SANTOS, E. A. Policetídeos citotóxicos da esponja marinha Plakortis angulospiculatus. 2016. 115 f. Tese (Doutorado em Farmacologia) - Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2016. / Submitted by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2016-10-26T17:33:17Z No. of bitstreams: 1 2016_tese_easantos.pdf: 6351038 bytes, checksum: d89c4ed6498cffbc1b919c4e8c3fb9a7 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2016-10-26T17:33:26Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_tese_easantos.pdf: 6351038 bytes, checksum: d89c4ed6498cffbc1b919c4e8c3fb9a7 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-26T17:33:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_tese_easantos.pdf: 6351038 bytes, checksum: d89c4ed6498cffbc1b919c4e8c3fb9a7 (MD5) Previous issue date: 2016-07-19 / As part of a bioprospecting study to identify compounds from marine organisms with anticancer potencial compounds from the brazilian coast, we investigated the cytotoxicity of an ethanolic extract derived from the marine sponge Plakortis angulospiculatus, widely known as a source of cyclic endoperoxides with various pharmacological activities, including cytotoxic. The bioguided fractionation of the extract led to the isolation of 4 polyketides with a dihydrofuran ring (3, 4, 5, 6), 5- (1) and 6- membered cyclic endoperoxides (2, 7-10), including three new plakortides, 7,8-dihydroplakortide E (1), 2 and 10, and known compounds such as spongosoritin A (5), plakortide P (9). To compare the cytotoxicity of both groups in human tumor cells of colon (HCT-116), prostate (PC-3M) and non-tumor (MRC-5) by the MTT assay, we observed different activity profiles, as compounds that contained a dihydrofuran ring were generally less activeand displayed a time-dependent activity. Six membered cyclic plakortides, on the other hand, exhibited greater cytotoxicity and time-independent effect. The modes underlying the cytotoxic actions of 2, 3, 5, 7, and 9 were further investigated using HCT-116 cells. Flow cytometry studies demonstrated cell density reduction accompanied by a reduction in membrane integrity at higher concentrations, with the exception of 2. Further inspection through cell cycle analyses indicated that 3 and 5 induced blockage at G0/G1. To the contrary, 2, 7 and 9 delivered a G2/M arrest and presence of mitotic figures, however this effect was independent of microtubule polymerization, as demonstrated by confocal microscopy. The evaluation of plakortides 2 and 9 on breast cancer cell line (MCF-7) revealed no changes on cell cycle, but increased DNA fragmentation, indicating cell death by apoptosis. Using the trypan blue assay, we verified a synergistic effect between plakortide P (9) and cyclosporin A, a calcineurin inhibitor, which induced a decrease of over 80% in viability of HCT-116 cells when compared to cells treated only with plakortide P (9) or cyclosporin A, which suggests the involvement of calcium-dependent pathways in the effect presented by plakortide P. / Como parte do estudo de bioprospecção para a identificação de compostos com potencial anticâncer de organismos da costa brasileira, investigamos a citotoxicidade do extrato etanólico da esponja marinha Plakortis angulospiculatus, reconhecida como fonte de endoperóxidos cíclicos com várias atividades farmacológicas, inclusive citotóxica. O fracionamento bioguiado do extrato levou ao isolamento de 4 policetídeos com anel dihidrofurano (3, 4, 5, 6), endoperóxidos cíclicos de 5 (1) e 6 membros (2, 7, 9, 10), incluindo 3 plakortídeos inéditos, 7,8-dihidroplakortídeo E (1), 2 e 10, além dos conhecidos, espongosoritina A (5), plakortídeo P (9) e derivados. Ao compararmos a citotoxicidade dos dois grupos de compostos em células tumorais humanas de cólon (HCT-116) e próstata (PC-3M), e não tumoral (MRC-5) pelo ensaio do MTT, observamos perfis diferentes de atividade, onde compostos com anel dihidrofurano foram, em geral, menos ativos, e exibiram citotoxicidade tempo-dependente, enquanto os plakortídeos com anéis de 6 membros exibiram maior citotoxicidade e efeito independente do tempo de incubação. Os mecanismos de ação citotóxicas dos compostos 2, 3, 5, 7 e 9 foram investigados usando células HCT-116. Estudos com citometria de fluxo indicaram redução da densidade celular acompanhado de redução de células com membrana íntegra nas maiores concentrações testadas, com exceção do composto 2. Análises do ciclo celular indicaram que 3 e 5 induziram bloqueio de G0/G1, enquanto 2, 7 e 9 causaram bloqueio na fase G2/M, com presença de figuras mitóticas e efeito independente da polimerização de microtúbulos, demonstrada por microscopia confocal. A avaliação de 2 e 9 em linhagem tumoral de mama (MCF-7) não revelou mudanças no ciclo celular, porém, aumentou a fragmentação de DNA, um indicativo de morte celular por apoptose. Através do teste de azul de tripan, verificamos um sinergismo entre plakortídeo P (9) e ciclosporina A, um inibidor da enzima calcineurina, demonstrado pela diminuição de mais de 80% da viabilidade das células HCT-116, quando comparado às células tratadas somente com plakortídeo P (9) ou com ciclosporina A, indicando um possível envolvimento de vias de sinalização dependentes de cálcio no efeito exercido pelo plakortídeo P.

