Orientador: Sergio Antonio De Bortoli / Coorientador: Ricardo Antonio Polanczyk / Banca: Alessandra Marieli Vacari / Banca: Fernando Hercos Valicente / Resumo: O objetivo deste estudo foi verificar, por meio de métodos moleculares, possíveis diferenças entre populações de Plutella xylostella (PX, PA, PC e PJ) de três estados brasileiros produtores de brassicáceas e avaliar a suscetibilidade e os efeitos subletais nestas populações à bioinseticidas e isolados de Bacillus thuringiensis. Foram utilizados os métodos de sequenciamento do gene COI e ISSR-PCR para analisar a estrutura genética das populações. Para avaliar a suscetibilidade e os efeitos subletais foram pulverizados em discos foliares de couve de 8 cm de diâmetro os isolados 153.30A, 49.19A, T08.024, E7, E28, E47, 41.7L, 20.7L, HD-1 e Bt tenebrionis e os produtos Btt090®, Dipel®, Agree® e Xentari®. Após a secagem, os discos foliares foram oferecidos para alimentação de lagartas de segundo ínstar de P. xylostella de cada população, em placas de Petri. As pupas foram individualizadas em placas com poços tipo Elisa® até a emergência dos adultos. Os adultos foram separados em casais e transferidos para gaiolas para oviposição. Os insetos foram observados até a morte dos adultos, sendo avaliado: viabilidade e duração larval e pupal, consumo foliar, peso das pupas, razão sexual, longevidade, número de ovos/fêmea/dia, período de incubação e viabilidade dos ovos. Os produtos/isolados que causaram mortalidade superior a 80% foram utilizados para estimar os valores de CL50. As populações apresentaram diferenças nas estruturas genéticas, sendo PJ a mais diferente. Os produtos Agree®, Dipel® e Xentari® e os isolados 49.19A, E47 e HD1 causaram 100% de mortalidade para todas as populações. De modo geral, Dipel® e HD1 foram mais tóxicos dentre os produtos e isolados, respectivamente, devido às menores CL50. Os isolados T08.024 e E28 foram os que mais afetaram negativamente as características biológicas da...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The aim of this study was to detect possible differences among populations of Plutella xylostella (PX, PA, PC and PJ), from three Brazilian states that produce brassicaceas, and to evaluate the susceptibility and sublethal effects of these populations to Bacillus thuringiensis bioinsecticides and strains. We used the methods of COI gene sequencing and ISSR-PCR to analyze the genetic structure of the populations. To evaluate the susceptibility and sublethal effects, isolates 153.30A, 49.19A, T08.024, E7, E28, E47, 41.7L, 20.7L, HD-1 and Bt tenebrionis and products Btt090®, Dipel®, Agree® and Xentari® were sprayed on 8-cm-diameter kale leaf discs. After drying, the leaf disks were offered to fed second instar caterpillars of P. xylostella from each population, in Petri dishes. The pupae were placed in separated wells plates with Elisa ® until adult emergence. The adults were separated into couples and transferred to cages for oviposition. We observed the insects until the adults death, evaluating: larval and pupal viability and period, leaf consumption, pupal weight, sex ratio, longevity, number of eggs/female/day, incubation period and egg viability. Products/strains that caused mortality exceeding 80% were used to estimate the values of LC50. The populations showed differences in genetic structures, being PJ the most different one. Agree®, Dipel®, Xentari®, and the isolates 49.19A, E47 and HD1 caused 100% mortality for all populations. Generally, HD1 and Dipel® were the most toxic among products and strains, due to lower LC50. The isolates T08.024 and E28 were the ones that most affected negatively the biological characteristics of the pest, despite they didn't cause 100% of mortality... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Ricardo Antonio Polanczyk / Banca: Italo Delalibera Júnior / Banca: Janete Apparecida Desidério / Resumo: A pesquisa objetivou analisar a suscetibilidade de duas populações distintas de Helicoverpa armigera a produtos comerciais à base de Bacillus thuringiensis (Bt) e isolados de Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae e Metarhizium rileyi. As populações foram coletadas em lavouras de soja nos municípios de Rio Verde (GO) e Luís Eduardo Magalhães (BA) e criadas em laboratório até a décima geração antes do início dos bioensaios. Os formulados utilizados foram Dipel® PM (B. thuringiensis var kurstaki), Xentari® WG (B. thuringiensis var. aizawai) e Agree® WG (B. thuringiensis var. aizawai GC91 transconjugado com B. thuringiensis var. kurstaki), com a aplicação de 50 μL da suspensão do produto biológico, na concentração de 107 esporos viáveis/mL, sobre a superfície da dieta acondicionada em recipientes esféricos de plástico (2 cm de diâmetro x 3 cm de altura). Em cada recipiente foi inserida uma lagarta, de cada instar larval, em um total de 100 lagartas por tratamento distribuídas em 10 repetições. As avaliações referentes à mortalidade foram efetuadas a cada 24 horas, até o sétimo dia após a aplicação dos tratamentos. Os fungos B. bassiana e M. anisopliae foram obtidos a partir dos produtos comerciais biológicos Boveril® PM e Metarril® PM, respectivamente, enquanto que M. rileyi foi isolado de cadáveres de H. armigera, sendo padronizados na concentração de 108 conídios viáveis/mL. Como unidade experimental foram utilizados recipientes de plástico (2 cm de diâmetro x 3 cm de altura), com dieta artificial na qual uma alíquota de 50 μL do fungo foi misturada ou aplicada na superfície. Em cada recipiente foi inserida uma lagarta de primeiro instar, com menos de 24 h de vida, totalizando 100 lagartas por tratamento distribuídas em 10 repetições. A mortalidade foi avaliada a cada 24 h, até o décimo dia após a aplicação dos tratamentos. Lagartas de primeiro instar de H. armigera, de ambas ... / Abstract: The research aimed to assess the suscetibility of two distinct Brazilian populations of Helicoverpa armigera to commercial Bacillus thuringiensis insecticides and isolates of Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae and Metarhizium rileyi.The pest populations were collected in soybean fields located in Rio Verde (GO) and Luís Eduardo Magalhães (BA), taken to laboratory and reared until the tenth generation on artificial diet, to be used in the experiment.The bioassays were performed using spherical plastic receptacles (2-cm diameter x 3- cm height) containing artificial diet until complete the half volume. The formulated products used were Dipel® WP (B. thuringiensis var kurstaki), Xentari® WG (B. thuringiensis var. aizawai) and Agree® WG (B. thuringiensis var. aizawai GC91 with B. thuringiensis var. kurstaki), spraying 50 μL of biological product solution at 107 viable spores/mL, on the surface of the diet. One caterpillar was inserted in each receptacle, related with larval instar, totaling 100 caterpillars per treatment and each group containing 10 caterpillars were considered a replication. Mortality were assessed each 24h, until the seventh day after the beginning of the bioassay. To perform the bioassays with entomopathogenic fungi, B. bassiana and M. anisopliae were obtained from the bio-insecticides Boveril® WP and Metarril® WP, respectively and M. rileyi was isolated from H. armigera cadavers at concentration of 108 viable conidia/mL. The bioassays were performed using spherical plastic receptacles (2-cmdiameter x 3-cm height) containing artificial diet until complete the half volume. After this step, a solution of 50 μL containing the entomopathogenic fungi was sprayed on the diet surface. One caterpillar was inserted in each receptacle, with less than 24 h after hatch, totaling 100 caterpillars per treatment. Each group containing 10 caterpillars were considered a replication. Mortality were assessed each 24h, until ... / Mestre

Orientador: Ricardo Antonio Polanczyk / Coorientador: Sergio Antonio De Bortoli / Coorientador: Nilza Maria Martinelli / Banca: Raphael de Campos Castilho / Banca: Luis Garrigós Leite / Banca: Amarildo Pasini / Banca: Roberto Marchi Goulart / Resumo: O objetivo dessa pesquisa foi analisar a compatibilidade entre produtos químicos e biológicos, a patogenicidade de Bacillus thuringiensis que cresceu em meio contendo inseticidas químicos e o efeito dos diferentes ingredientes ativos azadiractina, flubendiamida, bifentrina, espinosade e beta-ciflutrina e de três produtos biológicos comerciais à base de B. thuringiensis sobre lagartas de primeiro ínstar de T. absoluta. Os produtos químicos utilizados foram: azadiractina (Azamax®), flubendiamida (Belt®), bifentrina (Talstar® 100EC), espinosade (Tracer®) e beta-ciflutrina (Turbo®) e os bioenseticidas Bacillus thuringiensis var. kurstaki (Dipel®), B. thuringiensis aizawai (Xentari®) e B. thuringiensis