O vírus da diarreia viral bovina (BVDV) é um dos principais patógenos virais dos bovinos e sua infecção causa importantes perdas na produção dos rebanhos afetados. O presente trabalho contém os estudos realizados para esclarecer determinados aspectos da epidemiologia e da detecção da infecção causada pelo BVDV no Estado do Rio Grande do Sul, Brasil. O primeiro artigo consistiu de um estudo transversal onde os níveis de anticorpos contra o BVDV em amostras de tanque de leite que foram correlacionados com os aspectos produtivos dos rebanhos. As amostras e as informações foram coletadas de 300 criações escolhidas aleatoriamente entre 1.656 associados de uma cooperativa de leite na região central do Estado do Rio Grande do Sul e que não utilizaram vacina contra BVDV nos últimos 12 meses anteriores ao experimento. Dessas, 80 foram consideradas positivas para BVDV pela detecção de anticorpos contra vírus em níveis superiores ao ponto de corte do teste de ELISA comercial utilizado. A prevalência aparente estimada foi de 26,7% e, usando um intervalo de confiança de 95%, apresentou uma variação entre 22 e 31%. Os parâmetros de produção mensal de leite, densidade de bovinos (relação vacas/hectare), tipo de armazenamento do leite e origem do sêmen não apresentaram associação com a infecção pelo BVDV, mas o aumento do número total de animais por rebanho foi correlacionado positivamente com a infecção. A prevalência estimada foi considerada baixa para uma população de rebanhos, criados em sistema semi-intensivo de produção de leite, que não usava medidas específicas de controle contra a infecção. A hipótese proposta no presente artigo é que o pequeno número de animais por rebanho está favorecendo a uma provável limpeza ou erradicação da infecção nas criações e que a prevalência encontrada deve corresponder ao ponto de equilíbrio entre a pressão de infecção e a limpeza da infecção destes rebanhos. A baixa prevalência estimada pode ser uma condição favorável para iniciar um programa de controle para BVDV na população estudada. No segundo artigo, um teste da transcrição reversa seguida da reação em cadeia da polimerase (RT-PCR) foi estabelecido para detecção do vírus nas amostras de tanque de leite dos rebanhos suspeitos de infecção ativa pelo BVDV identificados no primeiro artigo. O teste foi capaz de detectar até 0,001 TCID50 de BVDV por mL de leite. Esses resultados demonstraram uma sensibilidade analítica 100 ou 1000 vezes superior aos testes de RTPCR convencionais descritos anteriormente para leite e são semelhantes aos resultados obtidos em testes de RT-PCR em tempo real para BVDV. Na análise das amostras de campo, o teste detectou RNA viral em dois rebanhos entre os 59 analisados. Esses resultados comprovaram a capacidade do teste para identificar amostras naturalmente infectadas e a presença de vacas adultas produtivas e virêmicas em 3% dos rebanhos suspeitos de infecção. Este teste é uma alternativa rápida e sensível para monitorar a infecção pelo vírus em rebanhos leiteiros, a partir de amostras coletivas. O terceiro artigo tratou da detecção do BVDV em carrapatos Rhipicephalus (Boophilus) microplus alimentados em bovino persistentemente infectado (PI). Seu objetivo foi investigar o papel do carrapato bovino R. microplus na transmissão do BVDV. O RNA viral foi detectado nas teleóginas alimentadas no bovino PI, mas não pode ser identificado em sua progênie (ovos e larvas). Esses resultados sugeriram não haver transmissão transovariana do BVDV nos carrapatos. Por outro lado, a infestação experimental de um segundo bovino com as larvas oriundas das teleóginas contaminadas com BVDV não resultou em manifestação clínica e o animal foi negativo no teste de RT-PCR. O experimento demonstrou que o carrapato R. microplus pode ser contaminado com BVDV durante o repasto sanguíneo, reforçando a idéia de que vetores hematófagos possam estar envolvidos na disseminação da doença e merecem mais investigações. / Bovine viral diarrhea virus (BVDV) is one of the main pathogenic agents in cattle and the infection with the agent causes important production losses in the affected herds. The present work contains studies carried out to clarify some aspects of the epidemiology and detection of the infection caused by BVDV in the State of Rio Grande do Sul, Brazil. The first paper consisted of a transversal study, where antibody levels against BVDV in samples of bulk milk tank were correlated with some aspects of milk production in the herds. Samples and information were collected from 300 herds randomly chosen between 1656 associates of a dairy cooperative in the region of the central area of the state of Rio Grande do Sul, Brazil, that were not using routine vaccination against BVDV in the last 12 months previous to the experiment. Among them, 80 were considered positive to BVDV by detection of antibodies against the virus in levels above the cut off point of the commercial ELISA test used. The apparent estimated prevalence was 26.7% and, using a confidence interval of 95%, showed a range between 22 and 31%. The parameters of average milk production, bovine density (relationship cattle/hectare), milk storing process and origin of the semen were not significantly associated with BVDV infection, but the increase in the total number of cows in the herds was positively correlated with the infection. The prevalence was considered low for a population of herds raised in a semi-intensive milk production system that was not using specific measures to control the viral infection. The hypothesis proposed in the present study is that the small number of animals present in the analyzed herds would favors a likely virus clearance in the herd and that the prevalence found would correspond to a point of balance between the pressure of infection and the virus clearance. The low prevalence detected can be a favorable condition to launch a control program for BVDV in the studied population. In the second paper, a reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) was established for BVDV detection in bulk tank milk samples of the herds suspected of active infection with BVDV in the first paper. The test detected up to 0.001 TCID50 of BVDV per mL of milk. These results demonstrated an analytical sensitivity 100 to 1000 times higher than conventional RT-PCR tests described previously for milk and are similar to results obtained by the use of real time RT-PCR already published. In the analysis of field samples, the test detected viral RNA in 2 out of 59 analyzed herds. These results demonstrated the relationship between the ability of the test to identify samples naturally infected and the presence of viremic adult cows in 3% of the herds suspected of the infection. This test represents a fast and sensitive alternative for monitoring virus infection in dairy herds, through the analysis of collective samples. The third article dealt with the detection of BVDV in the tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus fed in a bovine persistently infected (PI). The objective was to investigate the role of the cattle tick R. microplus in the transmission of BVDV. Viral RNA was detected in adult females fed on the PI bovine, but could not be identified in its progeny (eggs and larvae). These results suggest that there is no transovarial transmission of BVDV in ticks. On the other side, experimental infestation of a second bovine with larvae derived from adult cattle contaminated with BVDV did not result in clinical manifestations and the animal was negative in the RT-PCR test. The study demonstrated that the tick R. microplus can be contaminated with BVDV during blood feeding, strengthening the idea that haematophagous vectors could be involved in the dissemination of the disease and would deserve further consideration.

