Le système nerveux central est un organe complexe et privilégié, protégé, entre autres, par la barrière hémato-encéphalique (BHE), sur laquelle se trouvent des transporteurs d'efflux telle que la P-glycoprotéine (Pgp).<br />La BHE est impliquée dans la neuro-inflammation et les maladies cérébrales associées, et la littérature laisse penser que l'endothéline 1 (ET-1) y joue un rôle important. En utilisant un modèle in vitro autologue de BHE humaine adulte et un modèle in vitro de BHE humaine fœtale (co-culture de cellules gliales et de cellules endothéliales microvasculaires cérébrales), nous avons étudié l'effet de l'ET-1 sur la Pgp.<br />Une différence, en termes de modulation de l'activité de la Pgp, a été observée entre la BHE fœtale et la BHE adulte suite à l'exposition à l'ET-1. Nous avons également évalué la modulation induite par l'ET-1 sur la sécrétion de la MCP-1 (Monocyte chemoattractant protein 1) et de l'IL-8. Les résultats montrent que l'ET-1 diminue l'activité de la Pgp et induit la sécrétion de MCP-1 et d'IL-8.

En se focalisant sur l'administration de médicaments dans et vers le système nerveux central et notamment pour le traitement du glioblastome, ce travail de thèse a eu pour but la mise en place d'outils expérimentaux et l'évaluation du comportement de nanovecteurs au cours du franchissement de barrières biologiques. Trois types de nanovecteurs de taille variant entre 20 et 100nm ont été appréhendés : des nanoparticules de polysaccharide, de PLGA et des nanocapsules lipidiques (LNC). Le comportement de ces objets vis-à-vis des éléments du sang a permis de définir que le revêtement par la transferrine de nanoparticules de PLGA et l'insertion de phospholipides ou de BSA dans des nanoparticules polysaccharidiques diminuait leur reconnaissance par le système réticulo-endothélial et améliorait leur temps de résidence plasmatique. Ces modifications de surface sont également associées à une possibilité d'internalisation dans les cellules cibles F98 de gliomes influencée essentiellement par la nature lipidique ou polymérique du vecteur. L'évaluation précise du comportement cellulaire et subcellulaire des LNC dans les cellules F98 a permis de démontrer que si la nature du vecteur est impliquée notamment en ce qui concerne le recrutement de voies d'endocytoses cholestéroldépendantes, la taille, corrélée au taux de surfactant véhiculé, est également impliquée. Les LNC de 20nm sont ainsi les plus aptes à permettre l'échappement lysosomal des principes actifs véhiculés et démontrent des activités pharmacologiques renforcées notamment pour ce qui concerne la mort cellulaire induite par le paclitaxel. Ces résultats établissent donc un lien original entre le comportement subcellulaire des vecteurs et la biodisponibilité des agents anticancéreux. De nouvelles potentialités de franchissement de barrières ligand- ou taille-dépendants ont été soulignées. Ces observations renforcent donc l'intérêt d'études comparatives permettant de rationaliser l'utilisation d'un vecteur donné pour un médicament et une cible donnés. Elles démontrent également tout l'intérêt d'établir des justifications entre le comportement biologique et la pertinence thérapeutique des nanovecteurs.

