Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2017. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2017-06-19T16:20:52Z No. of bitstreams: 1 2017_FabríciodaSilvaMorgado.pdf: 7664868 bytes, checksum: 4767942a70994bbd3c3882749c32c0a1 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2017-08-18T16:45:30Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_FabríciodaSilvaMorgado.pdf: 7664868 bytes, checksum: 4767942a70994bbd3c3882749c32c0a1 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-18T16:45:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_FabríciodaSilvaMorgado.pdf: 7664868 bytes, checksum: 4767942a70994bbd3c3882749c32c0a1 (MD5) Previous issue date: 2017-08-18 / Os baculovírus são vírus que infectam larvas de mariposas e borboletas. São vírus capazes de formar dois fenótipos virais ao longo da infecção celular separados temporalmente. O primeiro fenótipo, os budded vírus, são vírus que brotam da célula e retêm um envelope a partir da membrana celular. Estes servem como agentes da proliferação sistêmica dentro do corpo do hospedeiro. O segundo fenótipo, os occlusion derived virus, são partículas virais envelopadas no núcleo e oclusas dentro da matriz cristalina formada pela proteína poliedrina, abundantemente expressa em momentos muito tardios da infecção. O progresso da infecção e os padrões de expressão gênica são controlados principalmente a nível transcricional, com base na sequência de DNA contida nos promotores dos genes. Para avaliar o programa transcricional e os elementos controladores das infecções baculovirais, desenvolvemos uma nova metodologia de detecção de luminescência em tempo real, derivada da infecção de células de inseto por baculovírus recombinantes contendo promotores de genes expressos em diferentes fases da infecção que controlam a expressão da proteína quimioluminescente Luciferase de vaga-lume. Isto permitiu, de forma inédita, a caracterização detalhada da expressão gênica a partir de promotores dos baculovírus Anticarsia gemmatalis MNPV e Autographa californica MNPV. O que revelou perfis de expressão diferenciais em linhagens permissivas, semipermissivas e não-permissivas à infecção por estes baculovírus. Também foram avaliados promotores do Bracovírus endosimbiótico encontrado em Microplitis demolitor, uma vespa parasita de larvas de Lepidoptera, através da metodologia de medição de luminescência em tempo real. Estes promotores derivados do Bracovírus apresentaram perfis de expressão similares aos de promotores tardios dos baculovírus. A capacidade de transdução e entrega gênica na linhagem celular derivada da vespa M. demolitor por baculovírus recombinantes também foi avaliada / The baculoviruses are infectious to the larvae of moths and butterflies. These are viruses capable of forming two distinct phenotypes throughout the cellular infection that are temporally separated. The first phenotype, the budded virus, are virions the budded thru the cell membrane, carrying an envelope. These are the agents of the systemic infection within the host’s body. The second phenotype, the occlusion derived virus, are enveloped viral particles that are occluded within the crystalline matrix that forms the occlusion bodies, that protect the virus in the environment in the absence of the host. The progress of the cell infection and the patterns of gene expression are controlled at the transcriptional level, mainly based on the DNA sequence of the gene promoters. To evaluate the transcriptional program and the controlling elements of the baculovírus, we developed a new methodology of real time detection of luminescence derived from the infection of insect cells by recombinante baculovírus containing gene promoters of different phases of the infection controlling the chemilluminescent firefly Luciferase protein. This allowed for the detailed characterization of the gene expression from selected Anticarsia gemmatalis and Autographa californica MNPV genes promoters. This revelaed differential patterns of expression in permissive, semipermissive and non-permissive cell lines. We also evaluated gene promoters of the endosymbiont Bracovirus found in Microplitis demolitor, a parasitic wasp of Lepidopteran larvae, using the real-time luminescence detection technique. These promoters revealed patterns similar to late gene promoters from the baculoviruses. The ability of recombinant baculovirus to transduce and deliver genes to a M. demolitor wasp derived cell line was also assessed.