O vírus da diarreia viral bovina (BVDV) é um dos principais patógenos virais dos bovinos e sua infecção causa importantes perdas na produção dos rebanhos afetados. O presente trabalho contém os estudos realizados para esclarecer determinados aspectos da epidemiologia e da detecção da infecção causada pelo BVDV no Estado do Rio Grande do Sul, Brasil. O primeiro artigo consistiu de um estudo transversal onde os níveis de anticorpos contra o BVDV em amostras de tanque de leite que foram correlacionados com os aspectos produtivos dos rebanhos. As amostras e as informações foram coletadas de 300 criações escolhidas aleatoriamente entre 1.656 associados de uma cooperativa de leite na região central do Estado do Rio Grande do Sul e que não utilizaram vacina contra BVDV nos últimos 12 meses anteriores ao experimento. Dessas, 80 foram consideradas positivas para BVDV pela detecção de anticorpos contra vírus em níveis superiores ao ponto de corte do teste de ELISA comercial utilizado. A prevalência aparente estimada foi de 26,7% e, usando um intervalo de confiança de 95%, apresentou uma variação entre 22 e 31%. Os parâmetros de produção mensal de leite, densidade de bovinos (relação vacas/hectare), tipo de armazenamento do leite e origem do sêmen não apresentaram associação com a infecção pelo BVDV, mas o aumento do número total de animais por rebanho foi correlacionado positivamente com a infecção. A prevalência estimada foi considerada baixa para uma população de rebanhos, criados em sistema semi-intensivo de produção de leite, que não usava medidas específicas de controle contra a infecção. A hipótese proposta no presente artigo é que o pequeno número de animais por rebanho está favorecendo a uma provável limpeza ou erradicação da infecção nas criações e que a prevalência encontrada deve corresponder ao ponto de equilíbrio entre a pressão de infecção e a limpeza da infecção destes rebanhos. A baixa prevalência estimada pode ser uma condição favorável para iniciar um programa de controle para BVDV na população estudada. No segundo artigo, um teste da transcrição reversa seguida da reação em cadeia da polimerase (RT-PCR) foi estabelecido para detecção do vírus nas amostras de tanque de leite dos rebanhos suspeitos de infecção ativa pelo BVDV identificados no primeiro artigo. O teste foi capaz de detectar até 0,001 TCID50 de BVDV por mL de leite. Esses resultados demonstraram uma sensibilidade analítica 100 ou 1000 vezes superior aos testes de RTPCR convencionais descritos anteriormente para leite e são semelhantes aos resultados obtidos em testes de RT-PCR em tempo real para BVDV. Na análise das amostras de campo, o teste detectou RNA viral em dois rebanhos entre os 59 analisados. Esses resultados comprovaram a capacidade do teste para identificar amostras naturalmente infectadas e a presença de vacas adultas produtivas e virêmicas em 3% dos rebanhos suspeitos de infecção. Este teste é uma alternativa rápida e sensível para monitorar a infecção pelo vírus em rebanhos leiteiros, a partir de amostras coletivas. O terceiro artigo tratou da detecção do BVDV em carrapatos Rhipicephalus (Boophilus) microplus alimentados em bovino persistentemente infectado (PI). Seu objetivo foi investigar o papel do carrapato bovino R. microplus na transmissão do BVDV. O RNA viral foi detectado nas teleóginas alimentadas no bovino PI, mas não pode ser identificado em sua progênie (ovos e larvas). Esses resultados sugeriram não haver transmissão transovariana do BVDV nos carrapatos. Por outro lado, a infestação experimental de um segundo bovino com as larvas oriundas das teleóginas contaminadas com BVDV não resultou em manifestação clínica e o animal foi negativo no teste de RT-PCR. O experimento demonstrou que o carrapato R. microplus pode ser contaminado com BVDV durante o repasto sanguíneo, reforçando a idéia de que vetores hematófagos possam estar envolvidos na disseminação da doença e merecem mais investigações. / Bovine viral diarrhea virus (BVDV) is one of the main pathogenic agents in cattle and the infection with the agent causes important production losses in the affected herds. The present work contains studies carried out to clarify some aspects of the epidemiology and detection of the infection caused by BVDV in the State of Rio Grande do Sul, Brazil. The first paper consisted of a transversal study, where antibody levels against BVDV in samples of bulk milk tank were correlated with some aspects of milk production in the herds. Samples and information were collected from 300 herds randomly chosen between 1656 associates of a dairy cooperative in the region of the central area of the state of Rio Grande do Sul, Brazil, that were not using routine vaccination against BVDV in the last 12 months previous to the experiment. Among them, 80 were considered positive to BVDV by detection of antibodies against the virus in levels above the cut off point of the commercial ELISA test used. The apparent estimated prevalence was 26.7% and, using a confidence interval of 95%, showed a range between 22 and 31%. The parameters of average milk production, bovine density (relationship cattle/hectare), milk storing process and origin of the semen were not significantly associated with BVDV infection, but the increase in the total number of cows in the herds was positively correlated with the infection. The prevalence was considered low for a population of herds raised in a semi-intensive milk production system that was not using specific measures to control the viral infection. The hypothesis proposed in the present study is that the small number of animals present in the analyzed herds would favors a likely virus clearance in the herd and that the prevalence found would correspond to a point of balance between the pressure of infection and the virus clearance. The low prevalence detected can be a favorable condition to launch a control program for BVDV in the studied population. In the second paper, a reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) was established for BVDV detection in bulk tank milk samples of the herds suspected of active infection with BVDV in the first paper. The test detected up to 0.001 TCID50 of BVDV per mL of milk. These results demonstrated an analytical sensitivity 100 to 1000 times higher than conventional RT-PCR tests described previously for milk and are similar to results obtained by the use of real time RT-PCR already published. In the analysis of field samples, the test detected viral RNA in 2 out of 59 analyzed herds. These results demonstrated the relationship between the ability of the test to identify samples naturally infected and the presence of viremic adult cows in 3% of the herds suspected of the infection. This test represents a fast and sensitive alternative for monitoring virus infection in dairy herds, through the analysis of collective samples. The third article dealt with the detection of BVDV in the tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus fed in a bovine persistently infected (PI). The objective was to investigate the role of the cattle tick R. microplus in the transmission of BVDV. Viral RNA was detected in adult females fed on the PI bovine, but could not be identified in its progeny (eggs and larvae). These results suggest that there is no transovarial transmission of BVDV in ticks. On the other side, experimental infestation of a second bovine with larvae derived from adult cattle contaminated with BVDV did not result in clinical manifestations and the animal was negative in the RT-PCR test. The study demonstrated that the tick R. microplus can be contaminated with BVDV during blood feeding, strengthening the idea that haematophagous vectors could be involved in the dissemination of the disease and would deserve further consideration.