Le déficit en transporteur de la créatine est une maladie rare neurologique dans laquelle la perte de fonctionnalité du transporteur de la créatine (SLC6A8) conduit à une absence de créatine au niveau cérébral et à des retards de développement majeurs chez les enfants. A l'heure actuelle, aucune thérapie efficace n'est disponible.Une approche thérapeutique potentielle est le développement de molécules prodrogues de la créatine plus lipophiles qui franchiront les membranes cellulaires de façon passive et la recherche d'une formulation galénique susceptible d'emmener la prodrogue vers les cellules cibles d'intérêt, les neurones. Ainsi, dans cette thèse, nous proposons une nouvelle voie de synthèse originale d'esters de la créatine à longue chaîne aliphatique. Ces composés présentent des propriétés pharmacologiques intéressantes : nous montrons qu'il existe une relation de structure-activité entre la taille de la chaîne aliphatique (et donc la lipophilie) et la capacité de la molécule à être internalisée dans les cellules endothéliales cérébrales, astrocytaires et neuronales, constituant l'unité neurovasculaire. Il ressort de nos observations expérimentales que l'ester dodécylique de créatine est le meilleur candidat médicament. De plus, après avoir été internalisé dans les fibroblastes des patients présentant un déficit fonctionnel du transporteur de la créatine, l'ester dodécylique subit une conversion par les estérases cellulaires, libérant ainsi la créatine dans le compartiment intracellulaire.La formulation galénique permettant de protéger ces esters de créatine jusqu'au cerveau repose, elle, sur la nanovectorisation, par encapsulation de l'ester dodécylique de créatine dans des NanoCapsules Lipidiques. L'avantage de cette formulation est de permettre également un ciblage actif vers la Barrière Hémato-Encéphalique, obstacle majeur dans le développement de thérapies ciblant le Système Nerveux Central. Nos observations expérimentales mettent en exergue cette double stratégie thérapeutique pour le traitement du déficit en transporteur de la créatine.Ce travail a été soutenu financièrement par la Fondation Lejeune.

Ce travail s'intéresse à l'étude préclinique de l'ischémie cérébrale focale transitoire à travers la caractérisation de la microvascularisation cérébrale grâce à différents outils d'investigation. Il décrit le développement d'un modèle d'ischémie cérébrale réversible par occlusion intraluminale de l'artère cérébrale moyenne chez le rat. Une ouverture précoce de la barrière hémato-encéphalique après reperfusion a été mise en évidence par l'extravasation d'agents de contraste en imagrie par résonance magnétique nucléaire. L'influence de différents anesthésiques sur l'évolution de la pathologie ischémique a été évaluée par la mesure du débit sanguin cérébral en autoradiographie et l'évaluation histologique des lésions induites. Enfin, une technique d'imagerie par spectroscopie proche-infrarouge permettant la localisation spatiale en temps réel d'un foyer ischémique est présentée.

Le diabète de type 2 est une pathologie complexe et multifactorielle caractérisée par une hyperglycémie chronique et une résistance à l’insuline. Actuellement, le diabète de type 2 est une préoccupation majeure et mondiale de santé publique. Les objectifs de cette thèse étaient d’étudier l’impact de l’hyperglycémie (aiguë, récurrente et chronique) sur des modèles complémentaires in vivo (poisson zèbre et souris) à un niveau périphérique et central. L’hyperglycémie aiguë et/ou chronique chez le poisson zèbre a altéré l’expression génique des cytokines pro-inflammatoires du cerveau, a modulé l’expression des gènes impliqués dans l’établissement de la barrière hémato-encéphalique, a diminué la prolifération des progéniteurs neuronaux de la plupart des niches neurogéniques et a impacté les mécanismes de réparation du télencéphale. L’hyperglycémie récurrente a induit un prédiabète caractéristique chez la souris avec des altérations périphériques et centrales que la glycine a atténuées en partie. L’ensemble des résultats indique que l’hyperglycémie contribue aux dysfonctionnements observés dans le diabète au niveau de l’inflammation, du stress oxydatif, de la barrière hémato-encéphalique, de la plasticité neuronale et des processus neurogéniques, ainsi que des fonctions cognitives, et souligne le potentiel antidiabétique intéressant de la glycine. En complément de ces résultats de recherche, une mission d’enseignement orientée santé a été menée auprès d’étudiants universitaires. Cette approche holistique de la pathologie diabétique pourrait contribuer, à terme, à l’élaboration de programmes de prévention adaptés, de dépistages précoces et de thérapies efficaces. / Type 2 diabetes is a complex and multifactorial disease characterized by chronic hyperglycemia and insulin resistance. Type 2 diabetes is currently a major and worldwide public health issue. The main objectives of this thesis were to investigate the peripheral and central impact of hyperglycemia (acute, recurrent and chronic) in vivo on complementary models (zebrafish and mouse). In zebrafish, acute and/or chronic hyperglycemia modulated cerebral expression of pro-inflammaty cytokines, as well as expression of genes involved in blood-brain barrier establishment. It also reduced neural progenitor proliferation in main neurogenic niches and impaired brain repair mechanisms. In the mouse, recurrent hyperglycemia induced a characterized prediabetes with central and peripheral alterations partially alleviated by glycine. All results suggest that, hyperglycemia contributes to related diabetes dysfunctions, through inflammation and oxydative stress, on blood-brain barrier integrity, neural plasticity including neurogenesis, and cognitive functions, and highlights the antidiabetic potential of glycine. In addition, a health-oriented teaching mission has been undertaken on university students. This holistic approach on diabetic disease could help in establishing effective prevention programs, early screenings and efficient therapies.

