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Orientador: Daniela Cardoso Umbelino Cavallini / Banca: Patricia de Oliveira Prada / Banca: Marla Simone Jovenasso Manzoni / Resumo: Objetivos: A utilização de microrganismos probióticos na redução do risco de doenças inflamatórias intestinais (DIIs), incluindo a colite ulcerativa (CU), tem se mostrado promissora, sendo que o efeito benéfico depende da cepa utilizada e da fase da patologia. O objetivo do presente estudo foi averiguar o efeito de um produto probiótico à base de soja, fermentado com Enterococcus faecium CRL 183 e Lactobacillus helveticus 416 e com adição de Bifidobacterium longum ATCC 15707, na fase aguda da colite quimicamente induzida em camundongos. Métodos: O protocolo experimental teve duração total de 14 dias e os animais foram distribuídos aleatoriamente em quatro grupos (n=10): Grupo C - Animais sadios que não receberam os produtos em estudo; Grupo CL - Animais com colite quimicamente induzida e que não receberam os produtos em estudo; Grupo CLF - Animais com colite quimicamente induzida e que receberam o produto fermentado probiótico; Grupo CLP - Animais com colite quimicamente induzida e que receberam o produto não fermentado (placebo). A indução da colite foi feita pela administração de dextran sulfato de sódio (DSS) a 3% dissolvido na água fornecida diariamente aos animais, por um período de sete dias, e os produtos foram administrados ao longo dos 14 dias de estudo. Durante o período experimental foram monitorados os seguintes parâmetros: peso corpóreo dos animais, ingestão hídrica e de ração, consistência e presença de sangue oculto ou aparente nas fezes e composição da microbiota fecal. Ao final do protocolo, os animais foram eutanasiados e o intestino grosso foi removido para realização das análises macroscópica e histológica. Resultados: De acordo com os resultados do índice de atividade da doença (IAD), os animais que consumiram o produto probiótico (CLF) apresentaram redução dos sintomas associados à colite durante... / Abstract: Objectives: The use of probiotic microorganisms in the reduction of inflammatory bowel diseases (IBD) risks, including ulcerative colitis (UC), has been shown promising, and the beneficial effect depends on the strain used and the stage of disease. The objective of this study was to investigate the effect of a probiotic soy product fermented with Enterococcus faecium CRL 183 and Lactobacillus helveticus 416 with addition of Bifidobacterium longum ATCC 15707 in the acute phase of colitis chemically induced in mice. Methods: The experimental protocol had total duration of 14 days and the animals were randomized into four groups (n = 10): Group C - healthy animals that have not received the products under study; CL Group - Animals with chemically induced colitis and who have not received the products under study; CLF Group - Animals with chemically induced colitis and receiving the probiotic fermented product; Group CLP - animals with chemically induced colitis and receiving the unfermented product (placebo). The induction of colitis was made by the administration of dextran sodium sulfate (DSS) 3% dissolved in the drinking water for a period of seven days, and the products were administered over the 14 days of the study. During the trial period the following parameters were monitored: body weight, water and food intake, consistency and presence of hidden or apparent blood in stool and composition of the fecal microbiota. At the end of the protocol, the animals were euthanized and the large intestine was removed to perform the macroscopic and histological analysis. Results: According to the results of disease activity index (DAI), the animals that consumed the probiotic product (CLF) showed a reduction of symptoms associated with colitis during the induction period, compared to the ... / Mestre

The purpose of the study was to compare the impact of 3 weeks of consumption of commercial yoghurt enriched with Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB-12 and Lactobacillus acidophilus LA-5 (P), and the same yoghurt supplemented with prebiotic-inulin (S), on feacal bacterial counts of healthy adults. A randomized, parallel-group, crossover, open-label – DBPC intervention with 66 volunteers was carried out. The 3 week administration of both P and S yoghurt increased (P lower 0.01) counts of bifidobacteria and Lactobacillus acidophilus, and reduced (P lower 0.01) counts of Clostridium spp., Enterococcus spp. and E. coli in fecal samples, in comparison with the control croup. The consumption of probiotics and synbiotics yoghurt reduced (P lower 0.05) the counts of tyramine producing enterococci and E. coli among the faecal isolates. In the synbiotics group, counts of bifidobacteria and Lactobacillus acidophilus remained higher, and counts of Clostridium spp., Enterococcus spp. and E. coli lower (P lower 0.05) after 1 week wash out period, in comparison with the preadministration phase. It was concluded that the synbiotics yoghurt was superior to the probiotics product in maintaining the increased levels of beneficial bacteria and decreased counts of potentially patogens bacteria in the intestine.

