Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Bovine herpesvirus types 1 and 5 (BoHV-1, BoHV-5) are genetically and antigenic related viruses and have been associated with important economic losses to the cattle industry. The aim of this Thesis was to perform the molecular identification of BoHV-1 and BoHV-5 isolates. The first part describes the identification of 40 herpesviruses isolated from different clinical specimens and syndromes in central-southern Brazil, Argentina and Uruguay (1987 2006). The differentiation between BoHV-1 and BoHV-5 was performed by examining the size of the amplification product of a glycoprotein C gene-based PCR, designed for a low homology region of the gene. BoHV-1 isolates (n=16) were identified in cases of respiratory disease (n=3), vulvovaginitis and/or balanoposthitis (n=3), in semen of healthy bulls (n=5) and in cases of neurological disease (n=5). Samples identified as BoHV-5 (n=24) were isolated predominantly from cases of neurological disease (n=21), but also from semen of healthy bulls (n=2) and from a spleen of a calf with systemic disease (n=1). These results show that both BoHV-1 and BoHV-5 are not strictly associated with their respective diseases; yet are frequently involved in clinical conditions otherwise attributed to the other virus type. These findings also reinforce the need of correctly identifying the herpesvirus isolates as to better understand their pathogenesis and epidemiology. In the second part, it is reported the characterization of five Brazilian BoHV-1 isolates associated with neurological disease, an unusual finding. All five samples were isolated from the brain of cattle presenting neurological disease, yet histological evidences of meningoencephalitis were not observed in three cases. The isolated viruses were identified as BoHV-1 by a glycoprotein C gene-based PCR able to differentiate BoHV-1 from BoHV-5. The identity of the isolates was confirmed by nucleotide sequencing of the amplicons and by restriction analysis of PCR products from another gC region. Monoclonal antibody binding and cross-neutralization assays with BoHV-1 and BoHV-5 antisera showed a typical BoHV-1 antigenic profile. Inoculation of rabbits with these five BoHV-1 isolates did not result in neurological disease, contrasting with fatal meningoencephalitis produced by BoHV-5. Thus, the involvement of BoHV-1 in neurological disease of cattle is more frequent than previously reported, indicating the need for fast and precise means of differentiating it from BoHV-5. Likewise, the potential role of BoHV-1 in neurological disease in cattle should be further investigated. / Os herpesvírus bovino tipos 1 e 5 (BoHV-1, BoHV-5) são agentes geneticamente e antigenicamente relacionados que causam grandes prejuízos econômicos à bovinocultura. O objetivo desta tese foi o de realizar a identificação e diferenciação molecular de isolados de BoHV-1 e BoHV-5. Na primeira parte, foi relatada a identificação de 40 amostras de BoHV isoladas de diferentes casos clínicos na região Centro-Sul do Brasil, Argentina e Uruguai entre 1987 e 2006. A diferenciação entre BoHV-1 e BoHV-5 foi realizada pelo uso de um PCR para uma região de baixa homologia do gene da glicoproteína C, o que permitiu a diferenciação entre os tipos virais pelo tamanho do amplicon. As amostras identificadas como BoHV-1 (n=16) foram isoladas de doença respiratória (n=3), balanopostite e/ou vulvovaginite (n=3), do sêmen de touros saudáveis (n=5) e de casos doença neurológica (n=5). As amostras identificadas como BoHV-5 (n=24) foram, em sua maioria, isoladas de doença neurológica (n=21), mas também do sêmen de touros saudáveis (n=2) e do baço de um bezerro com doença sistêmica (n=1). Esses resultados demonstram que tanto o BoHV-1 como o BoHV-5 não estão estritamente associados às suas respectivas síndromes clínicas e que podem estar envolvidos em casos clínicos classicamente atribuídos ao outro tipo viral. Esses achados também reforçam a necessidade da correta identificação dos isolados de herpesvírus para um melhor conhecimento da sua patogenia e epidemiologia. Na segunda parte do trabalho, foram caracterizados cinco isolados de BoHV-1 provenientes de casos de doença neurológica. Esses vírus foram isolados do encéfalo de bovinos que apresentavam sinais neurológicos. Entretanto, evidências histológicas de meningoencefalite não foram observadas em três dos cinco casos. Os isolados foram identificados como BoHV-1 pela utilização de um PCR direcionado para o gene da gC. A identidade dos isolados foi confirmada pelo sequenciamento do amplicon e também por um segundo PCR para outra região do gene da gC, seguido de análise de restrição enzimática do amplicon. A caracterização antigênica com anticorpos monoclonais e testes de soroneutralização cruzada demostraram um perfil típico de BoHV-1. Esses cinco isolados também foram inoculados em coelhos, nos quais não produziram doença neurológica. Esses resultados demostram que o envolvimento de BoHV-1 em doença neurológica em bovinos é mais frequente do que o relatado anteriormente, evidenciando a necessidade de uma precisa diferenciação entre os tipos virais.