Les bactéries jouent un rôle important dans le fonctionnement d'un écosystème aquatique et sont les joueurs clés de la boucle microbienne et du cycle du carbone. Le bactérioplancton est très abondant dans les lacs et les rivières et les récentes découvertes en biologie moléculaire ont démontré que ces communautés sont très diverses. Une question primordiale dans le domaine de l'écologie microbienne est comment la diversité de ces microorganismes est connectée à leur capacité métabolique et à leur activité dans l'environnement. Dans une communauté bactérienne, ce ne sont pas toutes les bactéries qui sont actives également et il y a une gamme continue d'activités des cellules mortes aux cellules hautement actives. Il est encore imprécis de dire que les différents états physiologiques sont associés à des taxa spécifiques ou si l'activité est distribuée de façon homogène à travers tous les taxa. Cette étude explore la connexion entre les états physiologiques et la composition taxonomique dans les communautés bactériennes de lacs. Dans cette étude, nous nous sommes concentrés sur les cellules avec un contenu élevé et bas d'acides nucléiques et les cellules avec une membrane intacte ou endommagée. Dans le premier cas, le colorant nucléique Syto 13 permettra de différencier les cellules à haut et bas taux d'acides nucléiques. Pour l'intégrité des membranes cellulaires, celles-ci seront étudiées avec Baclight, un produit composé de deux colorants. Nous avons analysé les fractions en utilisant la cytométrie en flux et le triage cellulaire pour séparer physiquement les fractions bactériennes. Les échantillons ont été ensuite concentrés et l'ADN résultant a été extrait, amplifié et analysé en utilisant la DGGE. Les résultats montrent qu'il y a une différence entre la composition taxonomique et les différents états physiologiques, i.e. ce ne sont pas les mêmes espèces que l'on retrouve entre les cellules avec une membrane intacte et endommagée et entre les bactéries à haut taux ou bas taux d'acides nucléiques. Ces différences sont observées par la présence ou l'absence de bandes (DGGE) et plus souvent dans l'intensité des bandes. Ces résultats tentent de montrer qu'une connexion existe entre les états physiologiques et la composition taxonomique des communautés bactériennes, ce qui pourrait avoir des implications au niveau du fonctionnement et de la régulation de ces communautés. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Triage cellulaire, composition bactérienne, lacs, état physiologique, DGGE, bactérioplancton

Les communautés bactériennes aquatiques sont extrêmement sensibles et réactives aux gradients environnementaux. Il a été proposé que leur réponse résultent de changements dans leur structure, tels que la composition, la fonction ct la structure physiologique. L'objectif de cette thèse est de décrire les processus qui déterminent la réponse métabolique des communautés bactériennes face à des gradients dans les principales ressources, avec un intérêt particulier pour le rôle de la composition dans cette réponse. Les chapitres de cette thèse explorent dans un contexte de métacommunauté: Dans quelle mesure les ressources déterminent le métabolisme bactérien et leur structure, comment les composantes de la structure sont liées les unes aux autres, avec les ressources et la performance de la communauté, comment la composition des communautés est liée à la fonction, comment la plasticité métabolique et la redondance fonctionnelle influencent le rôle de la composition dans la réponse de la communauté. Ces différents aspects ont été explorés in situ dans divers écotones dans un bassin versant et par des expériences de transplantations en laboratoire. Spécifiquement, les objectifs sont (1) d'examiner si les patrons en termes du métabolisme et des composantes de la structure de la communauté présentent une certaine spécificité écosystémique (2) d'étudier le lien entre la composition et la fonction des communautés, (3) de décrire la séquence des relations entre les composantes de la structure des communautés qui médient la réponse de la communauté aux changements des ressources, (4) d'évaluer l'influence de la plasticité métabolique et redondance fonctionnelle sur le métabolisme