Les premières souches bactériennes résistantes aux antibiotiques sont connues depuis 70 ans et se sont multipliées ces dernières années posant un grave problème de santé publique. Parmi les nombreux types d'infections induites par ces bactéries, nous nous sommes intéressés aux infections intestinales qui peuvent dégénérer en maladies inflammatoires de l'intestin et cancers. Notre travail de thèse a consisté à proposer des outils thérapeutiques dans le traitement des pathologies intestinales infectieuses : des peptides antimicrobiens dérivés de la chromogranine A et des extraits de plantes de la médecine traditionnelle béninoise. La chromogranine A est une protéine libérée par les cellules nerveuses, neuroendocrines et immunitaires au cours d'un stress et maturée en peptides. Des peptides actifs contre quatre souches bactériennes pathogènes (Klebsiella oxytoca, Salmonella enterica, Shigella sonnei et Vibrio cholera non O1) ont été identifiés et l'interaction bactérie-peptide analysée. L'étude de la combinaison peptide-antibiotique montre que la cateslytine permet de réduire les doses d'antibiotiques nécessaires. Ensuite, nous avons étudié l'implication de deux peptides sur un modèle de cellules neuroendocrines, les cellules BON. La chromofungine provoque la stimulation des cellules BON en induisant un influx de calcium extracellulaire, tandis que la catestatine est capable de bloquer l'activité de la chromofungine.Après un screening des extraits de 14 plantes du Bénin, nous avons isolé deux molécules, la sinensétine et l'O-tétraméthyléther scutellaréine, responsables de l'activité antibactérienne de Chromolaena odorata contre les pathogènes étudiés.

La surexpression des pompes d’efflux (PE) appartenant à la famille Resistance-Nodulation-Division (RND) est l’un des contributeurs majeurs de la multirésistance (MDR) et la pathogénicité des bactéries Gram-négatives. Ces transporteurs sont capables d'expulser à l’extérieur de la cellule bactérienne différentes classes d'antibiotiques, ce qui contribue de manière significative à l'échec thérapeutique du traitement des maladies infectieuses. Dans ce contexte, les PEs sont des cibles intéressantes pour la découverte de nouveaux antimicrobiens. Afin de combattre ce mécanisme de résistance, des inhibiteurs des pompes d’efflux (EPIs) sont développés comme adjuvants d'antibiotiques dans le but de restaurer ou d'améliorer leur activité. L'archétype AcrAB-TolC est particulièrement répandu chez les espèces d’Enterobacter pertinentes en clinique (pathogènes « ESKAPE »). Cette étude décrit une stratégie basée sur des analogues des fluoroquinolones pour le drug design des EPIs, contre la pompe AcrB chez E. aerogenes. Ainsi, la synthèse et l'évaluation microbiologique des dérivés de quinazoline-4(3H)-one ont été effectuées. Les propriétés structurales et moléculaires des composés testés (i.e. rigidité et flexibilité) ont également été étudiées. Pour cela, de nouveaux scaffolds ont été évaluées. Plusieurs molécules ont montré une augmentation de la sensibilité des bactéries à la norfloxacine et au chloramphénicol. Les résultats obtenus, appuyés par la modélisation moléculaire, suggèrent que la flexibilité moléculaire et la nature des fonctions chimiques des EPIs jouent un rôle essentiel dans l'amélioration de l'activité et la sélectivité vis-à-vis des fluoroquinolones. / Overexpression of Resistance-Nodulation-Division (RND) efflux pumps (EP) is a major contributor in multidrug resistance (MDR) and pathogenicity in Gram-negative bacteria. These transporters are able to expel out of the bacterial cell clinically important antibiotic classes, contributing in a significant manner to the treatment failure of infectious diseases. With the worrying levels of bacterial resistance reported worldwide and the continuous spreading of MDR pathogens, EPs are interesting targets for the discovery of new antimicrobial drugs. Therefore, to overcome this mechanism, efflux pump inhibitors (EPIs) are being developed as adjuvants in order to restore or improve the activity of usual antibiotics. The AcrAB-TolC archetype is particularly widespread in Enterobacter spp. presenting clinical relevance (ESKAPE pathogens). In this study, we described the drug design strategy based on fluoroquinolone antibiotic analogs, against the AcrB pump of E. aerogenes. Thus, synthesis and microbiological evaluation of quinazolin-4(3H)-one derivatives were performed. The structural and molecular properties of the tested compounds (i. e. rigidity and flexibility) were also investigated. In this purpose, a scaffold hopping of the quinazolinone core to homologous benzoquinazolinones and precursors benzamides were carried out. Several molecules increased the bacterial susceptibility towards norfloxacin and chloramphenicol. The obtained results, supported by molecular modeling, suggest that molecular flexibility and the nature of chemical functions play a critical role to improve activity and selectivity on fluoroquinolone potentiation targeting AcrB efflux pump.

