Les entérovirus humains (EV) constituent un groupe de virus à ARN d'une grande diversité génétique. Ils sont responsables d'infections cérébrales graves mais rares et de méningites bénignes mais fréquentes. Les évènements conduisant à l'entrée des EVs dans le système nerveux central (SNC), l'importance de la charge virale dans le liquide céphalo rachidien (LCR) et sa corrélation éventuelle avec l'intensité du processus inflammatoire réactionnel restent peu explorés. Comme de nombreux génotypes d'EV sont associés à des manifestations neurologiques semblables, des processus pathologiques communs sont envisageables. Le premier volet de cette thèse avait pour objectif d'étudier prospectivement la charge virale EV dans le LCR de patients présentant une méningite à l'aide d'une technique de RT-QPCR. Nos résultats montrent que les différences significatives de charge virale retrouvées dans le LCR en fonction de l'âge, des leucocytes et de la protéinorachie sont reliées au génotype de l'EV responsable de l'infection. Le second volet de cette thèse avait pour but d'explorer l'hypothèse qu'une infection de la barrière hémato-Encéphalique (BHE), peut représenter une voie d'accès commune à une majorité d'EVs vers le SNC. La réplication et la translocation des EVs ont été évaluées avec un modèle in vitro de BHE basé sur la lignée cellulaire hCMEC/D3. Nous avons validé ce modèle cellulaire en montrant une permissivité différentielle à un large éventail d'EVs et montré les spécificités du franchissement de cette barrière par l'EV-A71. Ces données soulèvent la question de l'origine de l'ARN EV dans le LCR au cours des premiers stades d'une méningite. / Human enteroviruses (EV) are RNA viruses characterized by a large genetic variability. They are associated with severe but rare neurological infections and frequent but self-Limiting meningitis. The processes of entry into the central nervous system (CNS), the level of EV viral load in the cerebrospinal fluid (CSF) and its possible relation to the intensity of the associated inflammatory process remain poorly understood. As several EV genotypes are related to common neurological disorders, common pathological processes may be involved. In the first part of this PhD thesis, we have prospectively investigated the EV viral load in the CSF of patients with meningitis using a RT-QPCR assay. Our results showed that significant differences between viral load levels and the age groups, the leukocytes count, the protein levels in the CSF, and with the EV genotype involved in the infection. We also explored the hypothesis that an infection of the blood brain barrier (BBB) could be a common pathway used by EVs released in the bloodstream to gain access into the CNS. The EV replication and translocation were analyzed with an in vitro model of BBB based on the hCMEC/D3 cell line. We validated this cell model by showing different permissivity patterns among a large array of EV genotypes. In addition, we showed the specificities in how the EV-A71 crosses the endothelial barrier. The overall data raise the unresolved issue of the origin of viral RNA in the CSF and the sources of infection during the early acute stage of EV meningitis.

L'épilepsie du lobe temporal est fréquente et souvent pharmacorésistante. L'épileptogenèse est imputée à la mort neuronale, l'inflammation ou au déséquilibre de la neurotransmission. Récemment, la perméabilité vasculaire a été reconnue comme une cause de crises d'épilepsie. Dans un modèle d'épilepsie chronique, nous avons montré une angiogenèse associant vascularisation, surexpression de VEGF, perte de protéines des jonctions serrées et perméabilité de la BHE. L'observation des immunoglobulines G (IgGs) comme marqueurs de perméabilité vasculaire nous a permis de découvrir que les IgGs s'accumulent dans les neurones. Nous avons alors étudié le rôle de ces protéines dans l'épileptogenèse. Ensuite, afin de corréler la perméabilité de la BHE à l'épileptogenèse, nous avons étudié le kindling, un modèle dans lequel les crises sont induites mais pas spontanées. Nous n'avons observé aucun remaniement vasculaire, si ce n'est une dérégulation transitoire de deux protéines de jonctions serrées. La comparaison de ces deux modèles confirme la contribution de la dérégulation de la BHE dans la genèse des crises et la désigne comme une nouvelle cible thérapeutique. / Temporal lobe epilepsy is the most frequent form of pharmacoresistant epilepsies. Epileptogenesis is commonly imputed to neuronal loss, inflammation and an imbalance in neurotransmission. Now, vascular permeability was shown to participate in epileptic seizures generation. In a model of chronic epilepsy, we showed a neo-vascularisation associated with VEGF over expression, loss of tight junction proteins and BBB permeability. The use of immunoglobulins G (IgGs) as markers of permeability vascular allowed us to discover that the IgGs accumulates in neurones. We then studied the role of these proteins in epileptogenesis. Then, to correlate BBB permeability to epileptogenesis, we studied the kindling, a model in which seizures are induced but never spontaneous. We observed no vascular remodeling, except for a transient deregulation of tight junctions proteins. The comparison of these models confirms the contribution of BBB deregulation and points it as new therapeutic target.

