Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:08Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-07-28Bitstream added on 2014-06-13T18:47:23Z : No. of bitstreams: 1 tremiliosi_lmm_me_jabo.pdf: 861044 bytes, checksum: c306ab67ac384aa19a76905d2b359990 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Bacillus thuringiensis durante sua fase de esporulação produz proteínas cristal, codificadas pelos genes cry, podendo atingir pragas de diversas ordens. Esta bactéria é utilizada no controle de pragas como a Spodoptera frugiperda, causadora de sérios prejuízos na agricultura. O objetivo desta pesquisa foi caracterizar os isolados MT6, MT7, SP8, SP6, PR2 e as linhagens H D73 e CRY-B de B. thuringiensis visando o controle de S. frugiperda. Foi utilizada a técnica de PCR que permitiu a identificação das subclasses do gene cry1 A (Aa, Ab, Ac e Ae). O RAPD determinou similaridade entre todos os isolados e linhagens e somente a subsp. CRY(-)B apresentou 50 % de similaridade em relação às demais. Evidenciaram-se dois perfis diferentes entre todos e a B ausência plasmidial na subsp. CRY(-). A resistência e susceptibilidade aos antibióticos estreptomicina, canamicina, rifampicina e eritromicina, nas concentrações de 40, 60, 80, 100 e 120 uglml, permitiu constatar que somente a linhagem CRY(-)B apresentou resistência para rifampicina. Todos os isolados e linhagens foram resistentes a canamicina e susceptíveis a eritromicina e para estreptomicina todos foram resistentes em concentração variadas. Nos bioensaios os isolados MT6, MT7, PR2, SP6, SP8 e a linhagem HD73, demonstraram potencial no controle de lagartas de primeiro instar de S. frugiperda. / Bacillus thuringiensis is an entomopathogenic bacteria that during sporulation produces crystal proteins, coded by cry genes, able to act on a great number of organisms. Such bacteria is used to control agronomic pests such as Spodoptera frugiperda, the causal agent of serious problems on the agroindustry. The aim of the present work was to characterize the isolates MT6, MT7, SP8, SP6, PR2 and the strains of the bacterium B. thuringiensis subsp. kurstaki HO-73 e CRY(-)B aiming the control of S. frugiperda. The RAPO have determined 90% of similarity among the isolates and the strain CRY (-)B presented 50% similarity with the other ones. The plasmid profiles analyses has revealed similarities among the isolates SP6, SP8, MT6 and MT8 and differences between this strain HO-73 and isolate PR2. The MICs were conducted with the antibiotics streptomycin, kanamycin, rifampicin and erythromycin on the following concentrations 40, 60, 80, 100 and 120 ug/ml. Only the strain CRY(-)B has presented resistance to rifampicin. The bioassays results have shown that the MT6, MT7, SP8, SP6, PR2 isolates and the HO-73 exhibited 100 % efficiency for the biological control of S. frugiperda larvae.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-02-26Bitstream added on 2014-06-13T19:42:46Z : No. of bitstreams: 1 costa_jrv_dr_jabo.pdf: 396090 bytes, checksum: 23a92262b1f5d4ef9aee14c8383cae79 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Aedes aegypti (Linnaeus), principal vetor da dengue no Brasil, tem sido combatido com o uso maciço de produtos químicos, contribuindo com o desenvolvimento de resistência e inviabilizando o controle do inseto. Bioinseticidas à base de Bacillus thuringiensis vêm apresentando resultados satisfatórios no controle de dípteros, devido à produção de proteínas bioinseticidas denominadas Cry (cristal), Cyt (citolíticas) e Chi (quitinase) e os efeitos sinergísticos existentes entre elas. O presente trabalho objetivou a seleção de isolados de B. thuringiensis, portadores de genes cry, cyt e chi com alta eficiência no controle de A. aegypti. Uma coleção de 1073 isolados de B. thuringiensis, provenientes de diversas regiões brasileiras, foi submetida à Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), com base nos iniciadores específicos para os genes cry4Aa, cry4Ba, cry10Aa, cry11Aa, cry11Ba, cyt1Aa, cyt1Ab, cyt2Aa e chi. Os isolados dípteros-específico foram avaliados quanto à estruturação genética e através de bioensaios seletivos e quantitativos, para determinação da CL50 e CL90. Apenas 45 (4,19%) apresentaram amplificação para os genes cry e cyt e destes, 25 (54,34%) eram quitinolíticos. Foram definidos 21 haplótipos entre os 45 isolados de B. thuringiensis, os quais foram submetidos aos bioensaios seletivos, indicando 13 isolados que causaram 100% de mortalidade às larvas de A. aegypti. Os bioensaios quantitativos e análise de agrupamento permitiram selecionar quatro isolados altamente tóxicos às larvas de A. aegypti. A identificação dos genes cry, cyt e chi de B. thuringiensis e análise dos efeitos sinergísticos entre as toxinas, associadas à análise da toxicidade a insetos vetores permitiram a seleção de isolados que poderão ser utilizados em formulações de novos bioinseticidas brasileiros, podendo contornar possíveis problemas de resistência. / Aedes aegypti (Linnaeus), the