Les premières souches bactériennes résistantes aux antibiotiques sont connues depuis 70 ans et se sont multipliées ces dernières années posant un grave problème de santé publique. Parmi les nombreux types d’infections induites par ces bactéries, nous nous sommes intéressés aux infections intestinales qui peuvent dégénérer en maladies inflammatoires de l’intestin et cancers. Notre travail de thèse a consisté à proposer des outils thérapeutiques dans le traitement des pathologies intestinales infectieuses : des peptides antimicrobiens dérivés de la chromogranine A et des extraits de plantes de la médecine traditionnelle béninoise. La chromogranine A est une protéine libérée par les cellules nerveuses, neuroendocrines et immunitaires au cours d’un stress et maturée en peptides. Des peptides actifs contre quatre souches bactériennes pathogènes (Klebsiella oxytoca, Salmonella enterica, Shigella sonnei et Vibrio cholera non O1) ont été identifiés et l’interaction bactérie-peptide analysée. L’étude de la combinaison peptide-antibiotique montre que la cateslytine permet de réduire les doses d’antibiotiques nécessaires. Ensuite, nous avons étudié l’implication de deux peptides sur un modèle de cellules neuroendocrines, les cellules BON. La chromofungine provoque la stimulation des cellules BON en induisant un influx de calcium extracellulaire, tandis que la catestatine est capable de bloquer l’activité de la chromofungine.Après un screening des extraits de 14 plantes du Bénin, nous avons isolé deux molécules, la sinensétine et l’O-tétraméthyléther scutellaréine, responsables de l’activité antibactérienne de Chromolaena odorata contre les pathogènes étudiés. / The first bacterial strains resistant to antibiotics appeared 70 years ago and have proliferated in recent years causing a serious public health problem. Such bacteria are responsible of several types of infections including intestinal infections with chronic inflammatory bowel diseases and cancers. This work consisted of proposing new therapeutic tools in the treatment of intestinal pathologies. In this context, we have studied antimicrobial peptides derived from chromogranin A and plant extracts used in Beninese traditional medicine for the treatment of such diseases. Chromogranin A is a protein produced by nervous, endocrine and immune cells during a stress and processed to generate biologically active peptides. We identified antimicrobial peptides, active against four pathogenic bacterial strains (Klebsiella oxytoca, Salmonella enterica, Shigella sonnei and Vibrio cholera non O1) and analyzed the bacteria-peptide interactions. Moreover, the study of the peptide-antibiotic combination shows that cateslytin is useful for reducing doses of antibiotic drugs. In addition of this work, we have studied the effects of two peptides derived from chromogranin A on neuroendocrine cells with model of BON cells. Chromofungin stimules BON cells by inducing an influx of extracellular calcium, whereas catestatin is able to block chromofungin’s activity.With plant extracts, after a screening on 14 plants from Benin, our works enabled us to isolate two active molecules, sinensetin and O-tetramethylether scutellarein, responsible of the antimicrobial activity of Chromolaena odorata against the studied pathogenic strains.

