leads to one of the worst prognosis among cancers. Cancer stem cells (CSCs) are scarce among the tumor cells, but can undergo differentiation and self-renewal, being fundamental for tumor maintenance. Tumorspheres, which resemble neurospheres, can grow in glioma cell cultures and are rich in CSC. Additionally, CSCs seem to be more resistant to radiotherapy and strategies aimed at differentiating these stem cells have potential to produce less aggressive and more efficient treatment regimes. CSCs have been identified in different tumor types as well as in established cell lines such as the human glioma cell line U87, and are characterized by the presence of the CD133 glycoprotein. Purinergic receptors are stimulated by nucleotides and nucleosides, and are involved in many biological processes, including embryonic development. ATP induces several cellular responses, such as proliferation and differentiation, and it has been demonstrated that the degradation of this nucleotide is slow in glioma cells, which results in its accumulation in the extracellular space. The aim of this work was to characterize the CSC population in U87 and the effect of ATP in sphere formation. Spheres were obtained by plating cells on a thin layer of agar. Tumorspheres presented a higher amount of CD133 marker as analyzed by flow citometry and western blotting. mRNA expression of OCT-4, a marker of undifferentiated cells, was higher in spheres, while GLAST and CAMKII, markers of differentiated glial and neuronal cells respectively, presented higher expression in the monolayer cells. Cells plated in the presence of ATP 100 µM formed 54% less spheres (P<0.05) when compared to control and also had a reduced level of CD133 marker. Among the purinergic receptors, P2X4 expression was higher in spheres, whereas P2X6 expression was higher in the monolayer. Our results indicate that spheres have components of stem cells and that the purinergic signaling is involved in important aspects of CSC biology.

Carrapatos são artrópodos hematófagos distribuídos por todo o mundo e vetores de diversas doenças. Como todos os hematófagos, os carrapatos possuem um arsenal de moléculas que inibe a resposta hemostática do hospedeiro, o que viabiliza o repasto sanguíneo bemsucedido. O carrapato bovino Rhipicephalus (Boophilus) microplus é um carrapato de um só hospedeiro e considerado o mais importante parasito de animais domésticos da América Latina. O R. microplus causa sérios danos aos bovinos, direta, e principalmente, devido à espoliação de sangue que leva à anemia e diminuição da produção de leite e do ganho de peso; e, indiretamente, via a transmissão de patógenos, como Babesia spp. e Anaplasma spp. O R. microplus é também um modelo interessante para o estudo das relações parasitohospedeiro, visto que ele permanece fixado ao mesmo hospedeiro durante toda a sua vida parasitária, o que leva em torno de três semanas. Os objetivos deste trabalho são explorar os mecanismos farmacológicos da saliva do carrapato R. microplus capazes de modular o sistema hemostático, bem como o papel que esta modulação desempenha na relação parasito-hospedeiro. Nesse sentido, este estudo foi organizado em duas partes. Primeiramente, foi realizada uma investigação sobre os parâmetros hemostáticos em bovinos infestados por carrapatos. Em um segundo momento, foram estudados os mecanismos da saliva do carrapato envolvidos na inibição da hemostasia, assim como a habilidade do soro de bovinos repetidamente infestados (que apresentam resistência imunológica naturalmente adquirida contra o carrapato bovino) em interferir na ação antihemostática da saliva do carrapato. Na primeira parte do estudo, foi demonstrado que bovinos experimentalmente infestados com 20.000 larvas de R. microplus apresentam uma diminuição na capacidade de agregação plaquetária (em resposta a colágeno e ADP), bem