Made available in DSpace on 2016-08-17T18:39:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3826.pdf: 1893652 bytes, checksum: cca227d41858b50ad19ca341e725b6d3 (MD5) Previous issue date: 2011-08-31 / Financiadora de Estudos e Projetos / The expression system of recombinant proteins in insect cells/baculovirus (BEVS) was described and introduced in 1983 and since then has become a powerful tool for the production of recombinant proteins of biotechnological interest. This work studied the kinetics of Bac-to-BacR Baculovirus Expression System (Invitrogen ) used for the production of recombinant proteins, evaluating growth patterns and consumption of nutrients from Sf-9 insect cells infected with this commercial bacmid and determining the effect of viral inoculum. For this, Sf-9 cells grew at 29oC in T flasks containing 5 mL of SF-900 II medium or Schott bottles with working volume of 15 mL and orbital shaking at 90 rpm. UFLAG-286 cells were also tested at 29°C in TC-100 medium supplemented with 10% bovine fetal serum. The baculovirus used were the Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (AcMNPV) as a wild baculovirus infection model, the bacmid extracted from DH10Bac bacteria and transposed with the transfer vector empty (pFastBac 1), called Bac sprec and the bacmid recombinant AcNPV with the GUS coding sequence of the gene β- glucuronidase, used as a standard for transposition experiments and transfection. Cells were infected at different times (TOI), on the initial phase, the exponential phase or stationary phase of cell growth, and with different multiplicities of infection (MOI) (0.01, 0.1, 1 and 10). It was observed that the MOI does not influence the viral replication, because even with the low MOI the cell growth was completely inhibited. TOI had already affected the production of total cell proteins, and infection in the early exponential phase was that obtained the highest number of total proteins. The supplementation of the cultivation with Bac sprec with serine and glutamine did not lead to increased viral production. The supernatant of cultures infected with Bac sprec was able to inhibit cell death where there was induction of apoptosis by terbutyl, indicating contain some protein with anti-apoptotic activity. This effect was not observed on wild baculovirus. / O sistema de expressao de proteinas recombinantes em celulas de inseto/baculovirus (BEVS) foi descrito e introduzido em 1983, e desde entao tornou-se uma ferramenta poderosa para a producao de proteinas recombinantes de interesse biotecnologico. O objetivo deste trabalho foi estudar os parametros cineticos do sistema Bac-to-BacR Baculovirus Expression (Invitrogen ) utilizado para a producao de proteinas recombinantes, avaliando os padroes de crescimento e consumo de nutrientes de celulas de inseto Sf-9 infectadas com este bacmideo comercial e determinando o efeito do inoculo viral. Para isso celulas Sf-9 foram cultivadas a 29oC em frascos T contendo 5 mL de meio SF-900 II, ou em frascos Schott com volume de trabalho de 15 mL e agitacao orbital a 90 rpm. Celulas UFLAG-286 tambem foram testadas a 29oC em meio TC-100 suplementado com 10% de soro fetal bovino. Os baculovirus utilizados foram o Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (AcMNPV), como modelo de infeccao de baculovirus selvagem, o bacmideo extraido da bacteria DH10BacTM e transposto com o vetor de transferencia vazio (pFastBac 1), chamado de Bac sprec e o bacmideo recombinante AcMNPV-GUS com a sequencia codificante do gene β glucuronidase, utilizado como um padrao para experimentos de transposicao e transfeccao. As celulas foram infectadas em diferentes momentos (TOI), seja na fase inicial, na fase exponencial ou fase estacionaria do crescimento celular e com diferentes multiplicidades de infeccao (MOI) (0,01; 0,1; 1 e 10). Observou-se que o MOI nao influencia a replicacao viral, pois mesmo com baixo MOI o crescimento celular foi inibido. Ja o TOI teve influencia na producao de proteinas totais da celula, sendo que a infeccao no inicio da fase exponencial foi que obteve maior numero de proteinas totais. A suplementacao do cultivo de Bac sprec com serina e glutamina nao levou a uma maior producao viral. O sobrenadante de cultivos infectados com o Bac sprec foi capaz de inibir a morte celular onde houve inducao de apoptose por terbutil, indicando conter alguma proteina com atividade antiapoptotica. Este efeito nao foi observado com o baculovirus selvagem.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2008. / Submitted by Raquel Viana (tempestade_b@hotmail.com) on 2009-11-05T20:14:13Z No. of bitstreams: 1 2008_BrianaCardosoFerreira.pdf: 1726853 bytes, checksum: 79af1e6efd638a8c867fcfa532c05c27 (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2009-12-08T11:41:03Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_BrianaCardosoFerreira.pdf: 1726853 bytes, checksum: 79af1e6efd638a8c867fcfa532c05c27 (MD5) / Made available in DSpace on 2009-12-08T11:41:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_BrianaCardosoFerreira.pdf: 1726853 bytes, checksum: 79af1e6efd638a8c867fcfa532c05c27 (MD5) Previous issue date: 2008-07-28 / Os baculovirus são vírus patogênicos a insetos, principalmente aos da ordem Lepidoptera. É comum o aparecimento de mutantes defectivos em populações de campo, com ausência de genes essenciais, que são mantidos pela co-infecção de células por diferentes genótipos virais. Esses genótipos quando purificados podem perder a capacidade de infectar a larva hospedeira, devido a deleções em genes pif (per os infectivity factor), essenciais para a infecção por via oral. Sabe-se que as proteínas PIF estão associadas ao envelope da partícula ODV, necessária para o estabelecimento da infecção primária no inseto. O genoma do Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) foi recentemente seqüenciado sendo então relatada a presença dos genes pif-1 e pif-2 no vírus. Neste trabalho, genótipos de AgMNPV derivados do isolado de campo AgMNPV-79 foram selecionados e, através de análise de perfil de restrição do DNA viral, foi confirmada a existência de variantes genotípicos na população. Para a investigação da possível presença de mutantes defectivos, amplificações das regiões de pif-1 e pif-2 por PCR foram realizadas em cada variante sendo que todos os clones da população apresentaram amplificações dos dois genes. Todos os clones mostraram-se altamente infecciosos por ingestão oral, porém o genótipo Ag79-01 apresentou maior virulência entre eles. A presença de um terceiro gene pif (pif-3) foi identificada recentemente no genoma do Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV). Da mesma forma, esse gene é também essencial para o estabelecimento da infecção primária por via oral. Por análise de BLAST o gene foi então identificado como a ORF 114 do genoma do vírus AgMNPV, a qual apresentou uma identidade de aminoácidos de 67% com a ORF do vírus AcMNPV. Com base nessa informação, primers para o gene pif-3 foram desenhados e amostras de DNA dos diferentes genótipos virais foram submetidas a amplificações por PCR. Novamente todos os clones virais apresentaram amplificação de um fragmento correspondente à região de pif-3. Uma vez que os genes pif estavam presentes em todos os variantes genotípicos analisados, foi elaborada uma estratégia para a construção de um vírus recombinante com deleção do gene pif-1, visando o estudo de seu papel na infecção oral do inseto. O vírus recombinante vAgGFP?pif-1, obtido por recombinação homóloga, teve o gene pif-1 substituído por um cassete gênico contendo um gene repórter (gfp) sob comando do promotor constitutivo hsp70. Esse vírus foi selecionado a partir da visualização de células infectadas emitindo fluorescência, devido à expressão da proteína GFP. O vírus vAgGFP?pif-1 encontra-se sob processo de purificação.