Les maladies infectieuses dues aux bactéries Gram + sont causes de mortalité importante à travers le monde, et de récentes études ont mis en évidence le rôle pathologique de l’interféron de type I (I IFN) dans ces maladies. Les cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC) produisent des quantités importantes d’IFN de type I suite à la détection de virus. Des données récentes suggèrent que les pDC humaines pourraient également détecter des bactéries, mais les récepteurs impliqués restent inconnus. Au cours de ma thèse, j’ai caractérisé l’expression des récepteurs TLR2 / 1 par les pDC. Ces deux récepteurs permettent aux pDC de détecter les lipoprotéines bactériennes. Je montre que les pDC répondent aux bactéries Gram + (M. tuberculosis, S. aureus et L. monocytogenes) par la voie TLR2 / 1. Mon travail a montré que les pDC primaires humaines expriment TLR1 et TLR2 à la fois au niveau de l'ARNm et au niveau protéique. En réponse aux lipoprotéines bactériennes, la régulation des molécules costimulatrices par les pDCs est TLR1-dépendante tandis que la sécrétion d’I-IFN est TLR2-dépendante. De plus, TLR2 et TLR1 jouent des rôles distincts au cours du priming des cellules T CD4+ naïves par les pDCs, induisant une prolifération et différentiation en sous-populations Th1 / Th2 / Treg. Je démontre en outre que ces différences reposent sur les voies de signalisation distinctes de ces deux TLR. Ce travail de thèse pose ainsi les bases pour l’exploration du rôle des pDC dans les infections bactériennes humaines. / Infections by Gram+ bacteria are worldwide life-threatening diseases where new studies are highlighting the pathological role of Type I interferon (I IFN). Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are the main source of Type I IFN following viral sensing. Recent evidence suggests that human pDCs might sense bacteria. The receptors mediating bacterial sensing in pDCs are not known. During my thesis, I focused on the characterization of pDCs TLR2/1 receptors expression. These two receptors allow pDCs to sense Gram+ bacterial lipoproteins. My work showed that human primary pDCs express TLR1 and TLR2 at the mRNA and protein level. I show that pDCs respond to the Gram+ bacteria M. tuberculosis, S. aureus and L. monocytogenes through TLR2/1 pathway. In human primary pDC, I found that in response to bacterial lipoproteins up-regulation of costimulatory molecules is TLR1-dependent while IFN-I secretion is TLR2-dependent. TLR2 and TLR1 signalling play a different role in the pDCs priming of naïve CD4+ T-cells, inducing proliferation and differentiation to TH1/TH2/Treg subsets. I further demonstrate that these differences rely on the diverse signaling pathway activated by the two TLRs. This work provides the rationale to explore pDCs activity in human bacterial infection.

Cette étude s’inscrit dans le cadre d’un programme de recherche destiné à évaluer le potentiel d’utilisation en horticulture des bactéries Bacillus pumilus souche PTB180 et Bacillus subtilis souche PTB185. Elle avait pour objectifs (1) d’évaluer in vitro l’activité antagoniste contre Botrytis cinerea des souches PTB180 et PTB185, (2) d’estimer leur capacité à survivre sur la phyllosphère de la tomate et du concombre et 3) d’évaluer leur effet sur le développement de la pourriture grise (B. cinerea) sur des plants de tomate et de concombre cultivés en serre. L'activité antagoniste de PTB180 et PTB185 a été évaluée en boîtes de Pétri sur géloses, sur tissus foliaires de tomate et de concombre et sur fruits de tomate. Les deux souches ont inhibé très fortement la croissance mycélienne et la germination des spores de B. cinerea sur géloses. Sur feuilles de tomate et sur disques foliaires de concombre, PTB185 et le mélange (1:1) des deux souches ont réduit significativement (p ≤ 0,01) la croissance mycélienne de B. cinerea comparativement aux témoins. PTB180 a réprimé significativement la croissance mycélienne de B. cinerea sur les fruits de tomate. Afin d'estimer la survie de PTB180 et PTB185 sur la phyllosphère, des plants de tomate et de concombre ont été pulvérisés jusqu'à ruissellement avec une suspension (1×107 unités formatrices de colonies [UFC]/mL) de PTB180, PTB185 ou d'un mélange (1:1) des deux souches. Les populations de chaque souche ont ensuite été suivies au cours du temps sur les feuilles. Les résultats obtenus montrent que les souches survivent au moins 21 jours sur les plants de tomate et de concombre avec un taux de survie variant de 43% à 100%. De plus, pratiquement aucune variation dans les proportions de chaque souche n'a été observée au fil du temps lorsque PTB180 et PTB185 étaient appliquées en mélange. Enfin, l’application foliaire de PTB180, PTB185 et du mélange (1:1) des deux souches a permis une réduction significative de l’incidence et de la sévérité de la pourriture grise chez des plants de tomate et de concombre inoculés avec B. cinerea et cultivés en serre. Les souches PTB180 et PTB185 ont montré au cours de cette étude une forte activité antagoniste envers B. cinerea, la capacité de survivre sur la phyllosphère de plants de tomate et de concombre et de réprimer le développement de la pourriture grise chez ces derniers. Ces souches pourraient éventuellement être utilisées comme agents de lutte biologique contre la pourriture grise du concombre et de la tomate de serre.