como na coagulação sanguínea (evidenciada por um aumento nos tempos de tromboplastina parcialmente ativado e de protrombina), enquanto a contagem de plaquetas e os níveis de fibrinogênio aumentaram significativamente ao longo da infestação. Na segunda parte, foi demonstrado que a saliva de R. microplus: (i) apresenta atividade inibitória in vitro sobre a agregação plaquetária induzida por colágeno; (ii) inibe a indução de ativação endotelial; e (iii) reduz a trombogênese in vivo. Ademais, o soro de bovinos repetidamente infestados (RIBS) foi capaz de bloquear parcialmente a atividade anticoagulante e antitrombótica da saliva e totalmente a modulação da ativação endotelial, ao passo que o RIBS não apresentou nenhum efeito sobre a inibição da agregação plaquetária. O conjunto dos dados apresentados permite um melhor entendimento dos fenômenos que ocorrem no hospedeiro durante o parasitismo, e também fornece mais subsídios para uma maior compreensão do processo de hematofagia e dos mecanismos fisiopatológicos que regem a relação parasitohospedeiro. / Ticks are blood-feeding arthropods widely distributed in the world and vectors of several diseases. Like all hematophagous animals, ticks resort to a variety of molecules in order to avoid the host hemostatic response, which in turn allow a successful blood-meal. The cattle tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus is an one-host tick, and is considered the most harmful parasite of domesticated animals in Latin America. R. microplus causes expressive injuries to bovines, directly, mainly due to blood spoliation, leading to anemia, and diminution of milk production and weight gain. Indirectly the tick is responsible for the transmission of pathogens such as Babesia spp. and Anaplasma spp. R. microplus is also a consistent model to study the parasite-host relationship, since it remains attached to the same host throughout the whole parasitic stage, which lasts around three weeks. This work aims at exploring the pharmacological mechanisms of R. microplus tick saliva able to modulate hemostasis, and the role of this modulation in tick-host relationship. In this sense, this study was organized in two parts: firstly, an investigation about the hemostatic parameters in tick infested bovines was performed. Secondly, the tick salivary mechanisms involved in the inhibition of hemostasis were studied, and the ability of serum from repeatedly infested bovines (which displays natural acquired immunological resistance to the cattle tick) to interfere in anti-hemostatic activity of tick saliva was also investigated. In the first part of this study it was shown that calves experimentally infested with 20,000 R. microplus larvae display a decrease in platelet aggregation (in response to collagen and ADP) as well as in coagulation ability (evinced by an increase in activated partial thromboplastin time and prothrombin time), whereas platelet blood count and fibrinogen level significantly increased during the course of infestation. In the second part of this work, it was demonstrated that R. microplus saliva: (i) displays in vitro inhibitory activity upon collagen-induced platelet aggregation; (ii) inhibits the induction of endothelial activation; and (iii) reduces thrombogenesis in vivo. Moreover, repeated infested bovine sera (RIBS) were shown to be able to partially block the delay of coagulation and the antithrombotic effect of saliva, and to totally abolish the modulation of endothelium activation, in spite of the fact that RIBS has no effect on the inhibition of platelet aggregation. The set of data presented in this work allows a better understanding of the phenomena occurring in the host during parasitism, and also gives more insights to improve the understanding of the hematophagy process and the pathophysiological mechanisms behind host-tick interaction.