Tesis por compendio / [EN] Celiac disease (CD) is a chronic enteropathy triggered by cereal gluten proteins in genetically predisposed individuals. The etiology is strongly associated with the genes of the human leukocyte antigen (HLA) encoding the DQ2/DQ8 molecules. Most CD patients carry this genotype but this is also present in the 40% of the general population and only a small percentage develops the disease. Thus, the HLA-DQ genotype is necessary but not solely responsible for the disease development. Gluten is the main environmental trigger but its intake neither fully explains the onset nor its clinical manifestations. Other environmental factors (e.g. early feeding practices, infections, intestinal microbiota) have been associated with the risk of developing CD. The only treatment for CD patients is the adherence to a gluten free diet (GFD), but the compliance with this dietary strategy is complicated because gluten is present in many foods. Therefore, the identification of modifiable environmental factors that contribute to CD onset is critical for the development of strategies to reduce its incidence. Observational studies in CD patients revealed imbalances in the intestinal microbiota which could contribute to the pathogenesis of the disease. It has been proposed that these imbalances are not only a secondary consequence of the disease but could also be a predisposing factor. To understand whether gut microbiota imbalances play a role in CD onset and pathogenesis, in vitro, animal and human prospective and intervention studies have been conducted in the context of the present PhD Thesis. The global aim of this Thesis has been to improve the understanding of the role played by intestinal microbiota in the pathogenesis and risk of CD, and the possibilities of contributing to disease prevention and treatment by modulating gut microbiota composition. Chapter 1 includes two in vitro studies investigating the influence of components of the gut microbiota (bifidobacteria and enterobacteria) on the maturation and functions of immunocompetent cells (dendritic cells), and on gluten toxicity in the intestinal epithelium (Caco-2 cells). We have observed that some Bifidobacterium strains are able to reduce the activation of dendritic cells and ameliorate the toxicity of gluten on intestinal epithelial cells. In Chapter 2 the effects of the administration of Bifidobacterium longum CECT 7347 was evaluated in an in vivo model of gluten induced enteropathy in newborn rats, resulting in a reduced proinflammatory cytokine production in the small intestine and CD4+T cell numbers in peripheral blood. Chapter 3 includes two observational studies in humans to unravel whether breast-feeding and human milk composition and/or the host genotype (HLA-DQ) are related to the microbiota, thereby influencing the later development of CD. We concluded that both factors may contribute to the early intestinal colonization of the infant's gut, influencing the Bifidobacterium spp. numbers. Human milk composition also varies in CD and non-CD mothers, modifying the supply of bifidobacteria and protective immune factors to the offspring. Finally, in Chapter 4 we have studied the potential beneficial effects of the administration of B. longum CECT 7347 in addition to the GFD to children with newly diagnosed CD. This study demonstrates that the bifidobacteria slightly reduces serum inflammatory markers and restored the gut microbiota composition. / [ES] La enfermedad celíaca (EC) es una enteropatía crónica de carácter autoinmune que sufren individuos genéticamente predispuestos tras la ingesta de gluten. La etiología está asociada con los genes del sistema "Antígeno Leucocitario Humano" (HLA) que codifican las moléculas DQ2/DQ8. Los pacientes con EC presentan este genotipo, sin embargo este también está presente en ¿40% de la población general y sólo un pequeño porcentaje desarrolla la enfermedad. Por lo tanto, el genotipo HLA-DQ resulta necesario pero no suficiente para que se desarrolle la enfermedad. El gluten es el principal desencadenante pero su ingesta tampoco explica su desarrollo ni sus manifestaciones clínicas. Otros factores ambientales (p.e. la lactancia, infecciones, microbiota intestinal) se han asociado con el riesgo de desarrollar la EC. El único tratamiento para los pacientes celíacos es el seguimiento de una dieta exenta de gluten (DEG), sin embargo su cumplimiento es complicado debido a que el gluten está presente en la mayoría de los alimentos procesados. Por ello, la identificación de factores ambientales modificables que contribuyan al desarrollo de la enfermedad, resulta fundamental para desarrollar estrategias que permitan reducir su incidencia. Estudios observacionales realizados en pacientes con la EC, han demostrado la existencia de desequilibrios en su microbiota intestinal, que podrían contribuir a la patogénesis de la enfermedad. Se ha propuesto que estos desequilibrios no son sólo una consecuencia secundaria de la EC, sino que podrían ser un factor predisponente. Para entender si la microbiota está implicada en el desarrollo y patogénesis de la EC, en la presente Tesis se han desarrollado estudios in vitro, con animales y estudios prospectivos y de intervención en humanos. El objetivo de esta Tesis ha sido avanzar en el conocimiento de la función que la microbiota intestinal desempeña en la patogénesis de la EC, así como, acerca de las posibilidades de tratar o prevenir esta enfermedad mediante la modulación de la composición de la microbiota intestinal. El Capítulo 1 incluye