Os hantavírus, membros da família Bunyaviridae, são os agentes infecciosos responsáveis pela Febre Hemorrágica com Síndrome Renal e pela Síndrome Cardiopulmonar por Hantavírus. São vírus com genoma constituído por três segmentos de RNA fita simples, de polaridade negativa, designados como S, M e L, que codificam, respectivamente, a nucleoproteína, as glicoproteínas G1 e G2 e a RNA polimerase dependente de RNA. Com o objetivo de estudar a montagem de pseudopartículas quiméricas de hantavírus, a proteína N do vírus Araraquara e as glicoproteínas G1 e G2 do vírus Andes foram expressas em sistema baculovírus. A microscopia confocal mostrou a colocalização das proteínas G1 e G2 com a proteína N. Pelos ensaios de imunoprecipitação e de centrifugação em gradiente de sacarose, foi observada a interação entre as proteínas N, G1 e G2. Nas análises por microscopia eletrônica de transmissão foi observada a montagem do pseudo-hantavírus quimera, com morfologia semelhante ao do vírion. O pseudo-hantavírus quimera obtido neste estudo poderá, no futuro, ser utilizado em estudos imunológicos, estruturais e morfológicos. / Hantaviruses, members of the Bunyaviridae family, are the infectious agents responsible for Hemorrhagic Fever with Renal Syndrome and the Hantavirus Cardiopulmonary Syndrome. The viral genome is composed by three segments of single-stranded negative-sense RNA, designated as S, M and L, which encode, respectively, the nucleoprotein, the G1 and G2 glycoproteins, and the RNA-dependent RNA polymerase. In order to study the assembly of a chimeric hantavirus-like particle, the Araraquara nucleoprotein and the Andes glycoproteins were expressed in a baculovirus system. Confocal microscopy showed the colocalization of G1 and G2 proteins with the N protein. Immunoprecipitation assay and sucrose density gradient showed the interaction among N, G1 and G2 proteins. The transmission electron microscopy showed the hantavirus-like particle with the same morphology of the virion. The chimeric hantavirus-like particle produced in this study could be used, in the future, in immunological, structural and morphological studies.