A presente dissertação descreve o isolamento e elucidação estrutural de alguns constituíntes químicos do tegumento de V. elongata, espécie envolvida em usos etnofarmacológicos. 0 extrato clorofórmico forneceu além de ésteres alifáticos e triglicerídeos dois policetídeos do tipo diarilalcanoílicos: 1-(2\',6\'- Dihidroxi-4\'-metoxifeni1)-12-fenil-dodecan-1-ona (inédito) e 1-(2\',4\',6\'- Trihidroxi-3\',4\'-dihidrofeni1)-11-fenil-undecan-1-ona (conhecido) ; três lignanas furofufurânicas: (1R,2S,5R,6R)-6-(3\',4\'-Dimetoxifeni1)-2-(3\",4\"-metilenodioxifeni1)-3,7-dioxabiciclo‌3.3.0‌ octano (fargesina); (1R,2S,5R,6R)-2,6-Bis-(3\",4\" -dimetoxifeni1)-3,7-dioxabiciclo- ‌3.3.0‌ octano (epieudesmina) e (1R,2S,5R,6S)-2,6-Bis-(3\",4\" -dimetoxifenil)-3,7-dioxabiciclo ‌3.3.0‌ octano (eudesmina); e duas neolignanas tetraidrofurânicas: (1S,2S,5R,6R)-1-Metil - 2-(3\",4\"-metilenodioxifeni1)-5-(α-hidroxi-3\" 1,4\'\"-dimetoxibenzil)-tetraidrofurano (inédita) e (15,2S,5R,6R)-1-Metil-2-(3\",4\"-dimetoxifeni1)-5-(α-hidroxi-3\'\",4\'\"-dimetoxibenzil)-tetraidrofurano (magnostelina A). 0 isolamento dos constituíntes químicos foi baseada em técnicas cromatográficas e a elucidação estrutural em métodos espectrométricos usuais (UV, IV, DRO, RMN de 1H e de 13C). A comprovação da estrutura do policetídeo Ve-6 foi baseada na aromatização por desidratação em meio ácido. A determinação da configuração relativa das neolignanas tetreidrofurânicas foi baseada em estudo envolvendo o reagente de deslocamento Eu(fod)3. A determinação da configuração absoluta foi baseada na conversão em uma neolignana tetralínica e comparação de sua curva de DRO com compostos modêlos. / The present dissertation describe isolation and structural elucidation of some chemicals constituents of tegument from V. elongata, involved in ethnopharmacology uses. The chloroform extract afford besides aliphatics esthers and triglycerides, two poliketides of the diarylalkanoyl type: 1-(2\',6\'-Dihydroxypheny1)-12-dodecan-l-one and 1-(2\',4\',6\'-Trihydroxy-3\',5\'-dihydropheny1)-11-phenyl-undecan-1-one, the former is unknown and the latter is known; three furofuranic lignans type: (1R, 2S, 5R, 6R) -6- (3\',4\'-Dimethoxypheny1)-2-(3\",4\" -methylenedioxypheny1)-3,7-dioxabicycle‌3.3.0‌ octane (fargesin); (1R,2S,5R,6R)-2,6-Bis-(3\",4\"-dimethoxypheny1)-3,7-dioxabicycle‌3.3.0‌octane (epieudesmin) and (1R,2S,5R,6S)-2,6-Bis-(3\",4\" -dimethoxypheny1)-3,7-dioxabicycle‌3.3.0‌ octane (eudesmin); and two neolignans of the tetrahydrofuranic type:(1S,2S,5R,6R)-1-Methy1-2-(3\",4\" -methylenedioxypheny1)-5-(α-hydroxy-3\'\",4\'\" -dimethoxybenzy1)-tetrahydrofuran (unknow) and (1S,2S,5R,6R)-1-Methy1-2-(3\",4\" -dimethoxypheni1)-5-(α-hydroxy-3\'\",4\'\"-dimethoxybenzy1)-tetrahydrofuran (magnostelin A). Isolation of chemical constituents was based on chromatographic techniques and structural determination on usual spectrometric methods (UV, IR, MS, ORD, 1H and 13C NMR). Poliketyde skeleton was elucidated by acid catalized dehydration yielding a diarylic compound. The relative structure of tetrahydrofuranic neolignans was based in lanthanide induced shift reagent. The absolute configuration was based on chemical transformation to tetralinic neolignan and comparison of its ORD curve with model compounds curves.

A presente dissertação descreve o isolamento e elucidação estrutural de alguns constituíntes químicos do tegumento de V. elongata, espécie envolvida em usos etnofarmacológicos. 0 extrato clorofórmico forneceu além de ésteres alifáticos e triglicerídeos dois policetídeos do tipo diarilalcanoílicos: 1-(2\',6\'- Dihidroxi-4\'-metoxifeni1)-12-fenil-dodecan-1-ona (inédito) e 1-(2\',4\',6\'- Trihidroxi-3\',4\'-dihidrofeni1)-11-fenil-undecan-1-ona (conhecido) ; três lignanas furofufurânicas: (1R,2S,5R,6R)-6-(3\',4\'-Dimetoxifeni1)-2-(3\",4\"-metilenodioxifeni1)-3,7-dioxabiciclo‌3.3.0‌ octano (fargesina); (1R,2S,5R,6R)-2,6-Bis-(3\",4\" -dimetoxifeni1)-3,7-dioxabiciclo- ‌3.3.0‌ octano (epieudesmina) e (1R,2S,5R,6S)-2,6-Bis-(3\",4\" -dimetoxifenil)-3,7-dioxabiciclo ‌3.3.0‌ octano (eudesmina); e duas neolignanas tetraidrofurânicas: (1S,2S,5R,6R)-1-Metil - 2-(3\",4\"-metilenodioxifeni1)-5-(α-hidroxi-3\" 1,4\'\"-dimetoxibenzil)-tetraidrofurano (inédita) e (15,2S,5R,6R)-1-Metil-2-(3\",4\"-dimetoxifeni1)-5-(α-hidroxi-3\'\",4\'\"-dimetoxibenzil)-tetraidrofurano (magnostelina A). 0 isolamento dos constituíntes químicos foi baseada em técnicas cromatográficas e a elucidação estrutural em métodos espectrométricos usuais (UV, IV, DRO, RMN de 1H e de 13C). A comprovação da estrutura do policetídeo Ve-6 foi baseada na aromatização por desidratação em meio ácido. A determinação da configuração relativa das neolignanas tetreidrofurânicas foi baseada em estudo envolvendo o reagente de deslocamento Eu(fod)3. A determinação da configuração absoluta foi baseada na conversão em uma neolignana tetralínica e comparação de sua curva de DRO com compostos modêlos. / The present dissertation describe isolation and structural elucidation of some chemicals constituents of tegument from V. elongata, involved in ethnopharmacology uses. The chloroform extract afford besides aliphatics esthers and triglycerides, two poliketides of the diarylalkanoyl type: 1-(2\',6\'-Dihydroxypheny1)-12-dodecan-l-one and 1-(2\',4\',6\'-Trihydroxy-3\',5\'-dihydropheny1)-11-phenyl-undecan-1-one, the former is unknown and the latter is known; three furofuranic lignans type: (1R, 2S, 5R, 6R) -6- (3\',4\'-Dimethoxypheny1)-2-(3\",4\" -methylenedioxypheny1)-3,7-dioxabicycle‌3.3.0‌ octane (fargesin); (1R,2S,5R,6R)-2,6-Bis-(3\",4\"-dimethoxypheny1)-3,7-dioxabicycle‌3.3.0‌octane (epieudesmin) and (1R,2S,5R,6S)-2,6-Bis-(3\",4\" -dimethoxypheny1)-3,7-dioxabicycle‌3.3.0‌ octane (eudesmin); and two neolignans of the tetrahydrofuranic type:(1S,2S,5R,6R)-1-Methy1-2-(3\",4\" -methylenedioxypheny1)-5-(α-hydroxy-3\'\",4\'\" -dimethoxybenzy1)-tetrahydrofuran (unknow) and (1S,2S,5R,6R)-1-Methy1-2-(3\",4\" -dimethoxypheni1)-5-(α-hydroxy-3\'\",4\'\"-dimethoxybenzy1)-tetrahydrofuran (magnostelin A). Isolation of chemical constituents was based on chromatographic techniques and structural determination on usual spectrometric methods (UV, IR, MS, ORD, 1H and 13C NMR). Poliketyde skeleton was elucidated by acid catalized dehydration yielding a diarylic compound. The relative structure of tetrahydrofuranic neolignans was based in lanthanide induced shift reagent. The absolute configuration was based on chemical transformation to tetralinic neolignan and comparison of its ORD curve with model compounds curves.