Parmi les récepteurs Frizzled, Frizzled 4 est le seul à avoir un phénotype vasculaire fort. Parcriblage, nous avons identifié l’ubiquitine ligase PDZRN3 en tant que nouveau partenaire de la protéineadaptatrice Dvl3 qui agit en aval de Fzd4. En utilisant des modèles murins inductibles, nous montronsque la délétion de PDZRN3 induit une létalité embryonnaire suite à des défauts de vascularisation dusac amniotique ; et que PDZRN3 est requis pour une vascularisation normale de la rétine. De par sonactivité d’ubiquitine ligase, PDZRN3 induit la prise en charge du complexe Fzd4/ Dvl3 par les vésiculesd’endocytose ce qui permet la transduction du signal après fixation du ligand Wnt5a sur le récepteurFzd4. PDZRN3 régule également le maintien des jonctions des cellules endothéliales et l’intégrité de labarrière hémato-encéphalique. La délétion de PDZRN3 stabilise les microvaisseaux après ischémiecérébrale. PDZRN3 induit la disruption des jonctions serrées et la rupture de la barrièrehématoencéphalique en ubiquitinant la protéine d’échafaudage MUPP1. / Fzd4 is the only Frizzled receptor that is essential for angiogenesis. By using a yeast twohybrid screening, we have identified the ubiquitin ligase PDZRN3 as a potential partner of the adaptorprotein Dvl3 that acts downstream of Fzd4. By using inducible mouse models, we have shown that lossof PDZRN3 leads to early embryo lethality due to vascular defects in the yolk sac when deleted inutero, and is then required during post natal retinal vascularization. PDZRN3 would target the Fzd4/Dvl3 complex to endosome, leading to signal transduction upon binding of Wnt5a to Fzd4. PDZRN3also regulates integrity of the blood brain barrier by acting on tight junctions stability. Loss of PDZRN3stabilizes microvessels after cerebral ischemia. PDZRN3 would induce tight junction disruption andblood brain barrier leakage by ubiquitinylating the scaffolding protein MUPP1.

La sclérose en plaques (SEP) est une maladie inflammatoire démyélinisante et neurodégénérative du système nerveux central (SNC). Les cellules T activées qui expriment le PD-1 sont inhibées via l’interaction avec l’un des ligands: PD-L1 ou PD-L2. Des études effectuées chez le modèle murin de la SEP, l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE), ont démontré que l’interaction du PD-1 avec ses ligands contribue à atténuer la maladie. Toutefois, le rôle du PD-1 et de ses ligands dans la pathogenèse de la SEP chez l’humain et dans le modèle murin n’a pas été complètement élucidé. Nous avons déterminé que plusieurs cellules du SNC humain peuvent exprimer les ligands du PD-1. Les astrocytes, les microglies, les oligodendrocytes et les neurones expriment faiblement le PD-L1 dans des conditions basales mais augmentent de façon significative cette expression en réponse à des cytokines inflammatoires. Le blocage de l’expression du PD-L1 par les astrocytes à l’aide de siRNA spécifiques mène à l’augmentation significative des réponses des cellules T CD8+ (prolifération, cytokines, enzymes lytiques). Nos résultats établissent ainsi que les cellules gliales humaines peuvent exprimer des niveaux suffisants de PD-L1 en milieu inflammatoire pour inhiber les réponses des cellules T CD8+. Notre analyse de tissus cérébraux post-mortem par immunohistochimie démontre que dans les lésions de la SEP les niveaux de PD-L1 sont significativement plus élevés que dans les tissus de témoins; les astrocytes et les microglies/macrophages expriment le PD-L1. Cependant, plus de la moitié des lymphocytes T CD8+ ayant infiltré des lésions de SEP n’expriment pas le récepteur PD-1. Au cours du développement de l’EAE, les cellules du SNC augmentent leur niveau de PD-L1. Le PD-1 est fortement exprimé par les cellules T dès le début des symptômes, mais son intensité diminue au cours de la maladie, rendant les cellules T insensibles au signal inhibiteur envoyé par le PD-L1. Nous avons observé que les cellules endothéliales humaines formant la barrière hémato-encéphalique (BHE) expriment de façon constitutive le PD-L2 mais pas le PD-L1 et que l’expression des deux ligands augmente dans des conditions inflammatoires. Les ligands PD-L1 et PD-L2 exprimés par les cellules endothéliales ont la capacité de freiner l’activation des cellules T CD8+ et CD4+, ainsi que leur migration à travers la BHE. L’endothélium du cerveau des tissus normaux et des lésions SEP n’exprime pas des taux détectables de PD-L1. En revanche, tous les vaisseaux sanguins des tissus de cerveaux normaux sont positifs pour le PD-L2, alors que seulement la moitié de ceux-ci expriment le PD-L2 dans des lésions SEP. Nos travaux démontrent que l’entrée des cellules T activées est contrôlée dans des conditions physiologiques grâce à la présence du PD-L2 sur la BHE. Cependant, l’expression plus faible du PD-L2 sur une partie des vaisseaux sanguins dans les lésions SEP nuit au contrôle de la migration des cellules immunes. De plus, une fois dans le SNC, les cellules T CD8+ étant dépourvues du PD-1 ne peuvent recevoir le signal inhibiteur fourni par le PD-L1 fortement exprimé par les cellules du SNC, leur permettant ainsi de rester activées. / Multiple sclerosis (MS) is an inflammatory, demyelinating and neurodegenerative disease of the central nervous system (CNS). Responses of activated T cells are suppressed upon engagement of the receptor programmed cell death-1 (PD-1) with its ligands (PD-L1 and PD-L2). Experiments using the mouse model of MS, experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), have demonstrated that the PD-1/PD-Ls interaction contributes to attenuate disease severity. However, the expression and the role of PD-1 and PD-Ls have been partially documented in inflammatory murine models and human CNS data are still incomplete. We determined that primary cultures of human astrocytes, microglia, oligodendrocytes, or neurons expressed low or undetectable PD-L1 levels under basal conditions, but inflammatory cytokines significantly induced such expression, especially on astrocytes and microglia. Blocking PD-L1 expression in astrocytes using specific siRNA in co-culture led to significantly increased CD8 T cell responses (proliferation, cytokines, lytic enzyme). Thus, our results establish that inflamed human glial cells can express sufficient and functional PD-L1 to inhibit CD8 T cell responses. Extensive immunohistochemical analysis of post-mortem brain tissues demonstrated a