Submitted by Eunice Novais (enovais@uepg.br) on 2018-05-07T19:38:50Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) Gizele Baldo.pdf: 5751948 bytes, checksum: df4e7c4c9be199c089c189cbe28764f0 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-07T19:38:50Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) Gizele Baldo.pdf: 5751948 bytes, checksum: df4e7c4c9be199c089c189cbe28764f0 (MD5) Previous issue date: 2018-02-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Os vírus de poliedrose nuclear são importantes agentes de controle microbiano de larvas de lepidópteros. No entanto, sua atividade pode ser comprometida durante a interação com suas plantas hospedeiras. Entender como ocorre a interação do vírus da lagarta Chrysodeixis includens, ChinNPV, com dois de seus hospedeiros, soja e algodão, pode auxiliar a expandir o uso de pesticidas biológicos amenizando suas limitações. A interação planta/vírus foi estudada a fim de verificar a influência da planta sobre o processo de infecção, alterando a forma e o momento em que as larvas se alimentam desses substratos. Os tratamentos foram: disco de folha, incorporação de folha (liofilizada e seca em estufa) em dieta, alimentação com substrato foliar antes da inoculação viral, persistência e exposição do vírus sobre a planta. As avaliações foram realizadas até o 10º ou 12º dias após a inoculação, quando foram determinados o peso e o estágio de desenvolvimento de cada sobrevivente. Os dados de mortalidade foram submetidos à análise de sobrevivência com riscos competitivos e os demais dados à ANOVA. Alterações histopatológicas no intestino médio das lagartas alimentadas com folhas de soja e algodão e inoculadas com o ChinNPV foram analisadas por microscopia de luz. A fixação das partículas virais foi avaliada através da extração da cera epicuticular com cinco solventes, seguida de aplicação, lavagem e contagem do vírus remanescentes. Fixação, morfologia e persistência dos poliedros sobre folhas de soja e algodão, em ambiente controlado e campo, foram avaliadas por MEV em diferentes períodos. A mortalidade das lagartas foi comprometida pelo algodão em quase todos os bioensaios realizados. A inoculação do NPV sobre discos de folha de soja resultou em mortalidades semelhantes à dieta. No entanto, quando tecidos liofilizados foram incorporados à dieta, os folíolos de soja reduziram a mortalidade de C. includens por NPV, com mortalidade análoga à provocada pelo algodão e, quando secos em estufa, a mortalidade larval foi intermediária, entre o apresentado pela dieta artificial e as folhas de algodão. Quando o vírus foi exposto na superfície da soja e posteriormente recuperado, o tempo de contato com a folha (72h) reduziu a atividade do vírus, o mesmo não foi válido para o algodão. A análise histopatológica mostrou desestruturação das células epiteliais no tratamento de alimentação prévia com folha, entretanto este fenômeno não alterou a mortalidade das lagartas. Enquanto em campo, a distribuição dos poliedros foi uniforme no filoplano das duas culturas, no laboratório, os poliedros formaram agregados sobre a superfície da soja. Já quando a cera epicuticular foi removida, a interação da folha com o vírus foi afetada. A atividade do ChinNPV foi comprometida tanto por folhas de soja quanto algodão, sendo que a persistência do vírus começa a reduzir após o terceiro dia de contato com o filoplano. Foi possível observar que a inativação do vírus somente ocorre quando folha de algodão e vírus são fornecidos em conjunto, enquanto na soja, o tempo de contato do vírus com a folha parece influenciar reduzindo a mortalidade das lagartas. Assim, seria interessante estudar formulações e doses para compensar a perda de atividade viral provocada pelos tecidos foliares. / Nucleopolyhedrovirus are important microbial control agents of lepidopteran larvae. However, their activity may be compromised during interaction with their host plants. Understanding the interaction process of the caterpillar virus Chrysodeixis includens, ChinNPV, with two of its hosts, soybean and cotton, may help to expand the use of biological pesticides by alleviating their limitations. The plant/virus interaction was studied in order to verify the influence of the plant on the infection process, changing the form and the moment in which the larvae feed on these substrates. The treatments were: leaf disc, incorporation of leaf (lyophilized and oven-dried) in diet, feeding with leaf substrate before viral inoculation, persistence, and virus exposure on the plant. Evaluations were carried out until the 10th or 12th days after inoculation, when the weight and stage of development of each survivor were determined. Mortality data were submitted to survival analysis with competitive risks and the other data to ANOVA. Histopathological changes in the midgut of caterpillars fed with soybean and cotton leaves and inoculated with ChinNPV were analyzed by light microscopy. Fixation of the virus particles was evaluated by extracting the epicuticular wax with five solvents followed by the application, washing and counting of the remaining virus. Fixation, morphology and persistence of the polyhedra on soybean and cotton leaves, under controlled environment and field, were evaluated by SEM on different periods. The mortality of caterpillars was compromised by cotton in almost all bioassays performed. NPV inoculation on soybean leaf discs resulted in diet-like mortalities. However, when lyophilized tissues were incorporated into the diet, soybean leaflets reduced the mortality of C. includens by NPV, with mortality similar to that caused by cotton, and when drying in oven, the larval mortality was intermediate between that presented by artificial diet and cotton leaves. When the virus was exposed on the soybean surface and later recovered, the time of contact with the leaf (72h) reduced the activity of the virus; the same was not true for cotton. The histopathological analysis showed disruption of epithelial cells in treatments of previous leaf feeding; however, this phenomenon did not change the mortality of caterpillars. While in the field, the polyhedra distribution was uniform on the phylloplane of the two cultures, in the laboratory, the polyhedra formed aggregates on the surface of the soybean. Already when the epicuticular wax was removed, the interaction of the leaf with the virus was affected. The activity of ChinNPV was compromised by both soybean and cotton leaves, and the persistence of the virus begins to decrease after the third day of contact with the phylloplane. It was possible to observe that the inactivation of the virus only occurs when cotton leaf and virus are supplied together, while in soybean, the time of contact of the virus with the leaf seems to influence, reducing the mortality of the caterpillars. Thus, it would be interesting to study formulations and doses to compensate for the loss of viral activity caused by foliar tissues.