dos estudios in vitro en los que se ha estudiado la influencia de componentes de la microbiota intestinal (bifidobacterias y enterobacterias) en la maduración y las funciones de células inmunocompetentes (células dendríticas), y en la toxicidad del gluten en el epitelio intestinal (células Caco-2). Hemos observado que algunas cepas de Bifidobacterium son capaces de reducir la activación de las células dendríticas y de reducir la toxicidad del gluten sobre el epitelio intestinal. En Capítulo 2 incluye el estudio de los efectos de la administración de B. longum CECT 7347 en un modelo de enteropatía inducida por gluten en ratas recién nacidas, observándose una reducción de citoquinas proinflamatorias en el intestino y de células T CD4+ en sangre periférica. El Capítulo 3 incluye dos estudios observaciones en humanos en los que se ha investigado si la lactancia y composición de la leche materna y/o el genotipo (HLA-DQ) están relacionados con la microbiota y, si así, podrían influir en el desarrollo de la EC. Concluimos que ambos factores contribuyen a la colonización intestinal del niño en los primeros meses de vida, afectando especialmente al número de Bifidobacterium spp. La composición de la leche maternal varía entre madres celíacas y sanas, lo que podría modificar el aporte de bifidobacterias y factores inmunológicos protectores al lactante. Por último, en el Capítulo 4 incluye el estudio del potencial efecto beneficioso de la administración de B. longum CECT 7347 junto con la DEG en niños recién diagnosticados de EC. Este estudio demuestra que la bifidobacteria ligeramente reduce los marcadores inflamatorios en sangre periférica y contribuye a restablecer la composición de la microbiota intestinal. / [CA] La malaltia celíaca (MC) és una enteropatia crònica provocada per les proteines del gluten de cereals en individus predisposats genèticament. L'etiologia està fortament associat amb els gens de l'antigen leucocitari humà (HLA). Pacients amb MC porten aquest genotip però també està present en aproximadament el 40% de la població general i només un petit percentatge (1-3%) es desenvolupa la malaltia. Per tant, HLA-DQ genotip és necessària, però no l'únic responsable. El gluten és el principal desencadenant ambiental però la seva ingesta no explica completament l'inici ni les seves manifestacions clíniques. Altres factors ambientals, com la microbiota intestinal, s'han associat amb el risc de desenvolupar CD. Els estudis observacionals en pacients amb MC van revelar desequilibris en la microbiota intestinal que podria contribuir a la patogènesi de la malaltia. S'ha proposat que aquests desequilibris no només són una conseqüència secundària de la malaltia, però també podria ser un factor predisponent. Per entendre si els desequilibris microbiota intestinal podrien tenir un paper en l'aparició de CD, un estudi prospectiu amb el nen en risc la família està en marxa. L'únic tractament per als pacients amb EC és l'adherència a una dieta lliure de gluten, però el seu compliment és complicada a causa del gluten està present en molts aliments. La identificació de factors ambientals modificables que contribueixen a l'aparició de CD és fonamental per a les estratègies de desenvolupament que porten a una reducció de la incidència. Aquest pot ser el cas per als components de la microbiota intestinal, l'adquisició podria ser modulada per factors ambientals i dietètics. L'objectiu global de la tesi és desentranyar els coneixements actuals sobre el paper exercit per la microbiota intestinal en la patogènesi de l'EC, i les possibilitats de contribuir a la prevenció i tractament de la malaltia mitjançant la modulació de la composició de la microbiota intestinal En el Capítol 1 hem estudiat l'ús de models in vitro de la influència de la microbiota intestinal durant la maduració i funcions del sistema immunològic (cèl·lules dendrítiques), i les interaccions entre el gluten i intestinal intestí i la resposta de l'epiteli intestinal resultant d'aquesta interacció. Hem observat que alguns ceps de Bifidobacterium són capaços de reduir l'activació del sistema immune i millorar la resposta nociva de l'epiteli intestinal a l'estimulació amb gluten. En el Capítol 2 hem estudiat els efectes de l'administració d'una soca de Bifidobacterium (B. longum CECT 7347) per a un model animal de rates nounades. El tractament amb els bacteris es va associar amb una reducció en la producció de citocines proinflamatòries i la resposta immune de cèl·lules T CD4 +. En el Capítol 3 es va descriure que alguns genètic (HLA-DQ genotip) i factors ambientals (llet materna) influeixen en la colonització intestinal primerenca, especialment en Bifidobacterium spp., que poden influir en l'aparició de CD més tard. Finalment, en el Capítol 4 s'ha estudiat l'efecte probiòtic de l'administració de B. longum CECT 7347 en nens acabats diagnosticats d'EC i el seu paper en el restabliment de la salut intestinal. / Olivares Sevilla, M. (2015). Influence of intestinal microbiota in celiac disease pathogenesis and risk [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/58768 / TESIS / Premios Extraordinarios de tesis doctorales / Compendio