significantly greater PD-L1 expression in MS lesions compared to control tissues, which co-localized with astrocyte and microglia/macrophage cell markers. However, more than half of infiltrating CD8 T lymphocytes in MS lesions did not express PD-1, the cognate receptor. Similar results were obtained in EAE mice. Even though CNS cells expressed PD-L1 at the peak of the disease, PD-1 intensity on infiltrating T cells decreased throughout EAE disease development. This reduction of PD-1 level on activated T cells prevented these cells to receive PD-L1 inhibitory signal. We also investigated whether human brain endothelial cells (HBECs), which form the blood brain barrier (BBB), can express PD-L1 or PD-L2 and thereby modulate T cells. HBECs expressed PD-L2 under basal conditions, whilst PD-L1 was not detected. Both ligands were up-regulated under inflammatory conditions. Blocking PD-L1 and PD-L2 led to increased transmigration and enhanced responses by human CD8 T cells in co-culture assays. Similarly, PD-L1 and PD-L2 blockade significantly increased CD4 T cell transmigration. Brain endothelium in normal tissues and MS lesions did not express detectable PD-L1; in contrast, all blood vessels in normal brain tissues were PD-L2-positive, while only about 50% expressed PD-L2 in MS lesions. Therefore, our results demonstrate that under basal conditions, PD-L2 expression by HBECs impedes the migration of activated immune T cells through the BBB, and inhibits their activation. However, such impact is impaired in MS lesions due to down-regulation of PD-L2 levels on the endothelium. The majority of infiltrating CD8 T cells is devoid of PD-1, thus insensitive to PD-L1 inhibitory signal providing by CNS cells once they have entered the CNS.

L'épilepsie est une maladie neurologique chronique caractérisée par des crises spontanées et récurrentes. Les crises sont générées par un déséquilibre dans le fonctionnement des neurotransmetteurs et des canaux ioniques qui contrôlent l'excitabilité. L'épileptogenèse est majoritairement associée à des pertes neuronales, une gliose, une inflammation plus ou moins importants. Un tiers des patients deviennent réfractaires. Récemment, plusieurs équipes ont montré une association entre les épilepsies focales pharmacorésistantes et la rupture de la barrière hémato-encéphalique (BHE). De plus, une implication du système immunitaire ainsi qu'une cause auto-immune de l'épilepsie ont été suggérées. Dans cette thèse, nous avons observé dans le tissu de patients atteints d'épilepsie pharmacorésistante du lobe temporal (ELT), des fuites d'Immunoglobulines G (IgG) dans le parenchyme et leur accumulation dans les neurones présentant des signes de neurodégénérescence. Le récepteur d'IgG de grande affinité FcyRI est surexprimé sur les cellules ayant une morphologie de type microglie/ macrophages, tandis que le récepteur de faible affinité FcyRIII et le récepteur inhibiteur FcγRII sont moins présents. Dans ce même tissu nous avons noté que les protéines du complément C3c et C5b9 sont exprimées. Ensuite, nous avons étudié si le modèle murin d'épilepsie focale induite par injection intra-amygdalienne de kaïnate reproduit la physiopathologie de l'ELT associée à une rupture de la BHE. ZO-1, la principale protéine des jonctions serrées, présente un marquage discontinu indiquant que la BHE a été affectée. Nous avons remarqué des fuites d'IgGs et d'albumine ainsi que leur accumulation dans le parenchyme coïncidant avec la survenue des crises. La présence d‘IgG dans l'épilepsie pourrait également avoir une cause auto-immune. Nous avons utilisé des puces à protéines pour identifier des antigènes qui induisent une réponse immunitaire, dans le plasma des patients atteints d'ELT, Nous avons sélectionné 19 auto-anticorps spécifiques qui peuvent servir de potentiels biomarqueurs diagnostiques L'ensemble de ces résultats suggère que les fuites d'IgG sont associées à une déficience neuronale, conduisant à des changements immunologiques dans le foyer épileptique qui participent à la pathogénèse de l'ELT. Nous pensons qu'une meilleure interprétation des profils de ces auto-anticorps pourrait offrir de nouvelles perspectives thérapeutiques. / Epilepsy is a chronic neurologic disorder characterized by recurrent unprovoked seizures. Seizures are generated by an imbalance in the functioning of neurotransmitters and ion channels that control excitability. Epileptogenesis is mostly associated with neuronal loss, gliosis, and inflammation more or less important. A third of patients become drug refractory. Recently, several teams have shown an association between drug-resistant focal epilepsy and disruption of the blood-brain barrier (BBB). In addition, a possible role of the immune system and an autoimmune nature in epilepsy has been suggested. In this thesis, in the tissue of patients with drug-resistant temporal lobe epilepsy (TLE), leakage of immunoglobulin G (IgG) into the parenchyma and IgG accumulation in neurons with attendant signs of neurodegeneration was observed. In addition, the high affinity IgG receptor, FcγRI was expressed on microglia/macrophage shaped cells. The expression of the low affinity IgG receptor, FcγRIII and the inhibitory IgG receptor, FcγRII was decreased. In the same tissue the complement proteins C3c and C5b9 were present on astrocyte/ microglia and macrophage/ microglia shaped cells respectively. Then, we evaluated whether the mouse model of focal epilepsy induced by intra-amygdala microinjection of kainic acid reproduced a pathophysiology of TLE associated with BBB impairment. ZO-1, the main tight junction protein presented discontinuous staining indicating that BBB was affected. Both IgG and albumin extravasations from blood vessels were noted and its parenchymal accumulation was concomitant with seizure occurrence. Another hypothesis of IgG presence in epilepsy incriminates an auto-immune cause. Protein microarray technology was used for identification in pooled plasma samples, of antigens that bind plasma antibody from TLE patients. 19 potential autoantibodies were identified as potential diagnostic biomarkers. Together, these observations suggest that IgG leakage is associated with neuronal impairment, leading to immunological changes in epileptic focus involved in the pathogenesis of TLE. A better interpretation of the profiles of these autoantibodies could offer new therapeutic and diagnostic perspectives.