Made available in DSpace on 2017-07-10T14:17:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 sostenez.pdf: 5444547 bytes, checksum: 0e57c73e9d81ba62bd8cce82698d43f6 (MD5) Previous issue date: 2013-10-17 / Bombyx mori nucleopolyhedrovirus (BmNPV) is an entomopathogenic and poliorganotrophic virus that infects Bombyx mori. BmNPV consists of a double strand DNA with two distinct phenotypes: the derived polyhedral virus (PDV), responsible for the primary infection in the insect s midgut; and the budded virus (BV), which disperses the infection in the hemocele, causing secondary or systemic infection. It is extremely virulent and when it infects silkworms, causes serious damages to the insect, usually leading to its death or harming the silk production, affecting all the productive chain, leading to economic losses. For a good silk production, a determinant factor is the functioning of the food duct, which is divided in foregut, midgut and hindgut, being the hindgut the place for water and mineral salts absorption and for the end of the digestive process. Several tissues have been established as virus targets, however, others have shown to be resilient to BmNPV. Given the importance of the hindgut, the present paper aimed to verify the susceptibility of its components, ileum, colon and rectum to an geographic isolated of BmNPV in Paraná, Brasil, the BmMNPV. In different post-inoculation days (dpi), the hindgut segment of 5th instar silkworms was dissected and processed for analysis in light microscopy, using conventional dyes and cytochemistry for viral detection and electronic scanning microscopy for the morphological details. The results revealed that the ileum, colon and rectum of the B. mori are constituted by simple epithelium, with alterations in cell morphology, covered by an intima in its luminal side, and that its organization is similar to that of other described insects. The cytological analysis of the ileum, colon and fore rectum revealed that its epithelial cells are not susceptible to BmMNPV in neither of the times analyzed. However, the posterior hindgut or anal duct showed itself to be susceptible to the virus after the 5º dpi, developing all the classic signs described for the infection with AlphaBV, as the presence of viroplasm, nuclear hypertrophy, polyhedra in formation and mature ones. At the end of the infectious cycle, occurs cell lysis with the liberation of viral polyhedra in the intestinal lumen and, consequently, to the external medium, coinciding with the death of the insect. Even with no infection in the other regions of the hindgut, the surrounding tissues have shown infected, affecting the normal functioning of this intestinal region, verified through changes in fecal pellet, which was less compact and changed format. These results will contribute in the establishment of the BmMNPV infectious cycle. Furthermore, the basic knowledge of viral behavior is important for the development of infection control, prevention and previous identification methods of this disease in the field, once it also makes possible the removal of infected silkworms, diminishing the horizontal transmission of the virus in the creation rooms, in a way to reduce the loss of cocoons to be used in the confection of silk yarn / Bombyx mori nucleopolyhedrovirus multiple (BmMNPV) é um vírus entomopatogênico e poliorganotrófico, constituído por DNA fita dupla e apresenta dois fenótipos distintos: o vírus poliédrico derivado, responsável pela infecção primária no intestino médio do inseto; e o vírus broto, que se dispersa na hemocele causando a infecção secundária ou sistêmica. É extremamente virulento e quando infecta lagartas do bicho-da-seda, causa sérios danos ao inseto, geralmente levando-o à morte ou prejudicando a produção da seda, comprometendo toda a sua cadeia produtiva e gerando prejuízos econômicos. Para uma boa produção de seda, um fator determinante é o funcionamento do canal alimentar, que nos insetos é dividido em anterior, médio e posterior, sendo o posterior, local de absorção de água e sais minerais e da finalização do processo digestório. Vários tecidos já foram estabelecidos como alvos do BmMNPV, entretanto outros se mostraram resistentes. Dada a importância do intestino posterior, o presente trabalho objetivou verificar a susceptibilidade de seus componentes, íleo, cólon e reto de lagartas de B. mori do 5° instar ao BmMNPV isolado geográfico do Paraná. Em diferentes dias pós-inoculação (dpi), o intestino posterior foi dissecado e processado para análise em microscopia de luz, utilizando colorações convencionais e citoquímica para detecção viral, e microscopia eletrônica de varredura, para os detalhes morfológicos. Os resultados revelaram que o íleo, cólon e reto de B. mori apresentou morfologia semelhante a de outros lepidópteros. A análise citopatológica do íleo, cólon e o reto anterior revelou que suas células epiteliais não são susceptíveis ao BmMNPV, em nenhum dos tempos analisados. Já o reto posterior ou canal anal, mostrou-se susceptível ao vírus a partir do 5º dpi, desenvolvendo todos os sinais clássicos descritos para a infecção com o AlphaBV, como presença de viroplasma, hipertrofia nuclear, poliedros em formação e maduros. No final do ciclo infeccioso, ocorre a lise celular com a liberação dos poliedros virais para luz intestinal e, consequentemente, para o meio externo, coincidindo com a morte do inseto. Mesmo não havendo infecção nas demais regiões do intestino posterior, os tecidos circunvizinhos se mostraram infectados, o que possivelmente afetou o funcionamento normal desta região, sendo visíveis as modificações na formação do pellet fecal, que se mostrou menos compacto e com alterações no formato. Os resultados obtidos irão contribuir no estabelecimento do ciclo infeccioso deste patógeno. Além disso, o conhecimento básico do comportamento viral é importante para o desenvolvimento de métodos de controle da infecção, prevenção e identificação prévia desta doença no campo, pois, possibilita ainda, a retirada de lagartas infectadas, diminuindo a transmissão horizontal do vírus nos barracões de criação, de forma a reduzir a perda de casulos, a serem utilizados na confecção dos fios de seda