Atualmente, o Brasil é o segundo maior exportador de carne bovina e o sexto exportador de leite no mundo. Visando melhorar a produtividade da bovinocultura, torna-se importante a aplicação de programas sanitários adequados e eficientes. As doenças virais são preocupações constantes em qualquer programa de sanidade, devido aos grandes prejuízos econômicos que causam e o seu diagnóstico correto depende de técnicas laboratoriais eficientes. O gênero Pestivirus, da família Flaviviridae, possui três espécies reconhecidas que podem infectar bovinos: o vírus da diarreia viral bovina tipo 1 (BVDV-1), o BVDV-2 e o vírus da doença da fronteira (BDV), além de uma espécie atípica proposta como BVDV-3. Causam principalmente distúrbios respiratórios, reprodutivos e digestivos em bovinos, levando a queda de índices de produção. Os objetivos do presente trabalho foram: descrever o uso de uma técnica modificada de detecção de agentes virais que possam estar presentes em insumos utilizados na reprodução assistida e descrever a caracterização patológica e análise filogenética de pestivírus detectados em um surto da doença, sendo os dados apresentados sob a forma de dois artigos. No primeiro, pools de líquidos foliculares colhidos durante a punção ovariana de vacas para coleta de oócitos para produção in vitro de embriões foram selecionados. As amostras foram analisadas para a detecção de BVDV, herpesvirus bovino tipo 1 (BoHV-1) e 5 (BoHV-5) por isolamento viral, RT-PCR e nested PCR, sendo utilizados dois protocolos de extração de DNA e RNA: um convencional e o outro com adição de etapas pré-extração de ácido nucleico, no intuito de reduzir possíveis inibidores de RT-PCR e PCR presentes nas amostras. A utilização da técnica de pré-extração permitiu detectar um maior número de amostras positivas. No segundo trabalho, foi descrito um surto de diarreia viral bovina em um rebanho que foi testado por imunohistoquímica, ELISA, isolamento viral, RT-PCR e sequenciamento de três regiões do genoma. Foram obtidas quatro amostras distintas de BVDV-3 e as principais alterações clinicas foram encontradas nos sistemas digestivo e respiratório, mas lesões de pele e opacidade de córnea também foram observadas. Os resultados encontrados nos trabalhos realizados reforçam a necessidade da verificação quanto à presença de patógenos em materiais biológicos utilizados na reprodução assistida utilizando técnicas sensíveis e que a doença causada por BVDV-3 em bovinos é indistinguível clinicamente das causadas por outros pestivírus, sugerindo que pestivírus atípicos podem estar subdiagnosticados nos rebanhos brasileiros. / Currently, Brazil is the second largest beef and the sixth milk exporter worldwide. To improve the livestock productivity, it becomes important the applying of appropriate and efficient health programs. Viral diseases are constant concerns on any health program due to major economic losses they cause and their correct diagnosis depends of the development of efficient diagnostic techniques. The genus Pestivirus of the family Flaviviridae, has three recognized species which can infect cattle: the bovine viral diarrhea virus type 1 (BVDV-1), BVDV-2 and border disease virus (BDV), and one atypical species putatively named as BVDV-3. These viruses mainly cause respiratory, digestive and reproductive disturbances in cattle, resulting in decrease of production rates. The goals of the present work were: describe the use of a modified procedure in detecting viral agents that may be present on byproducts utilized in assisted reproduction and describe the pathological and phylogenetic frame of pestivirus detected in an outbreak of disease. The data was presented in two papers. In the first study, pooled follicular fluid collected during oocyte retrieval for in vitro embryo production were selected. The samples were analyzed for BVDV, bovine herpesvirus type 1 (BoHV-1) and 5 (BoHV-5) by virus isolation, RT-PCR and nested PCR, using two extraction protocols for DNA and RNA: a conventional and the other with addition of pre-extraction of nucleic acid step, in order to reduce potential inhibitors of PCR and RT-PCR present in the samples. The use of the prenucleic acid procedure allowed detecting a greater number of positive samples. In the second paper, an outbreak of bovine viral diarrhea virus was described and has been tested by immunohistochemistry, ELISA, virus isolation, RT-PCR and sequencing of three regions of the genome. Four different BVDV-3 samples were obtained and major clinical disturbances were found in the digestive and respiratory systems, but skin lesions and corneal opacity were also observed. The results obtained in the works underscore the need in checking for pathogens in biologicals used in assisted reproduction utilizing sensitive techniques and shows that the disease caused by BVDV-3 in cattle is clinically undistinguishable from those caused by other pestiviruses, suggesting that atypical pestivirus may be underdiagnosed in the Brazilian herds.