Dans les maladies neurodégénératives comme la sclérose en plaques, la neuro-inflammation modifie l'activité de la barrière hémato-encéphalique (BHE) par des altérations cellulaires et moléculaires complexes. La caractérisation de tels changements moléculaires par une approche d'étiquetage in vivo justifie la recherche d’outils de ciblage fiables et de biomarqueurs. Les stratégies pour définir in vivo ces marqueurs sont cependant compliquées par la pléthore de molécules cibles accessibles, par l’intrication des régions atteintes au sein du tissu sain et par les altérations structurales potentielles des molécules cibles étudiées par histopathologie. Le but de ce travail est de rationaliser la découverte de biomarqueurs des altérations moléculaires dans les tissus par une stratégie de sélection in vivo de répertoires de phages présentant des peptides à leur surface (phage display), les ligands présents dans les deux répertoires (sain et pathologique) étant ensuite soustraits physiquement. Cette stratégie de soustraction (« PhiSSH ») permettant d’enrichir un répertoire en ligands spécifiques est d’un intérêt majeur dans le cas de répertoires complexes tels ceux obtenus dans des sélections in vivo.Nous présentons l'application de cette stratégie dans le modèle de rat de la sclérose en plaques, l’Encéphalomyélite Autoimmune Expérimentale (EAE), où les lésions disséminées dans le système nerveux central engendrent la sélection d’une grande quantité de clones s’associant au tissu sain, par comparaison avec les rats témoins en bonne santé. L'efficacité de la technique de soustraction a été contrôlée par séquençage massif des trois repertoires, «EAE», «SAIN», et «SOUSTRACTION». Plus de 95 % des clones communs aux répertoires EAE et contrôle sont absents du répertoire de la soustraction. Un ensemble de clones de phages et des peptides synthétisés chimiquement dessinés après l’analyse bioinformatique du répertoire de soustraction a été testé a) sur des tissus de rats EAE et sains et b) sur des cellules humaines en culture (HCMEC/D3) constituant un modèle de BHE, dans des conditions inflammatoires, (activation IL- 1ß) ou non activées. Un des clones et quatre peptide testés ont montré une association spécifique sur les cellules endothéliales de BHE dans des conditions inflammatoires. Pour identifier la cible d’un phage spécifique des lésions neuro-inflammatoires, nous avons mis en œuvre un procédé de création de liaison covalente entre ce phage et les protéines exprimées par des cellules de BHE cultivées en présence d’IL-1ß, puis effectué une analyse par spectométrie de masse. La galectine-1 est apparue comme une cible potential de ce phage. La découverte de biomarqueurs spécifiques de modifications moléculaires et cellulaires de régions inflammatoires disséminées dans les tissus sains, comme c’est le cas dans la plupart des pathologies présentant une activité neuro–inflammatoire, sera facilitée par l’utilisation de la stratégie de soustraction PhiSSH décrite dans ce document. / In neurodegenerative disorders like multiple sclerosis, neuroinflammation modifies the blood brain barrier (BBB) status by causing complex cellular and molecular alterations. Characterization of such molecular changes by an in vivo labeling approach is most challenging to generate reliable in vivo targeting tools and biomarkers. In vivo strategies to define such markers are, however, hampered by the plethora of the accessible target molecules, the vicinity of diseased target expression among healthy tissue and the potentially structural alterations of target molecules when studied by histopathology. The aim of this work is to streamline the biomarker discovery of pathological molecular tissue alterations by in vivo selection of phage displayed peptide repertoires that are further submitted to physical DNA subtraction (“PhiSSH”) of sequences encoding common peptides in both repertoires (HEALTHY and PATHOLOGY). The strategy of Subtraction allows thus the enrichment of clones specific for one repertoire and is of particular interest for complex repertoires produced by in vivo selection. We present the application of this strategy in the multiple sclerosis rat model, Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) pathology, where target lesions are disseminated in the central nervous system (CNS) generating a large amount of clones binding to healthy tissue among the recovered repertoire clones binding to the lesions by comparison with healthy control rats. The efficiency of the subtraction was monitored by massive sequencing of the three repertoires, «EAE», «HEALTHY», and «SUBTRACTION». More than 95% of the clones common to EAE and Healthy repertoires were shown to be absent from the Subtraction repertoire. A set of randomly chosen clones and synthesized peptides from the EAE and subtraction repertoires were tested for differential labeling of a) diseased and healthy animal tissues and b) an in vitro BBB model, in IL-1ß challenged and resting control state culture human cells (hCMEC/D3). One of the phage clones and 4 chemically synthesized peptides showed specific binding to brain ECs in neuro-inflammatory conditions. Using a strategy of crosslinking of an EAE specific phage clone on protein targets expressed by IL-1ß activated ECs followed by mass spectrometry, we propose hypothetically Galectin-1 as a possible target of this phage. PhiSSH will be useful for in vivo screening of small peptide combinatorial libraries for the discovery of biomarkers specific of molecular and cellular alterations untangled with healthy tissues, as in most pathologies presenting neuroinflammatory activity.