en réponse aux changements environnementaux. Les résultats indiquent que la régulation du métabolisme bactérien par les ressources est médiée par des changements dans les composantes de la structure qui peuvent être soit directionnels, spécifiques aux écosystèmes, ou aléatoire. En fait, les résultats montrent que la réponse peut être médiée d'une part, par des ajustements physiologiques des phylotypes dominants ou par le remplacement même des phylotypes dominants. Le type de réponse n'apparaît pas être déterminé par le type, ni l'intensité des gradients, mais par la plasticité métabolique de la communauté, qui à son tour semble être déterminée par des facteurs indépendants des gradients eux-mêmes. Les résultats montrent que la composition et la fonction des communautés sont liées l'une à l'autre d'une manière très dynamique, tel que leurs patrons absolus ne sont pas corrélés. La force et la forme de la relation varient en fonction du type et de l'intensité des gradients, suggérant un haut niveau de redondance fonctionnelle tant au sein de la communauté, qu'au sein de la métacommunauté, à partir de laquelle les phylotypes sont sélectionnés pour occuper les nouvelles niches créées le long des écotones. Les résultats des expériences de transplantations indiquent: L'existence d'un seuil environnemental qui détermine le niveau de redondance fonctionnelle, et une spécificité écosystémique dans la plasticité métabolique. Collectivement, les résultats de cette thèse montrent que les conditions environnementales locales ont une plus grande influence sur la structure de la communauté que la dispersion, et que la composition des communautés bactériennes joue toujours un rôle dans cette réponse en déterminant le niveau de plasticité de la communauté, mais que ce rôle n'est qu'apparent lorsque la réponse implique un remplacement des phylotypes dans les communautés qui sont intrinsèquement moins plastiques. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : bactérioplancton, gradients environnementaux, métabolisme du carbone, structure des communautés, métacommunauté.

Les techniques d'analyses chimiques et biologiques nécessitent le développement à faible coût de capteurs chimiques fiables. Dans ce contexte, les transistors chimiques à effet de champ ChemFETs et les microélectrodes offrent des solutions innovantes à condition d'optimiser l'interface entre les différents domaines que sont les microtechnologies, la biologie et la chimie. Au cours de cette thèse, nous nous sommes attachés à développer des techniques permettant de coupler des agents chimiques au silicium. Deux approches ont été étudiées, toutes les deux basées sur l'utilisation de polymère. La première approche a été centrée sur le développement des techniques d'encapsulation avec la réalisation de microcuves et micro-canaux d'analyse en PDMS. Le suivi de l'activité bactérienne à l'aide de pH-ISFETs a été optimisé dans le cadre de l'étude des lactobacillus acidophilolus. La deuxième approche s'est intéressée à l'adaptation des ChemFETs et des microélectrodes d'or à la détection d'ions tels que le potassium et le sodium. L'utilisation des techniques de photolithographie a ainsi permis la fabrication collective de couches ionosensibles en PSX (polysiloxane)

Le système de sécrétion de type II (T2SS) est largement répandu chez les bactéries à Gram négatif. Il permet la sécrétion d'enzymes lytiques et de toxines. Chez la bactérie phytopathogène Erwinia chrysanthemi, les pectinases, sécrétées par ce système appelé Out, dégradent la pectine, provoquant les symptômes de pourriture molle. La sécrétion par le T2SS se passe en 2 étapes : les protéines traversent la membrane interne par le système Sec ou le système Tat. Une fois dans le périplasme, elles sont repliées et transloquées par le T2SS à travers la membrane externe. Le système Out est composé de 14 protéines intégrées ou associées à l'une des deux membranes. Son assemblage et son fonctionnement restent obscurs. Une plateforme serait formée dans la membrane interne par OutE, -F, -L, -M et -C. Ces trois derniers composants sont des protéines bitopiques dont la stœchiométrie et le rôle sont inconnus. Pour identifier des interactions entre ses composants, nous avons