O presente trabalho teve como objetivo verificar a viabilidade da cepa probiótica Bifidobacterium animalis subsp. lactis Bb-12 incorporado em margarina, suplementada com inulina, concentrado protéico de soro (WPC) e concentrado de caseína (CMP), bem como avaliar as características do produto e a resistência do probiótico às condições simuladas do trato gastrintestinal humano. Foram produzidos 7 diferentes tipos de margarinas de mesa (60% de lipídios: 60 % de óleo de palma + 40% de óleo de canola), empregando-se um modelo de mistura, onde inulina, WPC e CMP foram as variáveis estudadas. Uma formulação controle foi produzida (M8), sem adição desses ingredientes. A utilização da mistura do óleo de palma com óleo de canola favoreceu nutricionalmente as formulações, fornecendo produtos contendo ácidos graxos essenciais em sua composição e ausência de ácidos graxos trans. As formulações M1 a M7, exceto a formulação M2 após o 21º dia de armazenamento, apresentaram populações satisfatórias de Bb-12 para um alimento probiótico, com populações acima de 6 log UFC/g durante 35 dias de armazenamento. Margarinas suplementadas com inulina apresentaram populações satisfatórias durante todo o armazenamento, atingindo populações de 8,01 log UFC/g ao 35º dia (M1). Além disso, M3 e M6, revelaram populações de Bb-12 de 6,87 log UFC/g e 7,27 log UFC/g (dia 35), respectivamente. Por outro lado, M8 não foi caracterizada como margarina probiótica, uma vez que apresentou populações abaixo de 6 log UFC/g, já ao 1º dia de armazenamento. Embora WPC seja utilizado em pesquisas para aumentar a viabilidade de probióticos em alimentos, a suplementação de margarina com WPC sem inulina ou CMP não resultou em populações satisfatórias de Bb-12, apresentando decréscimo de 7,82 (dia 1) para 4,64 log UFC/g (M2, dia 35) (p<0,05). Durante todo o ensaio de resistência in vitro, Bb-12 apresentou sobrevivência significativamente superior (p<0,05) em M1 e revelou populações acima de 6 log UFC/g após 6h de ensaio mesmo ao 28º dia. As populações observadas para M2 diminuíram drasticamente durante o ensaio in vitro (5 log UFC/g após 2h no dia 7). Para as outras formulações, as populações de Bb-12 diminuíram 2 log UFC/g após 2h de ensaio in vitro. Entretanto, M1, M2 e M5 (dias 14 e 28) revelaram aumento significativo nas populações de Bb-12 (p<0,05) entre a fase gástrica (2h) e a segunda fase entérica (6h). As margarinas suplementadas com inulina, principalmente M1, revelaram decréscimo significativo no pH durante todo o armazenamento (p<0,05). Entretanto, isto não afetou a qualidade sensorial dos produtos, uma vez que não foram detectadas diferenças significativas entre as formulações após 7 e 14 dias de armazenamento (p>0,05). A suplementação de margarina com inulina e CMP garantiu populações apropriadas de Bb-12 durante o armazenamento estudado pelo menos até o 28º dia. Além disso, contribuiu para sua sobrevivência durante o ensaio de resistência in vitro. Os resultados revelaram que a margarina apresenta-se como uma matriz alimentar adequada para administração de Bb-12, principalmente quando a inulina foi adicionada. / This study aimed to determine the viability of probiotic Bifidobacterium animalis subsp. lactis Bb-12 incorporated in margarine, with inulin, whey protein concentrate (WPC) and caseinomacropeptide (CMP) supplementation. In addition, the in vitro resistance of Bb-12 incorporated in margarine and related properties were evaluated. Seven margarine-making trials (60% of fat: 60% of palm oil +40% canola oil) were produced, using a mixture model, where inulin, WPC and CMP were the variables studied. Also, a control formulation without these ingredients was manufactured. The use of blending palm oil with canola oil improved the margarine formulations nutritionally, providing products containing essential fatty acids in its composition and absence of trans fatty acids. The formulations M1 to M7, except M2 after 21 days of storage, revealed satisfactory Bb-12 populations for a probiotic food, with counts above 6 log CFU/g during 35 days of storage at 5±1ºC. Margarines supplemented with inulin presented suitable Bb-12 populations throughout the whole storage period, reaching up to 8 log CFU/g by the end of storage (M1). Also, M3 and M6, revealed Bb-12 populations of 6.87 log CFU/g and of 7.27 log CFU/g (day 35), respectively. In contrast, M8 was not characterized as probiotic margarine, since it showed Bb-12 populations below 6 log CFU/g on day 1. Even though whey protein is largely employed in probiotic foods, margarine supplementation with WPC without inulin or CMP did not lead to Bb-12 satisfactory populations, decreasing from 7.82 (day 1) to 4.64 log CFU/g (M2, day 35) (p<0.05). During the whole in vitro assays, Bb-12 survived significantly better (p<0.05) in M1 and revealed populations above 6 log CFU/g after 6h even after 28 days. M2 populations decreased drastically during the in vitro assays for all storage period tested (reduction of 5 log CFU/g after 2h of in vitro assays on day 7 and populations of 2.8 log CFU/g after 6h). For the other formulations, Bb-12 populations decreased 2 log CFU/g after 2h of the in vitro assays. However, for M1, M2 and M5 (on day 14 and 28) the populations of Bb-12 increased significantly (p<0.05) between the gastric phase (2h) and the enteric phase (6h). Formulations containing inulin, mainly M1, showed a significant decrease in pH values during the whole storage period (p<0.05). However, this ingredient did not affect the sensory quality of products, since no significant differences between formulations after 7 and 14 days of storage were observed (p>0.05). The supplementation of margarine with inulin and CMP guaranteed appropriate Bb-12 populations during storage for at least 28 days, and also contributed for its survival throughout the in vitro assays. Therefore, margarine might be considered an appropriate food matrix for Bb-12 survival, mainly when inulin is also added.