La barrière hémato-encéphalique (BHE) représente la principale interface d'échange moléculaire entre la circulation sanguine et le système nerveux central (SNC), où elle joue un rôle essentiel sur le contrôle du passage bidirectionnel de composés endogènes et exogènes. À la BHE, la P-glycoprotéine (P-gp) et Breast Cancer Resistance Protein (BCRP) sont les transporteurs d’efflux ABC les plus importants, empêchant l'entrée de composés toxiques, des médicaments et des xénobiotiques circulant dans le sang dans le cerveau. Il y a un intérêt croissant pour la compréhension des mécanismes moléculaires sous-jacents à la modulation de l’expression et de la fonction de la P-gp et BCRP, afin de pouvoir contrôler l'accumulation de substances neurotoxiques dans le SNC et de surmonter les phénomènes de pharmaco-résistance. Des études récentes ont montré que la morphine, elle-même un substrat de la P-gp, est impliquée dans l’augmentation de l'expression de la P-gp, qui peuvent contribuer à sa faible pénétration dans le cerveau et pour le développement de la tolérance. Cependant, le mécanisme sous-jacent à l’induction de la P-gp par la morphine, bien comme son rôle sur l'expression de BCRP était inconnu. Des rats ont été utilisés comme modèle animal pour l'étude de l'amplitude et la cinétique de la modulation de la P-gp et Bcrp à la BHE, après un traitement morphinique subchronique, en utilisant un protocole d’escalade de doses. Des microvaisseaux cérébraux isolés ont été utilisés comme modèle pour étudier la BHE, et les contenus en P-gp et Bcrp après le traitement in vivo, tandis que la lignée cellulaire hCMEC/D3 a parfois été utilisé pour des études complémentaires. Nos résultats ont montré qu’un régime subchronique de traitement à la morphine pendant 5 jours a induit la P-gp et Bcrp 12 à 24 heures après la dernière dose de morphine, un effet qui n'a pas été enregistrée lors des précédentes temps de sacrifices des animaux, ni avec une traitement aigue à la morphine. Le traitement des animaux avec un antagoniste de du récepteur glutamatergique NMDA, ou avec un inhibiteur de la COX-2 a aboli l’induction protéique de la P-gp et Bcrp par la morphine-subchronique, ce qui suggère que les deux facteurs sont impliqués dans l’up-régulation morphine-dépendante de la P-gp et BCRP. Sachant que l’induction a été enregistrée seulement à partir de 12h après la dernière dose de morphine, nous avons examiné si elle était un effet direct de l'exposition continue à la morphine, ou plutôt une conséquence du sevrage à la morphine développé après l'arrêt du traitement. Les rats ont été traités soit avec une perfusion constante de morphine (5 jours), soit avec deux schémas chroniques de morphine lorsque le sevrage a été précipité par l'administration de naloxone: un régime de doses croissantes (5 jours) ou un régime de doses constantes de morphine. La perfusion en continue de morphine n'a pas changé les niveaux de P-gp et Bcrp dans les microvaisseaux cérébraux de rat, et du coup n'a pas une conséquence directe sur la cascade de régulation de ces transporteurs à la BHE. Le sevrage provoqué par la naloxone a augmenté les niveaux d’ARNm pour le Mdr1a et Bcrp, mais l'expression et de l'activité protéiques sont restées inchangées après l'administration de naloxone. Cette disparité peut être dû soit à un effet de la régulation post-traductionnelle, soit à l’action de la naloxone dans des récepteurs non-opioïdes, qui peut entraver l’induction de la P-gp et Bcrp. Par la suite, on a fait un large screening de l'expression de plusieurs récepteurs de neurotransmetteurs chez la BHE de rat, beaucoup d'entre eux impliqués dans la signalisation inflammatoire, et qui peut jouer un rôle dans la modulation de ces transporteurs ABC. (...) / The blood-brain barrier (BBB) is the main interface of molecular exchange between the bloodstream and the central nervous system (CNS), where it plays an essential role on the control over the bi-directional passage of endogenous and exogenous compounds. At the BBB, P-glycoprotein (P-gp) and Breast Cancer Resistance Protein (BCRP) are the most important ABC drug efflux transporters preventing the entry into the brain of toxic compounds, drugs and xenobiotics circulating in the blood. There is increasing interest in understanding the molecular mechanisms underlying the modulation of P-gp and BCRP expression and function in order to control CNS accumulation of neurotoxicants and to overcome pharmacoresistance phenomena. Recent studies showed that morphine, itself a substrate of P-gp, is implicated in the up-regulation of P-gp expression, which may contribute to its poor brain penetration and tolerance. However, it was unknown the mechanism underlying P-gp induction by morphine and its role on BCRP expression. Rats were used as an animal model for the study of the amplitude and the kinetics of the modulation of P-gp and Bcrp expressions at the BBB following a subchronic morphine treatment, in an escalating morphine dose regimen. Freshly isolated rat brain microvessels were used as BBB model to study P-gp and Bcrp contents following the in vivo treatment, while the hCMEC/D3 cell line was occasionally used for complementary studies. Our results demonstrated that a 5-day subchronic morphine regimen up-regulated both P-gp and Bcrp 12 to 24h after the last dose of morphine, which was not registered at earlier time-points of animal sacrifice, nor with a single dose of morphine. The animal treatment with a glutamatergic NMDA receptor antagonist, or a COX-2 inhibitor abolished the subchronic morphine-induced P-gp and Bcrp protein up-regulation, 24h after the last dose of morphine, suggesting