utilisé le double-hybride bactérien, basé sur la reconstitution de l'activité d'adénylate cyclase. Nous avons démontré que le domaine de type ferrédoxine, situé en C-terminus d'OutL et d'OutM, est directement impliqué dans l'homo- et l'hétérodimérisation de ces protéines. Une interaction entre les régions périplasmiques d'OutC et d'OutD a été aussi détectée (Login et al., 2010). Pour mieux analyser les multiples interactions au sein du T2SS, des expériences de triple-hybride ont été réalisées en co-exprimant différentes combinaisons des régions solubles de trois composants. Nos résultats suggèrent qu'OutL empêche l'interaction entre OutC et OutD. Par ailleurs, OutL est impliquée dans l'activation de l'ATPase OutE, le moteur du système (Camberg et al., 2007). OutL serait donc impliquée dans la transmission du signal entre le périplasme et le cytoplasme et pourrait intervenir dans la dissociation du complexe OutD/OutC. Afin d'analyser le rôle des segments transmembranaires (TMS) de composants du T2SS, nous avons adapté la technique du double-hybride. Le domaine de la protéine rapporteur Cya a été fusionné au N-terminus du TMS et BlaM au C-terminus. BlaM sert à contrôler la topologie correcte des fusions dans la membrane. Plusieurs interactions bi-partenaires entre les TMS d'OutC, OutL et OutM ont été ainsi détectées. Ce travail a été complété par une étude in vitro (pull-down) et par mutagenèse dirigée. Ces interactions TMS-TMS pourraient intervenir dans la transmission du signal du périplasme vers le cytoplasme à travers la membrane interne.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Ce travail est une contribution à la connaissance de l'importance des particules de nature polysaccharidique, les TEP (Transparent Exopolymer Particles) ou particules d'Exopolymères Transparentes, en milieu pélagique lacustre.Les différentes études présentées dans ce mémoire se sont essentiellement focalisées sur la distribution de ces particules et leur relation avec le phytoplancton et les autres microorganismes du réseau trophique aquatique en milieu naturel (le lac Pavin, oligo-mésotrophe et le réservoir hypereutrophe de Grangent) et en conditions semi contrôlées(enclos limniques installés sur le lac de Créteil). Les résultats de l'étude printanière au lac Pavin indiquent que la majorité des TEP sont colonisées par les bactéries et que l'intensité de colonisation est fortement liée à la température et diminue avec l'augmentation en taille des particules. La distribution des nanoflagellés hétérotrophes (HNF) est fortement liée à la densité des TEP mais pas à l'intensité de colonisation de ces particules. L'abondance et la surface cumulée de TEP sont significativement plus élevées dans le lac oligo-mésotrophe que dans le réservoir hypereutrophe de Grangent. Les abondances et les concentrations élevées de particules dans le lac Pavin coïncident avec la présence de diatomées de grande taille au printemps et en automne et avec les chlorophycées à la fin de l'été.Dans le réservoir de Grangent les valeurs maximales de TEP coïncident avec le développement de la cyanobactérie Microcystis aeruginosa. Si les TEP augmentent avec la productivité de l'écosystème, la production de ces particules par unité de chlorophylle a dépend de la composition algale et tend à diminuer avec l'augmentation du niveau trophique du milieu. Les résultats issus de la biomanipulation en enclos limniques indiquent que la structure du réseau trophique aquatique (par la présence ou l'absence de poissons planctonophages) influence fortement la distribution,la dynamique et le spectre de taille des TEP. Dans le traitement poisson, l'abondance des TEP, la chlorophylle a et la biomasse des chlorophycées sont fortement corrélées. De par son broutage sur le phytoplancton, le zooplancton a un effet négatif sur les TEP dans le traitement sans poissons mais il contribue sans doute à la formation de TEP e tinfluence le spectre de taille de ces dernières dans ce traitement. Ce travail souligne l'importance des particules de nature polysaccharidique en milieu pélagique lacustre qui doivent être considérées comme une part importante du carbone organique qui transite des producteurs primaires vers les décomposeurs et vers le sédiment.