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2012-09-04T16:57:00Z No. of bitstreams: 1 Tiago Landim d'Avila Administração de plasmídeos....pdf: 1447180 bytes, checksum: b65ad3c9ece2b6f29cc032b2fa22c49a (MD5) / Made available in DSpace on 2012-09-04T16:57:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tiago Landim d'Avila Administração de plasmídeos....pdf: 1447180 bytes, checksum: b65ad3c9ece2b6f29cc032b2fa22c49a (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, Bahia, Brasil / A interleucina-12 (IL-12) é uma glicoproteína heterodímerica, codificada por dois genes distintos co-expressados na mesma célula. IL-12 precisa ser glicosilada para exibir atividade funcional. Essa glicoproteína promove a diferenciação de células T e é capaz de estimular a proliferação de células T ativadas e células NK. Além disso, IL-12 promove a produção IFN-γ por células NK e o aumento da atividade lítica de células NK e linfócitos T CD+ citotóxicos. Várias das atividades de IL-12 são desempenhadas ou são amplificadas pela associação com IL-2. Em nosso laboratório, foi gerada uma construção plasmideal capaz de expressar IL-12 canina, na forma de proteína de fusão de cadeia única (pcDNA3.1-scca-IL-12), e outra construção plasmideal capaz de expressar IL-2 canina (pcDNA3.1-ca-IL-2) em células de mamífero. Experimentos preliminares, a combinação de IL-12 e IL-2 expressas em sobrenadantes de células COS-7 mostrou-se capaz de promover produção de IFN-γ em células mononucleares de sangue periférico (CMNSP) de cães sadios. Visando a avaliação do potencial do uso de IL-12 e/ou IL-2 para o desenvolvimento de vacina ou método imunoterapico, no presente trabalho, grupos de cães sadios foram injetados três vezes, com intervalo de 2 dias entre cada duas doses consecutivas, com plasmídeo pcDNA3.1-scca-IL-12 e/ou pcDNA3.1-ca-IL-2 por via muscular por eletroporação. Em seguida, os cães foram submetidos à avaliação clinica, clinico-laboratorial (hemograma, determinação da concentração de transaminases, proteínas, ureia e creatinina no soro) e ensaios foram realizados para a detecção da expressão das proteínas recombinantes (sensibilização de CMNSP para produção de IFN-γ e determinação da concentração de IL-2 no soro). Não foram observadas diferenças nos parâmetros avaliados entre os grupos de animais. Visando a produção de IL-12, células BTI-Tn-5B1-4 foram infectadas com baculovírus recombinante contendo cDNA scca-IL-12 e capazes de adicionar uma cauda de 6 histidinas na extremidade carboxila. Para isso, duas construções diferentes em baculovírus foram elaboradas nosso laboratório, sendo uma delas no presente trabalho. Células BTI-Tn-5B1-4 infectadas com as construções em baculovírus apresentaram a proteína recombinante: a) parcialmente degradada e em grande quantidade no sedimento celular e b) integra e em baixa quantidade no sobrenadante da cultura; de acordo com os resultados de obtidos por SDS-PAGE e Western blot. / Interleukin-12 (IL-12) is a heterodimeric glycoprotein, encoded by two distinct genes co-expressed in the same cell. IL-12 needs to be glycosylated to display functional activity. This glycoprotein promotes differentiation of T cells and is capable of stimulating proliferation of activated T cells and NK cells. In addition, IL-12 promotes IFN-γ production by NK cells and increased lytic activity of NK cells and cytotoxic Tlymphocyte CD +. Several of the activities of IL-12 are held or amplified by the association with IL-2. In our laboratory, a plasmideal construction was generated to express canine IL-12 like single-chain fusion protein (pcDNA3.1-scca-IL-12), and other construction to express canine IL-2 (pcDNA3.1-CA-IL-2) in mammalian cells. Preliminary experiments, the combination of IL-12 and IL-2 supernatants expressed in COS-7 cells was able to promote IFN-γ in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of healthy dogs. To assess the potential of using IL-12 and/or IL-2 for the development of vaccine or immunotherapy method, in this study, groups of healthy dogs were injected three times with an interval of 2 days between each two consecutive doses with plasmid pcDNA3.1-scca-IL-12 and/or pcDNA3.1-ca-IL-2 intramuscularly by electroporation. Then the dogs were submitted to clinical evaluation, clinical and laboratory (blood count, determination of the concentration of transaminases, proteins, urea and serum creatinine) and tests were performed to detect the expression of recombinant proteins (PBMC sensitization to produce IFN-γ concentration and determination of serum IL-2). No differences were observed in all evaluated parameters between the groups of animals. Aiming the production of IL-12 cells, BTI-Tn-5B1-4 were infected with recombinant baculovirus containing cDNA scca-IL-12 and capable of adding a tail of 6 histidines at the carboxyl end. For this, two different constructs were prepared in our laboratory baculovirus, one of them in this work. Cells BTI-Tn-5B1-4 infected with the constructs presented in the recombinant baculovirus: a) partially degraded in large quantities in the sediment cell and b) incorporates and in low quantities in the culture supernatant, according to the results obtained by SDS-PAGE and Western blo