Submitted by Marlene Santos (marlene.bc.ufg@gmail.com) on 2014-09-08T17:59:46Z No. of bitstreams: 1 LARISSA MATUDA MACEDO.pdf: 1925394 bytes, checksum: f5aee8d90e490ce7d7b1a21ffa29993c (MD5) / Made available in DSpace on 2014-09-08T17:59:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 LARISSA MATUDA MACEDO.pdf: 1925394 bytes, checksum: f5aee8d90e490ce7d7b1a21ffa29993c (MD5) Previous issue date: 2014-02-12 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás - FAPEG / Activation of the Angiotensin Converting Enzyme 2 (ACE2)-Angiotensin-(1-7) [Ang(1-7)]-Mas Receptor axis results in protective effects in the cardiovascular system. ACE 2 is an important component of Renin-Angiotensin System, because it is able to convert Angiotensin II in Ang-(1-7). Recents studies have shown that diminazene aceturate (DIZE) act as an activator of ACE 2. The objective of this study was to evaluate the cardiovascular effects of chronic treatment with DIZE in pressureoverloaded rats and the possible mechanisms involved in these effects. Male Wistar rats (200-350 g) were divided in four groups: (1) Sham; (2) Coarcted (abdominal aortic banding, CAA); (3) CAA + DIZE (1 mg/kg, gavage); e (4) CAA + DIZE (1 mg/kg, gavage) + A-779 (120 µg/day, osmotic mini-pumps). Twenty one days after surgery procedure, the blood pressure was recorded, the hearts were isolated and perfused according to Langendorff method. Vascular reactivity was measured by isolated aortic ring preparation. In order to evaluate the cardiac hypertrophy, the left ventricular mass index (VMI) was calculated through the ratio of the left ventricular wet weight to tibia length. The cross-sectional area of cardiomyocytes (CSA) was also evaluated. The mRNA levels for ANP, BNP e TGF-β were also evaluated by qRT-PCR. The expression of ACE-2 and ERK1/2, AKT, mTOR, GATA-4, catalase and SOD proteins involved in hypertrophic pathways was analyzed by Western Blot technique. The results are presented as means ± SEM. One-way ANOVA followed by the Newman-Keuls post-test was used to analyze the blood pressure, cardiac morphometric parameters, isolated heart, qRT-PCR and Western Blot experiments. Two-way ANOVA followed by the Bonferroni post-test was used for aortic rings preparation protocols. All statistical analyses were considered significant at P<0.05. Isolated hearts from coarcted rats presented a significant decrease in the left ventricular end systolic pressure (128.1 ± 9.0 vs. 79.1 ± 12.8 mmHg in CAA, P<0.05), left ventricular developed pressure (118.1 ± 8.9 vs. 69.0 ± 12.7 mmHg in CAA, P<0.05), +dP/dt (2295.0 ± 161.8 vs. 1406.0 ± 246.5 mmHg/s in CAA, P<0.05) and dP/dt (1787.0 ± 166.0 vs. 1066.0 ± 181.9 mmHg/s in CAA, P<0.05). The DIZE treatment attenuated all of these effects induced by CAA. Moreover, DIZE treatment increased the coronary flow in hypertrophic hearts (CAA: 11.6 ± 0.8 vs. CAA+DIZE: 15.8 ± 0.6 mL/min, P<0.05). This effect was blocked by A-779. Pressure–overloaded hearts showed a significant increase in VMI (0.17 ± 0.01 vs. 0.21 ± 0.01 g/cm in CAA, P<0.05) and CSA (8.98 ± 0.54 vs. 10.72 ± 0.27 µm in CAA, P<0.05). The chronic treatment with DIZE prevented the heart hypertrophy (10.72 ± 0.27 in CAA vs. 9.25 ± 0.23 µm in CAA+DIZE, P<0.05). Indeed, treatment with A-779 attenuated the antihypertrophic effect induced by DIZE treatment. The coarcted rats presented a increase in mRNA expression of ANP, BNP and TGF-β and the DIZE treatment reverted this effect. The pressure overload decreased the acetylcholine-induced relaxation in aortic rings from coarcted rats and treatment with DIZE was not able to improve this effect. The coarctation decreased the phosphorylation of the AKT, which was not changed by DIZE treatment. The expression of ACE 2, total and phosphorylated ERK1/2, total AKT, mTOR, SOD and catalase was not changed by coarctation or by ACE 2 activation. These results show that the chronic treatment with DIZE was efficient in preventing the left ventricular hypertrophy and cardiac dysfunction induced by pressure overload. These effects were independent of changes in the expression of ACE 2, ERK1/2, AKT, mTOR, SOD