that both are implicated in the morphine-dependent P-gp and Bcrp up-regulation. Since the registered up-regulation only occurred from 12h after the last dose of morphine-onwards, we investigated whether it was a direct effect of continued exposure to morphine, or rather a consequence of the morphine withdrawal developed after discontinuation of treatment. Rats were treated either with a constant morphine infusion (5 days), or two chronic morphine regimens where withdrawal was precipitated by naloxone administration: an escalating dose (5 days) or a constant dose morphine regimen followed by a withdrawal period (2 days) and resume of the treatment for 3 additional days. Continuous i.v. morphine did not change P-gp and Bcrp levels in rat brain microvessels, it does not have a direct consequence on the cascade of regulation of these transporters at the BBB. Naloxone-precipitated withdrawal after escalating or chronic morphine dose regimen increased Mdr1a and Bcrp mRNA levels, but protein expression and activity remained unchanged after naloxone administration. This latter result discrepancy may be due to posttranslational regulation or naloxone action at non-opioid receptors hampering P-gp and Bcrp up-regulation. Subsequently, we did a large screening of the expression of several neurotransmitter receptors at the rat BBB, many of them implicated in the inflammatory cell-cell signaling, and which may have a role in the modulation of these ABC transporters. Also, we compared two different approaches of isolation of rat brain microvessels, mechanical dissection and enzymatic digestion, to assess which yield the purest microvessel fraction for the BBB study. The enzymatic digestion provided the highest enrichment of endothelial cells and pericytes, and the least contamination with astrocyte and neuron markers. (...) / A barreira hemato-encefálica (BHE) representa a principal interface entre a corrente sanguínea e o sistema nervoso central (SNC), desempenhando um papel essencial no controlo da passagem sangue-cérebro de diversos compostos endógenos e exógenos. A glicoproteina P (P-gp) e a proteína de resistência ao cancro da mama (BCRP) são os principais transportadores de efluxo da família ABC presentes ao nível da BHE, limitando a passagem cerebral de compostos tóxicos, fármacos e xenobióticos circulantes na corrente sanguínea. Actualmente, regista-se um crescente interesse na comunidade científica para a melhor compreensão dos mecanismos moleculares subjacentes à modulação quer da expressão quer da função da P-gp e BCRP, no sentido de desenvolver medidas mais eficazes quer para prevenção da acumulação de compostos neurotóxicos no SNC, quer para superar fenómenos de farmacorresistência associados à terapêutica. Estudos recentes evidenciam que a morfina, por si só um substrato da P-gp, está envolvida na indução da expressão da P-gp, o que poderá contribuir para a sua menor penetração cerebral, bem como para o desenvolvimento de tolerância. No entanto, não se conhece o mecanismo subjacente a tal indução da P-gp pela morfina, nem o seu eventual papel na expressão da BCRP. Com efeito, na condução da presente dissertação, realizamos um estudo da amplitude e a cinética da regulação da expressão da P-gp e BCRP ao nível da BHE na sequência de um tratamento subcrónico com morfina, em regime de doses crescentes, usando o rato como modelo animal. Para o efeito, foram isolados os capilares cerebrais dos animais sujeitos a tratamento, in vivo, enquanto que a linha celular hCMEC/D3 foi ocasionalmente utilizada para estudos complementares. Os nossos resultados demonstraram que um tratamento subcrónico com morfina (5 dias) foi capaz de induzir tanto a P-gp como a Bcrp 12 a 24 horas após a última dose de morfina administrada, mas não para tempos de sacrifício anteriores, bem como tal indução não foi registada quando a morfina foi administrada de forma aguda. O tratamento animal com um antagonista do receptor glutamatérgico NMDA, ou com um inibidor da COX-2 anulou este efeito de indução da P-gp e Bcrp pela administraçãosubcrónica de morfina, o que sugere o envolvimento destes dois componentes na indução da P-gp e Bcrp dependente da morfina. Uma vez que este aumento da expressão só surgiu a partir de 12h após a última dose de morfina, decidimos investigar se tal seria um efeito direto da exposição continuada à morfina, ou por outro lado, uma consequência do síndrome de abstinência à morfina, desenvolvido após a descontinuação do tratamento. Desta forma, os animais foram tratados por um lado com uma infusão contínua de morfina (5 dias), ou sujeitos a dois diferentes regimes de exposição crónica à morfina, após os quais o síndrome de abstinência foi provocado pela administração de naloxona. A administração de morfina em contínuo, via i.v., não alterou os níveis de P-gp e BCRP nos capilares cerebrais de rato, o que indica a ausência de uma consequência directa da morfina na cascata de regulação destes transportadores ao nível da BHE. O síndrome de abstinência opióide provocado pela naloxona aumentou os níveis de mRNA Mdr1a e Bcrp, mas tanto a expressão e atividade proteicas mantiveram-se inalteradas após a administração de naloxona. Esta discrepância de resultados pode-se dever ou a um regulamento pós-translacional, ou a uma acção inespecífica da naloxona em receptores não opiáceos, impedindo a indução da P-gp e Bcrp. Num outro estudo, foi feito um screening da expressão de vários receptores de neurotransmissores na BHE de rato, muitos deles envolvidos na sinalização célula-célula em processos inflamatórios, e que podem ter um papel na modulação destes transportadores ABC. (...)