La résistance des bactéries à Gram négatif aux céphalosporines de troisième génération (C3G) et aux carbapénèmes constitue une menace de santé publique majeure à l’échelle mondiale. Ces β-lactamines à large spectre d’action sont spécifiquement utilisées dans le traitement des infections résistantes potentiellement mortelles causées par des bactéries multirésistantes. Le principal mécanisme de résistance aux C3G et aux carbapénèmes est l’acquisition de gènes encodant respectivement des β-lactamases à spectre étendu (BLSE) et des carbapénémases. Plusieurs études ont répertorié les principales β-lactamases responsables des épidémies dans de nombreux pays à savoir les types TEM, SHV et CTX-M pour les bactéries productrices de BLSE, et plus récemment les types IMP, KPC, NDM, OXA-48 et VIM pour les bactéries productrices de carbapénémases. L’Organisation mondiale de la Santé a recommandé des mesures contrôle et prévention et de contrôle afin de réduire le risque de transmission des bactéries à Gram négatif productrices de BLSE ou de carbapénémases. Ces stratégies incluent l’identification des bactéries productrices de BLSE et de carbapénémases par des méthodes diagnostiques rapides de même que la mise en place d’une surveillance épidémiologique des principaux gènes de résistance encodant à ces enzymes. Ce mémoire de maîtrise se présente en 2 volets. D’une part, le développement d’un essai PCR en temps réel pour la détection rapide et sensible des gènes encodant les principales carbapénémases. D’autre part, la réalisation d’une étude épidémiologique dans deux hôpitaux de la ville de Québec sur les principaux gènes de BLSE chez des souches cliniques résistantes aux céphalosporines de 3e génération. Ces résultats démontrent que ces approches moléculaires pourraient être utilisées dans les laboratoires de microbiologie clinique afin de faciliter la détection et la surveillance des bactéries productrices de BLSE et de carbapénémases. / The resistance of Gram-negative bacteria against third-generation cephalosporins (3GC) and carbapenems is a major public health threat worldwide. These antibiotics are used specifically in the treatment of life-threatening infections caused by multidrug-resistant bacteria. The acquisition of genes encoding for extended-spectrum β-lactamases (ESBL) and carbapenemases is the main mechanism of resistance to 3GC and carbapenems, respectively. Several studies have identified the main β-lactamases responsible for epidemics in many countries namely TEM, SHV, and CTX-M for ESBL-producing bacteria, and more recently IMP, KPC, NDM, OXA-48-type, and VIM for bacteria producing carbapenemases. The World Health Organization has recommended preventives measures to control and reduce the risk of transmission of Gram-negative bacteria producers of ESBL and carbapenemases. These strategies include the identification of ESBL and carbapenemases with rapid diagnostic methods as well as the establishment of epidemiological surveillance of major resistance genes for these enzymes. This master’s thesis is presented in two parts. On one hand, the development of a real-time PCR assay for rapid and sensitive detection of key genes encoding carbapenemases. On the other hand, an epidemiological study in two hospitals in Quebec City of genes coding for ESBL in clinical strains resistant to third generation cephalosporins. These results demonstrate that these molecular approaches could be used in clinical microbiology laboratories to facilitate the detection and monitoring of ESBL- and carbapenemases-producing bacteria.