and catalase. Thus, DIZE has important therapeutic potential for cardiovascular diseases. / A ativação do eixo Enzima Conversora de Angiotensina 2 (ECA2)-Angiotensina-(1-7) [Ang-(1-7)]-Receptor Mas resulta em importantes efeitos protetores no sistema cardiovascular..A ECA 2 é um importante componente do Sistema ReninaAngiotensina, pois hidrolisa a Angiotensina II em Ang-(1-7). Recentes estudos tem demonstrado que o aceturato de diminazeno (DIZE) apresenta capacidade de aumentar a atividade da ECA 2. Sendo assim, o objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos cardiovasculares do DIZE nas mudanças induzidas por sobrecarga pressórica e possíveis mecanismos intracelulares envolvidos nestes efeitos. Foram utilizados ratos Wistar (200-350 g), divididos em quatro grupos: (1) Sham; (2) Coarctados (coarctação da aorta abdominal, CAA), (3) CAA + DIZE (1 mg/kg, gavagem); e (4) CAA + DIZE (1 mg/kg, gavagem) + A-779 (120 µg/dia, mini-bombas osmóticas). Decorridos 21 dias da coarctação, a pressão arterial dos animais foi registrada, os corações foram isolados e perfundidos pelo método de Langendorff com pressão constante. A reatividade vascular foi avaliada por preparação de anéis de aorta isolada. Para avaliar a hipertrofia cardíaca, o peso dos ventrículos esquerdos foi normalizado pelo comprimento das tíbias e expresso como índice de massa ventricular (IMV), além da área de secção transversa dos cardiomiócitos (AST) ser também medida. Os níveis de mRNA para ANP, BNP e TGF-β também foram avaliados por qRT-PCR. A expressão de ECA 2 e das proteínas ERK1/2, AKT, mTOR, GATA-4, SOD e catalase, envolvidas em vias pró-hipertróficas, foi analisada através da técnica de Western Blot. Os resultados foram apresentados como média ± erro padrão da média. Para as análises de pressão arterial média, coração isolado e parâmetros morfométricos, qRT-PCR e Western Blot, foi utilizado o teste ANOVA One Way seguido pelo pós-teste de Newman-Keuls. Para a reparação de anéis de aorta isolada, foi usado ANOVA Two Way seguido pelo teste de Bonferroni. As diferenças foram consideradas significativas com P<0,05. Os corações isolados dos ratos coarctados apresentaram diminuição significativa da pressão ventricular esquerda ao final da sístole (128,1 ± 9,0 vs. 79,1 ± 12,8 mmHg em CAA, P<0,05), pressão desenvolvida pelo ventrículo esquerdo (118,1 ± 8,9 vs. 69,0 ± 12,7 mmHgem CAA, P<0,05), +dP/dt (2295,0 ± 161,8 vs. 1406,0 ± 246,5 mmHg/s em CAA, P<0,05) e -dP/dt (1787,0 ± 166,0 vs. 1066,0 ± 181,9 mmHg/s em CAA, P<0,05). A ativação da ECA 2 atenuou a disfunção ventricular esquerda induzida pela coarctação. O tratamento com DIZE aumentou o fluxo coronariano dos corações hipertrofiados (CAA: 11,6 ± 0,8 vs. CAA+DIZE: 15,8 ± 0,6 mL/min, P<0,05). Este efeito foi loqueado pelo A-779. Os corações submetidos a sobrecarga pressórica mostraram um umento significativo do IMV (0,17 ± 0,01 vs. 0,21 ± 0,01 g/cm em CAA, P<0,05) e AST (9,37 ± 0,55 vs. 10,72 ± 0,27 µm em CAA, P<0,05). A ativação da ECA 2 preveniu a hipertrofia cardíaca (AST: 10,72 ± 0,27 vs. 9,25 ± 0,23 µm em CAA + DIZE, P<0,05). O tratamento com A-779 atenuou o efeito anti-hipertrófico produzido pelo DIZE nos corações coarctados. A coarctação também promoveu aumento da expressão de mRNA de ANP, BNP e TGF-β e o tratamento com DIZE reverteu esse efeito. A sobrecarga pressórica diminuiu o relaxamento induzido por acetilcolina em anéis de aorta isolada e o tratamento com o ativador da ECA 2 não foi capaz de alterar esse efeito. A coarctação diminuiu a fosforilação da AKT e o tratamento com DIZE não foi capaz de alterá-la. Não foram encontradas alterações na expressão das proteínas ECA 2, ERK1/2 total e fosforilada, AKT total, mTOR, GATA-4, SOD e catalase. Tais resultados mostram que o tratamento crônico com DIZE apresenta efeitos cardioprotetores contra a disfunção cardíaca induzida pela sobrecarga pressórica através da diminuição da hipertrofia ventricular esquerda, sem mudanças na expressão de ECA 2, ERK1/2, AKT, mTOR, GATA-4, SOD e catalase. Portanto, o DIZE possui importante potencial terapêutico frente a doenças cardiovasculares.