Orientadores: Luiz Carlos Dias, Jean-Marc Campagne / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química / Made available in DSpace on 2018-08-26T12:59:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Sant'ana_DaniloPereirade_D.pdf: 12186591 bytes, checksum: 82263f5c920d42c10acf04cf823af93f (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: SÍNTESE DO FRAGMENTO C1-C9 DA (-)-DICTIOSTATINA: A (-)-dictiostatina é uma macrolactona de origem marinha que apresenta uma potente atividade antitumoral, inibindo a proliferação de células cancerígenas em concentrações na ordem de nanomolar. Propusemos desenvolver uma nova rota sintética para o fragmento C1-C9 deste produto natural. Conseguimos sintetizar o fragmento C1-C9 da (-)-dictiostatina em 15 etapas a partir do 1,3-propanodiol com 3,57% de rendimento global. Nossa rota sintética utilizou como etapas chaves a epoxidação assimétrica de Sharpless e a abertura de epóxido nas condições de Myashita para formar os centros estereogênicos. Este fragmento compreende os carbonos C1-C9 da (-)-dictiostatina, no qual está contido o dieno 2Z,4E e dois centros estereogênicos (C6R, C7S do produto natural). ESTUDOS VISANDO A SÍNTESE TOTAL DA (+)-TAUTOMICETINA: A (+)-tautomicetina é um policetídeo natural isolado em 1989 a partir de Streptomyces griseochromogenes como um antifúngico. Atualmente, TTN é mais conhecida pela sua atividade em proteínas serina/treonina fosfatases. Propusemos desenvolver uma rota sintética convergente para este produto natural. Conseguimos sintetizar dois fragmentos da tautomicetina, sendo o fragmento B2 correspondendo a parte C1-C12 e o composto 260 que consiste na parte C7¿-C13 da (+)-tautomiceina. A síntese do fragmento B2 teve como etapa chave a abertura estereosseletiva de epóxido quiral, o que consiste uma estratégia inédita para construir a parte desoxipropionato da TTN. A síntese do composto 260 teve como etapa chave, uma metodologia inédita de bis-esterificação de anidridos desenvolvida em nosso grupo de pesquisa / Abstract: SYNTHESIS OF THE C1-C9 FRAGMENT OF (-)-DICTYOSTATIN: (-)-Dictyostatin is a marine macrolactone with potent antitumor activity. Herein, we report the development of a new synthetic route for the C1-C9 fragment of this natural product. The C1-C9 fragment of (-)-dictyostatin was synthesized in 15 steps and 3.57% overall yield from 1,3-propanediol. Our synthetic route employed Sharpless asymmetric epoxidation and epoxide opening under Myashita's conditions as key steps to form the stereogenic centers. The C1-C9 fragment contains the 2Z,4E diene and two stereogenic centers (C6R, C7S) contained in the natural product. STUDIES TOWARD THE TOTAL SYNTHESIS OF (+)-TAUTOMYCETIN: (+)-Tautomycetin is a polyketide natural product isolated in 1989 from Streptomyces griseochromogenes with antifungal activity. Currently, TTN is best known for its activity in serine/threonine phosphatase proteins. We developed a convergent synthetic route to this natural product. Two key fragments of (+)-tautomycetin were synthesized, the B2 fragment containing the C1-C12 chain and the compound 260, corresponding to the C7'-C13 fragment of (+)-tautomycetin. The synthesis of fragment B2 employed a stereoselective chiral epoxide opening reaction as a key step, which consist of a novel strategy to prepare the desoxypropionate moiety of TTN. The synthesis of 260 employed a novel method for bis-esterification of anhydrides developed in the Dias-Campagne groups / Doutorado / Quimica Organica / Doutor em Ciências

Árvores evolutivas de espécies de Peperomia baseadas nas regiões de ITS e matK foram confrontadas com perfis metabólicos de extratos brutos obtidos por RMN 1H, HPLC-DAD e LC-ESI-MS. A análise de clusters (HCA) e a análise discriminante de componentes principais (DAPC) suportaram em parte os agrupamentos observados por ITS e matK. As principais classes de metabólicos secundários observadas foram policetídeos, meroterpenos, cromenos, fenilpropanoides e amidas, sendo que foram ainda isolados um policetídeo (malabaricona D) de P. megapotamica; o fenilpropanoide elemicina e a lignana tetraidrofurânica diyangambina de P. rotundifolia; e as flavonas 5,6,7-trimetoxiflavona e 4\',5,6,7- tetrametoxiflavona de P. sincorana. As PKS tipo chalcona sintase (CHS) de peperomias, diferiram daquelas de famílias filogeneticamente próximas como Myristicaceae (Virola) e Lauraceae (Aniba). Como muitos meroterpenos de espécies de Peperomia possuem como núcleo básico o ácido orselínico, produto típico de líquens e bactérias, o gene ácido orselínico sintase (OSAS) foi investigado nas plantas e nos 27 fungos endofíticos isolados de espécies de Peperomia (identificados pelas sequências de ITS1-5.8S-ITS2). Foram amplificadas pelo menos uma PKS (NR, HR e PR) em cada uma das linhagens e AOS em várias delas (UR1, UC3, UF1, UF2, UF3, UF4, GC3, NR1, NC1, NC2, NF1, AR1, AC1, AC4, OC1 e OF1). A homologia de 60% da OSAS amplificada de UR1 com a sequência de Streptomyces viridochromogenes é sugestivo de transferência horizontal de bactéria para fungos. / Phylogenetic tree of Peperomia species based on ITS and matK were compared to the metabolic profiling of crude extracts using 1H NMR, HPLC-DAD and LC-ESI-MS. Cluster analysis (HCA) and discriminant analysis of