O vírus da diarreia viral bovina (BVDV) é um dos principais patógenos virais dos bovinos e sua infecção causa importantes perdas na produção dos rebanhos afetados. O presente trabalho contém os estudos realizados para esclarecer determinados aspectos da epidemiologia e da detecção da infecção causada pelo BVDV no Estado do Rio Grande do Sul, Brasil. O primeiro artigo consistiu de um estudo transversal onde os níveis de anticorpos contra o BVDV em amostras de tanque de leite que foram correlacionados com os aspectos produtivos dos rebanhos. As amostras e as informações foram coletadas de 300 criações escolhidas aleatoriamente entre 1.656 associados de uma cooperativa de leite na região central do Estado do Rio Grande do Sul e que não utilizaram vacina contra BVDV nos últimos 12 meses anteriores ao experimento. Dessas, 80 foram consideradas positivas para BVDV pela detecção de anticorpos contra vírus em níveis superiores ao ponto de corte do teste de ELISA comercial utilizado. A prevalência aparente estimada foi de 26,7% e, usando um intervalo de confiança de 95%, apresentou uma variação entre 22 e 31%. Os parâmetros de produção mensal de leite, densidade de bovinos (relação vacas/hectare), tipo de armazenamento do leite e origem do sêmen não apresentaram associação com a infecção pelo BVDV, mas o aumento do número total de animais por rebanho foi correlacionado positivamente com a infecção. A prevalência estimada foi considerada baixa para uma população de rebanhos, criados em sistema semi-intensivo de produção de leite, que não usava medidas específicas de controle contra a infecção. A hipótese proposta no presente artigo é que o pequeno número de animais por rebanho está favorecendo a uma provável limpeza ou erradicação da infecção nas criações e que a prevalência encontrada deve corresponder ao ponto de equilíbrio entre a pressão de infecção e a limpeza da infecção destes rebanhos. A baixa prevalência estimada pode ser uma condição favorável para iniciar um programa de controle para BVDV na população estudada. No segundo artigo, um teste da transcrição reversa seguida da reação em cadeia da polimerase (RT-PCR) foi estabelecido para detecção do vírus nas amostras de tanque de leite dos rebanhos suspeitos de infecção ativa pelo BVDV identificados no primeiro artigo. O teste foi capaz de detectar até 0,001 TCID50 de BVDV por mL de leite. Esses resultados demonstraram uma sensibilidade analítica 100 ou 1000 vezes superior aos testes de RTPCR convencionais descritos anteriormente para leite e são semelhantes aos resultados obtidos em testes de RT-PCR em tempo real para BVDV. Na análise das amostras de campo, o teste detectou RNA viral em dois rebanhos entre os 59 analisados. Esses resultados comprovaram a capacidade do teste para identificar amostras naturalmente infectadas e a presença de vacas adultas produtivas e virêmicas em 3% dos rebanhos suspeitos de infecção. Este teste é uma alternativa rápida e sensível para monitorar a infecção pelo vírus em rebanhos leiteiros, a partir de amostras coletivas. O terceiro artigo tratou da detecção do BVDV em carrapatos Rhipicephalus (Boophilus) microplus alimentados em bovino persistentemente infectado (PI). Seu objetivo foi investigar o papel do carrapato bovino R. microplus na transmissão do BVDV. O RNA viral foi detectado nas teleóginas alimentadas no bovino PI, mas não pode ser identificado em sua progênie (ovos e larvas). Esses resultados sugeriram não haver transmissão transovariana do BVDV nos carrapatos. Por outro lado, a infestação experimental de um segundo bovino com as larvas oriundas das teleóginas contaminadas com BVDV não resultou em manifestação clínica e o animal foi negativo no teste de RT-PCR. O experimento demonstrou que o carrapato R. microplus pode ser contaminado com BVDV durante o repasto sanguíneo, reforçando a idéia de que vetores hematófagos possam estar envolvidos na disseminação da doença e merecem mais investigações. / Bovine viral diarrhea virus (BVDV) is one of the main pathogenic agents in cattle and the infection with the agent causes important production losses in the affected herds. The present work contains studies carried out to clarify some aspects of the epidemiology and detection of the infection caused by BVDV in the State of Rio Grande do Sul, Brazil. The first paper consisted of a transversal study, where antibody levels against BVDV in samples of bulk milk tank were correlated with some aspects of milk production in the herds. Samples and information were collected from 300 herds randomly chosen between 1656 associates of a dairy cooperative in the region of the central area of the state of Rio Grande do Sul, Brazil, that were not using routine vaccination against BVDV in the last 12 months previous to the experiment. Among them, 80 were considered positive to BVDV by detection of antibodies against the virus in levels above the cut off point of the commercial ELISA test used. The apparent estimated prevalence was 26.7% and, using a confidence interval of 95%, showed a range between 22 and 31%. The parameters of average milk production, bovine density (relationship cattle/hectare), milk storing process and origin of the semen were not significantly associated with BVDV infection, but the increase in the total number of cows in the herds was positively correlated with the infection. The prevalence was considered low for a population of herds raised in a semi-intensive milk production system that was not using specific measures to control the viral infection. The hypothesis proposed in the present study is that the small number of animals present in the analyzed herds would favors a likely virus clearance in the herd and that the prevalence found would correspond to a point of balance between the pressure of infection and the virus clearance. The low prevalence detected can be a favorable condition to launch a control program for BVDV in the studied population. In the second paper, a reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) was established for BVDV detection in bulk tank milk samples of the herds suspected of active infection with BVDV in the first paper. The test detected up to 0.001 TCID50 of BVDV per mL of milk. These results demonstrated an analytical sensitivity 100 to 1000 times higher than conventional RT-PCR tests described previously for milk and are similar to results obtained by the use of real time RT-PCR already published. In the analysis of field samples, the test detected viral RNA in 2 out of 59 analyzed herds. These results demonstrated the relationship between the ability of the test to identify samples naturally infected and the presence of viremic adult cows in 3% of the herds suspected of the infection. This test represents a fast and sensitive alternative for monitoring virus infection in dairy herds, through the analysis of collective samples. The third article dealt with the detection of BVDV in the tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus fed in a bovine persistently infected (PI). The objective was to investigate the role of the cattle tick R. microplus in the transmission of BVDV. Viral RNA was detected in adult females fed on the PI bovine, but could not be identified in its progeny (eggs and larvae). These results suggest that there is no transovarial transmission of BVDV in ticks. On the other side, experimental infestation of a second bovine with larvae derived from adult cattle contaminated with BVDV did not result in clinical manifestations and the animal was negative in the RT-PCR test. The study demonstrated that the tick R. microplus can be contaminated with BVDV during blood feeding, strengthening the idea that haematophagous vectors could be involved in the dissemination of the disease and would deserve further consideration.