Ces dernières décennies, la pollution de l’eau est devenue un problème se posant avec insistance dans le monde entier. En effet, la forte croissance des besoins en eau due à l’accroissement démographique ainsi qu’aux évolutions industrielles, agricoles et urbaines, engendrent des quantités énormes de rejets d’eaux usées. Ces derniers sont déversés dans la nature avec ou sans traitement et peuvent constituer un danger via la transmission de maladies ainsi que pour l’irrigation des terres qui se trouvent aux alentours du site de rejet. L’objectif de cette étude est le traitement des rejets aqueux par l’utilisation d’une nouvelle technologie appelée « photocatalyse hétérogène ». Ce procédé est basé sur l’utilisation d’un semiconducteur irradié par une source lumineuse de longueur d’onde appropriée et est simple à mettre en œuvre et peu coûteux. Des semiconducteurs ZnO/Fe2O3, ZnO de morphologie « bâtonnets » et ZnO dopé Mn2+ ont été synthétisés et testés dans diverses applications photocatalytiques. Les résultats obtenus ont montré une amélioration de l’efficacité catalytique par rapport au ZnO commercial. Les matériaux développés permettent de réduire la recombinaison des charges et, par conséquent, d’améliorer l’activité photocatalytique lors de la dégradation des polluants chimiques (acide salicylique, Orange II) et biologiques (bactéries) sous l’irradiation solaire. De plus, nous avons démontré la recyclabilité de ces catalyseurs sans traitement particulier. Dans la seconde partie de notre travail, nous avons étudié le mécanisme de la photocatalyse solaire sur une souche de référence E. coli MG 1655 en utilisant les bâtonnets ZnO soit en suspension soit immobilisés sur un support inerte. Les résultats montrent une perte de cultivabilité de la bactérie E. coli avec des dommages essentiellement localisés au niveau membranaire et des protéines, le matériel génétique restant intact. La réponse de trois souches bactériennes (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa et Salmonella enterica Typhi) au stress oxydant de la photocatalyse a montré des différences pouvant être attribués aux différences morphologiques, métaboliques et génétiques des souches (certaines souches peuvent se réactiver après traitement). Des études réalisées sur la souche Pseudomonas aeruginosa (ATCC 4114) montrent qu’il y a une perte de cultivabilité mais que la bactérie conserve sa capacité de se réactiver ainsi que ses caractères de virulence après traitement / In recent decades, the water pollution has become a problem worldwide. Indeed, the strong growth in water demand due to population growth as well as industrial developments, agricultural and urban, generates huge amounts of waste water discharges. These are released into nature with or without treatment and may constitute a danger via the transmission of diseases as well as for irrigation of lands that are surrounding the site of release. The objective of this study is the treatment of aqueous waste through the use of a new technology "heterogeneous photocatalysis." This method is based on the use of a semiconductor irradiated by a light source of appropriate wavelength and is simple to implement and inexpensive. ZnO / Fe2O3 semiconductors, ZnO morphology "nanorods" and Mn2+ doped ZnO were synthesized and tested in various photocatalytic applications. The results showed an improvement in catalytic efficiency compared to the commercial ZnO. The developed materials can reduce the recombination of charges and, therefore, improve the photocatalytic activity when the degradation of chemical pollutants (salicylic acid, Orange II) and biological (bacteria) under solar irradiation. Furthermore, we have demonstrated recyclability of these catalysts without specific treatment. In the second part of our work, we studied the solar photocatalysis mechanism on a reference strain E. coli MG1655 using ZnO nanorods either in suspension or immobilized on an inert support. The results show a loss of cultivability of E. coli with damage essentially localized in cell membranes and proteins. The genetic material remaining intact. The response of three bacterial strains (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa and Salmonella enterica Typhi) to oxidative stress of photocatalysis showed differences can be attributed to morphology, metabolism and genetics of each strain. (Some strains can be reactivated after treatment). Studies performed on the strain Pseudomonas aeruginosa (ATCC 4114) show that there is a loss of cultivability but that the bacterium retains its ability to activate its virulence and characters after treatment