Ureases (EC 3.5.1.5) são metaloenzimas que hidrolisam uréia para produzir amônia e dióxido de carbono. Estas enzimas, que são amplamente encontradas em fungos, bactérias e plantas, compartilham de estruturas similares. A presença de urease em várias bactérias patogênicas (Helicobacter pylori e Proteus mirabilis, p.e) está fortemente correlacionada com a patogênese em doenças humanas. Muitos fungos de importância médica possuem atividade ureásica, entre eles citamos Cryptococcus neoformans, Coccidioides immitis, Histoplasma capsulatum, Sporothrix schenckii, e espécies de Trichosporon e Aspergillus. C. neoformans é uma levedura que produz vários fatores de virulência conhecidos, como presença de cápsula polisacarídica, produção de melanina e capacidade de desenvolvimento a 37ºC. A maioria de isolados clínicos produz grandes quantidades de urease e muitos autores sugerem que a urease de Cryptococcus exerça uma função importante na patogênese, porém com mecanismos ainda não esclarecidos. Cryptococcus gattii – sorotipo B, tipo molecular VGII, linhagem R265, com capacidade de infectar pacientes imunocompetentes, causou uma epidemia na Ilha de Vancouver (Canadá) entre 1999 e 2003. Neste trabalho desenvolvemos um procedimento de purificação e apresentamos a caracterização físico-química e cinética da urease de C. gattii, cepa R265, após ter sido purificada na razão de 539 vezes. A massa molecular estimada foi de 120 kDa, Km 2,0 mM para uréia, pH ótimo 8,0. O ácido acetohidroxâmico demonstrou ser um bom inibidor em concentrações micromolares, enquanto ρ-hidroximercuriobenzoato causou inibição em concentrações mais altas, comparado a outras ureases. Espera-se que estudos adicionais com essa urease purificada permitam investigar propriedades biológicas independentes da atividade ureolítica e estabelecer sua contribuição para a patogênese da criptococose. / Ureases (EC 3.5.1.5) are metalloenzymes that hydrolyze urea to produce ammonia and carbon dioxide. These enzymes, which are found in fungi, bacteria, and plants show very similar structures. The presence of urease in many pathogenic bacteria (Helicobacter pylori and Proteus mirabilis) is strongly correlative with pathogenesis in human diseases. Many medically important fungi have urease activity, among which are Cryptococcus neoformans, Coccidioides immitis, Histoplasma capsulatum, Sporothrix schenckii, and species of Trichosporon and Aspergillus. C. neoformans is a heterothallic yeast with several known virulence factors, including a polysaccharide capsule, melanin production, and the ability to grow at 37°C.The majority of clinical isolates produce large amounts of urease and several authors suggest that Cryptococcal urease play an important role in pathogenesis but with unclear mechanisms but probably by different routes dependent and independent of ureolytic activity, althought many questions are unclear. We wanted to further investigate the role of urease in biological properties by using Cryptococcus gattii as a pathogen model. C. gatti – serotype B, molecular type VGII, R265 strain, which has capacity to infect immunocompetent individuals, caused an outbreak on Vancouver Island in Canada from 1999 to 2003. This work presents the physicochemical characterization of a urease from C. gatti strain R265 after a 539 fold purification. The estimated native molecular mass was 120 kDa, Km 2.0 mM urea, pH optimum 8.0. Aceto hydroxamic acid was a strong inhibitor at low concentration while ρ-hidroxy mercuribenzoate needed higher concentrations for inhibition compared to other ureases.