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-02-16Bitstream added on 2014-06-13T19:26:13Z : No. of bitstreams: 1 oliveira_mc_me_jabo.pdf: 308908 bytes, checksum: 64bbc47e580df30ef60b342b4c429d6c (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O Vírus da Diarréia Viral Bovina (BVDV) é um dos patógenos mais importantes na pecuária bovina em todo mundo, principalmente por desencadear manifestações clínicas relacionadas à esfera reprodutiva. A infecção em fêmeas gestantes pode resultar em abortamentos, reabsorções embrionárias, mumificações fetais, má formações e nascimento de bezerros fracos além do aparecimento de animais persistentemente infectados e imunotolerantes ao vírus, que são a principal fonte de infecção e disseminação da doença nos rebanhos. Atualmente, a complexidade do diagnóstico e consequentemente a patogenia, estão relacionados às diferenças genotípicas do agente. Por isso, a presente pesquisa teve como objetivo verificar a ocorrência dos genótipos BVDV-1 (Singer) e BVDV-2 (VS-253) em vacas, e respectivos fetos, abatidas em um frigorífico no Estado de São Paulo por meio da análise do soro sanguineo por meio da técnica de virusneutralização. No contexto geral, 52,51% (115/219) das vacas testadas foram reagentes, mas nenhum feto (0/219) reagiu na virusneutralização. Pela análise cruzada conforme a estirpe viral, observou-se que 42% (92/219) das vacas foram reagentes tanto para o genótipo BVDV-1 como para o genótipo do BVDV-2. Por outro lado 4,10% (9/219) reagiram apenas para o genótipo BVDV-1 e 6,39% (14/219) reagiram apenas para o genótipo do BVDV 2. Notou-se portanto que ambas as estirpes estão disseminadas nas regiões estudadas, fato que justifica o emprego de antígenos diferentes para evitar diagnóstico falso-negativo. Por fim, não foi observado qualquer alteração nos fetos que pudessem ser caracterizada como patologia da enfermidade. / The Bovine viral diarrhea virus (BVDV) is one of the pathogens in bovine livestock worldwide most important mainly triggered by clinical manifestations related to the reproductive sphere. The infection in pregnant females may result in abortions, embryonic resorptions, fetal mummification, poor training, birth of weak calves in addition to persistently infected and virus immunotolerant animals, which are the main source of infection and spread of the disease. Currently, the complexity to diagnosis and consequently to the pathogenesis are related genotypic differences that he presents. Therefore, this research aimed to verify the occurrence of BVDV- 1 (Singer) and BVDV-2 (VS-253) genotypes in cows and their respective fetuses slaughtered in a abattoir at the state of São Paulo by analyzing the blood serum using virusneutralization technique. In the general context, 52.51% (115/219) of cows were reagents, but no fetus (0/219) reacted in virusneutralization. After a cross-examination we observed that 42% (92/219) of cows reacted for both BVDV-1 and BVDV-2 genotype. Furthermore 4,10% (9/219) reacted only to the genotype BVDV-1 and 6,39% (14/219) responded only to the genotype 2 of BVDV. It was noted therefore that both strains are widespread in the regions studied, which also justifies the use of different antigens to avoid false-negative diagnosis. Finally, there was no change in fetuses that could be characterized as a pathology of the disease.

Atualmente, o Brasil é o segundo maior exportador de carne bovina e o sexto exportador de leite no mundo. Visando melhorar a produtividade da bovinocultura, torna-se importante a aplicação de programas sanitários adequados e eficientes. As doenças virais são preocupações constantes em qualquer programa de sanidade, devido aos grandes prejuízos econômicos que causam e o seu diagnóstico correto depende de técnicas laboratoriais eficientes. O gênero Pestivirus, da família Flaviviridae, possui três espécies reconhecidas que podem infectar bovinos: o vírus da diarreia viral bovina tipo 1 (BVDV-1), o BVDV-2 e o vírus da doença da fronteira (BDV), além de uma espécie atípica proposta como BVDV-3. Causam principalmente distúrbios respiratórios, reprodutivos e digestivos em bovinos, levando a queda de índices de produção. Os objetivos do presente trabalho foram: descrever o uso de uma técnica modificada de detecção de agentes virais que possam estar presentes em insumos utilizados na reprodução assistida e descrever a caracterização patológica e análise filogenética de pestivírus detectados em um surto da doença, sendo os dados apresentados sob a forma de dois artigos. No primeiro, pools de líquidos foliculares colhidos durante a punção ovariana de vacas para coleta de oócitos para produção in vitro de embriões foram selecionados. As amostras foram analisadas para a detecção de BVDV, herpesvirus bovino tipo 1 (BoHV-1) e 5 (BoHV-5) por isolamento viral, RT-PCR e nested PCR, sendo utilizados dois protocolos de extração de DNA e RNA: um convencional e o outro com adição de etapas pré-extração de ácido nucleico, no intuito de reduzir possíveis inibidores de RT-PCR e PCR presentes nas amostras. A utilização da técnica de pré-extração permitiu detectar um maior número de amostras positivas. No segundo trabalho, foi descrito um surto de diarreia viral bovina em um rebanho que foi testado por imunohistoquímica, ELISA, isolamento viral, RT-PCR e sequenciamento de três regiões do genoma. Foram obtidas quatro amostras distintas de BVDV-3 e as principais alterações clinicas foram encontradas nos sistemas digestivo e respiratório, mas lesões de pele e opacidade de córnea também foram observadas. Os resultados encontrados nos trabalhos realizados reforçam a necessidade da verificação quanto à presença de patógenos em materiais biológicos utilizados na reprodução assistida utilizando técnicas sensíveis e que a doença causada por BVDV-3 em bovinos é indistinguível clinicamente das causadas por outros pestivírus, sugerindo que pestivírus atípicos podem estar subdiagnosticados nos rebanhos brasileiros. / Currently, Brazil is the second largest beef and the sixth milk exporter worldwide. To improve the livestock productivity, it becomes important the applying of appropriate and efficient health programs. Viral diseases are constant concerns on any health program due to major economic losses they cause and their correct diagnosis depends of the development of efficient diagnostic techniques. The genus Pestivirus of the family Flaviviridae, has three recognized species which can infect cattle: the bovine viral diarrhea virus type 1 (BVDV-1), BVDV-2 and border disease virus (BDV), and one atypical species putatively named as BVDV-3. These viruses mainly cause respiratory, digestive and reproductive disturbances in cattle, resulting in decrease of production rates. The goals of the present work were: describe the use of a modified procedure in detecting viral agents that may be present on byproducts utilized in assisted reproduction and describe the pathological and phylogenetic frame of pestivirus detected in an outbreak of disease. The data was presented in two papers. In the first study, pooled follicular fluid collected during oocyte retrieval for in vitro embryo production were selected. The samples were analyzed for BVDV, bovine herpesvirus type 1 (BoHV-1) and 5 (BoHV-5) by virus isolation, RT-PCR and nested PCR, using two extraction protocols for DNA and RNA: a conventional and the other with addition of pre-extraction of nucleic acid step, in order to reduce potential inhibitors of PCR and RT-PCR present in the samples. The use of the prenucleic acid procedure allowed detecting a greater number of positive samples. In the second paper, an outbreak of bovine viral diarrhea virus was described and has been tested by immunohistochemistry, ELISA, virus isolation, RT-PCR and sequencing of three regions of the genome. Four different BVDV-3 samples were obtained and major clinical disturbances were found in the digestive and respiratory systems, but skin lesions and corneal opacity were also observed. The results obtained in the works underscore the need in checking for pathogens in biologicals used in assisted reproduction utilizing sensitive techniques and shows that the disease caused by BVDV-3 in cattle is clinically undistinguishable from those caused by other pestiviruses, suggesting that atypical pestivirus may be underdiagnosed in the Brazilian herds.