Les accidents vasculaires cérébraux (AVC) représentent l’une des premières causes de morbi-mortalité dans les pays industrialisés et sont en constante augmentation. Pour l’heure, aucune autre thérapie que la thrombolyse intraveineuse n’est validée, or moins de 10% des patients y sont éligibles.Les premiers essais de thérapie régénérative par greffe de progéniteurs endothéliaux ont montré leur efficacité au niveau préclinique sur la récupération fonctionnelle, mais très peu de cellules parviennent jusqu’au site de la lésion pour y exercer leurs effets. De précédents travaux ont montré que l’érythropoïétine (EPO) augmentait la mobilisation et la prolifération de progéniteurs endothéliaux depuis la moelle osseuse, ainsi que leur adressage vers les sites ischémiés in vivo.Nous avons formulé l’hypothèse que l’EPO pouvait permettre aux progéniteurs endothéliaux vrais (ECFCs) d’atteindre le site ischémié en plus grand nombre pour y exercer un effet plus important, plus rapidement. Nous avons donc décidé d’évaluer trois stratégies d’optimisation : coadministration d’ECFCs et d’EPO, administration d’ECFCs prétraités à l’EPO, et enfin coadministration d’ECFCs et d’un dérivé de l’EPO dénué d’effet hématopoïétique. Pour nos derniers travaux, nous nous sommes aidés de l’imagerie isotopique µSPECT/CT pour quantifier l’adressage au niveau de la lésion des ECFCs avec ou sans optimisation pharmacologique à l’EPO, et évaluer longitudinalement leurs effets bénéfiques sur la rupture de la barrière hémato-encéphalique, l’apoptose cérébrale et le débit sanguin cérébral résiduel, en complément des techniques référentes et de l’évaluation clinique neurofonctionnelle. / Stroke represents a leading cause of morbidity and mortality in industrialized countries and prevalence steadily increases. For now, no other therapy that intravenous thrombolysis is validated, still, less than 10% of patients are eligible.The first preclinical regenerative therapy trials using endothelial progenitor cells engraftment gave evidence of their efficacy on functional recovery, although very few cells reached the site of injury to exert their effects are. Previous works showed that erythropoietin (EPO) increased mobilization and proliferation of endothelial progenitor cells from bone marrow, as well as their homing to the ischemic sites in vivo.We hypothesized that EPO could enable true endothelial progenitor cells (ECFCs) to reach the ischemic site in larger quantity, faster, to exercise a greater effect. We decided to evaluate three optimization strategies: coadministration of ECFCs and EPO, administration of EPO-pretreated ECFCs, and finally coadministration of ECFCs and an EPO derivative devoid of hematopoietic effect.In this work, we used μSPECT/CT imaging to quantify the ECFCs homing to the ischemic site with or without EPO optimization after cerebral ischemia, and longitudinally assessed their beneficial effects on blood-brain barrier disruption, cerebral apoptosis and residual cerebral blood flow, complementary to the referent techniques and neurofunctional clinical evaluation.