Cupriavidus metallidurans CH34 est la bactérie Gram négative considérée comme organisme-modèle pour l’étude de la résistance aux métaux lourds. Notre travail a porté sur sa résistance au cuivre, codée par les gènes cop du plasmide pMOL30. Ces gènes, responsables des différentes étapes de la résistance (compartimentation des systèmes d’efflux entre périplasme et cytoplasme, modification de valence, et d’autres fonctions totalement inconnues) ont suscité notre intérêt.<p><p>On distingue dans l’îlot cop des gènes codant pour des fonctions de résistance proprement dite (essentiellement par détoxication active du cytoplasme et du périplasme). En effet, les mutants de copSRABCD, copF, et dans une moindre mesure copJ et copE deviennent sensibles. Les phénotypes des mutants divergent toutefois suivant que la mutation soit sur un cosmide qui ne porte que l’îlot (pMOL1024) ou dans son plasmide d’origine (pMOL30). Un second groupe de mutants (copVTMK, copG, copL, copQ) se distingue par un phénotype plus résistant ou identique à la souche parente, sauf autour de la CMI. Ces gènes interviendraient donc à la CMI pour assurer la résistance la plus élevée et le maintien d'un état viable latent.<p><p>La présence de l’îlot cop permet de contenir le taux d’oxygène radicalaire qui reste à un taux basal lorsque les cellules sont adaptées au cuivre environnent. Après un choc de Cu (ou stress aigu), l’îlot cop répond de façon « explosive » au stress, en consommant l’énergie du potentiel membranaire et en augmentant fortement l’activité de la chaîne respiratoire.<p><p>La résistance au cuivre est inductible, mais de façon différenciée pour la souche sauvage (CH34) et celle qui ne porte qu l’îlot cop (AE1744) :la CMI de CH34 triple après adaptation au cuivre, alors que celle d’AE1744 est inchangée. Après un choc de Cu, la résistance au cuivre est plus fortement induite pour AE1744 que pour CH34. Ces observations suggèrent que l’îlot cop ait été sélectionné pour sa capacité à répondre à un stress aigu puis intégré dans un ensemble de gènes plus vaste qui répond à des impératifs de stress chronique.<p><p>L’analyse biochimique de CopI, une petite protéine bleue à cuivre, montre qu’elle porte un site analogue à celui des oxydases multicuivre. Son rôle pourrait dès lors être celui d’une réductase multicuivre. La protéine CopK lie de façon très spécifique le Cu(I) et il semble que la liaison du cuivre modifie sa structure. L’analyse écologique a montré que des homologues de copK pourraient être présents dans l’ADN extrait de la terre de biotopes chargés en cuivre, et dans les souches cuprorésistantes qu’on y trouve. <p><p>La contribution majeure de cette thèse est de montrer que l’effet d’un stress métallique ne se résume pas à deux états physiologiques « mort ou vif ». Il y a lieu de considérer des états transitoires (choc de Cu, adaptation au métal, survie autour de la CMI, persistance) où interviennent des gènes spécifiques dans un ou plusieurs états donnés. Les résultats biochimiques et physiologiques ne nous éclairent pas encore assez sur les interconversions Cu(I)/Cu(II) ni sur les flux de cations notamment vers l'espace extracellulaire. Cette thèse ouvre des perspectives sur des mécanismes (protection à la CMI, phénotype persistant) assurant la survie des bactéries ou leur potentiel de recolonisation lors d'une diminution de la pression toxique :les gènes copT, copV, copK, copM, copB, copG, copL et copQ semblent impliqués dans ces fonctions. <p> / Doctorat en Sciences agronomiques et ingénierie biologique / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Le but de ce travail est d’étudier le lien suspecté entre l’inflammation buccale et la survenue des AVC ischémiques. Dans les pays occidentaux, l’incidence des infarctus cérébraux est en augmentation malgré les campagnes de prévention visant à limiter l’exposition aux facteurs de risque classiques des pathologies ischémiques. Près de 9% des accidents vasculaires