Probióticos do gênero Lactobacillus estão sendo amplamente investigados no tratamento da periodontite. Contudo, os efeitos de microrganismos do gênero Bifidobacterium ainda são pouco conhecidos. Este estudo avaliou os efeitos do probiótico Bifidobacterium animalis subsp. lactis (B. lactis) HN019 como adjuvante à raspagem e alisamento radicular (RAR) no tratamento da periodontite experimental (PE) em ratos. No dia 0 do experimento, 32 ratos foram alocados em 4 grupos: C (controle), PROB (probiótico), PE-RAR e PE-RARPROB. Nos grupos PE-RAR e PE-RAR-PROB, a PE foi induzida pela colocação de ligaduras de seda ao redor dos primeiros molares inferiores dos animais. No 14&deg; dia, as ligaduras foram removidas e realizou-se a RAR. Nos animais dos grupos PROB e PE-RARPROB, o probiótico B. lactis HN019 foi administrado diariamente (10 mL/dia de 109 unidades formadoras de colônia) por 15 dias tendo seu início no 14&deg; dia do experimento. Os animais de todos os grupos foram submetidos à eutanásia 29 dias após o início do experimento. As hemimandíbulas e amostras de intestino delgado foram coletadas. Foram realizadas análises histomorfométricas, microtomográficas e imunohistoquímicas. Foram investigados, também, os efeitos microbiológicos de B. lactis HN019 no biofilme associado às ligaduras durante o desenvolvimento da PE. Todos os dados foram analisados estatisticamente. O Grupo PE-RAR-PROB apresentou menores reabsorção óssea alveolar e perda de inserção conjuntiva quando comparado ao Grupo PE-RAR, bem como menor número de osteoclastos, maior expressão de citocinas anti-inflamatórias e menor expressão de citocinas pró-inflamatórias (p <0,05). No grupo PE-RAR-PROB, os valores médios da profundidade da cripta do jejuno e duodeno foram significativamente maiores que aqueles do grupo PE-RAR. A proporção de bactérias aeróbias/anaeróbias foi maior nas amostras de biofilme de animais tratados com B. lactis HN019 em relação àquelas de animais não tratados (p <0,05). Dentro dos limites deste estudo, pode-se concluir que a utilização de B. lactis HN019 como adjuvante à RAR promove benefícios histológicos, microtomográficos e imunológicos adicionais no tratamento da PE em ratos, bem como melhora a morfologia intestinal. / Lactobacillus probiotics have been investigated in periodontitis. However, the effects of the genus Bifidobacterium on periodontitis are hardly known. This study evaluated the effects of the probiotic Bifidobacterium animalis subsp. lactis (B. lactis) HN019 as an adjunct to scaling and root planing (SRP) in rats with experimental periodontitis (EP). At baseline, 32 rats were assigned to 4 groups: C (control), PROB, EP-SRP and EPSRP- PROB. In groups EP-SRP and EP-SRP-PROB, the mandibular first molars of the animals received a ligature. At day 14, the ligatures were removed and SRP was performed. Animals of groups PROB and EP-SRP-PROB were orally administered with 10 mL/day of 109 colony forming units of B. lactis HN019 for 15 days, starting at day 14. Animals were euthanized at day 29. The jaws and samples of the duodenum, jejunum, and ileum were resected. Histomorphometric, microtomographic and immunohistochemical analyses were performed. Microbiological effects of B. lactis on biofilm were also evaluated. Data were statistically analyzed. Group EP-SRP-PROB presented reduced alveolar bone resorption and attachment loss when compared with Group EP-SRP (p<0.05). Group EP-SRP-PROB showed significantly fewer osteoclasts, increased expression of anti-inflammatory cytokines and reduced expression of proinflammatory cytokines compared with Group EP-SRP (p<0.05). In group EP-SRPPROB, the mean values of crypt depth of the jejunum and dudoenum were significantly higher than the ones from group EP-SRP. B. lactis promoted a higher ratio between aerobic and anaerobic bacteria in biofilm samples (p<0.05). Within the limits of this study it can be concluded that the use of B. lactis HN019 as an adjunct to SRP promotes additional histologic, microtomographic and immunologic benefits in the treatment of EP in rats and improves the intestinal morphology.