var. aizawai GC-91 (Agree®) . Para avaliar a compatibilidade foram mensuradas a área de crescimento das colônias (cm2) e efetuada a contagem dos esporos. Já para os testes de mortalidade das lagartas foram utilizados 5 folíolos de plantas de tomate de aproximadamente 8 cm imersos nas suspensões por 10 segundos. Sobre cada folíolo foram colocadas 20 lagartas de primeiro ínstar de T. absoluta. Para a testemunha foi utilizada água destilada autoclavada e 0,05% de Tween 20®. Nenhum produto químico impediu o crescimento de B. thuringiesis (Agree®, Dipel® e Xentari®), independente da dose utilizada (mínima, média recomendada ou máxima). Tracer® e Azamax® proporcionaram maior tamanho de colônias em relação à testemunha. As três suspensões dos produtos biológicos (Agree®, Dipel® e Xentari®) que cresceram em Nutriente Agar + inseticidas químicos foram patogênicas à lagartas de primeiro ínstar de T. absoluta. No sétimo dia de avaliação da mortalidade foi observado que o produto biológico Xentari® X Belt®, dose mínima, apresentou 100% de mortalidade. Na avaliação de mortalidade dos produtos no sétimo dia de avaliação o produto Turbo® apresentou menor porcentagem de mortalidade em relação aos ... / Abstract: The aim of this study was to evaluate the compatibility between chemicals and biological insecticides, pathogenicity of Bacillus thuringiensis grown in medium containing chemical insecticides and the effect of the active ingredients Azadirachtin, Flubendiamide, Bifenthrin, Spinosad and Beta-cyfluthrin and those of three commercial Bt-based insecticides to control first instar caterpillars of T. absoluta. The chemicals used were: Azadirachtin (Azamax®), Flubendiamide (Belt®), Bifenthrin (Talstar®100 EC), Beta-cyfluthrin (Turbo®) and Spinosad (Tracer®) and bioinsecticides Dipel® (Bacillus thuringiensis kurstaki) Xentari® (Bacillus thuringiensis aizawai) and Agree® (Bacillus thuringiensis kurstaki + aizawai). To assess the compatibility we measured the colony growth area (cm2) and spores were counted. To evaluate the larval mortality, 5 leaflets with 8 cm were immersed in suspensions for 10 seconds were used. On each leaflet we placed 20 first instar larvae of T. absoluta. For the control, autoclaved distilled water and 0.05% Tween® 20 were used to immerse the leaflets. None of chemical insecticides prevented the growth of B. thuringiesis (Dipel®, Agree® and Xentari®), independent of dosage [minimum, half (recommended) or maximum]. Tracer® and Azamax® provided greater colony size compared to control. The three suspensions of Bt-based insecticides (Agree®, Dipel® and Xentari®) grown on Nutrient Agar + chemical insecticides were pathogenic to first instar larvae of T. absoluta. At the seventh day assessment of mortality, we observed that the biological insecticide Xentari® X Belt® at the lowest dose showed 100% of mortality. For the chemical insecticides at the seventh day, Turbo® showed the lowest mortality rate compared to the other products. The chemicals tested were compatible with Bt-based insecticides under laboratory conditions, showing possibilities to be adopted jointly to control T. absoluta after the ... / Doutor

Orientador: Manoel Victor Franco Lemos / Coorientador: Janete Apparecida Desidério / Banca: Ana Maria Guidelli Thuler / Banca: Fernando Hercos Valicente / Banca: Lucia Maria Carareto Alves / Banca: Odair Aparecido Fernandes / Resumo: A caracterização molecular de 46 isolados de Bacillus thuringiensis foi realizada por meio da técnica de PCR com os oligonucleotídeos iniciadores gerais Gral-cry8(d)/Gral-cry8(r), resultando na identificação do isolado BT_I622 como portador do gene cry8 (coleóptero-específico). O fragmento obtido de aproximadamente 376 pares de base (pb), localizado na porção inicial do gene, foi clonado em vetor pGEM®-T Easy, sequenciado e analisado por bioinformática. A determinação da sequência completa do gene cry8 presente no isolado BT_I622, foi realizada pela estratégia de "primer walking" com a utilização de oligonucleotídeos específicos. Os iniciadores foram elaborados através do programa Primer3, com base nas sequências de genes cry8 depositadas no banco de dados público GenBank (NCBI) e, por meio da análise das sequências geradas com o par de oligonucleotídeos gerais utilizados inicialmente na caracterização dos isolados. As amplificações com diferentes combinações de iniciadores