Atualmente, o Brasil é o segundo maior exportador de carne bovina e o sexto exportador de leite no mundo. Visando melhorar a produtividade da bovinocultura, torna-se importante a aplicação de programas sanitários adequados e eficientes. As doenças virais são preocupações constantes em qualquer programa de sanidade, devido aos grandes prejuízos econômicos que causam e o seu diagnóstico correto depende de técnicas laboratoriais eficientes. O gênero Pestivirus, da família Flaviviridae, possui três espécies reconhecidas que podem infectar bovinos: o vírus da diarreia viral bovina tipo 1 (BVDV-1), o BVDV-2 e o vírus da doença da fronteira (BDV), além de uma espécie atípica proposta como BVDV-3. Causam principalmente distúrbios respiratórios, reprodutivos e digestivos em bovinos, levando a queda de índices de produção. Os objetivos do presente trabalho foram: descrever o uso de uma técnica modificada de detecção de agentes virais que possam estar presentes em insumos utilizados na reprodução assistida e descrever a caracterização patológica e análise filogenética de pestivírus detectados em um surto da doença, sendo os dados apresentados sob a forma de dois artigos. No primeiro, pools de líquidos foliculares colhidos durante a punção ovariana de vacas para coleta de oócitos para produção in vitro de embriões foram selecionados. As amostras foram analisadas para a detecção de BVDV, herpesvirus bovino tipo 1 (BoHV-1) e 5 (BoHV-5) por isolamento viral, RT-PCR e nested PCR, sendo utilizados dois protocolos de extração de DNA e RNA: um convencional e o outro com adição de etapas pré-extração de ácido nucleico, no intuito de reduzir possíveis inibidores de RT-PCR e PCR presentes nas amostras. A utilização da técnica de pré-extração permitiu detectar um maior número de amostras positivas. No segundo trabalho, foi descrito um surto de diarreia viral bovina em um rebanho que foi testado por imunohistoquímica, ELISA, isolamento viral, RT-PCR e sequenciamento de três regiões do genoma. Foram obtidas quatro amostras distintas de BVDV-3 e as principais alterações clinicas foram encontradas nos sistemas digestivo e respiratório, mas lesões de pele e opacidade de córnea também foram observadas. Os resultados encontrados nos trabalhos realizados reforçam a necessidade da verificação quanto à presença de patógenos em materiais biológicos utilizados na reprodução assistida utilizando técnicas sensíveis e que a doença causada por BVDV-3 em bovinos é indistinguível clinicamente das causadas por outros pestivírus, sugerindo que pestivírus atípicos podem estar subdiagnosticados nos rebanhos brasileiros. / Currently, Brazil is the second largest beef and the sixth milk exporter worldwide. To improve the livestock productivity, it becomes important the applying of appropriate and efficient health programs. Viral diseases are constant concerns on any health program due to major economic losses they cause and their correct diagnosis depends of the development of efficient diagnostic techniques. The genus Pestivirus of the family Flaviviridae, has three recognized species which can infect cattle: the bovine viral diarrhea virus type 1 (BVDV-1), BVDV-2 and border disease virus (BDV), and one atypical species putatively named as BVDV-3. These viruses mainly cause respiratory, digestive and reproductive disturbances in cattle, resulting in decrease of production rates. The goals of the present work were: describe the use of a modified procedure in detecting viral agents that may be present on byproducts utilized in assisted reproduction and describe the pathological and phylogenetic frame of pestivirus detected in an outbreak of disease. The data was presented in two papers. In the first study, pooled follicular fluid collected during oocyte retrieval for in vitro embryo production were selected. The samples were analyzed for BVDV, bovine herpesvirus type 1 (BoHV-1) and 5 (BoHV-5) by virus isolation, RT-PCR and nested PCR, using two extraction protocols for DNA and RNA: a conventional and the other with addition of pre-extraction of nucleic acid step, in order to reduce potential inhibitors of PCR and RT-PCR present in the samples. The use of the prenucleic acid procedure allowed detecting a greater number of positive samples. In the second paper, an outbreak of bovine viral diarrhea virus was described and has been tested by immunohistochemistry, ELISA, virus isolation, RT-PCR and sequencing of three regions of the genome. Four different BVDV-3 samples were obtained and major clinical disturbances were found in the digestive and respiratory systems, but skin lesions and corneal opacity were also observed. The results obtained in the works underscore the need in checking for pathogens in biologicals used in assisted reproduction utilizing sensitive techniques and shows that the disease caused by BVDV-3 in cattle is clinically undistinguishable from those caused by other pestiviruses, suggesting that atypical pestivirus may be underdiagnosed in the Brazilian herds.