Despite the fact that Glycosyl Hydrolase Family 32 present 4 467 enzyme entries, only 14 of them have been characterized structurally. From the ten protein crystal structures deposited for Bifidobacterium adolescentis ATCC 15703 at PDB just one enzyme is related to the processing of non-digestible sugars and there is no structure of a &beta;-fructofuranosidase. In this research we studied the biochemical properties and the structural features of a recombinant &beta;-fructofuranosidase (BaFFse) from the healthy gut bacteria B. adolescentis ATCC 15703 (gen BAD_1325) heterologously expressed in Escherichia coli Rosetta. The enzyme was purified by nickel ion affinity chromatography and molecular exclusion chromatography; the purification process was judged by denaturing SDS-PAGE gel. Sucrose was used as a substrate for the enzyme activity assays and the amount of reducing sugars, detected by Dinitrosalycilic acid, was taken as indicator of the optimum conditions of hydrolysis for the enzyme. BaFFase crystal, grown in PEG 8K 25% (w/v) and buffer MES 0.1M pH 6.5, was diffracted at 2.44 &Aring; and processed using the CCP4 program package. The enzyme presented a classical four-stranded five-bladed &beta;-propeller and a C-terminal &beta;-sandwich characteristic from the GH 32 family; however, connected to the &beta;-propeller through a loop of 38 residues, BaFFase also presented an N-terminal &beta;-sandwich domain, which sequence (residues 3-100 from BaFFase) did not match with any protein sequence when aligned against PDB database. Assays with Gel filtration calibration, DLS and SAXS showed that the enzyme was a stable homodimer in solution. Based on the superposition of structures using the a &beta;-fructofuranosidase from B. longum KN29.1 we could deduced the three key aminoacids involved in the transferring of fructosyl moieties by BaFFase. A nucleophile attack is performed by the carboxylate of Asp 131, forming the fructose BaFFase intermediate; Glu 375 donates a proton, acting as an acid base catalyst and Asp 269 stabilizes the transitions state in the fructosyl transferring activity. This is the first GH32 oligomeric enzyme belonging to the bacteria kingdom. We have described a novel additional &beta;-sandwich domain for a GH32 enzyme that increases the region of contact to form a dimer. This is the first &beta;-fructofuranosidase crystal structure from the microorganism B. adolescentis ATCC 15703. / O presente trabalho disserta sobre os estudos das propriedades bioquímicas e as características estruturais de uma &beta;-frutofuranosidase recombinante (BaFFse) da bactéria Bifidobacterium adolescentis ATCC 15703 (gen BAD_1325) presente em intestinos saudáveis. A proteína foi expressa heterologamente em Escherichia coli Rosetta. A enzima foi purificada por cromatografia de afinidade (íons de níquel) e cromatografia de exclusão por massa molecular; o processo de purificação foi avaliado por gel desnaturante tipo SDS-PAGE. A sacarose foi usada como substrato para os ensaios de atividade enzimática e a quantidade de açúcares redutores, detectados por ácido dinitrosalicílico, foi tomada como indicador das condições ótimas de hidrólise para a enzima. Cristais de BaFFase, crescidos em solução contendo PEG 8 k em tampão Hepes pH 6,5, foram difratados a uma resolução de 2,44 &Aring; e processados utilizando o pacote de programas CCP4. A enzima apresentou um clássico enovelamento tipo composto por cinco pás de quatro-fitas &beta; cada e um domínio C-terminal sanduíche-&beta; característico da família GH32; no entanto, ligado ao &beta;-propeller, através de um loop de 38 resíduos, a BaFFase apresentou um inédito domínio N-terminal sanduíche-&beta; (resíduos 3-100 de BaFFase) ainda sem precedentes, quando alinhado contra a base de dados PDB. Ensaios de gel filtração, DLS e SAXS mostraram que a enzima se apresenta como um homodímero estável em solução. Com base na superposição estrutural, utilizando uma &beta;-frutofuranosidase de B. longum KN29.1, foi possível inferir os três aminoácidos essenciais envolvidos na transferência de unidades de frutosil pela BaFFase. Um ataque nucleofílico é realizado pelo grupo carboxílico do Asp131, formando um intermediário frutose-BaFFase; o Glu375 doa um próton, atuando como um catalisador ácido-base e o Asp269 estabiliza o estado transições na atividade de transferência frutose. Um novo domínio sanduíche-&beta; adicional para uma enzima GH32 é descrito. Esse domínio é responsável pelo aumento da região de contato e essencial para a formação do homodímero. Esta é a primeira estrutura cristalina da &beta;-frutofuranosidase do microrganismo B. adolescentis ATCC 15703, além de ser a primeira enzima GH32 descrita neste estado oligomérico pertencente ao reino das bactérias.