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / This dissertation reports the standardization of a monoclonal antibody (MAb)-based immunoenzymatic test (ELISA) for detection of antibodies to bovine herpesvírus types 1 and/or 5 (BoHV-1 and BoHV-5). The initial steps involved the determination of the most suitable MAb, the appropriate dilutions of viral antigen and test sera; and the cut-off value of the assay. After standardization, the ELISA was validated by testing 506 cattle serum samples previously tested for neutralizing antibodies to BoHV-1 and BoHV-5 by virus neutralizing (VN) assay. Comparing to the VN for BoHV-1 antibodies, the ELISA presented sensitivity and specificity of 96.6% and 98.3%, respectively. Positive and negative predictive values were 97.6%, the concordance between the tests was 97.6% and the coefficient of correlation k (kappa) was 0.95, demonstrating an excellent correlation. Comparing to the VN for BoHV-5 antibodies, the ELISA presented 94.3% of sensitivity, 97.9% of specificity, 97.1% of positive predictive value, 95.9% negative predictive value, concordance of 96.4% and kappa coefficient of 0.92. These results demonstrate that the ELISA presents suitable specificity and sensitivity to be used for individual and herd serological diagnosis of BoHV-1 and BoHV-5, thus, representing an alternative for VN assays and imported ELISA kits. / Essa dissertação relata a padronização de um teste imunoenzimático do tipo ELISA, com base em anticorpo monoclonal (AcM), para a detecção de anticorpos séricos que reagem contra herpesvírus bovino tipos 1 e/ou 5 (BoHV-1, BoHV-5). Inicialmente, determinou-se o AcM mais adequado para a sensibilização das placas, as diluições apropriadas do antígeno e dos soros-teste e o ponto de corte do ensaio. Após a padronização, o ensaio foi validado testando-se 506 amostras de soro bovino, previamente testadas para anticorpos neutralizantes contra o BoHV-1 e/ou BoHV-5 pela técnica de soroneutralização (SN). Comparando-se com os resultados da SN frente ao BoHV-1, o teste de ELISA apresentou sensibilidade e especificidade de 96,6% e 98,3%, respectivamente. Os valores preditivos positivo e negativo foram de 97,6%, a concordância foi de 97,6% e o índice de correlação (kappa) entre os testes foi de 0,95, o que indica uma excelente concordância. Comparando-se com os resultados da SN frente ao BoHV-5, o ELISA apresentou 94,3% de sensibilidade; 97,9% de especificidade; 97,1% de valor preditivo positivo e 95,9% de valor preditivo negativo. Para o BoHV-5, a concordância entre os testes foi de 96,4% e o índice de correlação foi de 0,92, também excelente. Esses resultados demonstram que o teste padronizado apresenta sensibilidade e especificidade adequados para o diagnóstico sorológico das infecções pelo BoHV-1 e BoHV-5 em nível individual e de rebanho. Dessa forma, o ensaio pode se constituir em alternativa para o teste de SN e para os kits de ELISA importados.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The present study describes an investigation of the attenuation/virulence and immunogenicity of a recombinant BoHV-5, a candidate vaccine strain. The recombinant BoHV-5gE/TKΔ was constructed out of a Brazilian BoHV-5 strain (SV507/99) and contains deletions in glycoprotein E (gE) gene as antigenic marker - and thymidine kinase (TK) gene for attenuation. In Chapter 1, we investigated the attenuation and immunogenicity of the recombinant in calves. Eighty-to-ninety days old calves (n=6) inoculated intranasally (IN) with the recombinant virus (titer of 107.5 TCID50) showed no clinical signs, and shed low titers of virus in nasal secretions. On day 30 post-infection (pi), all animals had neutralizing antibodies against BoHV-5, in titers from 4 to 8 and remained negative for antibodies to gE. Administration of dexamethasone (Dx) to four of these calves at day 42 pi (0.1mg/kg/day during 5 days) did not result in virus shedding or increase in antibody titers, indicating lack of viral reactivation. In a second experiment, intramuscular immunization (IM) of calves with 8 months of age (n=9) with the recombinant virus (107.5 TCID50/animal) did not result in virus shedding or clinical signs. Vaccinated animals developed neutralizing antibodies in titers from 2 to 8 at day 42 post-vaccination (PV) and remained negative for gE antibodies. Finally, 21 calves (approximately 10 months old) were vaccinated IM with the recombinant virus (107.3 TCID50). All vaccinated animals developed neutralizing antibodies in titers from 2 to 16 at day 30pv. A boost vaccination performed on those animals at day 240 pv resulted in a rapid and strong anamnestic antibody response, with VN titers reaching from 16 to 256 at day 14 post-booster. Serum samples of all animals remained negative for gE antibodies. Serum samples from vaccinated animals showed cross-neutralizing activity against nine field isolates of BoHV-5 and eight of BoHV-1. Chapter 2 describes an investigation of the immunogenicity and protection conferred by the recombinant virus against homologous (BoHV-5) and heterologous challenge (BoHV-1). A group of nine calves seronegative for BoHV-5 were vaccinated IM in a dose of 107.5 TCID50 of the recombinant virus and eight animals were maintained as non vaccinated controls. All vaccinated animals seroconverted 14 days postvaccination (pv), with neutralizing antibody titers from 2 to 4. At day 42 post-vaccination (pv), the vaccinated animals and controls were challenged by IN instillation of BoHV-5 or BoHV-1 isolates. After challenge, the length and magnitude of virus shedding was reduced in vaccinated animals compared to controls in both groups (challenged with BoHV-1 and BoHV-5). The vaccinated animals did not show systemic, respiratory or neurological clinical signs after challenge. Furthermore, the control animals challenged with BoHV-5 (n=4) developed severe neurological disease and were euthanized in extremis between days 13 and 14 post-challenge (pd). The challenge resulted in a strong and rapid anamnestic response in vaccinated animals, inducing neutralizing titers higher than in control animals. Antibodies to gE were detected only after challenge in both vaccinated and controls calves. These results indicate that recombinant BoHV-5 gE/TKΔ is an adequate candidate for a vaccine strain, with an antigenic marker, since it is attenuated and immunogenic for calves and provides homologous and heterologous (BoHV-1) protection. / O presente trabalho