As fosfodiesterases do tipo 2A (PDE2A) hidrolisam os nucleotídeos cíclicos cAMP e cGMP e por isso desempenham papel importante na sinalização intracelular. PDE2A é composta por uma região N-terminal, que ao contrário de outras famílias de PDEs, não possui função conhecida, dois domínios regulatórios, GAF A e GAF B, e um domínio catalítico localizado na porção C-terminal. Sabe-se que a hidrólise dos nucleotídeos cíclicos, pela PDE2A, é ativada pela ligação de cGMP ao domínio regulatório GAF B. Em uma triagem dois híbridos, identificamos XAP2 como a principal proteína interatora de PDE2A. XAP2 é um componente crucial do complexo multiprotéico do receptor Aril hidrocarboneto (Ahr), o principal fator de transcrição que controla a expressão de múltiplos genes envolvidos em detoxificação. Neste trabalho, foi determinado que XAP2 liga o domínio GAF B da enzima PDE2A. Ensaios de atividade fosfodiesterásica, utilizando proteínas purificadas, mostram que a ligação de XAP2 não interfere na atividade enzimática de PDE2A. Para analisar se PDE2A afeta a função de XAP2, foi investigado o deslocamento de Ahr para o núcleo. Sabe-se que a regulação da expressão dos genes alvos de Ah é iniciada pela ligação de tetraclorodibenzodioxina (TCDD) e por uma via, ainda pouco entendida, dependente de cAMP. Verificamos que a ligação de PDE2A à XAP2 inibe o deslocamento de Ahr para o núcleo, induzido por TCDD e por cAMP em células hepáticas Hepa1c1c7 em cultura. Em conclusão, mostramos neste trabalho que XAP2 recruta PDE2A para o complexo Ahr, causando a inibição da mobilidade de Ahr, possivelmente pela redução local da concentração de cAMP. Esses dados suportam o papel de cAMP no controle da função de Ahr. / Phosphodiesterase type 2A (PDE2A) hydrolyzes cyclic nucleotides cAMP and cGMP thus efficiently controlling cNMP-dependent signaling pathways. PDE2A is composed of an N-terminal region, two regulatory GAF domains and a catalytic domain. Cyclic nucleotide hydrolysis is known to be activated by cGMP binding to GAF-B, however, other mechanisms may operate to fine-tune local cyclic nucleotide levels. In a yeast-two-hybrid screening we identified XAP2, a crucial component of the aryl hydrocarbon receptor (AhR) complex, as a major PDE2A-interacting protein. We mapped the XAP2 binding site to the GAF-B domain of PDE2A. PDE assays with purified proteins showed that XAP2 binding does not change the enzymatic activity of PDE2A. To analyze if PDE2A could affect the function of XAP2 we studied nuclear translocation of AhR, i.e. the master transcription factor controlling the expression of multiple detoxification genes. Notably, regulation of AhR target gene expression is initiated by tetrachlorodibenzodioxin (TCDD) binding to AhR and by a poorly understood cAMP-dependent pathway, followed by the translocation of AhR from the cytosol into the nucleus. Binding of PDE2A to XAP2 inhibited TCDD- and cAMP-induced nuclear translocation of AhR in Hepa1c1c7 hepatocytes. We conclude that XAP2 targets PDE2A to the AhR complex thereby restricting AhR mobility, possibly by a local reduction of cAMP levels. Our results provide first insights into the elusive cAMP-dependent regulation of AhR.