Os objetivos do estudo foram elaborar iogurtes com a cultura tradicional e a cultura probiótica de Bifidobacterium animalis subsp. lactis, desidratar os produtos em spray dryer utilizando maltodextrina como carreador e caracterizar os pós obtidos, bem como determinar a resistência dos probióticos ao processo de atomização. O presente estudo avaliou três temperaturas de entrada do ar de secagem (130, 150 e 170°C) em iogurtes com duas diferentes concentrações de maltodextrina (10 e 20%), totalizando 6 tratamentos: T1 (10%malto/130°C), T2 (20%malto/130°C), T3 (10%malto/150°C), T4 (20%malto/150°C), T5 (10%malto/170°C) e T6 (20%malto/170°C). A secagem do iogurte foi realizada em spray dryer piloto e a enumeração das células viáveis de Bifidobacterium animalis subsp. lactis foi realizada através de plaqueamento em profundidade. Os pós apresentaram baixos valores de umidade e elevada higroscopicidade. A atividade de água (Aw) dos pós variou de 0,09 a 0,19 e aumentou após 30 dias de armazenamento, comprovando o caráter higroscópico dos pós obtidos. Verificou-se que após a desidratação dos iogurtes, apesar deles apresentarem contagens inferiores que os produtos integrais, ainda apresentaram contagens acima de 106 UFC/g, ou seja, ainda estavam dentro do limite estabelecido pela legislação para um produto ser considerado probiótico. Os tratamentos que passaram por maiores temperaturas durante o processamento de secagem (T5 e T6) foram os que tiveram maiores perdas de micro-organismos probióticos, sugerindo que as altas temperaturas exerceram forte influência na viabilidade dos probióticos. O T1 obteve maiores contagens do micro-organismo analisado, com contagens acima de 106 UFC/g, com até 60 dias de armazenamento, indicando ser o melhor tratamento entre os estudados, em relação à obtenção de um iogurte caprino probiótico em pó com maior período de vida de prateleira. De maneira geral, conclui-se que o processo de atomização possibilitou a obtenção de iogurte de leite de cabra em pó estável do ponto de vista microbiológico. Além disso, obteve-se um produto que pode ser uma alternativa para incrementar o consumo de leite de cabra, bem como o de probióticos. / The aim of this study was to develop yogurts with the traditional culture and Bifidobacterium animalis subsp. lactis probiotic culture, dehydrate products in spray drying using maltodextrin as a carrier and characterize the powders, as well as determining the resistance of probiotics to atomization process. The present study evaluated three different inlet air temperatures of spray dryer (130, 150 and 170°C) in yoghurts with two different maltodextrin concentrations (10 and 20%), totaling six treatments: T1 (10%malto/130°C), T2 (20%malto/130°C), T3 (10%malto/150°C), T4 (20%malto/150°C), T5 (10%malto/170°C) e T6 (20%malto/170°C). The yogurt drying was performed in a pilot spray dryer and the viable cells of Bifidobacterium animalis subsp. lactis enumeration was performed by pour plate. The powders showed low levels of humidity and high hygroscopicity. The water activity (Aw) of the powders ranged from 0.09 to 0.19 and increased after 30 days of storage, showing the hygroscopic powders character. It was found that after yogurt dehydration, despite their counts were less than integral products, still had counts above 106 CFU/g, therefore were still within regulation limits for a product to be considered as probiotic. The treatments that have undergone higher temperatures during the drying process (T5 and T6) were those who had higher losses of probiotic microorganisms, suggesting that high temperatures had a strong influence on the viability of probiotics. The T1 (130°C/10%) obtained higher counts of the microorganism analyzed, with counts above 106 CFU/g, during 60 days of storage, indicating that is the best treatment among those studied in relation to obtaining a goat probiotic yoghurt powder with longer shelf life. In general, it is concluded that the atomization process allows the obtention of stable goat milk yogurt powder, in a microbiological point of view. Furthermore, it was obtained a product that can be an alternative for increasing the consumption of goat milk as well as probiotics.