descreve a atenuação/virulência e imunogenicidade de uma cepa recombinante do herpesvírus bovino tipo 5 (BoHV-5) candidata a cepa vacinal. O recombinante BoHV-5gE/TKΔ foi construído a partir da cepa brasileira SV507/99 e contém deleções nos genes da glicoproteína E (gE) como marcador antigênico - e da enzima timidina quinase (TK), para atenuação. No capítulo 1, investigou-se a atenuação e imunogenicidade do recombinante em bezerros. Bezerros com 80 a 90 dias de idade (n=6), inoculados pela via intranasal (IN) com o vírus recombinante (título de 107,5 TCID50) não apresentaram sinais clínicos, e excretaram títulos baixos de vírus nas secreções nasais. No dia 30 pós-infecção (pi), todos os animais possuíam anticorpos neutralizantes contra o BoHV-5, em títulos entre 4 e 8, permanecendo soronegativos para a gE. Administração de dexametasona (Dx) a quatro desses bezerros no dia 42 pi (0.1mg/kg/dia durante 5 dias) não resultou em excreção viral ou em aumento dos títulos de anticorpos, indicando ausência de reativação viral. Em um segundo experimento, vacinação intramuscular (IM) de bezerros com 8 meses de idade (n=9) com o recombinante (107,5TCID50/animal) não resultou em excreção viral ou em manifestações clínicas. Os animais vacinados desenvolveram anticorpos neutralizantes em títulos de 2 a 8 no dia 42 pós-vacinação (PV) e permaneceram negativos para anticorpos anti-gE. Finalmente, 21 bezerros (aproximadamente 10 meses de idade) foram vacinados com o recombinante (107,3 TCID50) pela via IM. Todos os animais vacinados desenvolveram anticorpos neutralizantes em títulos de 2 a 16 no dia 30pv. Revacinação desses animais no dia 240 pv provocou uma resposta anamnéstica rápida e intensa, resultando em títulos neutralizantes entre 16 e 256 no dia 14 pós-revacinação. O soro de todos os animais permaneceu negativo para anticorpos contra a gE. Amostras de soro dos animais vacinados apresentaram atividade neutralizante cruzada frente a nove isolados de BoHV-5 e oito de BoHV-1. O capítulo 2 relata uma investigação sobre a imunogenicidade e proteção conferida pelo vírus recombinante frente a desafio homólogo (BoHV-5) e heterólogo (BoHV-1). Para isso, nove bezerros soronegativos para o BoHV-5 foram vacinados pela via intramuscular com uma dose de 107,5DICC50 do vírus recombinante e oito animais foram mantidos como controle. Todos os animais vacinados soroconverteram aos 14 dias pós-vacinação (pv), apresentando títulos de anticorpos neutralizantes entre 2 e 4. No dia 42 pós-vacinação (pv), os animais vacinados e os controles foram desafiados pela inoculação intranasal (IN) de isolados de BoHV-5 ou de BoHV-1. Após o desafio, a excreção de vírus pelos animais vacinados foi reduzida em comparação com os não vacinados, nos dois grupos (desafiados com BoHV-1 e BoHV-5). Os animais vacinados também não apresentaram sinais clínicos sistêmicos, respiratórios ou neurológicos pós desafio. Por outro lado, os animais controles inoculados com o BoHV-5 (n=4) desenvolveram doença neurológica severa e foram eutanasiados in extremis entre os dias 13 e 14 pós-desafio (pd). O desafio provocou uma resposta anamnéstica intensa e rápida nos animais vacinados, induzindo títulos neutralizantes superiores aos animais não vacinados. Anticorpos contra a gE foram detectados apenas após o desafio, tanto nos vacinados quanto nos controles. Esses resultados indicam que o recombinante BoHV-5 gE/TKΔ é um candidato adequado a cepa vacinal com marcador antigênico, pois é atenuado e imunogênico para bezerros, confere proteção homóloga e também contra o BoHV-1.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Bovine herpesvirus type 1 (BoHV-1) is distributed worldwide and produces high economic losses to the in livestock industry. BoHV-1 infection causes respiratory, reproductive and may also be associated with neurological signs. There are several tests that can diagnose the infection, however, serological techniques currently used are not able to differentiate antibodies produced by vaccination from those produced in response to natural infection. What is sought is a mean to differentiate vaccinated animals of those infected by the field strain. Vaccines with deletion in the glycoprotein E (gE) gene have been developed for this purpose. However, this also requires the development of tests capable to differentiate the serological response between infected and vaccinated animals. To this end, a 651 nucleotide fragment corresponding to the amino-terminal third (217 amino acids) of the BoHV-1 gE gene - that shares a high identity with the homologous BoHV-5 counterpart - was cloned as a 6×His-tag fusion protein in an Escherichia coli expression vector pET16b. A soluble protein of approximately 25 kDa was purified from lysates of transformed E. coli. The recombinant protein was detected in Western blot (WB) by anti-6-his tag and anti BoHV-1 gE monoclonal antibodies. Antibodies present in the sera of cattle infected with BoHV-1 and BoHV-5 reacted specifically with the 25 kDa recombinant protein in WB. Moreover, mice immunized with the purified protein developed antibodies that recognized the viral gE in lysates of cell monolayers infected with BoHV-1 and BoHV-5. An indirect ELISA for gE antibodies, based on the expressed protein, was able to differentiate serologically calves vaccinated with a gE-deleted BoHV- 5 strain from calves experimentally infected with BoHV-1 or BoHV-5. These data demonstrate that the antigen retained its immunological properties and, thus, can be used in serological tests for bovine herpesvirus infections. It has a potential use in a indirect ELISA to differentiate naturally infected animals from those vaccinated whit the recombinant, gE-negative strains. / O herpesvírus bovino tipo 1 (BoHV-1) é um vírus de distribuição mundial e produz grandes prejuízos econômicos