Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:23Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-08-08Bitstream added on 2014-06-13T19:35:23Z : No. of bitstreams: 1 rodrigues_gr_me_jabo.pdf: 533286 bytes, checksum: dff723ba2dc7ffcab8ade10e5ed0fee4 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Os microrganismos apresentam uma imensa diversidade genética e desempenham funções únicas e cruciais na manutenção de ecossistemas, uma dessas funções é a produção de enzimas extracelulares que ajudam na mineralização da matéria orgânica, liberação de carbono e nutrientes na forma de serem assimilados. Devido a esses importantes fatores é que cada vez mais aumenta a busca por enzimas que possam ser utilizadas nos diversos setores industriais com maior aproveitamento e baixo custo. A celulase pertence a essa classe de enzimas, ela é formada por um complexo multienzimático capaz de hidrolisar celulose através da quebra da ligação ~,1-4. A partir disso foi realizada uma busca de gene r~lacionado com a hidrolise da celulose em biblioteca metagenômica de DNA extraído de solo de arboreto de eucalipto. Foram realizado testes bioquímicos e moleculares, partindo de um par de oligonucleotídeo iniciadores degenerado que foi construído para identificar gene da glucanase que está ligado na hidrolise da celulose. Com o teste bioquímico foi possível selecionar clones que estão relacionados com hidrolise da celulose, a confirmação dos clones positivos foi feita através de reações de PCR. Após a escolha do clone foi feita uma sub-biblioteca, os clones da sub-biblioteca foram sequenciados e através do sequenciamento foi possível encontrar gene relacionado à hidrólise da celulose. / The microorganisms show a abundant genetic diversity and perform unique and crucial ecosystems maintence, one of this function is the produce of extracellular enzymes that mineralize organic matte and release carbon and nutrients in forms that can be assimilated. Due this important factors its increasing the search of enzymes who can be use on the manufacturing with better utilization and low cust. The cellulase belongs to this class of enzymes and its formed by a complex multienzimatic who its able to hydrolisar a cellulose trough the broke of the linked (3- 1-4. The cellulose, o homopolissacarideo wich we see in big amount on the biosphere. So, was made a screening to genes related with cellulase in metagenômic library of aboreto of eucalyptus cloning larg fragmenets in vector cosmídeo, with size who was between 30 and 45kb. There was made tests biochemists and molecular starting of a couple degenerate primes wich vvas made to identify the gene of glucanase that its connected in hydrolise da cellulose.With this tests we could detect the dones related with hydrolose of cellulose.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:23Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-02-28Bitstream added on 2014-06-13T20:47:49Z : No. of bitstreams: 1 schuch_v_me_jabo.pdf: 3089029 bytes, checksum: 0835ef08e49e97cfdf7ad571bdfc3671 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Metabólitos secundários são compostos bioativos, com grande importância para a indústria farmacêutica e agropecuária, produzidos por certos grupos de microrganismos e plantas. Os policetídeos, que são sintetizados por complexos enzimáticos denominados policetídeos sintases (PKSs), desatacam-se entre os metabólitos secundários conhecidos e compõe a estrutura química básica de vários antibióticos. Todos os genes envolvidos na biossíntese de um policetídeo se encontram agrupados fisicamente no cromossomo, e contém genes que são altamente conservados, comumente chamados d~ pks mínima. Os métodos tradicionais para pesquisa de novas drogas, que envolvem o cultivo de microrganismos isolados do solo, não são mais tão promissores, devido à alta taxa de redescoberta de antibióticos já conhecidos, que chega a 99,9%, e à pequena parcela de microrganismos do solo que são cultiváveis pelas técnicas padrões de cultivo, cerca de 1 %. A Metagenômica é uma abordagem promissora que permite acessar o genoma desses organismos incultiváveis, pois consiste na extração de DNA diretamente do ambiente e construção de uma biblioteca com este genoma misto. Neste trabalho descrevemos a construção de uma biblioteca feita com DNA de alto peso molecular isolado diretamente de solo coletado sob arboreto de eucaliptos no Estado de São Paulo, Brasil. A biblioteca possui 9.320 clones e foi construída em vetor cosmídeo, com insertos de tamanho variando entre 30 e 45kb... / Secondary metabolites are bioactive compounds with great importance in the pharmaceutical and agriculture industries, procuced by a few groups of microrganisms and plants. The polyketides that are synthetized by enzimatic complexes, denominated polyketides synthases, outstand among the secondary known metabolites, which are part of the main structure of many antibiotics. Ali genes involved in the biosynthesis of antibiotics are found as clusters in the chromossome. The traditional methods for the research of new drugs that are made from microrganisms cultures isolated from the soil are not so promissing, due to the high rate of rediscorevy of already known species, reaching 99.9%. The other small piece of microrganisms are culturable by standards culture methods, reaching 1 % maximum. Metagenomics is a promissing approach that allows the access to genom of these organisms that are not culturable, as it is carried out by DNA extraction directly from the environment and construction of a mixed genomic library. In this work, we describe the construction of a library made from high molecular weight DNA isolated directly form the soi! undemeath a pinus forest in the State of São Paulo, Brazil. The library shows 9.320 dones and it was constructed in a cosmideo vector, with insert size ranging from 30 to 45 kb. Digestion with difterent restriction enzymes of cosmidial DNA randomly chosen allowed to visualize evident difterences in the restriction fragments among the clones, as does the possibility to determine the average insert size. The initial evaluation of the presence of genes involved in the biosynthesis of antibiotics synthesized by the enzymatic system PKS of kind I, was accomplished by the PCR amplification of clones from the library using specific primers. We studied 4.320 clones and the results suggest a great variety of these genes. The PCR products obtained were sequenced for the determination of identity of the amplified gene.