principal componentes (DAPC) supported significantly the clustering observed by ITS and matK. The major classes of secondary metabolites were polyketides, meroterpenes, chromenes, phenylpropanoids and amides and besides, one polyketide (malabaricone D) of P. megapotamica; the phenylpropanoid elemicin and the tetrahydrofuran lignan diyangambin from P. rotundifolia; and the flavones 5,6,7- trimethoxyflavone and 4\',5,6,7-tetramethoxyflavone were isolated from P. sincorana. The PKS chalcone synthase type (CHS) from peperomia, differed from phylogenetically related families Myristicaceae (Virola) and Lauraceae (Aniba). Since several meroterpenes from Peperomia species have the orsellinic acid as an aromatic core, typical of liquens and bacteria, the orsellinic acid (OSAS) was investigate in the plants and 27 endophytes isolated from Peperomia (identified based on ITS1-5.8S-ITS2 sequences). At least one PKS (NR, HR and PR) were isolated from each strains and AOS were isolated from several strains (UR1, UC3, UF1, UF2, UF3, UF4, GC3, NR1, NC1, NC2, NF1, AR1, AC1, AC4, OC1 and OF1). The 60% of homology observed for OSAS amplified from UR1 with that of Streptomyces viridochromogenes is suggestive of a horizontal transferring from bacteria to fungi.

O espaço intergênico (IGS) juntamente com suas subunidades flanqueadoras (cpcB) e (cpcA) do operon do ficocianina foi usado para identificar linhagens de cianobactérias. Dentro do domínio Bacteria somente as cianobactérias possuem o operon da ficocianina e a região cpcBA-IGS é suficientemente variável para diferenciar linhagens desses microrganismos. No presente estudo 25 linhagens de cianobactérias isoladas de diversos locais brasileiros foram caracterizadas usando a seqüência cpcBA-IGS. DNA genômico foi extraído das ordens Chroococcales (oito linhagens), Oscillatoriales (duas linhagens), Nostocales (onze linhagens) e Stigonematales (quatro linhagens). Os oligonucleotídeos iniciadores PCβF/PCαR, específicos para a seqüência cpcBA-IGS, foram usados para amplificar fragmentos de DNA de aproximadamente 685 pb. Os produtos da PCR foram clonados, seqüenciados e as seqüências foram comparadas pela análise BLAST. Todas as seqüências de Microcystis e também as seqüências de Radiocystis fernadoi SPC736, Planktothrix mougeotii SPC788, Geitlerinema splendidum SPC923, Microchaete investiens CENA64 e Gloeotrichia UFV-B2 mostraram identidades com seqüências do GenBank. Entretanto, nenhuma identidade foi encontrada para as seqüências restantes. As relações filogenéticas das seqüências de cpcBA-IGS foram investigadas junto com outras seqüências de cianobactéria do Genbank usando a análise “Neighbour Joining". A topologia da árvore foi congruente com outras árvores de cianobactérias, com exceção de todas as seqüências sem identidades no GenBank, as quais formaram um agrupamento separado. Os dados das seqüências de cpcBA-IGS analisadas confirmam que as cianobactéria heterocitadas formam um grupo monofilético. Estudos anteriores realizados com linhagens de cianobactéria mostraram que estes microrganismos são uma fonte rica de produtos naturais. No presente estudo conduzido com 59 linhagens de cianobactérias, sendo a maioria isolada de ambientes brasileiros, isto foi confirmado. Para alcançar esse objetivo, dois conjuntos de iniciadores degenerados foram usados para produzir seqüências amplificadas por PCR das sintetases de peptídeos não-ribossômicos (NRPSs), e de sintases policetídeos (PKSs) modulares, as quais são enzimas multifuncionais envolvidas na produção de produtos naturais. O sistema híbrido NRPS/PKS também foi amplificado por PCR usando uma combinação de iniciadores de NRPS e de PKS. Essa abordagem molecular mostrou a presença de genes de NRPS e de PKS em 93% e 81% linhagens de cianobactérias, respectivamente. Genes de NRPS/PKS foram encontrados em 87% das cianobactérias examinadas. Numa tentativa de atribuir funções a oito fragmentos de PKS identificados por PCR, estas seqüências foram clonadas, seqüenciadas e analisadas filogeneticamente. As seqüências de PKSs da Microcystis aeruginosa NPCD1 e Fischerella CENA62 mostraram correlação com a síntese de sideróforo e de microcistina, respectivamente. Todas as 59 linhagens foram analisadas para a produção do microcistinas e 20 linhagens apresentaram resultados positivos. Para a maioria das linhagens potencialmente produtoras de microcistinas os produtos de PCR esperados de NRPS, PKS e NRPS/PKS foram amplificados. A produção de sideróforos foi testada em 28 linhagens e somente cinco produziram resultados positivos. Em três linhagens produtoras de sideróforos todos os três sistemas moleculares analisados estavam presentes. Estes resultados serão altamente valiosos na exploração futura de cada peptídeo dessas cianobactérias e para a elucidação da bioatividade de tais produtos naturais. / The intergenic spacer (IGS) together with its flanking subunits  (cpcB) and  (cpcA) of the phycocyanin operon has been used to identify cyanobacterial strains. Within the Bacteria domain only cyanobacteria present phycocyanin operon and the cpcBA-IGS region is variable enough to differentiate strains of these microorganisms. In the present study 25 cyanobacterial strains isolated from several Brazilian locations were characterized using