O complexo respiratório bovino é um dos principais problemas encontrados em bovinos tanto confinados quanto àqueles criados a pasto, levando a importantes perdas econômicas devido aos altos índices de morbidade e mortalidade. O objetivo geral deste trabalho foi determinar a prevalência de M. bovis, M. díspar, M. mycoides subsp. mycoides SC, P. multocida, M. haemolytica, Parainfluenza Bovino tipo-3 (PIb- 3) e Influenza vírus D e a prevalência de anticorpos contra Vírus da Diarreia Viral Bovina (VDVB), Herpesvírus tipo -1 (BoHV1) e o Vírus Respiratório Sincicial Bovino (VRSB) em bezerros sadios e com broncopneumonia criados nos assentamentos de Caiuá, Presidente Epitácio e Mirante de Paranapanema - SP. Além disso, objetivase avaliar a associação destes micro-organismos com a presença da broncopneumonia e dos sinais e sintomas apresentados pelos animais durante a avaliação física. Estudou-se 141 bezerros, machos e fêmeas de até um ano de idade, os quais, após exame físico, foram classificados em sadios e com pneumonia. Foram coletadas amostras de lavado traqueobrônquico e sangue total para obtenção do soro. As amostras foram utilizadas para isolamento e identificação de M. bovis, M. díspar, M. mycoides subsp. mycoides SC, P. multocida e M. haemolytica, detecção molecular de Parainfluenza Bovino tipo-3 (PIb-3) e Influenza vírus D (IVD) e detecção de anticorpos contra Vírus da Diarreia Viral Bovina (VDVB), Herpesvírus tipo -1 (HVBo-1) e o Vírus Respiratório Sincicial Bovino (VRSB). Não houve isolamento de P. multocida e M. haemolytica. Dentre as bactérias aeróbias isoladas, observou-se maior frequência de isolamento de Bacillus sp., Staphylococcus intermedius e bactérias Gram-negativas não fermentadoras. M. díspar foi a única espécie de micoplasma identificada com os oligonucleotídeos iniciadores utilizados. Faz-se necessário a busca por outras espécies de micoplasmas que podem estar relacionadas aos casos de broncopneumonia em bovinos. Não houve detecção de Parainfluenza Bovino tipo 3 e Influenza vírus D nas amostras de lavado traqueobrônquico. Os três municípios estudados apresentaram anticorpos para os vírus estudados. Observou-se prevalência de BoHV-1, VDVB e VRSB de 31,7%, 24,6 e 38,8%, respectivamente. Não houve associação entre o status de saúde dos bezerros e os achados microbiológicos e sorológicos. Foi observada associação entre enterobactérias e a variável “desidratação leve” (p=0,033/ OR= 11,25, IC: 1,809-41,834. Observou-se associações entre Mollicutes e a variável “secreção nasal serosa” (p=0,03). Concluiu-se que a broncopneumonia é uma enfermidade multifatorial. Faz-se, necessário, portanto, a associação dos achados de exames físico, microbiológicos e características do ambiente e manejo / Bovine respiratory disease complex is one of the major problems observed in feedlot and grazing cattle, causing economic losses due to high morbidity and mortality rates. The aim of this study was to determine the prevalence of M. bovis, M. díspar, M. mycoides subsp. mycoides SC, P. multocida, M. haemolytica, Bovine Parainfluenza type-3 (bPI-3) and Influenza vírus D (IVD) and the prevalence of antibodies against Bovine Viral Diarrhea Vírus (BVDV), Bovine Herpesvírus type -1 (BoHV1) and Bovine Respiratory Syncytial Vírus (VRSB) in healthy and pneumonic calves raised in settlements located in Caiuá, Presidente Epitácio e Mirante de Paranapanema São Paulo State. Moreover, we aimed to evaluate the association between those microorganisms and antibodies and the presence of bronchopneumonia and the symptoms observed during the physical examination. We studied 141 males and females calves that were classified as healthy and pneumonic calves. We collected tracheobronchial lavage samples and total blood to obtain serum samples. Isolation and biochemical/ molecular identification were performed in order to detect M. bovis, M. díspar, M. mycoides subsp. mycoides SC, P. multocida, M. haemolytica, Bovine Parainfluenza type-3 and Influenzavírus D. Serological survey was performed to detect antibodies aginst Bovine Viral Diarrhea Vírus (BVDV), Bovine Herpesvírus type -1 (BoHV1) and Bovine Respiratory Syncytial Vírus (VRSB). There was not any isolation of P. multocida and M. haemolytica. Bacillus sp., Staphylococcus intermedius and Non-fermenter Gram-negative bacteria were higher prevalent compared to the other aerobic bacteria isolated. M. díspar was the only mycoplasma species identified by the primers used. It is necessary the identification of other mycoplasma species that could be related to the cases of bronchopneumonia in cattle. Bovine Parainfluenza type-3 and Influenza vírus D were not identified. Antibodies were detected in all municipalities. The prevalence of BoHV, BVDV e VRSB was 31.7%, 24.6 and 38.8%, respectively. The association between health status and microbial/ serological findings was not observed. Enterobacterias were associated to “mild dehydration” (p=0.033/OR=11.25; IC: 1.809-41.834). Associations between Mollicutes and “serous nasal discharge” (p=0.03) was also detected. In conclusion, S. intermedius was associated to “nasal air flow” (p=0.097). In conclusion bovine bronchopneumonia is multi-factorial disease. It is necessary, though, physical examination, microbiology and management and environment feature results