The selective degeneration of motoneurons in the spinal cord, the brainstem and the brain cortex is the core pathology of amyotrophic lateral sclerosis (ALS), but evidences suggest that the neighbouring non-neuronal cells are also involved in the disease progression. Beside Riluzole, only drug approved to treat this fatal neurodegenerative disease, new pharmaceutical agents or novel strategies including stem cell therapy are currently under development and evaluated preclinically in front line on mutant SOD1 rodents mimicking all hallmarks of the human disease. <p>Current intravenously delivered drugs tested in ALS therapy assume an intact blood-brain barrier and suppose the passage across the endothelium to hit their targets in the CNS parenchyma. If BBB impairment occurs in ALS, it may lead to revision of planned pharmaceutical treatment. In the first part of the work, we have validated the mutant SOD1 rat model of ALS and we characterized properties and integrity of its BBB. We observed a significant BBB disruption at symptomatic phase of ALS, evidenced by blood protein leakage, IgG accumulation and microhemorrhage. To look for the mechanism of BBB opening, we demonstrated that the expression of key genes involved in the BBB integrity was decreased. At the ultrastructure, the morphology of endothelial cells and vascular astrocyte end-feet was altered. Our results suggest that BBB disruption is a late event in ALS disease course and appears like a consequence of the local degenerative process or neuroinflammation rather than a cause. Since a lot of extracellular oedema and swollen astrocyte end-feet were found in mutant SOD1 rats, we also looked at the expression and localization of aquaporin-4, a key protein involved in CNS water movement. We found that its expression was highly increased in the symptomatic phase of ALS course and we hypothesize that this overexpression might be related to the resolution of oedema after BBB opening. <p>In the second part of the work, we considered an original, easy, non-invasive and safe therapeutical approach of stem cell delivery in ALS rats. Since ALS affects the motoneurons throughout the CNS, we decided to use the bloodstream to deliver neural stem cells. We studied cell homing, survival, proliferation, integration and differentiation. Interestingly, the highest efficiency of cell delivery to the CNS was found in symptomatic ALS and the lowest in healthy animals. Neural stem cells injected into ALS animals preferentially colonized the motor cortex, hippocampus and spinal cord. We detected their successful differentiation into neural lineages by the appearance of MAP2-, GFAP-positive cells and the decrease of nestin expression.<p>One of the realistic near-term clinical goals for ALS is the transplantation of stem cells that counteract the loss of motoneurons by secreting neuroprotective factors. Accordingly, we evaluated in vitro the expression of neurotrophic factors released by stem cells after stimulation with tissue extracts from ALS rats. The aim of this paradigm was to determine whether the ALS environment triggers neuroprotective factors release from stem cells. Mesenchymal stem cells and neural stem cells were able to express a wider range of growth factors than fibroblasts. According to the stem cell population stimulated, we obtained differential expression pattern, raising the choice of cell population for appropriate clinical applications in ALS.<p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

L’intégrité fonctionnelle de la barrière hémato-encéphalique (BHE) est altérée dans de nombreuses pathologies neurologiques et métaboliques. Les vaisseaux cérébraux sont des tissus cibles des hormones stéroïdes sexuelles mais la contribution respective de ces effecteurs endocriniens et de leurs récepteurs dans l’intégrité de la BHE reste encore à être précisée. Les effets des hormones gonadiques sur l’unité neurovasculaire chez la souris ont été étudiés, en se concentrant sur l’aire préoptique médiane de l’hypothalamus, une région cérébrale hormono-sensible. L’augmentation de la perméabilité de la BHE chez des souris mâles et femelles gonadectomisés. Elle est associée chez le mâle à une désorganisation des jonctions serrées et une diminution de l’expression des protéines les constituant, à une activation des cellules gliales, et à une augmentation de l’expression de molécules inflammatoires, la supplémentation en testostérone permettant la restoration. Les récepteurs des androgènes et des estrogènes peuvent ainsi être impliqués dans la régulation hormono-dépendante du transport paracellulaire. La lignée de souris transgéniques sélectivement invalidées pour le récepteur neural des androgènes, a permis de mettre en évidence l’effet délétère de l’absence de ce récepteur sur l’intégrité de la BHE et des jonctions serrées. Pour compléter, un modèle ex vivo de tranches d’hypothalamus a permis d’appréhender les effets à court terme de la testostérone sur la BHE. Ces données soulèvent des questions sur les effets délétères potentiels des perturbateurs endo-criniens sur l'intégrité BBB et l'apparition de maladies neurologiques et métaboliques associées. / Functional integrity of the blood-brain barrier (BBB) is compromised in many neurological and metabolic pathologies. Cerebral blood vessels are target tissue for sex steroid hormones but the relative contribution of these endocrine effectors and their receptors in the BBB integrity are still unclear. Effects of gonadal hormones on the mouse neurovascular unit were studied, focusing on the hypothalamic medial preoptic area, a highly sensitive brain area to gonadal steroid hormones. BBB permeability increased in both gonactectomized male and female, is associated with tight junction disorganization and lower expression of tight junction proteins, glial activation, and up-regulation of inflammatory molecules in male. Testosterone supplementation restores the BBB impermeability, tight junction integrity, and almost completely abrogated the inflammatory features. Androgen and estrogen receptor may be involved in testosterone-induced regulation of the formation and maintenance of tight junction in males. Studying the involvement of these receptors using a trans-genic mice line selectively lacking neural AR in the CNS, highlighted the negative effect of this dele-tion on the BBB and TJ integrity. To complete, ex vivo slices of male mouse hypothalamus allowed to assess short-term molecular mechanisms of testosterone on the BBB structure and function.These data raise questions about the potential deleterious effects of endocrine disruptors on the BBB integrity and the occurrence of neurological and metabolic diseases.