the cpcBA-IGS sequence. Genomic DNA was extracted from the orders Chroococcales (eight strains), Oscillatoriales (two strains), Nostocales (eleven strains) and Stigonematales (four strains). The primers PCβF/PCαR targeting the cpcBA-IGS sequence were used to amplify DNA fragments of approximately 685 bp. The PCR products were cloned, sequenced and the sequences were compared by BLAST analysis. All Microcystis sequences and also sequences from Radiocystis fernadoi SPC736, Planktothrix mougeotii SPC788, Geitlerinema splendidum SPC923, Microchaete investiens CENA64 and Gloeotrichia UFV-B2 showed identities with sequences from GenBank. However, no identities were found for the remaining sequences. Phylogenetic relationships of the cpcBA-IGS sequences were investigated together with other cyanobacterial sequences from Genbank using the Neighbour Joining analysis. The tree topology was congruent with previous cyanobacterial trees, except for all sequences with no identities in the GenBank, which formed a separated cluster. The cpcBA-IGS sequences analysis data confirm that heterocyte-forming cyanobacteria are a monophyletic group. Previous studies carried out with cyanobacterial strains showed that these microorganisms are a rich source of natural products. This has been confirmed in the present study conducted with 59 cyanobacterial strains, with the majority of them isolated from Brazilian environment. To reach this goal, two sets of degenerate primers were used to generate PCR amplification sequences of nonribosomal peptide synthetases (NRPSs) and modular polyketide synthases (PKSs), which are multifunctional enzymes implicated in natural products production. Also, NRPS/PKS hybrid system was PCR amplified by using a combination of NRPS and PKS primers. This molecular approach revealed the presence of NRPS and PKS genes in 93% and 81% cyanobacterial strains, respectively. NRPS/PKS genes were found in 87% of cyanobacteria examined. In an attempt to attribute functions to eight PCR identified PKS fragments, these sequences were cloned, sequenced and phylogenetically analyzed. PKSs sequences of Microcystis aeruginosa NPCD1 and Fischerella CENA62 showed correlation with the synthesis of siderophore and microcystin, respectively. All 59 strains were analyzed for microcystin production and 20 strains presented positive results. For the majority of potentially producing-microcystin strains expected PCR products of NRPS, PKS and NRPS/PKS were amplified. The siderophores production was tested in 28 strains and only five gave positive results. In three producing-siderophore strains all three molecular systems analyzed were present. These results will be highly valuable for further exploring each of these cyanobacterial peptides and for elucidating the bioactivity of such natural products.

Este trabalho descreve os isolamentos e as determinações estruturais dos metabólitos secundários das diferentes partes dos frutos (pericarpos, arilos, tegumentos e amêndoas) de Virola elongata. 0 material foi coletado em Humaitá (AM) e no Km 96 da Rodovia Santarém-Cuiabá (PA). Os constituíntes químicos foram isolados por cromatografias de adsorção e tiveram suas estruturas identificadas ou determinadas por técnicas espectrométricas usuais (IV, UV, RMN e EM). As configurações absolutas dos metabólitos foram deduzidas a partir de medidas espectropolarimétricas, ou auxiliadas pela obtenção de derivados mais informativos. As substâncias foram agrupadas nas seguintes subclasses: lignanas furofurânicas [(+)-sesamina (LF-1), (+)-epifargesina (LF-2), (+)-eudesmina (LF-3), (+)-fargesina (LF-4), (+)-filigenina (LF-5) e (+)-epieudesmina (LF-6)]; lignanas tetraidrofurânicas [(+)-magnostelina-A (LT-1), (+)-magnostelina-C (LT-2), (±)-4\'-metil-5\'-metoxi-lariciresinol (LT-3), (±)-4,4\'-dimetil-5\'- metoxi-lariciresinol (LT-4) e (±)-4-4\'-dimetil-5\'-hidroxi-5-metoxi-lariciresinol (LT-5)]; Lignana diarilbutanólica [(-)-4,4\'-dimetil-5-metoxi-secolariciresinol (LD-1)]; e lignanas dibenzilbutirolactâmicas [(-)-hinokinina (DB-1), (-)-kusunokinina (DB-2), (-)-dimetilmatairesinol (DB-3), (-)-metiltujaplicatina (DB-4), (-)-dimetil-5-hidroximatairesinol (DB-5) e (-)-dimetil-5-metoxi-matairesinol (DB-6)]; neolignanas diarilbutânicas [ND-1, ND-2 e ND-3], neolignana ariltetralínica: galbulina (NA-1) e neolignanas ariltetralônicas [(-) e (+)-oxoisogalcatina (NA-2), (+)-hidroxi-isogalcatina (NA-3), diidroxi-oxoisogalcatinas epiméricas inéditas (NA-4 e NA-5), NA-6, NA-7, (+)-otobanona (NA-8), hidroxi-otobanonas epiméricas (NA-9 e NA-10)]; neolignanas secoariltetralínicas (ND-5 e seu acetato ND-6]; uma neolignana dimérica [NA-11] e ainda diversos policetídeos acilresorcinólicos e acifloroglucinôlicos [AR-1 a AR-8]. 0 padrão 3,4-dioxigenado nos anéis aromáticos é predominante na maioria dos lignóides isolados. 