Bovine viral diarrhoea virus (BVDV) has emerged as one of the economically important pathogens in cattle populations with a worldwide distribution and causing a complex of disease syndromes. It is a single-stranded RNA virus of the genus Pestivirus in the family Flaviviridae. Two genotypes (1 and 2) of BVDV exist and can be distinguished on the basis of the 5' non-coding region (5' NCR) of the genome using real-time PCR. This technique is more sensitive, specific, less time consuming and has reduced risks of cross contamination of samples compared to a conventional PCR. Limited information exists on BVDV genetic subtypes in South Africa. The aim of this study was to determine the genotypes of BVDV currently circulating in South African feedlots. A total of 279 specimens (219 tissue samples, 59 trans-tracheal aspirates and one blood sample) were collected from dead and living cattle. Pooled homogenates from the same animals were prepared and total RNA was extracted from 200 μl of the homogenates using the RNeasy Mini Kit (Qiagen) as described by the manufacturer. A screening test was performed on the pooled samples and positive pools were investigated individually. The Cador BVDV Type 1/2 RT-PCR Kit (Qiagen, Hilden, Germany) was used for the real-time PCR assay. The PCR was performed on a Lightcycler® V2 (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) real-time PCR machine and the amplified products were detected via fluorescent dyes. The results were read at 530 and 640 nm for BVDV 1 and 2, respectively. Bovine viral diarrhoea virus was detected in a total of 103 samples that included 91 tissue samples, one blood sample and 11 trans-tracheal aspirates. Eighty five of the strains were genotype 1 strains and 18 were genotype 2. These results represent the first documented evidence for the presence of BVDV genotype 2 in South African cattle. / Dissertation (MSc)--University of Pretoria, 2010. / Veterinary Tropical Diseases / unrestricted

O vírus da diarreia viral bovina (BVDV) causa uma das doenças mais importantes de bovinos em termos de custos econômicos e sociais, uma vez que é largamente disseminado na população de gado leiteiro. Os objetivos do trabalho foram estimar a prevalência em nível de rebanho e investigar fatores associados aos níveis de anticorpos em leite de tanque através de um estudo de caso-controle pareado, bem como discutir estratégias de construção de modelos. Para estimar a prevalência de rebanho, amostras de tanque de leite foram selecionadas aleatoriamente (n = 314) de uma população (N = 1604). A prevalência real de BVDV foi de 24,3% (IC95% = 20,1-29,3%). Para o estudo de caso-controle, rebanhos positivos para BVDV (altos níveis de anticorpos) foram classificados como casos (n = 21) e pareados (n = 63) por produção de leite com rebanhos que apresentaram baixos títulos de anticorpos (razão 1:3). Para análise, três modelos multivariáveis foram construídos: 1) modelo completo, onde todas as 21 variáveis independentes foram oferecidas, e dois modelos foram criados de acordo com conhecimento empírico e similaridades entre as variáveis independentes, 2) modelo de fatores animais e 3) modelo de biossegurança. Um questionário foi aplicado (n = 84) para obtenção de informações a respeito de possíveis fatores de risco para BVDV. O modelo completo (Modelo 1) identificou as seguintes variáveis: idade com critério de eliminação (OR = 0,10; IC95% = 0,02 – 0,39; P < 0,01); propriedades que forneceram leite a outras cooperativas anteriormente (OR = 4,13; IC95% = 1,17 - 14,49; P = 0,02) e a presença de piquete de isolamento para animais doentes (OR = 0,14; IC95% = 0,01 – 0,26; P = 0,02). O modelo de biossegurança (Modelo 3) revelou uma associação significativa com o uso de monta natural (OR = 9,03; IC95% = 2,14 – 38,03; P < 0,01); presença de piquete de isolamento para animais doentes (OR = 0,06; IC95% = 0,05 – 0,83; P = 0,03); anos fornecendo leite para a mesma cooperativa (OR = 0,94; IC95% = 0,91 – 0,97; P < 0,01) e contato direto pela cerca entre bovinos de propriedades vizinhas (OR = 5,78; IC95% = 1,41 – 23,67; P = 0,04). O modelo de biossegurança pode ser considerado o “melhor”, pois obteve AIC = 43,880 e BIC = 48,058 menores quando comparado com o modelo completo que obteve AIC = 50,445 e BIC = 53,779. Esta dissertação tem a intenção de promover a discussão sobre as estratégias de construção de modelos especialmente quando se trata de saúde animal. Recomenda-se a aplicação de agrupamento de variáveis independentes como uma boa alternativa na construção de modelos, uma vez que este processo pode levar a uma melhor compreensão a respeito da associação entre cause e efeito de doenças. / Bovine viral diarrhea virus (BVDV) causes one of the most important diseases of cattle in terms of economic costs and welfare, since it is widespread in the dairy cattle population. The aims were to estimate herd prevalence and investigate factors associated with antibodies in bulk tank milk (BTM) in dairy herds through a matched case-control design as well as discuss model-building strategies. To estimate herd prevalence, BTM samples were randomly selected (n = 314) from a population (N = 1604). The true prevalence of BVDV was 24.3% (CI95% = 20.1 - 29.3%). For the case-control study, BVDV antibody-positive herds (high antibody titers) were classified as cases (n = 21) and matched (n = 63) by milk production with herds presenting low antibody titers (ratio of 1:3). For analysis, three multivariable models were built: 1) full model, holding all 21 independent variables; and two models divided according to empirical knowledge and similarity among independent variables, i.e., 2) animal factor model and 3) biosecurity model. A questionnaire was applied (n = 84) to get information about possible BVDV risk factors. The full model (model 1) identified the following variables: age as a culling criteria (OR = 0.10; IC95% = 0.02 – 0.39; P < 0.01); farms that provided milk to other industries previously (OR = 4.13; IC95% = 1.17 – 14.49; P = 0.02); and isolation paddocks for ill animals (OR = 0.14; IC95% = 0.01 – 0.26; P = 0.02). The biosecurity model (model 3) revealed a significant association with the use of natural mating (OR = 9.03; IC95% = 2.14 – 38.03; P < 0.01); isolation paddocks for ill animals (OR = 0.06; IC95% = 0.05 – 0.83; P = 0.03); years providing milk for the same industry (OR = 0.94; CI95% = 0.89 - 0.99; P = 0.02); and direct contact over fences among cattle of neighboring farms (OR = 5.78; IC95% = 1.41 – 23.67; P = 0.04). The biosecurity model could be considered the “best” since AIC = 43,880 and BIC = 48,058 when compared with the full model where AIC = 50,445 and BIC = 53,579. This paper intends to promote discussion about the model-building strategy when animal-health-modeling is on the line. We recommend the application of grouping predictors as a good choice for model building since it could lead to a better understanding of disease-exposure associations.