em rebanhos de corte e de leite. A infecção pelo BoHV-1 produz manifestações respiratórias, reprodutivas e também pode cursar com sinais nervosos. Existem diversos testes laboratoriais capazes de diagnosticar a infecção. Contudo, as técnicas sorológicas empregadas atualmente não são capazes de diferenciar anticorpos produzidos pela vacinação daqueles produzidos em resposta à infecção natural. Assim, vacinas diferenciais com deleção da glicoproteína E (gE) têm sido desenvolvidas com essa finalidade. No entanto, necessita-se também de testes capazes de diferenciar a produção de anticorpos vacinais dos induzidos pelo vírus vacinal. Com essa finalidade, essa dissertação relata a expressão e caracterização de um fragmento da glicoproteína E do BoHV-1 e seu uso no desenvolvimento e padronização de um ELISA indireto para detecção de anticorpos anti-gE. Um fragmento de 651 nucleotídeos correspondente ao terço amino-terminal (217 aminoácidos) do gene da gE do BoHV-1, que possui uma alta identidade com o homólogo herpesvírus bovino tipo 5 (BoHV-5), foi clonado com proteína de fusão 6xHis-tag em Escherichia coli utilizando vetor de expressão pET16b. Uma proteína solúvel de aproximadamente 25kDa foi purificada a partir de lisados de E. coli transformadas. A proteína recombinante foi detectada por Western blot (WB) por anticorpos monoclonais anti-histidina e anti-gE do BoHV-1. Anticorpos presentes no soro de animais infectados com BoHV-1 e BoHV-5 reagiram especificamente com a proteína recombinante no WB. Além disso, camundongos imunizados com a proteína purificada desenvolveram anticorpos que reconheceram a gE viral proveniente de lisados de monocamadas celulares infectadas com BoHV-1 e BoHV-5. Um ELISA indireto para detecção de anticorpos anti-gE, baseado na proteína expressa, foi capaz de diferenciar sorologicamente animais vacinados com a cepa gE deletada do BoHV-5 dos animais experimentalmente infectados com BoHV-1 ou BoHV-5. Esses resultados demonstram que o antígeno obtido conservou suas características imunológicas e pode ser utilizado na detecção sorológica das infecções por herpesvírus bovinos. Possui potencial para uso em grande escala como antígeno em testes de ELISA para diferenciar animais naturalmente infectados de animais vacinados com a cepas defectivas na gE

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-02-22Bitstream added on 2014-06-13T18:55:48Z : No. of bitstreams: 1 affonso_ib_me_jabo.pdf: 804054 bytes, checksum: 44c5a047b2c4507ea787e45752bb674c (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O Vírus Respiratório Sincicial Bovino (BRSV) é um dos patógenos pertencentes ao complexo respiratório bovino. Apesar de não provocar enfermidade severa na maioria dos casos, há evidências de que este vírus possa facilitar o estabelecimento de outros patógenos. Assim, o presente estudo buscou estabelecer a possibilidade de relação entre o BRSV e o Herpesvírus Bovino Tipo 1 (BoHV-1), em três propriedades leiteiras, localizadas em três municípios do noroeste do Estado de São Paulo. Além disso, visou também monitorar ao longo do tempo os títulos de anticorpos contra o BRSV em bezerros desde o nascimento. Com base em dados previamente estabelecidos, essas propriedades foram categorizadas como tendo alta, média e baixa prevalência de BoHV-1, respectivamente, propriedade A, no município de Viradouro, (78,6%); propriedade B, no município de Altinópolis, (40%); e, propriedade C, no município de Jaboticabal, (1,6%). Com relação à prevalência de BRSV, a propriedade B apresentou maior prevalência sorológica (82,4%), possivelmente por possuir fatores de risco facilitadores para o desenvolvimento da infecção, enquanto que as propriedades A e C mostraram prevalências estatisticamente equivalentes (45,6% e 59,1%, respectivamente), sem qualquer correlação entre as prevalências de BRSV e BoHV-1. A curva dos títulos de anticorpos contra o BRSV em bezerros nas propriedades A e B monitorados ao longo de um ano foi semelhante, pois ambas apresentaram redução dos títulos a partir do sexto até o oitavo mês de idade dos animais, com seguida retomada de títulos cada vez mais elevados, fato característico de infecção natural. A propriedade C apresentou uma dinâmica semelhante, porém, a maior parte dos bezerros manteve-se positiva durante todo o período, com títulos que decresceram e voltaram a aumentar. / The Bovine Respiratory Syncytial Vírus (BRSV) is one of the Bovine Respiratory Complex pathogens. The disease caused by this virus is often mild, but there are evidences that this pathogen may ease the establishment of other pathogens. Data on the epidemiology of BRSV are still scarce. Based on that, this study aimed to determine the prevalence and evaluate antibody titers in calves from three farms. Moreover, the relationship between BRSV and the Bovine Herpesvirus Type 1 (BHV-1) was investigated, based on epidemiological data previously determined in these farms. The three farms were categorized as A, in Viradouro municipality, with high prevalence of BHV-1 (78.6%); B, in Altinópolis municipaltity, with intermediate prevalence for this agent (40%); and C, in Jaboticabal municipality, with low prevalence of BHV-1 (1.6%). Farm B showed higher BRSV prevalence (82.4%), maybe due to larger herd and colder climate than farms A and C, which showed equivalent prevalences for BRSV (45.6% and 59.1%, respectively). The curve of antibody titers against BRSV in calves from farms A and B over one year were similar, as both showed lower titers by 6 to 8 months of age, rising up again due to antigenic induction. Farm C showed equivalent dynamics, but calves remained positive all over the year. In disagree to literature data, this experiment did not showed correlation between BRSV and BHV-1 prevalences, maybe due to lack of circulation of the latter.