0 padrão 3,4,5-trioxigenado observado nos anéis aromáticos de lignanas dibenzilbutirolactônicas (DB-4 e DB-5), diarilbutanólica (LD-1) e tetraidrofurânicas (LT-3, LT-4 e LT-5) e, o padrão 2,4,5-trioxigenado observado para neolionanas ariltetralônicas (NA-6, NA-7), conferem para algumas o caráter inédito. A maior variação no padrão de substituição de esqueletos foi observada para neolignanas ariltetralônicas, o que motivou a elaboração de experimentos especíificos em RMN- 1H (ENO e uso de reagente de deslocamento) associados a análise dos dados de RMN- 13C para proposições de constituições e de configurações relativas. Foi constatada a presença das neolionanas NA-2, NA-9 e NA-10 nos extratos dos tegumentos e de seus enantiômeros nos extratos das amêndoas de V. elongata (PA). Algumas classes de substâncias isoladas foram correlacionadas biossinteticamente a partir de suas configurações absolutas. A quantificação aproximada das substâncias identificadas foi efetuada, através das quantidades isoladas e análises de espectros de RMN-1H de frações impuras. Nos pericarpos e arilos foi constatada a presença exclusiva e alternada de lignanas furofurâanicas e lignanas dibenzilbutirolactônicas entre os frutos de diferentes localidades. Essas lignanas, também presentes nos tegumentos, ocorrem em maior teor com maior diversidade de substituição nos anéis aromáticos, mas são completamente ausentes nos extratos das amêndoas, onde o perfil é baseado na presença de neolignanas ariltetralônicas e policetídeos. Os policetídeos com anéis aromáticos di- e triidroxilados foram isolados, principalmente, dos tegumentos e amêndoas. A análise do extrato de uma das amêndoas foi baseada na análise conjunta do espectro de RMN-1H, dos cromatogramas em camada delgada e dos dados obtidos por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas. A metodologia foi tentativamente aplicada á análise das diversas partes dos frutos de V. sebifera coletada em Roraima. Os dados obtidos sobre as estruturas e distribuição dos metabólitos são confrontados com os descritos na literatura para espécies taxonomicamente afins. / This work describes isolations and structural determinations of secondary metabolites in parts of fruits (pericarps, arils, teguments and kernels) from Virola elongata. Material was collected in Humaita (AM) and Km 96 of Santarém-Cuiabá Road (PA). The chemical constituents were isolated by chromatographic processes and their structures identified or elucidated by usual spectrometric techniques (IR, UV, NMR, and MS). Absolute configuration were deduced through spectropolarimetric measures, or based on data from derivatives. The compounds were classified in the following classes: furofuran lignans [(+)-sesamin (LF-1), (+)-epifargesin (LF-2), (+)-eudesmin (LF-3), (+)- fargesin (LF-4), (+)-phylligenin (LF-5) and (+)-epieudesmin (LF-6)]; tetrahydrofuran lignans [(+)-magnostelin-A (LT-1), (+)-magnostelin-C (LT-2), (±)-5\'-methox y -4\'-methyl-lariciresinol (LT-3), (±)-5\'-methoxy-4,4\'-dimethyl-lariciresinol (LT-4) and (±)-5\'-hydroxy-5-methoxy-4,4\'-dimethvl-lariciresinol (LT-5)]; diarylbutanol lignan [(-)-4,4\'-dimethvl-5-methoxy-secolariciresinol (LD-1)]; and dibenzylbutyrolactone lignans [(-)-hinokinin (DB-1), (-)-kusunokinin (DB-2), (-)-dimethylmatairesinol (DB-3), (-)-methylthujaplicatin (DB-4)]; diarylbutane neolignans (ND-1, ND-2 and ND-3); aryltetralin neolignans [galbulin (NA-1) and aryltetralone neolignans [(-)- and (+)-oxoisogalcatin (NA-2), (+)-hydroxyisogalcatin (NA-3), unpublished epimeric dihydroxy-isogalcatins (NA-4 and NA-5), (+)-otobanone (NA-8), epimeric hydroxy-otobanones (NA-9 and NA-10)]; secoaryltetralin neolignans [ND-5 and its acetate (NA-6).1; dimeric neolignan (NA-11) and several acylresorcinol and acylphloroglucinol polyketides (AR-1 to AR-8). The 3,4-dioxygenated pattern was observed in aromatic rings of the majority isolated lignans. The 3,4,5-trioxygenated pattern observed in dibenz y lbutyrolactone lignans (DB-4 e DB-5), diarylbutanol (LD-1), and tetrahydrofuran lignans (LT-3, LT-4, LT-5), and the 2,4,5-pattern observed in aryltetralone neolignans, confer to some of them the unusual character. The main variation in the substitution pattern was observed in aryltetralone neolignans, which needed more detailed study involving 1H-NMR experiments (NOE and LIS reagent) and refined analysis of 13C-NMR data. It was observed the presence of NA-2, NA-9 and NA-10 neolignans in teguments and its enantiomers in kernels of fruits from Virola elongata (PA). The biosynthetic relationships among several classes of lignoids are discussed under their absolute configurations. The near concentration of identified compounds was obtained from isolated quantities and analysis of 1H-NMR spectra of mixtures. In pericarps and arils was determined the exclusive and alternated presence of furofuran and dibenzylbutyrolactone lignans between fruits from different localities. These last two subclasses, also present in teguments, occur in higher concentrations and substitution diversifications in aromatic rings, but are completely absent in kernels whose profile is based on the presence of aryltetralone lignans. The poliketide with di- and trihydroxylated aromatic rings were isolated mainly from teguments and kernels. The analysis from kernels extract was performed by combined analysis involving 1H-NMR spectra, thin layer chromatography, and gas chromatography coupled to mass spectrometry. This methodology was tested to analyse the parts of fruits from Virola sebifera collected in Roraima. The obtained informations about structures of metabolites and their distributions in fruits was compared with those data described for taxonomically closed species.