main vector of dengue fever in Brazil, has been controlled with massive use of chemical products wich, contributed to the development of resistance decreasing the insect control efficacy. Bioinsecticides based on Bacillus thuringiensis is currently presenting satisfactory results on controlling dipterans, due to the production of Cry proteins (crystal proteins), Cyt (citolitic) and Chi (chitinase) with synergistic effects between them. The present work aimed to select B. thuringiensis isolates with cry, cyt and chi genes exhibiting high efficiency on A. aegypti larvae. A bacterial collection containing 1073 isolates of B. thuringiensis, obtained from different Brazilian locations, had their DNA isolated and submitted to PCR amplifications using specific primers for the genes cry4Aa, cry4Ba, cry10Aa, cry11Aa, cry11Ba, cyt1Aa, cyt1Ab, cyt2Aa e chi. The dipterans-especific isolates were then evaluated for the genetic structure and through selective and latter to quantitative bioassays for the determination of LC50 and LC90. Forty five out of 1073 isolates (4.19%) presented amplicons for the cry and cyt genes and from these 25 (54.34%) were detected as chitinolitic. Twenty one haplotypes were identified among the 45 isolates of B. thuringiensis, which were submitted to the selective bioassays, indicating 13 isolates that caused 100% mortality of A. aegypti larvae. The quantitative bioassays and the statistical analysis have pointed four toxic isolates to A. aegypti larvae. The identification of the cry, cyt and chi genes of B. thuringiensis and the analysis of the synergistic effects among the toxins, along with the toxicity analysis towards the vector insects allowed the selection of a set of isolates that can be used for the formulation of new bioinsecticides from Brazilian origin, that would avoid or at least delay the appearance of resistance problems.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-06-12Bitstream added on 2014-06-13T20:43:08Z : No. of bitstreams: 1 rossi_jr_dr_jabo_parcial.pdf: 88852 bytes, checksum: f0badc33849f0f480aac58f70772e600 (MD5) Bitstreams deleted on 2015-01-16T10:37:50Z: rossi_jr_dr_jabo_parcial.pdf,Bitstream added on 2015-01-16T10:38:35Z : No. of bitstreams: 1 000671176.pdf: 1093299 bytes, checksum: d1fd5a36d749654ea04ac75ca09f863d (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A caracterização molecular de 46 isolados de Bacillus thuringiensis foi realizada por meio da técnica de PCR com os oligonucleotídeos iniciadores gerais Gral-cry8(d)/Gral-cry8(r), resultando na identificação do isolado BT_I622 como portador do gene cry8 (coleóptero-específico). O fragmento obtido de aproximadamente 376 pares de base (pb), localizado na porção inicial do gene, foi clonado em vetor pGEM®-T Easy, sequenciado e analisado por bioinformática. A determinação da sequência completa do gene cry8 presente no isolado BT_I622, foi realizada pela estratégia de “primer walking” com a utilização de oligonucleotídeos específicos. Os iniciadores foram elaborados através do programa Primer3, com base nas sequências de genes cry8 depositadas no banco de dados público GenBank (NCBI) e, por meio da análise das sequências geradas com o par de oligonucleotídeos gerais utilizados inicialmente na caracterização dos isolados. As amplificações com diferentes combinações de iniciadores resultaram na obtenção de fragmentos em torno de 1420, 3302, 628, 1580, 508 e 510 pb, os quais foram clonados, sequenciados e analisados pelos programas Phred/Phrap/Consed visando a montagem do gene. A sequência contendo 3531 pb foi comparada ao GenBank pela ferramenta BLASTn, apresentando 98% de similaridade com o gene cry8Ka2. Paralelamente, a sequência de aminoácidos deduzida (1176 aa) revelou 75% de identidade com a proteína Cry8Ba1 na análise com o algoritmo BLASTp, demonstrando que o isolado BT_I622 é portador de um novo gene cry8. Os bioensaios indicaram que as larvas de Sphenophorus levis são sensíveis a nova proteína Cry8 de B. thuringiensis / The molecular characterization of 46 Bacillus thuringiensis isolates was carried out using the PCR technique with primers designed to detect cry8 genes (Gral-cry8(d)/Gral-cry8(r)), resulting in the identification of the isolate BT_1622 as a cry8 gene carrier (coleopteran specific). The ca. 376 base pairs (bp) fragment obtained was located in the initial part of the gene, which was cloned into the plasmid pGEM®-T Easy, sequenced and analyzed by bioinformatics. The complete sequence determination of this gene found within isolate BT_1622 was done using the “primer walking” strategy. The primers were designed using the software Primer3, comparing to previously sequenced cry8 genes found in the public database GenBank (NCBI) and analyzing the sequences generated with the pair of general primers used initially in the characterization of isolates. The amplifications with different primer combinations resulted other fragments of this gene with 1,420; 3,302; 628; 1,580; 508 and 510 bp, which were cloned, sequenced and analyzed using the software Phred/Phrap/Consed to obtain the full gene. The 3,531 bp sequence was compared to the GenBank using the BLASTn tool, and showed 98% of similarity with the gene cry8Ka2. Also, the deduced amino acid sequence (1,176 amino acids) showed 75% identity to the Cry8Ba1 using the algorithm BLASTp, demonstrating that the isolate BT_1622 carriers a new cry8 gene. The bioassay results indicated that the Sphenophorus levis larvae are sensitive to the new Cry8 protein of B. thuringiensis