resultaram na obtenção de fragmentos em torno de 1420, 3302, 628, 1580, 508 e 510 pb, os quais foram clonados, sequenciados e analisados pelos programas Phred/Phrap/Consed visando a montagem do gene. A sequência contendo 3531 pb foi comparada ao GenBank pela ferramenta BLASTn, apresentando 98% de similaridade com o gene cry8Ka2. Paralelamente, a sequência de aminoácidos deduzida (1176 aa) revelou 75% de identidade com a proteína Cry8Ba1 na análise com o algoritmo BLASTp, demonstrando que o isolado BT_I622 é portador de um novo gene cry8. Os bioensaios indicaram que as larvas de Sphenophorus levis são sensíveis a nova proteína Cry8 de B. thuringiensis / Abstract: The molecular characterization of 46 Bacillus thuringiensis isolates was carried out using the PCR technique with primers designed to detect cry8 genes (Gral-cry8(d)/Gral-cry8(r)), resulting in the identification of the isolate BT_1622 as a cry8 gene carrier (coleopteran specific). The ca. 376 base pairs (bp) fragment obtained was located in the initial part of the gene, which was cloned into the plasmid pGEM®-T Easy, sequenced and analyzed by bioinformatics. The complete sequence determination of this gene found within isolate BT_1622 was done using the "primer walking" strategy. The primers were designed using the software Primer3, comparing to previously sequenced cry8 genes found in the public database GenBank (NCBI) and analyzing the sequences generated with the pair of general primers used initially in the characterization of isolates. The amplifications with different primer combinations resulted other fragments of this gene with 1,420; 3,302; 628; 1,580; 508 and 510 bp, which were cloned, sequenced and analyzed using the software Phred/Phrap/Consed to obtain the full gene. The 3,531 bp sequence was compared to the GenBank using the BLASTn tool, and showed 98% of similarity with the gene cry8Ka2. Also, the deduced amino acid sequence (1,176 amino acids) showed 75% identity to the Cry8Ba1 using the algorithm BLASTp, demonstrating that the isolate BT_1622 carriers a new cry8 gene. The bioassay results indicated that the Sphenophorus levis larvae are sensitive to the new Cry8 protein of B. thuringiensis / Doutor

Orientador: Manoel Victor Franco Lemos / Banca: José Eduardo Garcia / Banca: Cristina Lacerda Soares Petrarolha Silva / Banca: Odair Aparecido Fernandes / Banca: Antônio Carlos Monteiro / Resumo: Os países industrializados apresentam uma forte tendência em buscarem, cada vez mais, sistemas de controle biológico eficiente e específicos sendo menos tóxicos para os humanos e o ecossistema em geral. Os bioinseticidas à base de microrganismos entomopatogênicos não encontram grandes restrições quanto a sua utilização. Dentre as bactérias que possuem atividade entomopatogênica, Bacillus thuringiensis é a que apresenta maior valor potencial no controle dos insetos-praga, por apresentar vários genes cry e possuir mecanismos de recombinação genética como: conjugação e transformação. O objetivo desse estudo foi identificar e caracterizar a linhagem B. thuringiensis var. londrina. A análise morfológica dos cristais indica uma nova proteína Cry. Para comparação foram utilizadas as linhagens de B. thuringiensis var. tenebrionis, var. tolworthi e var. kurstaki - HD1 que possuem os genes cry3Aa, cry3Ba e cry1Aa, respectivamente. Foi realizada a extração do DNA total das quatro linhagens, em seguida esse material foi submetido à reação de PCR com os oligonucleotideos iniciadores específicos dos genes acima citado. Para a confirmação dos resultados utilizou-se a técnica de hibridização por Southern blotting e seqüenciamento dos amplicon. O amplicom para o gene cry3 obtido pela linhagem padrão B. thuringiensis var. tenebrionis foi igual ao tamanho esperado, porém o obtido pela linhagem var. londrina foi maior em números de nucleotídeo que o esperado, indicando uma possível recombinação. A técnica de Southern blotting confirmou a recombinação do gene mostrando diferenças entre as bandas das linhagens padrão e da linhagem var. londrina, confirmando assim um novo gene cry3. Os bioensaios executados com esse novo gene não indicaram eficiência para alguns insetos-praga de lavoura da ordem Lepidoptera e foram eficientes... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Industrialized countries show a strong tendency to look for efficient and specific biological control systems that are less toxic to humans and ecosystems. Bioinsecticides based on entomopathogenic microorganisms are well accepted by the public. Among those, bacteria that exhibit such entomopathogenic activities, Bacillus thuringiensis is the one with major potential over the pests, since it harbors several cry genes and holds genetic recombination mechanisms such as bacterial conjugation and transformation in order to accomplish these control procedures. The aim of this research was to identify and characterize the strain of B. thuringiensis var. londrina. As a comparison some other strains of B. thuringiensis such as B. thuringiensis var. tenebrionis, var. tolworthi and var. kurstaki - HD1 that holds the genes cry3Aa, cry3Ba and cry1Aa, were used respectively. Alkaline lysis procedure was used for the DNA extraction from the four bacterial strains followed by its use on PCR reactions using the specific primers for the genes. To confirm the results were utilized the techniques of Southern blotting hybridization and DNA sequencing. The obtained amplicons have shown a difference in size considering the pattern strains compared to the var. londrina. The genetic recombination that took place so as to generate the var. londrina cry gene was detected by Southern blotting analysis, the hybridization results confirm the genetic recombination showing the banding pattern differences that took place generating the new cry3 gene. The bioassays showed that the recombinant gene was efficient to control Sphenophorus levis (Coleopteran). / Doutor

Resumo: Bacillus thuringiensis é uma bactéria gram-positiva e possui habilidade de produzir proteínas denominadas Cry ou delta-endotoxinas, durante a fase de esporulação. Estas proteínas são utilizadas no controle biológico de várias ordens de insetos. No entanto, pouco se conhece a respeito das vias metabólicas envolvidas na produção dessas proteínas, por exemplo, na natureza, é possível encontrar isolados que produzem grande quantidade de proteínas Cry, como também é possível encontrar outros isolados que produzem poucas quantidades. Considerando que essa diferença é devida a uma regulação gênica diferenciada entre isolados, a identificação dessa regulação pode levar a um incremento na produção de proteínas. Neste trabalho, foram analisados 10 clones mutantes comparados com o isolado selvagem (Bt1) quanto à mortalidade de lagartas neonatas de Spodoptera frugiperda considerando também a quantidade de proteínas Cry produzidas por estes mutantes. Os resultados demonstram que dois clones identificados como B9 e E2, demonstraram um bom controle dessas lagartas, mesmo aquelas que permaneceram vivas, ocorreu um atraso em seu desenvolvimento. Quanto à produção de proteínas, os clones apresentaram perfil protéico entre ~45 kDa e ~120 kDa, perfil característico encontrado entre estirpes ativas contra Lepidópteros. No entanto, os clones que apresentaram bons níveis de mortalidade (B9 e E2) mostraram somente a banda de ~65 kDa similar ao isolado selvagem, que pode ser a responsável pela sua ação inseticida. Os resultados obtidos demonstram a possibilidade de efetuar melhoramento genético em B. thuringiensis por meio de mutagênese mediada por transposon e abre caminho para o estudo das vias metabólicas envolvidas na produção de proteínas Cry. / Abstract: Bacillus is a gram-positive bacterium and produces internal crystal inclusions named crystal (Cry) proteins or d - endotoxins during the sporulation phase. These proteins as used to control several agriculture insect pests. However little is known concerning the metabolic pathways involved in the production of these proteins. For example, in nature, it is possible to find isolates that produce large quantities of the Cry proteins as well as it is possible to find ones that produce limited quantities. Since such difference might be related to gene regulation the identification of regulation factors found in these isolated should lead to an increment on the crystal protein production found in isolated naturally exhibiting lower production. In this work, ten mutant clones were analyzed compared to the wild type (Bt1) with respect to Spodoptera frugiperda neonatal larvae mortality considering also the amount of crystal protein produced by these mutants. The results have demonstrated that two mutant clones named B9 and E2 have produced strong