O estudo fitoquímico de Peperomia oreophila revelou a presençca de duas lignanas furofurânicas (7R, 8R, 7R, 8R)-3,4,5-trimetóxi-3,4-metilenodioxi-5-metóxi- 8.8,7.O.9,7.O.9-lignana (1), (7R, 8R, 7R, 8R)-3,4,5-trimetóxi-3,4,5-trimetóxi- 8.8,7.O.9,7.O.9-lignana (2); as duas amidas (2E)-N-isobutil-3-(5-metóxi-7,8- benzodioxol-1-il)acrilamida (3), (2E)-N-isobutil-3-(3,4,5-trimetóxifenil)acrilamida (4), três derivados de acido cinâmico (2E)-3-(3,4,5-trimetóxifenil)acrilato de metila (5), (2Z)-3- (3,4,5-trimetóxifenil)acrilato de metila (6), (2E)-3-(5-metóxi-7,8-benzodioxol-1-il)acrilato de metila (7); os dois policetídeos fenólicos [(2E)-3,7-dimetilocta-2,6-dien-1-il]-5- metil-2-(3-metilbut-2-en-1-il)benzeno-1,3-diol (8) (inédita) e [(2E)-3,7-dimetilocta- 2,6-dien-1-il]-2,2,7-trimetil-2H-cromen-5-ol (9); de P. arifolia: o policetídeo fenólico [(2E)-3,7-dimetilocta-2,6-dien-1-il]-5-metil-2-(3-metilbut-2-en-1-il) benzeno-1,3-diol, isolada também de P. oreophila (10) (inédita); de P. urocarpa: o policetídeo fenólico 5- metil-2-[(2E,6E)-3,7,11-trimetildodeca-2,6,10-trien-1-il] benzeno-1,3-diol (11) e o ácido 2,4-dihidróxi-6-metil-3-[(2E,6E)-3,7,11-trimetildodeca-2,6,10-trien-1-il] benzóico, (12); de P. nitida: o fenilpropanoide apiol (1-alil-3,6-dimetóxi-10,11- benzodioxol) (13), os cromenos 7-hidróxi-2,2,5-trimetil-2H-cromeno-carboxilato de metila (14) e o 7-metóxi-2,2,5-dimetil-2H-cromeno-6-carboxilato de metila (15). O policetídeo 2-hidróxi-4,6-dimetóxiacetofenona, principal metabólito das folhas de P. glabella, teve sua biossíntese investigada utilizando-se como precursores o acetil-CoA e o malonil-CoA. Foram realizados estudos de otimização da atividade de policetídeo sintase (PKS) em função do pH, tempo de reação, temperatura e saturação de substratos, além de estudos da variação circadiana. Estudos de genes de PKS resultaram em amplificações cujo seqüenciamento poderá determinar a identidade dessas regiões e homologia entre as seqüências dessas Peperomias e a região KS do gene AviM de Streptomyces viridochromogenes que expressa o ácido orselínico / The phytochemical investigation carried out on Peperomia oreophila revealed the accumulation of two furofuran lignans (7R,8R,7R,8R)-3,4,5-trimethoxy-3,4- methylenedioxy-8.8, 7.O.9, 9.O.7-lignan (1), (7, 8R, 7R, 8)-3,4,5-trimethoxy-3,4,5- trimethoxy-8.8-7.O.9, 9.O.7-lignan (2); two amides (2´E)-N-isobutyl-3´-(5-methoxy-7,8- benzodioxol-1-yl) acrylamide (3), (2E)-N-isobutyl-3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)acrylamide (4), three derivate cinâmic acid methyl (2E)-3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)acrylate (5), methyl (2Z)-3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)acrylate (6), methyl (2E)-3-(5-methoxy-7,8- benzodioxol-1-yl)acrylate (7); two phenolic polyketides [(2E)-3,7-dimethylocta-2,6- dien-1-yl]-5-methyl-2-(3-methylbut-2-en-1-yl)benzene-1,3-diol (8) (novel), [(2´E)-3´,7´- dimethylocta-2´,6´-dien-1-yl]-2,2,7-trimethyl-2H-chromen-5-ol (9); P. arifolia, two phenolic polyketide [(2E)-3,7-dimethylocta-2,6-dien-1-yl]-5-methyl-2-(3-methylbut-2- en-1-yl)benzene-1,3-diol, also isolated from P. oreophila (10) (novel); P. urocarpa, the two phenolic polyketides 5-methyl-2-[(2E,6E)-3,7,11-trimethyldodeca-2,6,10-trien-1- yl]benzene-1,3-diol (11) and 2,4-dihydroxy-6-methyl-3-[(2E,6E)-3,7,11-trimethyldodeca- 2,6,10-trien-1-yl]benzoic acid (12); P. nitida, the phenylpropanoid apiole 1-allyl-3,6- dimethoxy-10,11-benzodioxole (13); the chromenes methyl 7-hydroxy-2,2,5-trimethyl- 2H-chromene-6-carboxylate (14) and methyl 7-methoxy-2,2,5-trimethyl-2H-chromene-6- carboxylate (15). The polyketide 2-hydroxy-4,6-dimethoxyacetophenone, the major compound in P. glabella leaves, had its biosynthetic origin investigated using acetyl-CoA and malonyl-CoA as precursors. The enzymatic activity of polyketide synthase was optimized to pH, incubation time, temperatures and substrate saturation, in addition to the analysis of circadian variation activity. The amplifications of putative PKS genes was based on primers from AviM gene of Streptomyces viridochromogenes that express for orsellinic acid. The sequencing will enable the identification of such regions and also to study the homology to fungi PKS

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:23Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-02-28Bitstream added on 2014-06-13T20:47:49Z : No. of bitstreams: 1 schuch_v_me_jabo.pdf: 3089029 bytes, checksum: 0835ef08e49e97cfdf7ad571bdfc3671 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Metabólitos secundários são compostos bioativos, com grande importância para a indústria farmacêutica e agropecuária, produzidos por certos grupos de microrganismos e plantas. Os policetídeos, que são sintetizados por complexos enzimáticos denominados policetídeos sintases (PKSs), desatacam-se entre os metabólitos secundários conhecidos e compõe a estrutura química básica de vários antibióticos. Todos os genes envolvidos na biossíntese de um policetídeo se encontram agrupados fisicamente no cromossomo, e contém genes que são altamente conservados, comumente chamados d~ pks mínima. Os métodos tradicionais para pesquisa de novas drogas, que envolvem o cultivo de microrganismos isolados do solo, não são mais tão promissores, devido à alta taxa de redescoberta de antibióticos já conhecidos, que chega a 99,9%, e à pequena parcela de microrganismos do solo que são cultiváveis pelas técnicas padrões de cultivo, cerca de 1 %. A Metagenômica é uma abordagem promissora que permite acessar o genoma desses organismos incultiváveis, pois consiste na extração de DNA diretamente do ambiente e construção de uma biblioteca com este genoma misto. Neste trabalho descrevemos a construção de uma biblioteca feita com DNA de alto peso molecular isolado diretamente de solo coletado sob arboreto de eucaliptos no Estado de São Paulo, Brasil. A biblioteca possui 9.320 clones e foi construída em vetor cosmídeo, com insertos de tamanho variando entre 30 e 45kb... / Secondary metabolites are bioactive compounds with great importance in the pharmaceutical and agriculture industries, procuced by a few groups of microrganisms and plants. The polyketides that are synthetized by enzimatic complexes, denominated polyketides synthases, outstand among the secondary known metabolites, which are part of the main structure of many antibiotics. Ali genes involved in the biosynthesis of antibiotics are found as clusters in the chromossome. The traditional methods for the research of new drugs that are made from microrganisms cultures isolated from the soil are not so promissing, due to the high rate of rediscorevy of already known species, reaching 99.9%. The other small piece of microrganisms are culturable by standards culture methods, reaching 1 % maximum. Metagenomics is a promissing approach that allows the access to genom of these organisms that are not culturable, as it is carried out by DNA extraction directly from the environment and construction of a mixed genomic library. In this work, we describe the construction of a library made from high molecular weight DNA isolated directly form the soi! undemeath a pinus forest in the State of São Paulo, Brazil. The library shows 9.320 dones and it was constructed in a cosmideo vector, with insert size ranging from 30 to 45 kb. Digestion with difterent restriction enzymes of cosmidial DNA randomly chosen allowed to visualize evident difterences in the restriction fragments among the clones, as does the possibility to determine the average insert size. The initial evaluation of the presence of genes involved in the biosynthesis of antibiotics synthesized by the enzymatic system PKS of kind I, was accomplished by the PCR amplification of clones from the library using specific primers. We studied 4.320 clones and the results suggest a great variety of these genes. The PCR products obtained were sequenced for the determination of identity of the amplified gene.