Made available in DSpace on 2015-06-17T19:34:09Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-02-26. Added 1 bitstream(s) on 2015-06-18T12:49:23Z : No. of bitstreams: 1 000829428_20170301.pdf: 100482 bytes, checksum: 894af24aad4ca7d75f9898581c07f398 (MD5) Bitstreams deleted on 2017-03-03T11:01:31Z: 000829428_20170301.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2017-03-03T11:02:40Z : No. of bitstreams: 1 000829428.pdf: 275587 bytes, checksum: 79098a3390015f4449a4b64413d932a8 (MD5) / Estudos que visam a interação das proteínas Cry de Bacillus thuringiensis, a fim de encontrar combinações adequadas para o desenvolvimento de plantas Bt são ferramentais fundamentais no controle de lepidópteros-praga. A lagarta H. armigera causa danos severos nas culturas agrícolas e sua introdução no Brasil levou a busca de formas de controle eficientes e nesse contexto B. thuringiensis pode ser um bom agente de controle. Diante do exposto o presente trabalho objetivou avaliar a toxicidade das proteínas Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac e Cry1Ca de B. thuringiensis à H. armigera, assim como interação dessas proteínas aos receptores do mesêntero do inseto. A toxicidade foi estimada com bioensaios de dose resposta com as proteínas testadas e a interação das proteínas com os receptores foram verificadas em análise de união entre a proteína ativada e marcada com a vesícula da borda em escova da membrana apical das células do intestino (brush border mambrane vesicle- BBMV) do mesêntero larval de H. armigera, e ensaios de competição heteróloga. Dentre as proteínas testadas, a Cry1Ac destacou-se como a mais efetiva, seguida das proteínas Cry1Ab e Cry1Aa. A proteína Cry1Ca não apresentou toxicidade. As proteínas Cry1Aa, Cry1Ab e Cry1Ac se ligaram aos receptores da membrana do intestino médio das lagartas de H. armigera de forma especifica. Os ensaios de competição heteróloga revelaram que as proteínas Cry1Aa, Cry1Ac e Cry1Ab competem entre si pelo mesmo receptor / Studies attempting interaction of Bacillus thuringiensis Cry proteins in order to find combinations for developing Bt plants are fundamental in controlling lepidopteran pests. H. armigera causes severe damage to agricultural crops and their introduction in Brazil has led the search for efficient control and B. thuringiensis may be a good control agent. The aim of this research was to evaluate the toxicity of Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac and Cry1Ca proteins from B. thuringiensis to H. armigera, as well as interaction of these proteins with the receptors present in insect midgut. Toxicity was estimated from the lethal concentration LC50 of the tested proteins and protein interactions with the receptors were found in a binding analysis between activated and biotinylated protein with the midgut brush border vesicle membrane (BBMV) of H. armigera, and heterologous competitive binding assays. Among the tested proteins, Cry1Ac protein was the most toxic, followed by the Cry1Ab and Cry1Aa proteins. The Cry1Ca protein showed no toxicity. The Cry1Aa, Cry1Ab and Cry1Ac proteins showed specific binding to the midgut membrane receptors of H. armigera caterpillars. Heterologous competitive binding assays revealed that Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac compete for a common receptor in the midgut larvae

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:23Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-06-30Bitstream added on 2014-06-13T19:55:58Z : No. of bitstreams: 1 machado_tro_me_jabo.pdf: 255795 bytes, checksum: 94bed73df71cf07445d3e1f703d8704c (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Um total de 109 cepas de Staphylococcus coagulase-negativa foi isolado de mastite bovina clinica e subclinica em 35 fazendas de leite situadas em 9 estados brasileiros no período de fevereiro a maio de 2005, elas foram investigadas em relação a sua susceptibilidade in vitro a diversos agentes antimicrobianos. Entre as cepas obtidas, a resistência a penicilina foi a mais freqüente (93,5%), seguida pela resistência a sulfonamida (88,9%), novobiocina (88,6%) e ampicilina (85,3%). Todas as cepas examinadas mostraram resistência a pelo menos 1 das drogas antimicrobianas testadas. Cepas apresentando resistência múltipla foram extremamente comuns, com 10,0% dos isolados apresentando resistência a todas as drogas antimicrobianas. Os resultados obtidos indicaram que as cepas de Staphylococcus coagulase-negativas isoladas no Brasil apresentaram