Pour lutter contre les nuisibles des cultures (herbivores et pathogènes), de nouvelles voies ont été explorées et en particulier la lutte biologique. Utilisé la nature et ses organismes pour réguler les populations de pathogènes, tel est le but de la lutte biologique aussi appelé biocontrôle. Parmi les organismes couramment retrouvés dans le biocontrôle se trouve les micro-organismes, que cela soit des champignons ou des bactéries. Ces micro-organismes possèdent des capacités très intéressante pour des agriculteurs et agronomes. En effet, des études ont montré qu’ils étaient capables d’interagir avec les plantes pour permettre une meilleure croissance et santé de celle-ci. Alors, dans cette thèse, nous nous sommes intéressés aux bactéries pour trouver des méthodes de luttes alternatives à Fusarium graminearum, un pathogène des céréales responsables de fortes pertes de rendements, en particulier grâce à la production de mycotoxines qui va rendre les grains impropres à la consommation humaine et animales. Par l’intermédiaire d’une approche original consistant à garder des souches non-inhibitrice in vitro pour des tests in planta, nous avons pu montrer les limites de la sélection in vitro. Grâce à l’exploration métaboliques d’une souche particulièrement efficace, nous avons aussi pu mettre en évidence de potentiels nouvelles molécules antifongiques. Par l’intermédiaire d’une souche modèle, nous avons explorer les mécanismes de la mise en place d’une résistance systémique chez le blé induite par les bactéries. Et enfin, nous avons exploré le potentiel des combinaisons de bactéries dans la protection du blé qui semble représenter un vrai futur dans le monde du biocontrôle. Les travaux effectués s’inscrivent dans les besoins de nouvelles ressources pour limiter l’utilisation des pesticides, mais aussi dans un besoin de mieux comprendre les interactions tripartite entre blé, pathogène et bactéries bénéfiques / To combat pests of crops (herbivores and pathogens) new pathways have been explored, in particular biological control. Used the nature and its organisms to regulate the populations of pathogens, that is the goal of the biological fight also called biocontrol. Among the organisms commonly found in biocontrol are micro-organisms, be they fungi or bacteria. These microorganisms have very interesting capabilities for farmers and agronomists. Indeed, studies have shown that they are able to interact with plants to allow a better growth and health of it.Then, in this thesis, we were interested in bacteria to find alternative methods of struggle with Fusarium graminearum, a pathogen of cereals responsible for high yield losses, especially thanks to the production of mycotoxins that will make the seeds unfit for human and animal consumption.Through an original approach of keeping noninhibitory strains in vitro for in planta tests, we have been able to show the limitations of in vitro selection. Thanks to the metabolic exploration of a particularly efficient strain, we have also been able to highlight potential new antifungal molecules. Through a model strain, we explored the mechanisms of the establishment of systemic resistance in wheat induced by bacteria. And finally, we have explored the potential of bacterial combinations in wheat protection that seems to represent a real future in the world of biocontrol.The work done is in line with the needs of new resources to limit the use of pesticides, but also in a need to better understand the tripartite interactions between wheat, pathogen and beneficial bacteria

P. aeruginosa est une bactérie pathogène de l'homme, responsable d'infections nosocomiales chez les patients immunodéprimés. Bien que son évolution au sein d'un patient soit bien décrite, son évolution génomique globale au cours de sa propagation dans un hôpital est très mal connue. Le clone à haut-risque ST395 multirésistant aux antibiotiques a diffusé dans le Centre Hospitalier Regional Universitaire de Besançon entre 1997 et 2008 en infectant ou colonisant plus de 300 patients. Une approche WGS a été utilisée afin d'identifier l'origine de l'épidémie, les caractéristiques ayant aidé à son installation à l'hôpital ainsi que celles à l'origine de sa disparition. Les génomes de 54 isolats représentatifs de l'épidémie ont été séquencés. L’arbre phylogénétique a mis en évidence deux clusters distincts indiquant la présence de deux épidémies parallèles. La datation d'un ancêtre commun en 1979, date de début de la construction de l'hôpital, indiquerait une contamination