Os herpesvírus bovino tipo 1 (BoHV-1) e 5 (BoHV-5) são alfaherpesvírus freqüentemente associados a meningoencefalites. Por outro lado, o vírus da raiva é o agente mais frequentemente identificado como causador de encefalites virais em bovinos no Brasil. O objetivo do presente estudo foi examinar a ocorrência de infecções por BoHV-1 e/ou BoHV-5 em amostras de tecido encefálico bovino submetidas ao diagnóstico de raiva e avaliar seu possível envolvimento nos quadros de encefalite que originaram a suspeita de raiva. Para tanto, 101 amostras desses tecidos, sendo 39 positivas para raiva e 62 negativas, recebidas pelo órgão oficial responsável pelo diagnóstico de raiva no Estado do Rio Grande do Sul (IPVDF) no período de 2009- 2010, foram submetidas a exames buscando o isolamento viral e amplificação de genomas de herpesvírus bovinos. Ao isolamento viral, todas as amostras foram negativas para vírus infeccioso após a realização de três passagens cegas em células MDBK. As mesmas foram submetidas à amplificação por “nested PCR” (nPCR) para a pesquisa de genomas de BoHV-1 e BoHV-5. Das 101 amostras totais analisadas esta técnica revelou que 25,7% (26/101) continham genomas de BoHV-1 e 21,8% (22/101) continham genomas de BoHV-5. Genomas de ambos os tipos foram identificadas em 30 (29,7%) amostras. Entre as amostras que foram também positivas para raiva em 23% (9/39) foram detectados genomas de BoHV-1 e em 15,4% (6/39) continham genomas de BoHV-5. Em 16 destas 39 amostras (41%) foram detectados genomas de BoHV-1 e BoHV-5. Em contrapartida, nas amostras negativas para o vírus rábico, 27,4% (17/62) também foram positivas para BoHV-1, 25,8% (16/62) foram positivas para BoHV-5. Detectaram-se os genomas de ambos BoHVs em 22,6% (14/62) dos animais. Estas diferenças não foram estatisticamente significativas, indicando não haver correlação entre a ocorrência de raiva e infecções por herpesvírus na amostragem realizada. Estes resultados indicam que, embora as infecções por BoHV-1 e BoHV-5 tenham apresentado elevada incidência nessas amostras, não havia vírus infeccioso nas mesmas, sugerindo infecções latentes sem envolvimento aparente nos quadros de encefalite que originaram a suspeita inicial de raiva. / Bovine herpesvirus type 1 (BoHV-1) and 5 (BoHV-5) are alphaherpesviruses associated with a number of clinical manifestations in cattle, including encephalitis. On the other hand, rabies virus is the agent most frequently identified as cause of viral encephalitis in cattle in Brazil. The aim of this study was to examine the occurrence of BoHV-1 and / or BoHV-5 in bovine brain tissue samples submitted to rabies diagnosis. The search was carried out by virus isolation and nested polymerase chain reaction (PCR) in brain tissues of cattle submitted to rabies diagnosis in the state of Rio Grande do Sul in the period 2009-2010. One hundred and one brain samples from cattle with signs of neurological disease, of which 39 were positive and 62 negative for rabies, were used in this study. At virus isolation, all samples were negative for the presence of infectious herpesviruses after three successive passages in MDBK cells. Of the 101 total samples analyzed, this test revealed that 25.7% (26/101) of cattle were infected with BoHV-1 and 21.8% (22/101) were infected with BoHV-5. Genomes of both types were detected in 29.7% (30/101) samples. With the 39 samples positive for rabies virus, BoHV-1 genome was detected in 23% (9/39) and 15.4% (6/39) were positive for BoHV-5 as well as in 41% (16/39) of these samples, which were positive for both BoHVs. On the other hand, the negative samples for rabies virus, 27.4% (17/62) also were positive for BoHV-1, as well and 25.8% (16/62) were positive for BoHV-5. Genomes of both BoHVs were detected in 22.6% (14/62) of the specimens. These differences were not statistically significant indicating no correlation between the occurrence of rabies and herpesvirus infections in the animals. These results do not imply that the herpesviruses detected, even showing a high incidence, were the causative agents of meningoencephalitis in the samples tested, once it was not possible to isolate virus in its infectious form, however it suggests a latent infection in the animals involved with neurological signs of meningoencephalitis whose primary suspicion was rabies.