O estudo fitoquímico de Peperomia oreophila revelou a presençca de duas lignanas furofurânicas (7R, 8R, 7R, 8R)-3,4,5-trimetóxi-3,4-metilenodioxi-5-metóxi- 8.8,7.O.9,7.O.9-lignana (1), (7R, 8R, 7R, 8R)-3,4,5-trimetóxi-3,4,5-trimetóxi- 8.8,7.O.9,7.O.9-lignana (2); as duas amidas (2E)-N-isobutil-3-(5-metóxi-7,8- benzodioxol-1-il)acrilamida (3), (2E)-N-isobutil-3-(3,4,5-trimetóxifenil)acrilamida (4), três derivados de acido cinâmico (2E)-3-(3,4,5-trimetóxifenil)acrilato de metila (5), (2Z)-3- (3,4,5-trimetóxifenil)acrilato de metila (6), (2E)-3-(5-metóxi-7,8-benzodioxol-1-il)acrilato de metila (7); os dois policetídeos fenólicos [(2E)-3,7-dimetilocta-2,6-dien-1-il]-5- metil-2-(3-metilbut-2-en-1-il)benzeno-1,3-diol (8) (inédita) e [(2E)-3,7-dimetilocta- 2,6-dien-1-il]-2,2,7-trimetil-2H-cromen-5-ol (9); de P. arifolia: o policetídeo fenólico [(2E)-3,7-dimetilocta-2,6-dien-1-il]-5-metil-2-(3-metilbut-2-en-1-il) benzeno-1,3-diol, isolada também de P. oreophila (10) (inédita); de P. urocarpa: o policetídeo fenólico 5- metil-2-[(2E,6E)-3,7,11-trimetildodeca-2,6,10-trien-1-il] benzeno-1,3-diol (11) e o ácido 2,4-dihidróxi-6-metil-3-[(2E,6E)-3,7,11-trimetildodeca-2,6,10-trien-1-il] benzóico, (12); de P. nitida: o fenilpropanoide apiol (1-alil-3,6-dimetóxi-10,11- benzodioxol) (13), os cromenos 7-hidróxi-2,2,5-trimetil-2H-cromeno-carboxilato de metila (14) e o 7-metóxi-2,2,5-dimetil-2H-cromeno-6-carboxilato de metila (15). O policetídeo 2-hidróxi-4,6-dimetóxiacetofenona, principal metabólito das folhas de P. glabella, teve sua biossíntese investigada utilizando-se como precursores o acetil-CoA e o malonil-CoA. Foram realizados estudos de otimização da atividade de policetídeo sintase (PKS) em função do pH, tempo de reação, temperatura e saturação de substratos, além de estudos da variação circadiana. Estudos de genes de PKS resultaram em amplificações cujo seqüenciamento poderá determinar a identidade dessas regiões e homologia entre as seqüências dessas Peperomias e a região KS do gene AviM de Streptomyces viridochromogenes que expressa o ácido orselínico / The phytochemical investigation carried out on Peperomia oreophila revealed the accumulation of two furofuran lignans (7R,8R,7R,8R)-3,4,5-trimethoxy-3,4- methylenedioxy-8.8, 7.O.9, 9.O.7-lignan (1), (7, 8R, 7R, 8)-3,4,5-trimethoxy-3,4,5- trimethoxy-8.8-7.O.9, 9.O.7-lignan (2); two amides (2´E)-N-isobutyl-3´-(5-methoxy-7,8- benzodioxol-1-yl) acrylamide (3), (2E)-N-isobutyl-3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)acrylamide (4), three derivate cinâmic acid methyl (2E)-3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)acrylate (5), methyl (2Z)-3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)acrylate (6), methyl (2E)-3-(5-methoxy-7,8- benzodioxol-1-yl)acrylate (7); two phenolic polyketides [(2E)-3,7-dimethylocta-2,6- dien-1-yl]-5-methyl-2-(3-methylbut-2-en-1-yl)benzene-1,3-diol (8) (novel), [(2´E)-3´,7´- dimethylocta-2´,6´-dien-1-yl]-2,2,7-trimethyl-2H-chromen-5-ol (9); P. arifolia, two phenolic polyketide [(2E)-3,7-dimethylocta-2,6-dien-1-yl]-5-methyl-2-(3-methylbut-2- en-1-yl)benzene-1,3-diol, also isolated from P. oreophila (10) (novel); P. urocarpa, the two phenolic polyketides 5-methyl-2-[(2E,6E)-3,7,11-trimethyldodeca-2,6,10-trien-1- yl]benzene-1,3-diol (11) and 2,4-dihydroxy-6-methyl-3-[(2E,6E)-3,7,11-trimethyldodeca- 2,6,10-trien-1-yl]benzoic acid (12); P. nitida, the phenylpropanoid apiole 1-allyl-3,6- dimethoxy-10,11-benzodioxole (13); the chromenes methyl 7-hydroxy-2,2,5-trimethyl- 2H-chromene-6-carboxylate (14) and methyl 7-methoxy-2,2,5-trimethyl-2H-chromene-6- carboxylate (15). The polyketide 2-hydroxy-4,6-dimethoxyacetophenone, the major compound in P. glabella leaves, had its biosynthetic origin investigated using acetyl-CoA and malonyl-CoA as precursors. The enzymatic activity of polyketide synthase was optimized to pH, incubation time, temperatures and substrate saturation, in addition to the analysis of circadian variation activity. The amplifications of putative PKS genes was based on primers from AviM gene of Streptomyces viridochromogenes that express for orsellinic acid. The sequencing will enable the identification of such regions and also to study the homology to fungi PKS