précoce du réseau d'eau de l'hôpital. Cette hypothèse est soutenue par la présence d'un îlot génomique spécifique de ST395 portant les gènes codant 6 transporteurs du cuivre et associée à une résistance phénotypique à ce métal constituant les tuyaux du réseaux de distribution d'eau potable. Les isolats tardifs présentaient des signatures génomiques d'adaptation à l’infection chronique (altération du lipopolysaccharide et de la porine OprD – objectivées phénotypiquement, et extinction de la surproduction de la pompe d’efflux MexAB-OprM – contrôlée par RT-qPCR) suite à des mutations indépendantes. Certaines de ces mutations ont été associées à une perte de fitness bactérien. Nous émettons l’hypothèse que l’émergence indépendante d’isolats adaptés à l’infection chronique, et ainsi l’accumulation de culs-de-sac épidémiologiques, a participé à l’épuisement de l’épidémie hospitalière de P. aeruginosa ST395. / P. aeruginosa is an opportunistic pathogen responsible of hospital-acquired infections in immunocompromised patients. Although in-host evolution of P. aeruginosa is well documented, little is known about this pathogen evolution during its spread on a hospital scale. The high-risk multidrug resistant clone ST395 spread among more than 300 patients in the University Hospital of Besançon between 1997 and 2008. We used a WGS approach to identify the origin of the outbreak, the features that could have helped its implantation in our hospital and those associated with the end of the epidemics. The genomes of 54 representative isolates were fully sequenced. The phylogenetic tree indicated two distinct clusters corresponding to two parallel outbreaks. The ancestor of the ST395 clone possibly contaminated our hospital water network during its construction in 1979. This hypothesis is supported by the fact that the ST395 strain had a specific genomic island carrying 6 copper transporter genes implicated in copper resistance, correlated with the resistance to this metal which water supply network is made of. The late isolates displayed independent genomic signatures of chronic adaptation in patients (altered LPS and porin OprD, and extinction of MexAB-oprM efflux pump overproduction). Some of these mutations were associated with a decreased in vitro fitness. We hypothesize that the independent emergence of isolates adapted to chronic infection, and thus the accumulation of epidemiological dead-ends, participated to the end of the hospital outbreak of P. aeruginosa ST395.

Nous avons développé un module de detection de bactérie base sur le suivi électrochimique d’une PCR. Le système a été realisé en Copolymère d’Oléfin Cyclique (COC). Il s’agit ici de présenter une nouvelle approche pour concevoir des systèmes de despistage d’infection nosocomiale en quelques heures. INTRODUCTION Avec le développement des flux migratoires de population et l’apparition de résistance aux antibiotiques, les infections nosocomiales sont devenues un enjeu de santé majeur. Les besoins en systèmes de diagnostique accessibles financièrement augmentent considérablement. L’approche qui consiste à intégrer entièrement une chaîne d’analyse commence à avoir les faveurs des systèmes de santé et en particulier de l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS). Une compagnie nord américaine Cepheid a par ailleurs déjà développé un système automatisé de détection de germes basé sur l’identification de l’ADN par PCR. Cependant le coût élevé des technologies ralentit sa démocratisation malgré un apport considérable pour les tests cliniques de routine. Ici nous nous proposons une stratégie d’analyse qui permet de maîtriser les drastiquement les coûts de consommable. Tout d’abord tout le système est réalisé en COC, un thermoplastique qui peut être façonné à très grande échelle pour quelques dizines de centimes l’unité. [1]. Ensuite le système de détection, implique un suivi électrochimique qui remplace avantageusement les plateformes optiques traditionnellement coûteuses. Si la première cible de ce système est le dépistage de maladie nosocomiale, il apparaît aussi qu’il est transposable à d’autres domaines où la détection basée sur une PCR peut apporter des solutions. THEORIE L’échantillon, un écouvillon nasal est prélevé sur le patient. Ensuite les bactéries sont lysées grâce à l’utilisation de détergent. Une fois les parois bactériennes détruites, l’ADN est extrait sur phase solide par l’intermédiaire de billes magnétiques de type « charge switch » assemblées en colonnes [2]. Après lavage l’ADN est élué, puis amplifié par PCR en temps réel. Durant cette