Ces dernières années, alors qu’aucun agent neuroprotecteur n’a été efficace en clinique pour parer les dommages de l’ischémie cérébrale, le concept d’unité neurovasculaire (UNV) est apparu comme un nouveau paradigme pour l’investigation et le traitement des accidents vasculaires cérébraux ischémiques. La rupture de la barrière hémato-encéphalique (BHE) localisée au niveau des capillaires cérébraux, et ses corollaires l’œdème vasogénique et l’hémorragie intracérébrale, constituent des événements critiques de la maladie, et restreignent considérablement l’éligibilité des patients à la thrombolyse au rtPA, seul traitement de phase aiguë disponible actuellement en clinique. La complexité des intercommunications qui s’exercent au sein de l’UNV rend difficile l’appréhension de la dysfonction microvasculaire in vivo, soulignant l’importance des études in vitro pour compléter les connaissances dans ce domaine. C’est par cette approche combinée que les travaux effectués au cours de ce doctorat démontrent l’impact de la nécrose cérébrale sur la cinétique de la perte d’intégrité de la BHE au décours de la reperfusion. Cependant, même si l’endothélium microvasculaire demeure fonctionnel après un épisode ischémique dans un contexte non lésionel, il devient vulnérable à certaines molécules comme le rtPA dans une situation de thrombolyse. Ces résultats illustrent le rôle déterminant de l’environnement moléculaire périvasculaire sur la dysfonction de la BHE lors de l’ischémie cérébrale, et orientent les nouvelles stratégies thérapeutiques vers des approches ciblant la protection de l’ensemble de l’UNV. / In the recent years, while no neuroprotective agent was clinically effective in reducing brain ischemic damage, the neurovascular unit (NVU) concept emerged as a new paradigm for stroke investigation and treatment. The breakdown of the blood-brain barrier (BBB), localized in brain capillaries, with ensuing vasogenic edema and intracerebral hemorrhage, appears as a critical event of this disease, and severely restricts the eligibility of patients for rtPA thrombolysis, the only acute-phase treatment currently available. The complex intercommunications occurring within the NVU makes the microvascular dysfunction difficult to study in vivo, highlighting the importance of in vitro approaches to complete the knowledge in this field. In this context, the work done in this PhD demonstrates that brain tissue necrosis influences the kinetics of the loss of BBB integrity during reperfusion. However, even when the BBB remains functional in a non-lesional ischemic context, it becomes vulnerable to certain molecules such as rtPA in a thrombolysis situation. These results illustrate the key role of molecular perivascular environment on the BBB dysfunction during cerebral ischemia, and orientate new therapeutic strategies towards the protection of the entire NVU.