um alto grau de resistência a antimicrobianos. Estes resultados são provavelmente uma conseqüência da pressão devido ao uso intensivo de drogas antimicrobianas e eles são um motivo de preocupação em relação a saúde pública. / A total of 109 strains of coagulase-negative Staphy/ococci were isolated from bovine clinical and subdinical mastitic cattle in 35 dairy farms, in 9 states of Brazil from february to may 2005, and investigated for in vitro susceptibility to several antimicrobial agents. Among the isolates, resistance to penicillin was most frequent (93.5%), followed by resistance to sulphonamide (88.9%), novobiocin (88.6%) and ampicillin (85.3%). Ali isolates exhibited resistance to at least 1 of the antimicrobial drugs tested. Multidrug resistant isolates were quite common, 10.0% of the isolates showing resistance to ali antimicrobial drugs tested. This indicates that coagulase-negative Staphy/ococci in 3razil exhibit a high degree of antimicrobial agents' resistance, probably as a :onsequence of the pressure of the intensive use of antimicrobial drugs, a practice that :onstitute a public health concem.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:23Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-08-07Bitstream added on 2014-06-13T18:56:06Z : No. of bitstreams: 1 cordeiro_jx_me_jabo.pdf: 844386 bytes, checksum: ae05c2706130041d387b83b68d235663 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Bacillus thuringiensis é uma bactéria gram-positiva e possui habilidade de produzir proteínas denominadas Cry ou delta-endotoxinas, durante a fase de esporulação. Estas proteínas são utilizadas no controle biológico de várias ordens de insetos. No entanto, pouco se conhece a respeito das vias metabólicas envolvidas na produção dessas proteínas, por exemplo, na natureza, é possível encontrar isolados que produzem grande quantidade de proteínas Cry, como também é possível encontrar outros isolados que produzem poucas quantidades. Considerando que essa diferença é devida a uma regulação gênica diferenciada entre isolados, a identificação dessa regulação pode levar a um incremento na produção de proteínas. Neste trabalho, foram analisados 10 clones mutantes comparados com o isolado selvagem (Bt1) quanto à mortalidade de lagartas neonatas de Spodoptera frugiperda considerando também a quantidade de proteínas Cry produzidas por estes mutantes. Os resultados demonstram que dois clones identificados como B9 e E2, demonstraram um bom controle dessas lagartas, mesmo aquelas que permaneceram vivas, ocorreu um atraso em seu desenvolvimento. Quanto à produção de proteínas, os clones apresentaram perfil protéico entre ~45 kDa e ~120 kDa, perfil característico encontrado entre estirpes ativas contra Lepidópteros. No entanto, os clones que apresentaram bons níveis de mortalidade (B9 e E2) mostraram somente a banda de ~65 kDa similar ao isolado selvagem, que pode ser a responsável pela sua ação inseticida. Os resultados obtidos demonstram a possibilidade de efetuar melhoramento genético em B. thuringiensis por meio de mutagênese mediada por transposon e abre caminho para o estudo das vias metabólicas envolvidas na produção de proteínas Cry. / Bacillus is a gram-positive bacterium and produces internal crystal inclusions named crystal (Cry) proteins or d - endotoxins during the sporulation phase. These proteins as used to control several agriculture insect pests. However little is known concerning the metabolic pathways involved in the production of these proteins. For example, in nature, it is possible to find isolates that produce large quantities of the Cry proteins as well as it is possible to find ones that produce limited quantities. Since such difference might be related to gene regulation the identification of regulation factors found in these isolated should lead to an increment on the crystal protein production found in isolated naturally exhibiting lower production. In this work, ten mutant clones were analyzed compared to the wild type (Bt1) with respect to Spodoptera frugiperda neonatal larvae mortality considering also the amount of crystal protein produced by these mutants. The results have demonstrated that two mutant clones named B9 and E2 have produced strong control of these larvae; while at the same time eliciting a delay on the development of the ones that eventually did not dye at first. As for the Cry protein content, the cloned presented a protein profile ranging from ~45 kDa to ~120 kDa which is typical of Cry proteins acting on lepidopterans. The clones that have shown good mortality levels (B9 and E2) have exhibited only a protein band with ~65 kDa, similar to the one produced by the wild type strain, which might be related to its control activity. Finally, the results obtained seem to lead to the possibility of improving genetically B. thuringiensis using mutagenesis induced by transposon and at the same time might pave the way to the shed light on the study of metabolic pathways involved in the Cry proteins production.