phase l’amplification de l’ADN est suivie grâce à l’utilisation d’un intercalant redox. Ce principe de détection fait l’objet d’un brevet [3] et nous présentons ici sa première implémentation dans un système de type laboratoire sur puce. Le complexe redox qui sert d’intercalant est détecté par voltammétrie à onde carrée (en anglais : Square Wave Voltammetry SQWV). Ce complexe interagit avec l’ADN double brin par intercalation pendant la phase d’élongation, ainsi il n’est plus disponible pour l’échange d’électrons avec les électrodes de détection. En conséquence, on observe une chute du niveau de courant mesuré pendant la SQWV qui correspond à l’augmentation de la quantité d’ADN. PRATIQUE De noveaux protocoles de fabrication de systèmes en thermoplastique ont été développés permettant de réaliser des système en COC robustes et étanches. L’intégration des électrodes sérigraphiées a été réalisée avec succès. Le desgin de la puce a été choisi afin de permettre la parallélisation d’expérience en vue des tests de sensibilité de détection. Afin de réaliser les cycles de chauffage nécessaire à l’amplification par PCR un système dédié, comprenant un bloc thermique, un système de régulation et une partie logicielle à été développé. La preuve de concept de l’efficacité du système a été démontré sur de l’ADN modèle : le Litmus. Il est possible de distinguer différentes concentration en ADN de départ. / With the development of human mobility and antibiotics resistance, nosocomial infections have become a major health problem. The need for fast and efficient diagnosis systems, ,while affordable by the health care systems, is increasing. The “sample to result” integration allowed by microfludics is a strong asset in such developments. Cepheid developed an integrated system for germ genotyping based on real-time PCR, but due to expensive laser-induced fluorescence detection its cost still reduces its range of applications in routine clinics. Here, we propose a new strategy allowing further cost reduction. First, the whole analysis streamline is integrated in a single chip made of Cyclo Olefin Copolymer (COC) [1]. This material can be mass-processed by CD technology, to yield chips at a few cents a piece. Second, the detection involves an electrochemical method that alleviates need for optics. Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA) was chosen as the initial primary target for validation. The technologies developed will further be applied to other strains of Bacteria or other fields such as agriculture, food testing, GMOs or security. The sample, a nasal swab, undergoes a chemical lysis, and DNA is extracted by selective capture on magnetic beads self-assembled into dense microcolumns arrays, as presented at MicroTAS 2009 [2]. DNA is then eluted, amplified by PCR in real time in the chip, while detected in situ by a high sensitivity electrochemical detection catalyzed by an intercalating redox compound. This proprietary technology [3] is being implemented here for the first time in a lab on chip. New protocols were developed to make a robust and leakage-free COC microfluidic chip with integrated electrodes. COC is a biocompatible and solvent resistant thermoplastic material. The COC microfluidic chip consists of a substrate with a hot-embossed microchannel and screen printed carbon and silver electrodes. The chip is sealed by solvent bonding [4]. This provides simple and cost effective fabrication, directly upscalable to mass production PCR Thermal control is done externally with a customized thermocycler. A redox compound is introduced together with DNA sample enabling electrochemical detection through Square Wave Voltammetry (SQWV). This compound intercalates in double-stranded DNA during the extension step, reducing its mobility and redox activity, so the peak current decreases during amplification of the target DNA. A sensitivity below 1ng/µL suitable for MRSA detection was achieved. The data were obtained by SQWV measurements. There is a clear correlation between the increase of DNA concentration and the decrease of the peak current for the redox compound: PCR amplification was also performed inside the chip, demonstrating the compatibility of this platform with thermal cycling and biomolecular reactions. Real-time electrochemical measurement during cycling was not possible yet due to experimental setup geometrical constraints, but work is in progress and results will be presented at the conference. Future experiments will focus on the integration of the bacteria lysis and DNA extraction steps on the same chip.