control of these larvae; while at the same time eliciting a delay on the development of the ones that eventually did not dye at first. As for the Cry protein content, the cloned presented a protein profile ranging from ~45 kDa to ~120 kDa which is typical of Cry proteins acting on lepidopterans. The clones that have shown good mortality levels (B9 and E2) have exhibited only a protein band with ~65 kDa, similar to the one produced by the wild type strain, which might be related to its control activity. Finally, the results obtained seem to lead to the possibility of improving genetically B. thuringiensis using mutagenesis induced by transposon and at the same time might pave the way to the shed light on the study of metabolic pathways involved in the Cry proteins production. / Orientador: Manoel Victor Franco Lemos / Coorientador: Marcelo Luiz de Laia / Banca: Janete Apparecida Desidério Sena / Banca: Cristina Lacerda Soares Petrarolha Silva / Mestre

Orientador: Manoel Victor Franco Lemos / Banca: Lúcia Maria Carareto Alves / Banca: Ricardo Antonio Polanczyk / Resumo: Bacillus thuringiensis durante sua fase de esporulação produz proteínas cristal, codificadas pelos genes cry, podendo atingir pragas de diversas ordens. Esta bactéria é utilizada no controle de pragas como a Spodoptera frugiperda, causadora de sérios prejuízos na agricultura. O objetivo desta pesquisa foi caracterizar os isolados MT6, MT7, SP8, SP6, PR2 e as linhagens H D73 e CRY-B de B. thuringiensis visando o controle de S. frugiperda. Foi utilizada a técnica de PCR que permitiu a identificação das subclasses do gene cry1 A (Aa, Ab, Ac e Ae). O RAPD determinou similaridade entre todos os isolados e linhagens e somente a subsp. CRY(-)B apresentou 50 % de similaridade em relação às demais. Evidenciaram-se dois perfis diferentes entre todos e a B ausência plasmidial na subsp. CRY(-). A resistência e susceptibilidade aos antibióticos estreptomicina, canamicina, rifampicina e eritromicina, nas concentrações de 40, 60, 80, 100 e 120 uglml, permitiu constatar que somente a linhagem CRY(-)B apresentou resistência para rifampicina. Todos os isolados e linhagens foram resistentes a canamicina e susceptíveis a eritromicina e para estreptomicina todos foram resistentes em concentração variadas. Nos bioensaios os isolados MT6, MT7, PR2, SP6, SP8 e a linhagem HD73, demonstraram potencial no controle de lagartas de primeiro instar de S. frugiperda. / Abstract: Bacillus thuringiensis is an entomopathogenic bacteria that during sporulation produces crystal proteins, coded by cry genes, able to act on a great number of organisms. Such bacteria is used to control agronomic pests such as Spodoptera frugiperda, the causal agent of serious problems on the agroindustry. The aim of the present work was to characterize the isolates MT6, MT7, SP8, SP6, PR2 and the strains of the bacterium B. thuringiensis subsp. kurstaki HO-73 e CRY(-)B aiming the control of S. frugiperda. The RAPO have determined 90% of similarity among the isolates and the strain CRY (-)B presented 50% similarity with the other ones. The plasmid profiles analyses has revealed similarities among the isolates SP6, SP8, MT6 and MT8 and differences between this strain HO-73 and isolate PR2. The MICs were conducted with the antibiotics streptomycin, kanamycin, rifampicin and erythromycin on the following concentrations 40, 60, 80, 100 and 120 ug/ml. Only the strain CRY(-)B has presented resistance to rifampicin. The bioassays results have shown that the MT6, MT7, SP8, SP6, PR2 isolates and the HO-73 exhibited 100 % efficiency for the biological control of S. frugiperda larvae. / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-12T16:26:29Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo2154_1.pdf: 2946293 bytes, checksum: d55db8fd95c353e5369e10a31bb5a187 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2009 / A dengue é atualmente considerada a mais importante arbovirose que afeta o homem. O agravamento desta situação epidemiológica tem acarretado um aumento expressivo no uso de inseticidas organofosforados no combate ao vetor, principalmente o temefós, que é amplamente e sistematicamente aplicado em ambientes urbanos em reservatórios de água, até para o consumo humano. Este projeto propôs investigar efeito genotóxico (clastogênico) em células de mamíferos, induzido pela exposição ao temefós (grau técnico 95,5%), e ao biolarvicida Bacillus thuringiensis sorovar. israelenses (Bti) - IPS 82, ambos empregados no controle do Aedes aegypti. Na avaliação genotóxica foram utilizadas células da medula óssea de camundongos albinos Swiss Webster de ambos os sexos, empregando-se os testes de metáfase e de micronúcleos para detecção dos danos cromossômicos: aberrações cromossômicas e micronúcleos. Os camundongos foram tratados com temefós (grau técnico 95,5%) nas concentrações de 27,75; 55,5 e 111 mg/kg ou com água destilada 10 ml/kg, via gavagem, como controle negativo ou com Ciclofosfamida a 25 mg/kg, via i.p., como controle positivo por 24, 48 e 72h, em dose única ou em 9 doses repetidas (1 dose/semana). Outros grupos foram tratados com Bti nas doses de 204 e 122,4 UFC (Unidade Formadora de Colônia) ou água destilada (200 μl) como controle negativo, via gavagem, por 24 e 48h. Os resultados observados confirmaram a ação genotóxica induzida pelo inseticida temefós em camundongos de ambos os sexos, com a formação de micronúcleo em eritrócitos policromáticos (PCE MN), em todas as concentrações testadas 24h após o tratamento único. Na concentração de 111,00 mg/kg induziu PCE MN também após 48 e 72h em dose única e após tratamento com 9 doses. O temefós induziu também aberrações cromossômicas nas células em metáfases, em todas as concentrações testadas, 24h após tratamento único, e na concentração de 111,00 mg/kg, também após 48 e 72h de tratamento único. A Ciclofosfamida padronizada como controle positivo, para detecção de genotoxicidade, assegurou a confiabilidade dos experimentos realizados nos padrões estabelecidos. O Bti, através dos experimentos realizados, não induziu formação de micronúcleos, portanto, não foi considerado como um agente mutagênico e/ou genotóxico. A citotoxicidade do Bti também foi avaliada em diferentes doses e tempos de permanência em ambos o sexo, não apresentando diferença estatisticamente significativa ao nível de 5% em comparação com o controle negativo. Esta investigação veio comprovar a preocupação pelos potenciais riscos que o uso sistemático, constante ou mesmo esporádico de inseticidas de síntese em ambiente antropico, na agricultura e em programas de controles de vetores, pode induzir ao homem ao nível mutagênico e/ou genotóxico. É imprescindível, para o uso seguro para a saúde e o meio ambiente, a investigação do potencial mutagênico e/ou genotóxico de produtos utilizados para o controle de insetos

Bacillus thuringiensis var. israelensis é uma bactéria entomopatogênica capaz de sintetizar um cristal protéico composto por endotoxinas. Estas endotoxinas são utilizadas em formulações de biolarvicidas, sendo efetivas contra dípteros que representam um problema para a saúde humana. Neste trabalho, estudou-se a influência de fontes protéicas, de substratos energéticos, da temperatura e do pH sobre o crescimento celular, a esporulação e a expressão de endotoxinas de B. thuringiensis var. israelensis, em frascos agitados e em fermentador de bancada. Foram estudadas fontes protéicas de menor custo em substituição ao extrato de levedura de laboratório. Melhores resultados, com relação ao crescimento celular, à esporulação e à mortalidade de larvas de Culex quinquefasciatus, foram obtidos com 12 g/L de extrato de levedura bruto Prodex (ELB) ou 20 g/L de farelo de soja (FS) em biorreator de bancada, com valores máximos de demanda de oxigênio pelo cultivo (OUR) de 58,1 e 53,3 mmolO2/L/h, máxima concentração celular (X) de 12 g/L, esporulação de 3.1012 e 6.1012 esporos/mL e concentração letal mediana (CL50) de 0,21 e 0,45 ppm, respectivamente. Entre estas alternativas, o ELB, com um custo muito inferior ao do extrato de levedura de laboratório, foi considerado como uma fonte de proteína mais adequada que o farelo de soja por ser completamente solúvel o que representaria uma vantagem em processos em larga escala. Com relação aos substratos energéticos estudados (glicose, sacarose e lactose), a glicose, nas concentrações de 10 e 20 g/L, apresentou os resultados mais expressivos em termos de respiração (OUR máximo apoximadamente 60 mmolO2/L/h, em ambos os cultivos), de crescimento (X máxima = 8,2 e 12 g/L, respectivamente) e esporulação (1012 esporos/mL em 26 e 28 horas, respectivamente). A expressão de endotoxinas foi maior em meios com glicose ou sacarose, observando-se em eletroforese as bandas