Submitted by DANIELA DE LIMA VIANA null (danielaviana28@gmail.com) on 2018-03-12T18:58:25Z No. of bitstreams: 1 Tese_Daniela_de_Lima_Viana.pdf: 1718435 bytes, checksum: fb23294ce65ac4d0c05140ed95a1d66d (MD5) / Approved for entry into archive by Neli Silvia Pereira null (nelisps@fcav.unesp.br) on 2018-03-13T13:15:00Z (GMT) No. of bitstreams: 1 viana_dl_dr_jabo.pdf: 1718435 bytes, checksum: fb23294ce65ac4d0c05140ed95a1d66d (MD5) / Made available in DSpace on 2018-03-13T13:15:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 viana_dl_dr_jabo.pdf: 1718435 bytes, checksum: fb23294ce65ac4d0c05140ed95a1d66d (MD5) Previous issue date: 2018-02-16 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O cenário agrícola no Centro Oeste conta com os chamados sistemas de produção, nos quais os cultivos ocorrem de forma constante e sucessiva durante um mesmo ano agrícola. No entanto, isso tem propiciado problemas cada vez mais frequentes relacionados a alguns grupos de pragas, dentre eles os lepidópteros. Espécies como Chrysodeixis includens e o complexo de Spodoptera vem crescendo de importância, causando prejuízos, principalmente em culturas como a soja e o algodoeiro. Dentre os métodos mais utilizados para o controle de insetos-praga no Brasil, destaca-se o uso de OGM, a partir da inserção de genes da bactéria Bacillus thuringiensis (Bt), com expressão de proteínas com ações inseticidas. Entretanto, um dos grandes problemas é a seleção de populações de pragas resistentes aos cultivos Bt devido ao uso contínuo e inadequado da tecnologia. Diante disso, os objetivos do presente estudo foram avaliar os efeitos de cultivares Bt de soja e algodoeiro, que expressam proteínas inseticidas Cry, sobre os aspectos biológicos de C. includens em laboratório, como também avaliar a dinâmica populacional e a infestação natural de lagartas de C. includens e de Spodoptera spp. em condições de campo, no estado do Mato Grosso. Para o estudo dos aspectos biológicos, utilizou-se lagartas neonatas que foram alimentadas com folhas das cultivares de soja e algodoeiro não Bt e Bt de diferentes tecnologias. Os experimentos de campo foram realizados em área experimental do IMAmt na safra 2016/2017, utilizando cultivares de soja e algodoeiro não Bt e Bt com expressão de diferentes proteínas Cry. As cultivares de soja Bt, que expressam a proteína Cry1Ac, afetam os parâmetros biológicos de C. includens, controlando de maneira eficiente, tanto em laboratório quanto em campo. Em relação às lagartas de Spodoptera spp. observou-se que as cultivares de soja Bt não controlam eficientemente esses lepidópteros. A cultivar de algodoeiro que expressa a proteína Cry1Ac, causa pouco efeito sobre as lagartas de C. includens, não apresentando controle satisfatório, tanto nos aspectos biológicos observados em laboratório quanto na infestação em campo, se comportando de forma similar à cultivar de algodoeiro não Bt. As cultivares de algodoeiro Bt piramidadas, Cry1Ac+Cry1F, Cry1Ac+Cry2Ab2 e Cry1Ab+Cry2Ae, apresentaram controle de C. includens, afetando a sobrevivência de lagartas pequenas em laboratório e campo. Por outro lado, a piramidação de cultivares por si só não é suficiente, por exemplo, para as lagartas de Spodoptera spp. Nos eventos de algodão Bt em campo, verificou-se que as cultivares que expressam as proteínas Cry1Ac e Cry1Ac+Cry1F, não suprimem suas infestações, enquanto que nas cultivares piramidadas que expressam Cry1Ac+Cry2Ab2 e Cry1Ab+Cry2Ae a supressão foi considerada eficiente. / The agricultural scenario in the brazilian midwest counts on the socalled production systems, in which crops occur constantly and successively during the same agricultural year. However, this has caused increasingly frequent problems related to some groups of pests, among them the Lepidoptera. Species such as Chrysodeixis includens and the Spodoptera complex have been increasing in importance, causing damage, especially in crops such as soybean and cotton. Among the most used methods for the control of insect pests in Brazil, the use of GMOs, from the insertion of genes of the bacterium Bacillus thuringiensis (Bt), with expression of proteins with insecticidal actions, stands out. However, one of the major problems is the selection of populations of pests resistant to Bt crops due to the continuous and inadequate use of the technology. The objectives of the present study were to evaluate the effects of Bt cultivars of soybean and cotton, which express insecticidal Cry proteins, on the biological aspects of C. includens in the laboratory, as well as to evaluate the population dynamics and the natural infestation of caterpillars C. includens and Spodoptera spp. under field conditions, in the state of Mato Grosso. For the study of the biological aspects, we used caterpillars that were fed with leaves of the cultivars of soybean and non-Bt and Bt cotton of different technologies. Field experiments were carried out in the experimental area of the IMAmt in the 2016/2017 season, using soybean and cotton cultivars non-Bt and Bt with different Cry protein expression. Soybean Bt cultivars, which express the Cry1Ac protein, affect the biological parameters of C. includens, efficiently controlling both in the laboratory and in the field. In relation to the caterpillars of Spodoptera spp., it was observed that Bt soybean cultivars do not efficiently control these lepidoptera. The cotton cultivar that expresses the Cry1Ac protein causes little effect on the caterpillars of C. includens, not showing satisfactory control, both in the biological aspects observed in the laboratory and in the infestation in the field, behaving in a similar way to the cultivar of non-Bt cotton. Cotton Bt cultivars, Cry1Ac+Cry1F, Cry1Ac+Cry2Ab2 and Cry1Ab+Cry2Ae, showed control of C. includens, affecting the survival of small caterpillars in the laboratory and in the field. On the other hand, the pyramiding of cultivars alone is not sufficient, for example, for the caterpillars of Spodoptera spp. In the field cotton Bt events, it was found that cultivars expressing the Cry1Ac and Cry1Ac+Cry1F proteins do not suppress their infestations, whereas in pyrite cultivars expressing Cry1Ac+Cry2Ab2 and Cry1Ab+Cry2Ae suppression was considered efficient.