Os herpesvírus bovino tipo 1 (BoHV-1) e 5 (BoHV-5) são alfaherpesvírus freqüentemente associados a meningoencefalites. Por outro lado, o vírus da raiva é o agente mais frequentemente identificado como causador de encefalites virais em bovinos no Brasil. O objetivo do presente estudo foi examinar a ocorrência de infecções por BoHV-1 e/ou BoHV-5 em amostras de tecido encefálico bovino submetidas ao diagnóstico de raiva e avaliar seu possível envolvimento nos quadros de encefalite que originaram a suspeita de raiva. Para tanto, 101 amostras desses tecidos, sendo 39 positivas para raiva e 62 negativas, recebidas pelo órgão oficial responsável pelo diagnóstico de raiva no Estado do Rio Grande do Sul (IPVDF) no período de 2009- 2010, foram submetidas a exames buscando o isolamento viral e amplificação de genomas de herpesvírus bovinos. Ao isolamento viral, todas as amostras foram negativas para vírus infeccioso após a realização de três passagens cegas em células MDBK. As mesmas foram submetidas à amplificação por “nested PCR” (nPCR) para a pesquisa de genomas de BoHV-1 e BoHV-5. Das 101 amostras totais analisadas esta técnica revelou que 25,7% (26/101) continham genomas de BoHV-1 e 21,8% (22/101) continham genomas de BoHV-5. Genomas de ambos os tipos foram identificadas em 30 (29,7%) amostras. Entre as amostras que foram também positivas para raiva em 23% (9/39) foram detectados genomas de BoHV-1 e em 15,4% (6/39) continham genomas de BoHV-5. Em 16 destas 39 amostras (41%) foram detectados genomas de BoHV-1 e BoHV-5. Em contrapartida, nas amostras negativas para o vírus rábico, 27,4% (17/62) também foram positivas para BoHV-1, 25,8% (16/62) foram positivas para BoHV-5. Detectaram-se os genomas de ambos BoHVs em 22,6% (14/62) dos animais. Estas diferenças não foram estatisticamente significativas, indicando não haver correlação entre a ocorrência de raiva e infecções por herpesvírus na amostragem realizada. Estes resultados indicam que, embora as infecções por BoHV-1 e BoHV-5 tenham apresentado elevada incidência nessas amostras, não havia vírus infeccioso nas mesmas, sugerindo infecções latentes sem envolvimento aparente nos quadros de encefalite que originaram a suspeita inicial de raiva. / Bovine herpesvirus type 1 (BoHV-1) and 5 (BoHV-5) are alphaherpesviruses associated with a number of clinical manifestations in cattle, including encephalitis. On the other hand, rabies virus is the agent most frequently identified as cause of viral encephalitis in cattle in Brazil. The aim of this study was to examine the occurrence of BoHV-1 and / or BoHV-5 in bovine brain tissue samples submitted to rabies diagnosis. The search was carried out by virus isolation and nested polymerase chain reaction (PCR) in brain tissues of cattle submitted to rabies diagnosis in the state of Rio Grande do Sul in the period 2009-2010. One hundred and one brain samples from cattle with signs of neurological disease, of which 39 were positive and 62 negative for rabies, were used in this study. At virus isolation, all samples were negative for the presence of infectious herpesviruses after three successive passages in MDBK cells. Of the 101 total samples analyzed, this test revealed that 25.7% (26/101) of cattle were infected with BoHV-1 and 21.8% (22/101) were infected with BoHV-5. Genomes of both types were detected in 29.7% (30/101) samples. With the 39 samples positive for rabies virus, BoHV-1 genome was detected in 23% (9/39) and 15.4% (6/39) were positive for BoHV-5 as well as in 41% (16/39) of these samples, which were positive for both BoHVs. On the other hand, the negative samples for rabies virus, 27.4% (17/62) also were positive for BoHV-1, as well and 25.8% (16/62) were positive for BoHV-5. Genomes of both BoHVs were detected in 22.6% (14/62) of the specimens. These differences were not statistically significant indicating no correlation between the occurrence of rabies and herpesvirus infections in the animals. These results do not imply that the herpesviruses detected, even showing a high incidence, were the causative agents of meningoencephalitis in the samples tested, once it was not possible to isolate virus in its infectious form, however it suggests a latent infection in the animals involved with neurological signs of meningoencephalitis whose primary suspicion was rabies.