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissMMS.pdf: 957649 bytes, checksum: 26153578cc56d59b9fd242494f3cd28d (MD5) Previous issue date: 2007-03-09 / Financiadora de Estudos e Projetos / Due to the great economic importance of sugarcane crop in Brazil, the occurrence of infections by phytopathogens leading to decreased productivity and quality remains a serious problem. As the plants have natural mechanisms of defense against the attack of fungi and insects, amongst which the inhibitors of proteases are distinguished, the use of these substances in the development of resistant plants or in pesticide production may be an interesting alternative. One of the major classes of protease inhibitors acting against the attack of pathogens is the cystatins, proteins that inhibit cysteine proteases specifically. Canecystatin was the first cysteine protease inhibitor characterized from sugarcane. This gene codes for a ~ 14 kDa protein that contains conserved regions common to the cystatin family. Although the protein has previously been produced in a bacterial system of expression, in this work we use this sugarcane cystatin as a model for the implementation of a heterologous protein expression system in insect cells. This system has some advantages relatively to the prokaryotic system such as the possibility of posttranslational modifications. The recombinant protein was expressed in this system in a soluble form and purified using affinity chromatography in a nickel column, rendering approximately 23 mg/L of pure protein. The activity of the protein was assayed against papain, being capable of inhibiting the activity of this cysteine protease efficiently. Furthermore, the stability of the protein was analyzed in different conditions of pH and temperature. We conclude that the canecystatin is a good model for the implementation of the Baculovirus Expression System at the Molecular Biology Laboratory of the UFSCar / Devido à grande importância da cultura da cana-de-açúcar no Brasil, a ocorrência de infecções por fitopatógenos constitui um grave problema que acarreta queda na produtividade e na qualidade da lavoura canavieira. Uma vez que as plantas têm mecanismos naturais de defesa contra o ataque de fungos e insetos, dentre os quais se destacam os inibidores de proteases, a utilização dessas substâncias no desenvolvimento de plantas resistentes ou na produção de pesticidas seria uma alternativa interessante. Um tipo de inibidor de protease que atua na proteção contra o ataque de patógenos e como proteínas de reservas em algumas sementes são as cistatinas, proteínas que inibem especificamente cisteínoproteases. A Canacistatina foi o primeiro inibidor de cisteíno-protease caracterizado originado da cana-de-açúcar. Apesar de já ter sido anteriormente produzida em sistema bacteriano de expressão, a Canacistatina foi utilizada, nesse trabalho, como modelo de estudo para implementação do sistema de expressão de proteínas heterólogas em células de inseto. Esse sistema apresenta algumas vantagens sobre o sistema procariótico como a possibilidade de realizarem modificações pós-traducionais. A proteína recombinante foi expressa nesse sistema na forma solúvel e purificada em cromatografia de afinidade em coluna de níquel, resultando em um rendimento de 23 gramas por litro de cultura. A proteína purificada foi submetida a testes de inibição enzimática contra a papaína, sendo capaz de inibir satisfatoriamente a atividade dessa cisteíno-protease. Também foram realizados testes de estabilidade desse inibidor em diferentes condições de pH e temperatura, mostrando-se estável. A Canacistatina foi um modelo de estudo adequado para a implementação do sistema de expressão de proteínas no Laboratório de Biologia Molecular da UFSCar

Os hantavírus, membros da família Bunyaviridae, são os agentes infecciosos responsáveis pela Febre Hemorrágica com Síndrome Renal e pela Síndrome Cardiopulmonar por Hantavírus. São vírus com genoma constituído por três segmentos de RNA fita simples, de polaridade negativa, designados como S, M e L, que codificam, respectivamente, a nucleoproteína, as glicoproteínas G1 e G2 e a RNA polimerase dependente de RNA. Com o objetivo de estudar a montagem de pseudopartículas quiméricas de hantavírus, a proteína N do vírus Araraquara e as glicoproteínas G1 e G2 do vírus Andes foram expressas em sistema baculovírus. A microscopia confocal mostrou a colocalização das proteínas G1 e G2 com a proteína N. Pelos ensaios de imunoprecipitação e de centrifugação em gradiente de sacarose, foi observada a interação entre as proteínas N, G1 e G2. Nas análises por microscopia eletrônica de transmissão foi observada a montagem do pseudo-hantavírus quimera, com morfologia semelhante ao do vírion. O pseudo-hantavírus quimera obtido neste estudo poderá, no futuro, ser utilizado em estudos imunológicos, estruturais e morfológicos. / Hantaviruses, members of the Bunyaviridae family, are the infectious agents responsible for Hemorrhagic Fever with Renal Syndrome and the Hantavirus Cardiopulmonary Syndrome. The viral genome is composed by three segments of single-stranded negative-sense RNA, designated as S, M and L, which encode, respectively, the nucleoprotein, the G1 and G2 glycoproteins, and the RNA-dependent RNA polymerase. In order to study the assembly of a chimeric hantavirus-like particle, the Araraquara nucleoprotein and the Andes glycoproteins were expressed in a baculovirus system. Confocal microscopy showed the colocalization of G1 and G2 proteins with the N protein. Immunoprecipitation assay and sucrose density gradient showed the interaction among N, G1 and G2 proteins. The transmission electron microscopy showed the hantavirus-like particle with the same morphology of the virion. The chimeric hantavirus-like particle produced in this study could be used, in the future, in immunological, structural and morphological studies.