Bacillus thuringiensis var. israelensis é uma bactéria entomopatogênica capaz de sintetizar um cristal protéico composto por endotoxinas. Estas endotoxinas são utilizadas em formulações de biolarvicidas, sendo efetivas contra dípteros que representam um problema para a saúde humana. Neste trabalho, estudou-se a influência de fontes protéicas, de substratos energéticos, da temperatura e do pH sobre o crescimento celular, a esporulação e a expressão de endotoxinas de B. thuringiensis var. israelensis, em frascos agitados e em fermentador de bancada. Foram estudadas fontes protéicas de menor custo em substituição ao extrato de levedura de laboratório. Melhores resultados, com relação ao crescimento celular, à esporulação e à mortalidade de larvas de Culex quinquefasciatus, foram obtidos com 12 g/L de extrato de levedura bruto Prodex (ELB) ou 20 g/L de farelo de soja (FS) em biorreator de bancada, com valores máximos de demanda de oxigênio pelo cultivo (OUR) de 58,1 e 53,3 mmolO2/L/h, máxima concentração celular (X) de 12 g/L, esporulação de 3.1012 e 6.1012 esporos/mL e concentração letal mediana (CL50) de 0,21 e 0,45 ppm, respectivamente. Entre estas alternativas, o ELB, com um custo muito inferior ao do extrato de levedura de laboratório, foi considerado como uma fonte de proteína mais adequada que o farelo de soja por ser completamente solúvel o que representaria uma vantagem em processos em larga escala. Com relação aos substratos energéticos estudados (glicose, sacarose e lactose), a glicose, nas concentrações de 10 e 20 g/L, apresentou os resultados mais expressivos em termos de respiração (OUR máximo apoximadamente 60 mmolO2/L/h, em ambos os cultivos), de crescimento (X máxima = 8,2 e 12 g/L, respectivamente) e esporulação (1012 esporos/mL em 26 e 28 horas, respectivamente). A expressão de endotoxinas foi maior em meios com glicose ou sacarose, observando-se em eletroforese as bandas de 26, 70 e 128 kDa. Apesar do crescimento celular inferior, a sacarose (10 g/L), um carboidrato de custo relativamente baixo no Brasil, pode ser utilizada como substrato para Bti uma vez que permite a expressão das endotoxinas em estudo. A temperatura mostrou grande influência sobre o cultivo de Bti, sendo 27 e 30oC as que proporcionaram as mais altas OUR (88,1 e 66,1 mmolO2/L/h), X (13 g/L, em ambos os cultivos) e esporulação (8 e 7.1010 esporos/mL), assim como maior expressão das endotoxinas de 70 e 26 kDa em meios com ELB (12 g/L) e glicose ( 20 g/L). Entre as duas, a temperatura de 27oC, porém, foi considerada mais adequada por facilitar a transferência de oxigênio em cultivo de Bti. Os baixos valores de pH, observados quando o cultivo foi realizado sem controle e quando foi controlado em 5,5, influenciaram negativamente a produção de biomassa que atingiu 9,5 g/L. Com o pH controlado em 6,2 e 7,0 ou quando variou entre 7,0 e 5,5, o maior valor de X foi de cerca de 12 g/L. Apesar disso, a contagem de esporos foi semelhante em todos os ensaios: aproximadamente 1012 esporos/mL, em cerca de 30 horas de cultivo. Uma melhor expressão das endotoxinas de 26, 70 e 128 kDa foi evidenciada quando o pH foi mantido próximo da neutralidade. / Submitted by Marcelo Teixeira (mvteixeira@ucs.br) on 2014-05-13T17:26:06Z No. of bitstreams: 1 dissertacao Cintia Panarotto.pdf: 1176937 bytes, checksum: b1ab2e0e4c43ddf42a0f132a88cf7c77 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-05-13T17:26:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao Cintia Panarotto.pdf: 1176937 bytes, checksum: b1ab2e0e4c43ddf42a0f132a88cf7c77 (MD5) / The entomopathogenic bacterium Bacillus thuringiensis var. israelensis produces a crystal protein formed by endotoxins. These endotoxins are used in the formulation of biolarvicides effective for the control of diptera, which represent a problem for human health. In this work, the influence of nitrogen sources, energetic substrates, temperature, and pH on the cell growth, spore formation, and the expression of endotoxins by B. thuringiensis var. israelensis was studied in shake-flask and bioreactor experiments. Low-cost nitrogen sources were studied for the substitution of laboratory yeast extract. The best results for cell growth, spore formation and lethality of Culex quinquefasciatus larvae were obtained in bench bioreactor with medium containing 12 g/L of the bulk yeast extract Prodex (BYE) or 20 g/L of soy bran (SB), with maximum oxygen uptake rate values (OUR) of 58.1 and 53.3 mmolO2/L/h, maximum cell concentration of 12 g/L, spore counting of 3.1012 and 6.1012 spores/mL, and medium lethal concentration (LC50) of 0.21 and 0.45 ppm, respectively. In this comparison, BYE, which is much cheaper than laboratory yeast extract, was preferred as a protein source than soy bran because it is completely soluble, which could be an advantage in large-scale processing. With respect to the energetic substrates evaluated (glucose, sucrose and lactose), glucose, in concentrations of 10 and 20 g/L, led to the most significant results for respiration (maximum OUR approximately 60 mmolO2/L/h for both conditions), cell growth (maximum X = 8.2 and 12 g/L, respectively), and spore counting (1012 spores/mL in 26 and 28 hours, approximately). In media containing glucose or sucrose, the presence of toxins of 26, 70, and 128 kDa was observed. Despite the inferior cell growth observed, sucrose (10 g/L), a relatively low-cost carbohydrate in Brazil, could be used as a substrate for Bti cultivation since the endotoxins studied were expressed. With lactose, no significant result was found. The temperature of the medium exerts a major influence on the cultivation of Bti. At 27 and 30ºC, the higher values for the maximum OUR (88.1 and 66.1 mmolO2/L/h), X (13 g/L for both conditions) and spore counting (8 and 7.1010 spores/mL) were measured. The more intense expression for proteins of 70 and 26 kDa, in mediu containing BYE (12 g/L) and glucose (20 g/L), were also observed at these temperatures. The temperature of 27ºC can be considered as a better temperature for this process since oxygen supply would be facilitated at this condition. The low pH observed when the cultivation was performed without pH control or with pH kept constant at 5.5 led to decreasing values of biomass concentration which reached 9.5 g/L. When the pH was controlled in 6.2 and 7.0 or varied from 7.0 to 5.5, the maximum X was measured as 12 g/L. Despite such a difference, spore counting was similar in all experiments: 1012 spores/mL in approximately 30 hours of cultivation. A better expression of endotoxins of 26, 70, and 128 kDa was detected when the pH was kept close to neutral values.

Entre os insetos que prejudicam o desenvolvimento sócio-econômico na Serra Gaúcha, encontram-se os dípteros da família Simuliidae, que devido a hematofagia, provocam desconforto e alergias, interferindo no turismo rural. Na área agrícola, os lepidópteros da família Noctuidae, são pragas de diversas culturas, sendo economicamente relevantes. Visando reduzir o uso de substâncias químicas que normalmente são empregadas no controle destes insetos, este trabalho objetivou obter isolados de Bacillus thuringiensis (Bt) para a aplicação em programas regionais de controle de simulídeos e noctuídeos. Utilizando-se amostras de solo da área rural e urbana e de insetos, coletados em municípios da Região, obtiveram-se 721 colônias bacterianas, das quais, 231 (32,03%) foram identificadas como Bt. Testes de patogenicidade contra Culex quinquefasciatus e Anticarsia gemmatalis com 84 isolados de solo e 28 de insetos selecionados por apresentarem elevada taxa de esporulação, indicaram que os recuperados de insetos foram mais específicos, enquanto que maior número dos provenientes de solo foram tóxicos para ambas as espécies, indicando mais amplo espectro entomopatogênico. Apenas um dos 12 isolados apresentou valor de CL50 similar àquele obtido com a linhagem padrão IPS-82, em relação a mortalidade de larvas de C. quinquefasciatus. O perfil das protoxinas dos isolados foi caracterizado por SDS-PAGE, demonstrando que dois isolados obtidos de díptero, tiveram um perfil semelhante a linhagem IPS-82, enquanto dois isolados de solo, com bandas entre 65 e 130 kDa, foram mais tóxicos para lepidópteros e dois obtidos de solo e três de insetos, apresentaram uma banda de aproximadamente 120 kDa, sendo mais efetivos contra lagartas. / Submitted by Marcelo Teixeira (mvteixeira@ucs.br) on 2014-05-14T18:40:07Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao Vaneisa Gobatto.pdf: 986124 bytes, checksum: 93d4dcd83d81795ddae4df5606944698 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-05-14T18:40:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Vaneisa Gobatto.pdf: 986124 bytes, checksum: 93d4dcd83d81795ddae4df5606944698 (MD5) / Among the insects that harm the socioeconomic development of Serra Gaúcha, exist the dipterous, of the family Simuliidae that, due to its hematofagic process, cause discomfort and allergies to active rural tourists. In the agricultural regions, the lepidopterous, of the family Noctuidae, constitute curses of several cultures, constituting an economical prejudice. Seeking to