Os herpesvírus bovino tipo 1 (BoHV-1) e 5 (BoHV-5) são alfaherpesvírus freqüentemente associados a meningoencefalites. Por outro lado, o vírus da raiva é o agente mais frequentemente identificado como causador de encefalites virais em bovinos no Brasil. O objetivo do presente estudo foi examinar a ocorrência de infecções por BoHV-1 e/ou BoHV-5 em amostras de tecido encefálico bovino submetidas ao diagnóstico de raiva e avaliar seu possível envolvimento nos quadros de encefalite que originaram a suspeita de raiva. Para tanto, 101 amostras desses tecidos, sendo 39 positivas para raiva e 62 negativas, recebidas pelo órgão oficial responsável pelo diagnóstico de raiva no Estado do Rio Grande do Sul (IPVDF) no período de 2009- 2010, foram submetidas a exames buscando o isolamento viral e amplificação de genomas de herpesvírus bovinos. Ao isolamento viral, todas as amostras foram negativas para vírus infeccioso após a realização de três passagens cegas em células MDBK. As mesmas foram submetidas à amplificação por “nested PCR” (nPCR) para a pesquisa de genomas de BoHV-1 e BoHV-5. Das 101 amostras totais analisadas esta técnica revelou que 25,7% (26/101) continham genomas de BoHV-1 e 21,8% (22/101) continham genomas de BoHV-5. Genomas de ambos os tipos foram identificadas em 30 (29,7%) amostras. Entre as amostras que foram também positivas para raiva em 23% (9/39) foram detectados genomas de BoHV-1 e em 15,4% (6/39) continham genomas de BoHV-5. Em 16 destas 39 amostras (41%) foram detectados genomas de BoHV-1 e BoHV-5. Em contrapartida, nas amostras negativas para o vírus rábico, 27,4% (17/62) também foram positivas para BoHV-1, 25,8% (16/62) foram positivas para BoHV-5. Detectaram-se os genomas de ambos BoHVs em 22,6% (14/62) dos animais. Estas diferenças não foram estatisticamente significativas, indicando não haver correlação entre a ocorrência de raiva e infecções por herpesvírus na amostragem realizada. Estes resultados indicam que, embora as infecções por BoHV-1 e BoHV-5 tenham apresentado elevada incidência nessas amostras, não havia vírus infeccioso nas mesmas, sugerindo infecções latentes sem envolvimento aparente nos quadros de encefalite que originaram a suspeita inicial de raiva. / Bovine herpesvirus type 1 (BoHV-1) and 5 (BoHV-5) are alphaherpesviruses associated with a number of clinical manifestations in cattle, including encephalitis. On the other hand, rabies virus is the agent most frequently identified as cause of viral encephalitis in cattle in Brazil. The aim of this study was to examine the occurrence of BoHV-1 and / or BoHV-5 in bovine brain tissue samples submitted to rabies diagnosis. The search was carried out by virus isolation and nested polymerase chain reaction (PCR) in brain tissues of cattle submitted to rabies diagnosis in the state of Rio Grande do Sul in the period 2009-2010. One hundred and one brain samples from cattle with signs of neurological disease, of which 39 were positive and 62 negative for rabies, were used in this study. At virus isolation, all samples were negative for the presence of infectious herpesviruses after three successive passages in MDBK cells. Of the 101 total samples analyzed, this test revealed that 25.7% (26/101) of cattle were infected with BoHV-1 and 21.8% (22/101) were infected with BoHV-5. Genomes of both types were detected in 29.7% (30/101) samples. With the 39 samples positive for rabies virus, BoHV-1 genome was detected in 23% (9/39) and 15.4% (6/39) were positive for BoHV-5 as well as in 41% (16/39) of these samples, which were positive for both BoHVs. On the other hand, the negative samples for rabies virus, 27.4% (17/62) also were positive for BoHV-1, as well and 25.8% (16/62) were positive for BoHV-5. Genomes of both BoHVs were detected in 22.6% (14/62) of the specimens. These differences were not statistically significant indicating no correlation between the occurrence of rabies and herpesvirus infections in the animals. These results do not imply that the herpesviruses detected, even showing a high incidence, were the causative agents of meningoencephalitis in the samples tested, once it was not possible to isolate virus in its infectious form, however it suggests a latent infection in the animals involved with neurological signs of meningoencephalitis whose primary suspicion was rabies.

Submitted by Marlene Santos (marlene.bc.ufg@gmail.com) on 2016-04-19T18:10:39Z No. of bitstreams: 2 Tese - Greyciele Rodrigues de Almeida - 2015.pdf: 2860659 bytes, checksum: c6b139400f7d4d535cf2e4ccecbabaed (MD5) license_rdf: 19874 bytes, checksum: 38cb62ef53e6f513db2fb7e337df6485 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-04-20T15:16:36Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Greyciele Rodrigues de Almeida - 2015.pdf: 2860659 bytes, checksum: c6b139400f7d4d535cf2e4ccecbabaed (MD5) license_rdf: 19874 bytes, checksum: 38cb62ef53e6f513db2fb7e337df6485 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-20T15:16:36Z (GMT). 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After three cycles of selection (biopanning) and amplification, 44 clones were isolated and their amino acid sequences were determined by sequencing generating 16 different sequences. ELISA, demonstrating the efficiency of selection from the specific antibodies, confirmed the reactivity of pooled clones. Another ELISA evaluated the individual specificity of the most frequent clones, the M13 phage was used as a negative control. We selected three peptides (B, C and E) with affinity for anti-BoHV-1 antibodies, and the E peptide (pepE), showed to have potential as antigen for antibody detection in a serological test for BoHV-1. Immunization of rabbits with the peptides induced specific production of serum antibodies, but they were not able do neutralize BoHV-1 cell lysis. The in silico analysis of the dodecapeptide E (1DRALYGPTVIDH12) enabled the identification of a new discontinuous epitope on the envelope glycoprotein B (gB Env) of bovine herpesvirus type 1 (BoHV-1). There is a short motif (338YKRD341) within a region of the env gB BoHV-1 with high similarity to motifs shared by dodecapeptide the N-terminal region (5YxARD1) of gB and HSV-1 (326YARD329), wherein the 328Arg residue is described as