Recentemente, vários arbovírus têm acometido a população de países emergentes ocasionando sérios problemas de saúde pública, como as doenças causadas pelos vírus da dengue, Chikungunya, Zika e febre amarela. Um vírus emergente e já circulante no Brasil, chamado Mayaro (MAYV), do mesmo gênero do Chikungunya (Alphavirus), possui potencial prejudicial semelhante a esses já estabelecidos. Seu vetor de transmissão é o mosquito do gênero Haemagogus, característico de regiões isoladas, principalmente florestas. Entretanto, estudos demonstraram que o Aedes aegypti é um competente vetor desse agente, o que possibilita sua disseminação em regiões urbanas. O presente trabalho avaliou a expressão das proteínas estruturais do vírus Mayaro (E1, E2, E3, C e 6K), utilizando dois sistemas de expressão distintos, um baseado na levedura Pichia pastoris, e outro derivado de Baculovírus (BEVS). Essa estratégia foi estabelecida para que a expressão dessas proteínas promova a formação de partículas semelhantes ao vírus (virus like particles), estruturas multiprotéicas que mimetizam a conformação de uma partícula viral podendo ser utilizada como um candidato vacinal. O trabalho evidenciou a correta obtenção de organismos recombinantes em ambos os sistemas, com a avaliação da expressão sendo feita com técnicas de dot blot, western blot e imunofluorescência indireta (IFI). Com o sistema baculovírus, foram avaliadas as linhagens Sf-9 e Hi-5, sendo evidenciada a expressão de proteínas do MAYV em ambas, utilizando MOI 10 e tempos pós-infecção de 96 e 72 h, respectivamente. A correta expressão das proteínas de MAYV também foi evidenciada com a levedura Pichia pastoris, com cultivo a 30 °C e tempo de análise 48 h após indução. A geração de VLPs foi avaliada em amostras de sobrenadantes de ambos os sistemasapós a concentração por ultracentrifugação em gradiente de iodixanol, e análise por microscopia eletrônica de transmissão, sendo observadas nos dois sistemas com tamanhos variando entre 30-60 nm. Os resultados desse projeto podem gerar ferramentas importantes no desenvolvimento de kits diagnósticos e métodos vacinais contra o MAYV. / Recently, several arboviruses have affected emerging countries causing serious public health problems, such as diseases caused by dengue viruses, Chikungunya, Zika and yellow fever. An emerging and already circulating virus in Brazil, called Mayaro (MAYV), of the same genus of Chikungunya (Alphavirus), has harmful potential similar to those already established. Its transmission vector is the mosquito of the genus Haemagogus, characteristic of isolated regions, mainly forests. However, studies have demonstrated that Aedes aegypti is a competent vector of this agent, which would allow its dissemination in urban areas. The present work evaluated the expression of the structural proteins of the Mayaro virus (E1, E2, E3, C and 6K) using two distinct expression systems, one based on the yeast Pichia pastoris and another derived from Baculovirus (BEVS). The strategy of expressing structural proteins has been established so that the expression of these proteins promotes the formation of viruslike particles or VLPs, multiprotein structures that mimic the conformation of a viral particle and can be used as a vaccine candidate. The work evidenced the correct obtaining of recombinant organisms in both systems, with the evaluation of the expression being done with dot blot, western blot and indirect immunofluorescence (IFI) techniques. With the baculovirus system, the Sf-9 and Hi-5 strains were evaluated, and the expression of the MAYV proteins was evidenced in both, using MOI 10 and the time of post-infection analysis of 96 and 72 h, respectively. Correct expression of MAYV proteins was also evidenced with yeast Pichia pastoris, with culture at 30 ° C and analysis time 48 h after induction. The generation of VLPs was evaluated in both supernatants after concentration by iodixanol gradient ultracentrifugation and transmission electron microscopy analysis, being observed in both systems with sizes ranging from 30-60 nm. The results of this project can generate important tools in the development of diagnostic kits and vaccine methods against the MAYV.