reduce the use of chemical substances in the control of insects, this work is aimed at isolating the bacteria Bacillus thuringiensis (Bt) for the application of regional programs of Simulids and Noctuids pest control. Samples of insects and of soil of rural and urban areas were collected in the municipal districts of the specific area. Were obtained 721 bacterial colonies, from which, 231 (32,03%) were identified as Bt. Patogenicity tests against Culex quinquefasciatus and Anticarsia gemmatalis were executed with 84 bacteria isolated from soil and 28 bacteria isolated from insects that had a larger capacity of cellular reproduction. The results indicated that the isolated bacteria recovered from the insects were more specific, considering that a larger number of bacteria coming from the soil were more toxic for both species, showing a wider spectrum of entomopatogenic. Just one of the isolated 12 bacteria presented a similar value of CL50 than the one obtained with the lineage pattern IPS-82, in relation of the mortality rate of larvae of C. quinquefasciatus. The profile of the protoxins of one of the isolated ones is characterized by SDS-PAGE, demonstrating that two isolated bacteria obtained from the dipteran, had a similar profile as lineage IPS-82, while two others isolated from the soil, with bands between 65 and 130 kDa, were more toxics for lepidopteran and the two obtained from the soil and three obtained from of insects, and presented one band of approximately 120 kDa, being more effective against caterpillars.

Orientador: Manoel Victor Franco Lemos / Coorientador: Ricardo Antonio Polanczyk / Banca: Janete Apparecida Desidério / Banca: Camila Chiaradia Davolos / Resumo: Estudos que visam a interação das proteínas Cry de Bacillus thuringiensis, a fim de encontrar combinações adequadas para o desenvolvimento de plantas Bt são ferramentais fundamentais no controle de lepidópteros-praga. A lagarta H. armigera causa danos severos nas culturas agrícolas e sua introdução no Brasil levou a busca de formas de controle eficientes e nesse contexto B. thuringiensis pode ser um bom agente de controle. Diante do exposto o presente trabalho objetivou avaliar a toxicidade das proteínas Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac e Cry1Ca de B. thuringiensis à H. armigera, assim como interação dessas proteínas aos receptores do mesêntero do inseto. A toxicidade foi estimada com bioensaios de dose resposta com as proteínas testadas e a interação das proteínas com os receptores foram verificadas em análise de união entre a proteína ativada e marcada com a vesícula da "borda em escova" da membrana apical das células do intestino ("brush border mambrane vesicle"- BBMV) do mesêntero larval de H. armigera, e ensaios de competição heteróloga. Dentre as proteínas testadas, a Cry1Ac destacou-se como a mais efetiva, seguida das proteínas Cry1Ab e Cry1Aa. A proteína Cry1Ca não apresentou toxicidade. As proteínas Cry1Aa, Cry1Ab e Cry1Ac se ligaram aos receptores da membrana do intestino médio das lagartas de H. armigera de forma especifica. Os ensaios de competição heteróloga revelaram que as proteínas Cry1Aa, Cry1Ac e Cry1Ab competem entre si pelo mesmo receptor / Abstract: Studies attempting interaction of Bacillus thuringiensis Cry proteins in order to find combinations for developing Bt plants are fundamental in controlling lepidopteran pests. H. armigera causes severe damage to agricultural crops and their introduction in Brazil has led the search for efficient control and B. thuringiensis may be a good control agent. The aim of this research was to evaluate the toxicity of Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac and Cry1Ca proteins from B. thuringiensis to H. armigera, as well as interaction of these proteins with the receptors present in insect midgut. Toxicity was estimated from the lethal concentration LC50 of the tested proteins and protein interactions with the receptors were found in a binding analysis between activated and biotinylated protein with the midgut brush border vesicle membrane (BBMV) of H. armigera, and heterologous competitive binding assays. Among the tested proteins, Cry1Ac protein was the most toxic, followed by the Cry1Ab and Cry1Aa proteins. The Cry1Ca protein showed no toxicity. The Cry1Aa, Cry1Ab and Cry1Ac proteins showed specific binding to the midgut membrane receptors of H. armigera caterpillars. Heterologous competitive binding assays revealed that Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac compete for a common receptor in the midgut larvae / Mestre