a target for neutralizing monoclonal antibodies (mAb) for HSV-1 gB. Besides the characterization of an antibody-binding site of the BoHV-1 Env gB, we have demonstrated that the phage-fused peptide has potential use as a reagent for virus diagnosis by phage-ELISA assay, discriminating BoHV-1 positive serum samples from negative ones. / Membro da família Herpesviridae, subfamília Alphaherpesvirinae, gênero Varicellovirus, o herpesvírus bovino 1 (BoHV-1) tem sido associado a diferentes condições clínicas em bovinos (doenças respiratórias, genitais e falhas reprodutivas). Não existe um procedimento padrão para medidas de controle e profilaxia das infecções causadas por herpesvírus. Nesse sentido, o phage display foi utilizado com o objetivo de selecionar novos antígenos mimetopos de glicoproteínas do herpesvírus bovino 1 (BoHV-1) e que apresentam potencial para uso em vacinas e diagnóstico. A técnica de phage display foi realizada com a utilização de uma biblioteca de peptídeos randômicos e lineares composta de 12 resíduos de aminoácidos fusionada à pIII de fagos M13 (sem peptídeo), contra anticorpos anti-BoHV-1, purificados em coluna de cromatografia por afinidade. Após três ciclos de seleção (biopanning) e amplificação, 44 clones foram isolados e as sequências de aminoácidos dos peptídeos foram determinadas pelo sequenciamento gerando 16 sequencias diferentes. A reatividade do pool de clones foi confirmada por ELISA, demonstrando a eficiência da seleção a partir dos anticorpos específicos. Para avaliação da especificidade individual, realizou-se o ELISA dos clones mais frequentes, tendo como controle negativo o fago M13. Foram selecionados três peptídeos (B, C e E) com afinidade por anticorpos anti-BoHV-1, e um destes, o peptídeo E (pepE), apresentou potencial antigênico na detecção de anticorpos para o diagnóstico sorológico do BoHV-1. Nos testes de imunização em coelhos, os três peptídeos induziram a produção de anticorpos específicos, porém, estes não foram capazes de neutralizar a lise celular ocasionada pelo BoHV-1 em placa. A análise in silico do dodecapeptídeo E (1DRALYGPTVIDH12) possibilitou a identificação de um novo epitopo descontínuo na glicoproteína B de envelope (Env gB) do BoHV-1. Há um curto motivo (338YKRD341) dentro de uma região do gene Env gB do BoHV-1, com alta similaridade com os motivos compartilhados pelo dodecapeptídio da região N-terminal (5YxARD1) da gB e do Herpesvirus Humano 1 (HSV-1) (326YARD329), em que o resíduo 328Arg é descrito como um alvo para anticorpos monoclonais neutralizantes (mAb) para a gB do HSV-1. Concluindo, além da caracterização de um sítio de ligação ao anticorpo na Env gB do BoHV-1, o pepE expresso pelo fago tem potencial de utilização como reagente para o diagnóstico virológico por ensaio ELISA-fago, que discrimina amostras de soro positivas e negativas para o BoHV-1.

Orientador: Samir Issa Samara / Banca: Sandra Possebon Gatti / Banca: Edvirges Maristela Pituco / Resumo: O Vírus Respiratório Sincicial Bovino (BRSV) é um dos patógenos pertencentes ao complexo respiratório bovino. Apesar de não provocar enfermidade severa na maioria dos casos, há evidências de que este vírus possa facilitar o estabelecimento de outros patógenos. Assim, o presente estudo buscou estabelecer a possibilidade de relação entre o BRSV e o Herpesvírus Bovino Tipo 1 (BoHV-1), em três propriedades leiteiras, localizadas em três municípios do noroeste do Estado de São Paulo. Além disso, visou também monitorar ao longo do tempo os títulos de anticorpos contra o BRSV em bezerros desde o nascimento. Com base em dados previamente estabelecidos, essas propriedades foram categorizadas como tendo alta, média e baixa prevalência de BoHV-1, respectivamente, propriedade A, no município de Viradouro, (78,6%); propriedade B, no município de Altinópolis, (40%); e, propriedade C, no município de Jaboticabal, (1,6%). Com relação à prevalência de BRSV, a propriedade B apresentou maior prevalência sorológica (82,4%), possivelmente por possuir fatores de risco facilitadores para o desenvolvimento da infecção, enquanto que as propriedades A e C mostraram prevalências estatisticamente equivalentes (45,6% e 59,1%, respectivamente), sem qualquer correlação entre as prevalências de BRSV e BoHV-1. A curva dos títulos de anticorpos contra o BRSV em bezerros nas propriedades A e B monitorados ao longo de um ano foi semelhante, pois ambas apresentaram redução dos títulos a partir do sexto até o oitavo mês de idade dos animais, com seguida retomada de títulos cada vez mais elevados, fato característico de infecção natural. A propriedade C apresentou uma dinâmica semelhante, porém, a maior parte dos bezerros manteve-se positiva durante todo o período, com títulos que decresceram e voltaram a aumentar. / Abstract: The Bovine Respiratory Syncytial Vírus (BRSV) is one of the Bovine Respiratory Complex pathogens. The disease caused by this virus is often mild, but there are evidences that this pathogen may ease the establishment of other pathogens. Data on the epidemiology of BRSV are still scarce. Based on that, this study aimed to determine the prevalence and evaluate antibody titers in calves from three farms. Moreover, the relationship between BRSV and the Bovine Herpesvirus Type 1 (BHV-1) was investigated, based on epidemiological data previously determined in these farms. The three farms were categorized as A, in Viradouro municipality, with high prevalence of BHV-1 (78.6%); B, in Altinópolis municipaltity, with intermediate prevalence for this agent (40%); and C, in Jaboticabal municipality, with low prevalence of BHV-1 (1.6%). Farm B showed higher BRSV prevalence (82.4%), maybe due to larger herd and colder climate than farms A and C, which showed equivalent prevalences for BRSV (45.6% and 59.1%, respectively). The curve of antibody titers against BRSV in calves from farms A and B over one year were similar, as both showed lower titers by 6 to 8 months of age, rising up again due to antigenic induction. Farm C showed equivalent dynamics, but calves remained positive all over the year. In disagree to literature data, this experiment did not showed correlation between BRSV and BHV-1 prevalences, maybe due to lack of circulation of the latter. / Mestre