de 26, 70 e 128 kDa. Apesar do crescimento celular inferior, a sacarose (10 g/L), um carboidrato de custo relativamente baixo no Brasil, pode ser utilizada como substrato para Bti uma vez que permite a expressão das endotoxinas em estudo. A temperatura mostrou grande influência sobre o cultivo de Bti, sendo 27 e 30oC as que proporcionaram as mais altas OUR (88,1 e 66,1 mmolO2/L/h), X (13 g/L, em ambos os cultivos) e esporulação (8 e 7.1010 esporos/mL), assim como maior expressão das endotoxinas de 70 e 26 kDa em meios com ELB (12 g/L) e glicose ( 20 g/L). Entre as duas, a temperatura de 27oC, porém, foi considerada mais adequada por facilitar a transferência de oxigênio em cultivo de Bti. Os baixos valores de pH, observados quando o cultivo foi realizado sem controle e quando foi controlado em 5,5, influenciaram negativamente a produção de biomassa que atingiu 9,5 g/L. Com o pH controlado em 6,2 e 7,0 ou quando variou entre 7,0 e 5,5, o maior valor de X foi de cerca de 12 g/L. Apesar disso, a contagem de esporos foi semelhante em todos os ensaios: aproximadamente 1012 esporos/mL, em cerca de 30 horas de cultivo. Uma melhor expressão das endotoxinas de 26, 70 e 128 kDa foi evidenciada quando o pH foi mantido próximo da neutralidade. / The entomopathogenic bacterium Bacillus thuringiensis var. israelensis produces a crystal protein formed by endotoxins. These endotoxins are used in the formulation of biolarvicides effective for the control of diptera, which represent a problem for human health. In this work, the influence of nitrogen sources, energetic substrates, temperature, and pH on the cell growth, spore formation, and the expression of endotoxins by B. thuringiensis var. israelensis was studied in shake-flask and bioreactor experiments. Low-cost nitrogen sources were studied for the substitution of laboratory yeast extract. The best results for cell growth, spore formation and lethality of Culex quinquefasciatus larvae were obtained in bench bioreactor with medium containing 12 g/L of the bulk yeast extract Prodex (BYE) or 20 g/L of soy bran (SB), with maximum oxygen uptake rate values (OUR) of 58.1 and 53.3 mmolO2/L/h, maximum cell concentration of 12 g/L, spore counting of 3.1012 and 6.1012 spores/mL, and medium lethal concentration (LC50) of 0.21 and 0.45 ppm, respectively. In this comparison, BYE, which is much cheaper than laboratory yeast extract, was preferred as a protein source than soy bran because it is completely soluble, which could be an advantage in large-scale processing. With respect to the energetic substrates evaluated (glucose, sucrose and lactose), glucose, in concentrations of 10 and 20 g/L, led to the most significant results for respiration (maximum OUR approximately 60 mmolO2/L/h for both conditions), cell growth (maximum X = 8.2 and 12 g/L, respectively), and spore counting (1012 spores/mL in 26 and 28 hours, approximately). In media containing glucose or sucrose, the presence of toxins of 26, 70, and 128 kDa was observed. Despite the inferior cell growth observed, sucrose (10 g/L), a relatively low-cost carbohydrate in Brazil, could be used as a substrate for Bti cultivation since the endotoxins studied were expressed. With lactose, no significant result was found. The temperature of the medium exerts a major influence on the cultivation of Bti. At 27 and 30ºC, the higher values for the maximum OUR (88.1 and 66.1 mmolO2/L/h), X (13 g/L for both conditions) and spore counting (8 and 7.1010 spores/mL) were measured. The more intense expression for proteins of 70 and 26 kDa, in mediu containing BYE (12 g/L) and glucose (20 g/L), were also observed at these temperatures. The temperature of 27ºC can be considered as a better temperature for this process since oxygen supply would be facilitated at this condition. The low pH observed when the cultivation was performed without pH control or with pH kept constant at 5.5 led to decreasing values of biomass concentration which reached 9.5 g/L. When the pH was controlled in 6.2 and 7.0 or varied from 7.0 to 5.5, the maximum X was measured as 12 g/L. Despite such a difference, spore counting was similar in all experiments: 1012 spores/mL in approximately 30 hours of cultivation. A better expression of endotoxins of 26, 70, and 128 kDa was detected when the pH was kept close to neutral values.

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