La barrière hémato-encéphalique (BHE) contrôle le passage des médicaments, en partie par la présence d’ATP Binding Cassette (ABC) transporteurs. Dans de nombreuses pathologies cérébrales, la BHE est altérée. Parmi elles, les hémorragies intracérébrales (HIC), qui sont un effet iatrogène des anticoagulants. Des analyses cliniques montrent que les patients sous Anticoagulants Oraux Directs (AODs) présentent moins d’HIC que les patients traités avec les anticoagulants de référence, les anti-vitamine K (AVK), sans que les mécanismes cellulaires soient élucidés. Une des différences entre les AODs et les AVK résident dans leur profil pharmacocinétique, effectivement, les AODs sont des substrats des ABC transporteurs contrairement aux AVKs. Au cours des HIC, la thrombine est activée et entraine une altération de la BHE par clivage et des récepteurs protease activated receptor (PAR). Les objectifs de ce travail de thèse ont été de mettre en place un modèle in vitro de BHE afin d’étudier les interactions des médicaments avec les ABC transporteurs. Ensuite, le modèle est utilisé pour étudier les interactions des AODs en condition pathologique. Le modèle développé est basé sur la lignée HBEC-5i, peu décrite dans la littérature. Les cellules ont été cultivées en monocouche sur insert avec milieu conditionné issu d’astrocytes humains. Le modèle permet l’étude de l’interaction de thérapeutiques avec des ABC transporteurs par des mesures d’efflux ratios. Le modèle a été validé par des études de transport de molécules pharmacologiques. Ensuite, nous avons comparé, sur notre modèle, les effets de l’exposition à la thrombine avec ou sans prétraitement d’anticoagulants (rivaroxaban, dabigatran, apixaban, warfarine et héparine). Les AODs limitent l’ouverture de la BHE induite par la thrombine contrairement aux autres anticoagulants. Nos résultats ont montré que l’altération de la BHE est médiée par le clivage du récepteur PAR-1 par la thrombine. Ce clivage n’est pas le même en fonction de la classe d’anticoagulants utilisée, les AODs minimisant ce clivage. L’ensemble de ce travail de thèse a permis de donner des premières explications cellulaires quant aux mécanismes d’ouverture de la BHE consécutifs aux HIC sous AODs. / The blood-brain barrier (BBB) controls the passage of drugs, in part through the expression of the ATP Binding Cassette (ABC) transporters. In many brain diseases, the BBB is altered. Among them, intracerebral haemorrhages (ICH), which are an iatrogenic effect of anticoagulants. Clinical analyses show that patients with Direct Oral Anticoagulants (DOACs) treatment have less HIC than patients treated with the reference anticoagulants, Vitamin K Antagonist (VKA), without understanding the cellular mechanisms. One of the differences between DOACs and VKA lies in their pharmacokinetic profile, indeed, DOACs are substrates of ABC transporters unlike VKA. During HIC, thrombin, is activated and causes alterations in the BBB by the cleavage of the protease activated receptor (PAR). The objectives of this thesis work were first to set up an in vitro model of the BBB in order to study the passage of drugs and their interactions with ABC transporters. In a second step, the model is used to study the interactions of DOACs in pathological conditions. The model developed is based on the HBEC-5i cell line seldom described in the literature. The cells were cultured in monolayer on insert with conditioned medium from human astrocytes. It allows the study of the interaction of therapeutics with ABC transporters by measuring efflux ratios. The model has been validated by transport studies of pharmacological molecules. In order to meet our second objective, we compared the effect of thrombin exposure with or without pretreatment with anticoagulants (rivaroxaban, dabigatran, apixaban, warfarin and heparin sodium) on our model. DOACs limit the BBB damage induced by the thrombin unlike other anticoagulants. Our results showed that alteration of the BBB is mediated by the cleavage of the PAR-1 receptor by thrombin. This cleavage is not the same depending on the class of anticoagulants used, DOACs minimizing this cleavage. All this thesis work made it possible to provide the first cellular explanations of the opening mechanisms of the BBB following HIC under DOACs.