cérébraux sont sans étiologie connue. Le facteur déclenchant de l’AVC ischémique ou le « key trigger » reste inconnu. Des études récentes montrent qu’un AVC ischémique est plus susceptible de se déclencher dans la semaine qui suit un événement infectieux. De ce fait, l’inflammation buccale entraînant une élévation de différents biomarqueurs inflammatoires est susceptible de favoriser la survenue des AVC. Dans un premier temps, une méta-analyse a été effectuée afin de faire la synthèse des données étudiant la relation entre l’inflammation buccale et la survenue des AVC. Elle a montré que le risque d’avoir un AVC ischémique fatal augmente de 38% chez les sujets atteints de parodontite sévère. Dans un deuxième temps, deux études cliniques observationnelles ont été mises en place afin de renforcer la validité des liens épidémiologiques supposés et d’apporter de nouveaux éléments dans la compréhension des mécanismes physiopathologiques liant l’inflammation buccale et la survenue des AVCI. Les résultats montrent une relation entre le degré d’inflammation buccale et les marqueurs biologiques athéromateux et inflammatoires. En effet, nos résultats montrent une augmentation des taux de CRP, de VLDL, de triglycérides et une diminution des taux de HDL lors d’une atteinte parodontale sévère. C’est la perte osseuse parmi les marqueurs cliniques de l’inflammation buccale aisément évaluable sur un panoramique dentaire, qui est la plus significativement liée au risque de la survenue des AVC ischémiques. Les résultats de cette thèse suggèrent que la présence d’un contexte buccal inflammatoire favoriserait la survenue le développement d’un AVCI. En outre, nos résultats confirment la nécessité d’une coopération entre l’odontologue et le neurologue afin d’améliorer la prise en charge du risque vasculaire chez un patient ayant un AVCI avec une inflammation buccale. / The aim of this work is to investigate the suspected link between oral inflammation and the occurrence of ischemic stroke. In Western countries, the incidence of ischemic stroke is rising despite prevention campaigns aiming at limiting the exposure to common risk factors for ischemic diseases. Nearly 9% of strokes are of unknown etiology. The triggering factor for ischemic stroke or "trigger key" remains unknown. Recent studies have shown that ischemic stroke is more likely to occur in the week following an infectious event. Therefore, oral inflammation, that causes a rise in various inflammatory biomarkers is studied as potentially increasing the risk of stroke. Firstly, a meta-analysis was performed to synthesize data about the relationship between oral inflammation and the occurrence of stroke. It has shown that the risk of fatal ischemic stroke increases by 38% in patients with severe periodontitis. Secondly, two observational clinical studies have been implemented to strengthen the validity of the supposed epidemiological links and bring new elements in our understanding about the pathophysiological mechanisms linking oral inflammation and the occurrence of ischemic stroke. The results show a proportional relationship between the degree of oral-inflammation and biological assessments that demonstrate pro-atherosclerotic and pro-inflammatory state. Indeed, we observe an increase in CRP levels, VLDL triglycerides and a decrease in HDL in patients with severe periodontal disease. Bone loss, that is easily measurable on a dental panoramic radiograph, appears to be the main risk factor of the occurrence of ischemic stroke.The results of this thesis show that the presence of an inflammatory oral environment is an additional marker for the discovery of a cardiovascular risk in patients combining other conventional risk factors of ischemic stroke. In addition, our results suggest the need for cooperation between the neurologists and odontologists to improve the management of cardiovascular risk in patients with ischemic stroke and oral inflammation.