Made available in DSpace on 2015-04-22T22:12:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 carolinie.pdf: 1105289 bytes, checksum: fb4a9af7cf4012e7784dfbcf92246455 (MD5) Previous issue date: 2010-03-09 / FAPEAM - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas / In the Amazon agricultural soils are found in soil called Anthropogenic Dark Earths (ADE), a soil rich in organic matter and minerals. The biodiversity is a source of very high value of non-cultivable microorganisms that can be isolated through construction of metagenomic libraries, using vectors of large fragments, with the goal of finding new biocatalytic enzymes. Enzymes widely used in the industrial market are amylase and protease, are applied in industry: chemical, pharmaceutical, textile, detergent and food industries. Amylases degrade starch into smaller units of saccharides, as proteases catalyze the hydrolysis of peptide bonds. The aim of this study was to isolate and partially characterize enzymes amylase and protease of clones isolated from a selection of functional metagenomic library of TPI in the Amazon region. In this study were isolated 1.344 clones, only 4 producing halo of starch hydrolysis and 3 proteolytic clones belonging to metagenomic library constructed with total DNA extracted from microorganisms present in soil samples of the TPI, were partially characterized the enzymes produced by 4 clones amilolytic and 1 proteolytic clone. After isolation, the clones were inoculated in culture medium Luria Bertani (LB) at 37ºC under agitation of 150 rpm and subjected to assays at pHs of 3 to 10 and temperatures ranging from 25 to 100ºC for up to 90 of incubation. Amylases had its highest production in 24 h (4.3 U/mL) and its activity was optimal at neutral pH to slightly alkaline, the clone P1C4 showed the highest production at 70°C (6.93 U/mL), since the clones P5C4 and P6C12 reported higher thermostability at 80°C, these results indicate that the gene for alpha-amylase to be cloned encoding a thermostable enzyme, such as the enzyme produced by Bacillus liqueniformis. Since the clone P3A3 produced 26.3 U/mL protease in 10 hours of production, its activity was optimal at neutral pH, and its optimum temperature at 30ºC (56.0 U/mL) and its thermostability was demonstrated in 50°C (22,0 U/mL). These features contribute to the implementation of these enzymes in industrial sectors as in food production, chemical industry and production of detergents. The enzymes isolated in this study demonstrated new features and performance when compared to enzymes described today, which proves the efficiency of the construction of metagenomic libraries for isolation of new bioproducts. / Na floresta Amazônica são encontrados solos agricultáveis denominado de solo de Terra Preta de Índio (TPI), um solo rico em matéria orgânica e em minerais. A biodiversidade da Amazônia constitui uma fonte de valor altíssimo de micro-organismos não-cultiváveis que podem ser isolados através das construções das bibliotecas metagenômicas, utilizando vetores de grandes fragmentos, com o objetivo de encontrar novas enzimas biocatalíticas. As enzimas de maior aplicação no mercado industrial são as amilases e proteases, aplicadas nas indústrias: química, farmacêutica, têxtil, de detergentes e alimentícia. As amilases são capazes de degradar o amido em unidades de sacarídeos menores, já as proteases catalisam a hidrólise de ligações peptídicas. O objetivo deste trabalho foi isolar e caracterizar parcialmente enzimas amilolíticas e proteolíticas de clones isolados a partir de uma seleção funcional da biblioteca metagenômica de TPI da região Amazônica construída com DNA total extraído dos micro-organismos presentes nas amostras de solos de TPI, inseridos no vetor fosmidial (pCC1Fos ) e clonado na célula hospedeira Escherichia coli (EPI300). De 1.344 clones pertencente a biblioteca metagenômica, apenas 4 clones foram produtores de halo de hidrólise de amido e 3 clones foram proteolíticos, além disso, todas as enzimas produzidas pelos 4 clones amilolíticos e 1 clone proteolítico foram caracterizadas parcialmente. Após o isolamento, os clones foram inoculados em meio de cultura Luria Bertani (LB) a 37oC, sob agitação de 150 rpm e submetidos aos ensaios enzimáticos nos pHs de 3 a 10 e temperatura variando de 25 a 100ºC por até 90 minutos de incubação. As amilases tiveram sua maior produção em 24 horas (4,3 U/mL) e sua atividade ótima foi em pH neutro a levemente alcalino, o clone P1C4 demonstrou a maior produção a 70ºC (6,93 U/mL), já os clones P5C4 e P6C12 demonstraram a maior termoestabilidade a 80°C, tais resultados indicam que o gene de alfa-amilase clonado deve ser codificador de uma enzima termoestável, como por exemplo, a enzima produzida por Bacillus liqueniformis. Já o clone P3A3 produziu 26,3 U/mL de proteases em 10 horas de produção, sua atividade ótima foi em pH neutro, sendo sua temperatura ótima em 30ºC (56,0 U/mL) e sua termoestabilidade foi demonstrada em 50ºC (22,0 U/mL). Estas características contribuem para a aplicação destas enzimas em setores industriais como na produção de alimentos, indústria química e produção de detergentes. As enzimas isoladas neste trabalho demonstraram características e atuações novas quando comparadas a enzimas descritas atualmente, a qual comprova a eficiência da construção de bibliotecas metagenômicas para o isolamento de novos bioprodutos.