La barrière hémato-encéphalique (BHE), localisée au niveau des capillaires cérébraux, contrôle les échanges entre le sang et le compartiment cérébral et assure ainsi le maintien de l'homéostasie du système nerveux central (SNC). La présence de la BHE est un atout lors du développement de médicament à visée périphérique. En effet, en limitant le passage de nombreuses molécules, la BHE protège le SNC des effets potentiellement neurotoxiques de ces molécules. Toutefois, l‟exposition des cellules endothéliales des capillaires cérébraux à des agents chimiques est susceptible d‟engendrer une augmentation transitoire de la perméabilité de la BHE. Cette augmentation peut perturber l‟homéostasie cérébrale et permettre l‟entrée massive de molécules potentiellement neurotoxiques dans le SNC. La prise en compte de la BHE en amont de l‟étude de la neurotoxicité d‟un médicament est donc un élément important. De plus, la majorité des médicaments sont utilisés de façon chronique et les effets secondaires indésirables résultant d‟une administration chronique sont fréquemment liés à une atteinte cérébrale. Afin de répondre à cette problématique, notre modèle in vitro de BHE, qui consiste en une co-culture de cellules endothéliales de capillaires cérébraux et de cellules gliales, a été adapté à l‟étude de la toxicité de molécules lors d‟un traitement prolongé. Les propriétés protectrices de la BHE deviennent une contrainte importante lors du développement de médicament à visée cérébrale. En effet, la présence de la BHE explique en partie les taux de succès très faibles des molécules lors du développement de médicaments à visée cérébrale. Afin de limiter les taux d‟échec, il est nécessaire de prédire efficacement la distribution cérébrale des composés en prenant en compte la BHE. Or, il est admis que l‟effet pharmacologique est lié à la concentration libre du médicament au niveau de sa cible. Ainsi, les nouvelles approches visent à prédire la concentration libre que la molécule atteindra dans le cerveau. Toutefois, les méthodes existantes pour prédire ce paramètre reposent sur une méthodologie in vivo et ne présentent pas un débit suffisant pour être utilisées lors des phases précoces du développement de médicaments. Une méthodologie in vitro pour obtenir le ratio de concentrations libres d‟une molécule entre le cerveau et le sang a été développée pour répondre à ce besoin. Le travail réalisé a permis de développer deux méthodologies in vitro. La première permet de prédire la toxicité chronique des molécules. En prédisant le ratio des concentrations libres entre le compartiment cérébral et sanguin des composés, la seconde facilite la sélection des médicaments candidats lors du développement de médicaments à visée cérébrale. Ces méthodologies pourront donc contribuer à diminuer les taux d‟échecs lors des phases précliniques et cliniques du développement de médicaments. / The blood-brain barrier (BBB), located at the level of brain capillaries, is responsible for brain homeostasis maintenance by tightly controlling blood-borne substances access to the brain. The presence of the BBB is an asset during peripheral drug development. Indeed, the BBB protects the central nervous system (CNS) against potential neurotoxic effects of compounds by strongly limiting their passage. However, exposure of brain capillaries endothelial cells to chemical agents is likely to cause a transient increase in BBB permeability. This increase can disrupt brain homeostasis and allow the massive entry of potentially neurotoxic molecules in the CNS. Hence, taking into account BBB toxicity in alternative neurotoxicity studies is important. In addition, the CNS side effects of several drugs used chronically could be at least partly attributed to their toxicity at the level of the BBB causing unwanted, indirect effect on brain cells. To address this issue, our in vitro BBB model, which consist of a co-culture of brain capillary endothelial cells and glial cells, has been adapted to the evaluation of repeated-dose toxicity at the BBB. The protective properties of the BBB become a major hurdle during CNS drug development. One way to reduce theimportant attrition rate, consists in predicting the CNS distribution of drug candidates early in CNS drug discovery programs. The use of unbound brain concentrations has been shown to provide the best correlations with pharmacological data. Hence, new approaches aim to predict the free brain concentration of compounds. However, the determination of free brain / free plasma ratios requires both in vitro and in vivo experiments that are both animal and time consuming. Consequently, we have explored the possibility to directly generate free brain / free plasma ratios under steady-state and non-steady state conditions in our in vitro BBB model, thereby greatly simplifying existing experimental procedures.. The work presented herein aimed to develop two in vitro methodologies. The first one allows the study of repeated-dose BBB toxicity. The second one allows free brain / free plasma ratios assessment using an in vitro model of the blood brain barrier, which can drive the selection of CNS drug candidates with the most favourable target engagement. The use of these two methodologies may help to reduce attrition rates in drug discovery and development by appreciating the eventual central toxicity of systemic drug associated with BBB dysfunction and by identifying centrally acting-compounds with a desirable in vivo response in the CNS early on in the drug discovery process.