Le déficit en transporteur de la créatine est une maladie rare neurologique dans laquelle la perte de fonctionnalité du transporteur de la créatine (SLC6A8) conduit à une absence de créatine au niveau cérébral et à des retards de développement majeurs chez les enfants. A l’heure actuelle, aucune thérapie efficace n’est disponible.Une approche thérapeutique potentielle est le développement de molécules prodrogues de la créatine plus lipophiles qui franchiront les membranes cellulaires de façon passive et la recherche d’une formulation galénique susceptible d’emmener la prodrogue vers les cellules cibles d’intérêt, les neurones. Ainsi, dans cette thèse, nous proposons une nouvelle voie de synthèse originale d’esters de la créatine à longue chaîne aliphatique. Ces composés présentent des propriétés pharmacologiques intéressantes : nous montrons qu’il existe une relation de structure-activité entre la taille de la chaîne aliphatique (et donc la lipophilie) et la capacité de la molécule à être internalisée dans les cellules endothéliales cérébrales, astrocytaires et neuronales, constituant l’unité neurovasculaire. Il ressort de nos observations expérimentales que l’ester dodécylique de créatine est le meilleur candidat médicament. De plus, après avoir été internalisé dans les fibroblastes des patients présentant un déficit fonctionnel du transporteur de la créatine, l’ester dodécylique subit une conversion par les estérases cellulaires, libérant ainsi la créatine dans le compartiment intracellulaire.La formulation galénique permettant de protéger ces esters de créatine jusqu’au cerveau repose, elle, sur la nanovectorisation, par encapsulation de l’ester dodécylique de créatine dans des NanoCapsules Lipidiques. L’avantage de cette formulation est de permettre également un ciblage actif vers la Barrière Hémato-Encéphalique, obstacle majeur dans le développement de thérapies ciblant le Système Nerveux Central. Nos observations expérimentales mettent en exergue cette double stratégie thérapeutique pour le traitement du déficit en transporteur de la créatine.Ce travail a été soutenu financièrement par la Fondation Lejeune. / Creatine transporter deficiency is a rare brain disease associated with the loss of function of the SLC6A8 (creatine transporter) leading to an absence of creatine at the cerebral level and to a dramatic neurodevelopmental retardation in the children. To date, no effective therapy is available.A potential therapeutic option would be the design of a pharmaceutical formulation of lipophilic prodrugs of creatine that will cross the cell membranes passively and target the neurons in order to restore the creatine content inside these cells.One of the main purposes of this dissertation is to propose an original chemistry synthesis process of creatine esters with long aliphatic chain. These compounds show interesting pharmacological properties of structure-activity relationship between the length of the aliphatic chain (i.e. lipophilicity) and the ability for the drug to enter cerebral endothelial, astroglial and neuronal cells. According to our experimental observations, the dodecyl ester creatine seems to be the best drug candidate. Moreover, the dodecyl ester is acted on by cellular esterases inside patients’ fibroblasts with a functional deficit of the SLC6A8 and increases the intracellular creatine content.The pharmaceutical formulation developed in this study consists by incorporation of dodecyl ester inside a nanovector (Lipid NanoCapsules). Two main advantages can be gained by nanovectorization: firstly, the dodecyl ester is protected from the degradation by plasmatic esterases before reaching the brain. Secondly, the nanovectorization strategy is highly valuable to brain targeting bypassing the blood-brain barrier, which remains until now a major impediment in the drug design for the Central Nervous System. Our experimental observations highlight this two-step therapeutic strategy for the treatment of deficiency of the creatine transporter.This work was financially supported by the International PhD Program of the Life Sciences division of the CEA and the Fondation Jérôme Lejeune.

Dans l'épilepsie du lobe temporal (ELT), l'hyperexcitabilité est attribuée à la mort neuronale, la gliose et la plasticité synaptique. Un remodelage vasculaire n'a jamais été recherché dans le tissu épileptique, bien que des données récentes suggèrent que la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique (BHE) est épileptogène.<br />Nous avons observé dans l'hippocampe de patients atteints d'ELT réfractaire une dégradation de la BHE, une néo-vascularisation et la surexpression du vascular endothelial growth factor (VEGF) et de son récepteur VEGFR-2. <br />Pour comprendre cette angiogenèse, nous avons modélisé l'épilepsie in vivo et in vitro chez le rat. In vivo, la néo-vascularisation, la surexpression de VEGF/VEGFR-2 et la rupture de BHE sont présentes dans un modèle avec lésions et gliose, mais transitoires dans un modèle non lésionnel. <br />In vitro, nous avons observé que des crises déclenchées sur des cultures organotypiques d'hippocampe (COHs) induisent une angiogenèse et une dégradation de BHE qui ne persiste qu'en présence de lésions.<br /> Nous avons étudié le rôle du VEGF in vitro, en le neutralisant ou en inhibant des voies de signalisation de VEGFR-2 dans les COHs, confirmant l'importance de PKC et src dans l'angiogenèse et la dégradation de la BHE. De plus, nous avons montré un déséquilibre des angiopoiétines en faveur d'Ang2 qui potentialise les effets du VEGF.<br />Chez l'homme et l'animal, la rupture de la BHE persiste dans les foyers chroniques entretenant l'induction des crises. En ciblant des facteurs angiogéniques pour réparer la BHE, nous espérons réduire l'épileptogenèse et donc proposer de nouvelles stratégies pour les épilepsies réfractaires.