Les systèmes d’efflux tripartite de type Resistance, Nodulation and cell-Division (RND) sont essentiels dans le maintien de phénotypes de résistance multidrogues et contre les métaux lourds dans nombreuses bactéries Gram-négatives. Le transport de ces composés toxiques hors de la cellule est permis par l’assemblage d’une protéine de type antiporteur cation/proton (unité RND) insérée dans la membrane interne, connectée à une protéine insérée dans la membrane externe, pour former un canal de sorti qui traverse l’entièreté de l’enveloppe cellulaire. Le troisième composant du système, la protéine de type membrane fusion protein (MFP) qui est aussi appelée periplasmic adaptor protein (PAP), est requis pour permettre l’assemblage de tout ce complexe à trois composants. Cependant, les MFPs sont supposées jouer un rôle important et actif dans le mécanisme d’efflux du substrat. Pour mieux comprendre le rôle des MFPs au sein des systèmes d’efflux de type RND, nous avons étudié les protéines ZneB (précédemment appelée HmxB) et SilB, les composants périplasmiques des systèmes ZneCBA et SilABC responsables de la résistance aux métaux lourds chez Cupriavidus metallidurans CH34. Nous avons identifié la spécificité de liaison au substrat de ces protéines, montrant leur capacité à fixer le zinc (ZneB), ou le cuivre et l’argent (SilB). De plus, nous avons résolu la structure cristalline de ZneB à une résolution de 2.8 Å dans la forme apo- et avec un ion zinc fixé. La structure de ZneB possède une architecture générale composée de quatre domaines caractéristiques des MFPs, et la présence du site de coordination au zinc dans une région très flexible à l’interface des domaines β-barrel et membrane proximal. Les modifications structurales que la protéine subit lors de la fixation du zinc on été observée dans le cristal mais aussi en solution, ce qui suggère un rôle actif des MFPs dans le mécanisme d’efflux des métaux, vraisemblablement via la fixation et le relargage de l’ion à l’antiporteur. Les études de sélectivité de transport des antiporteurs ZneA et SilA montre que ces dernières et leurs protéines périplasmiques respectives ont des affinités similaires pour les métaux lourds. De plus, les études de transport ont apportés des arguments en faveur de l’hypothèse de capture cytoplasmique du substrat par l’antiporteur, tandis que la capacité des protéines périplasmiques à fixer les métaux lourds a apporté des arguments en faveur de l’hypothèse de capture périplasmique du substrat par l’antiporteur. Les deux modes de capture pourraient en réalité coexister ;cependant, le débat autour du compartiment cellulaire de capture du substrat par l’antiporteur est complexe et requiert de plus amples efforts afin d’être cerné. / Tripartite resistance nodulation cell division (RND)-based efflux complexes are paramount for multidrug and heavy metal resistance in numerous Gram-negative bacteria. The transport of these toxic compounds out of the cell is driven by the inner membrane proton/substrate antiporter (RND protein) connected to an outer membrane protein to form an exit duct that spans the entire cell envelope. The third component, a membrane fusion protein (MFP) also called periplasmic adaptor protein, is required for the assembly of this complex. However, MFPs are also proposed to play an important active role in substrate efflux. To better understand the role of MFPs in RND-driven efflux systems, we studied ZneB (formerly HmxB) and SilB, the MFP components of the ZneCAB and SilABC heavy metal RND-driven efflux complexes from Cupriavidus metallidurans CH34. We have identified the substrate binding specificity of the proteins, showing their ability to selectively bind zinc (ZneB), or copper and silver cations (SilB). Moreover, we have solved the crystal structure of the apo- and the metal-bound forms of ZneB to 2.8 Å resolution. The structure of ZneB displays a general architecture composed of four domains characteristic of MFPs, and it reveals the metal coordination site at the very flexible interface between the β-barrel and the membrane proximal domains. Structural modifications of the protein upon zinc binding were observed in both the crystal structure and in solution, suggesting an active role of MFPs in substrate efflux possibly through binding and release. The selectivity assays of the antiporter proteins ZneA and SilA demonstrated similar specificities in relation to their cognate MFPs toward heavy metal cations. Moreover, antiporter transport assays provide evidence for cytoplasmic substrate capture by this protein, whereas MFP substrate binding provides evidence for periplasmic substrate capture. Therefore, both modes of capture might co-exist; nevertheless, the substrate capture issue is a complex topic still needing consequent efforts to understand it. / Doctorat en Sciences agronomiques et ingénierie biologique / info:eu-repo/semantics/nonPublished