Objetivou-se a produção de bacteriocina de Bifidobacterium animalis subsp. lactis, comparando-se os meios de cultivo sintéticos BSM (Bifidus Selective Medium) e MRS (Man Rogosa and Sharpe) com o meio de cultivo natural (soro de leite). Inicialmente, foram determinadas curvas de crescimento e de pós-acidificação, consumo de glicose, lactose e produção de bacteriocina de B.lactis através de processos fermentativos utilizando os meios de cultivo BSM, MRS e soro de leite (SL). Os microrganismos indicadores utilizados no teste de sensibilidade à bacteriocina produzida por B. lactis foram Lactobacillus sakei, Escherichia coli e Listeria monocytogenes. Considerando a cepa B. lactis uma espécie de bactéria aerotolerante, foi realizado, em meio de cultura BSM, estudo prévio avaliando o seu crescimento, com a variação da agitação (25, 50 e 100 rpm) e com tempo de cultivo de 30 h, a 37°C de temperatura. Os melhores resultados de crescimento celular (9,4 log UFC/mL) foram obtidos na agitação de 50 rpm. Determinada a melhor condição de agitação (50 rpm) e temperatura (37°C), foi realizado, em soro de leite, estudo de crescimento, acidificação e consumo de lactose, variando a concentração de sólidos totais dissolvidos (5, 10, 15, 20 e 25% p/v), para se estabelecer a concentração de soro de leite ideal para os estudos de suplementação. A maior quantidade de biomassa produzida, aliada à menor pós-acidificação, foi encontrada em soro de leite a 10% (p/v) de sólidos totais, no qual o microrganismo apresentou, ao final do cultivo (30 horas), contagem de 9,13 log UFC/mL e valor de pH 4,29, respectivamente. Também se verificou a influência dos meios de cultivo no crescimento e na produção de bacteriocina de B. lactis em agitador rotativo (shaker), que consistiu na análise comparativa do efeito da suplementação de 1% dos seguintes ingredientes: extrato de levedura (EL), inulina (I), L-cisteína (CI) e Tween 80 (T80). As melhores condições de cultivo encontradas para a maior produção de biomassa e bacteriocina foram obtidas no soro de leite, à concentração de 10% (p/v) suplementado com 1% de extrato de levedura (9,9 log UFC/mL e 200 UA/mL). Na etapa final do trabalho, estas condições foram testadas em fermentador de bancada, quando foi observado que o crescimento de Bifidobacterium lactis foi 10% maior em relação ao agitador rotativo. Quanto à atividade da bacteriocina produzida em fermentador de bancada, não houve diferença em relação ao agitador rotativo (200 UA/mL). Esta diferença no crescimento pode ser devido as melhores condições de anaerobiose oferecidas em fermentador de bancada, no qual houve a injeção de nitrogênio no meio de cultivo, sendo que, no agitador rotativo, a condição de anaerobiose foi gerada por um agente externo ao meio (uso de jarras de anaerobiose). Através do presente trabalho, pode-se concluir que a produção de bacteriocina por B. lactis é viável e apresenta resultados promissores quando utilizada a combinação soro de leite adicionado de extrato de levedura, o qual apresentou atividade antimicrobiana contra a cepa Listeria monocytogenes. A otimização do processo em fermentador de bancada demonstrou-se interessante quanto à produção de bacteriocina em nível industrial. / The objective was the production of bacteriocins by Bifidobacterium animalis subsp. lactis, comparing the synthetic culture medium BSM (Bifidus Selective Medium) and MRS (Man Rogosa and Sharpe) with the natural culture medium (whey). Initially, growth and post-acidification curves were determined, consumption of glucose, lactose and B. lactis bacteriocin production by fermentation processes using culture media BSM, MRS and milk whey (SL).The indicator organisms used in the test sensitivity to bacteriocin produced by B. lactis were Lactobacillus sakei, Escherichia coli and Listeria monocytogenes. Given the strain B. lactis one aerotolerant species of bacteria, it was conducted in culture medium BSM, a preliminary study assessing the growth, by varying the agitation (25, 50, and 100 rpm) with cultivation time of 30h at 37°C temperature. The best results of cell growth (9.4 log CFU / mL) were obtained at 50 rpm agitation. After the best condition of agitation (50 rpm) and temperature (37°C) determination, it was performed on whey, a study of growth, acidification and consumption of lactose, varying the concentration of total dissolved solids (5, 10, 15, 20 and 25% w/v), to settle the best concentration of whey for studies of supplementation. The highest amount of biomass produced, combined with the lowest post acidification was found in whey at 10% (w/v) of total solids, wherein the microorganism presented at the end of culture (30 hours) a counting of 9.13 log CFU/mL and pH 4.29, respectively. It was also verified the influence from the culture media on B. lactis growth and production of bacteriocin on a rotary shaker (shaker), which was the comparative analysis from the effect of supplementation by 1% of the following ingredients: yeast extract (EL), inulin (I), L-cysteine (IC) and Tween 80 (T80). The best growing conditions found for higher biomass and bacteriocin production were obtained from the whey concentration of 10% (w/v) supplemented with 1% yeast extract (9.9 log CFU/ml to 200 AU/mL). In the final stage of the work, these conditions were tested in bench fermentor, where it was observed that the growth of Bifidobacterium lactis was 10% higher than in the rotary shaker. Regarding the activity of bacteriocin produced in fermenter bench, there was no difference in the rotary shaker (200 AU / mL). This difference in growth may be due to the better anaerobic conditions offered in bench fermentor, which was the injection of nitrogen into the medium, and in a rotary shaker, the anaerobic condition was generated by an external agent to the medium (use of anaerobic jars). Through this study, it can be concluded that bacteriocin production by B. lactis is achievable and shows promising results when used the combination whey added yeast extract, which showed antimicrobial activity against the strain Listeria monocytogenes. The optimization process bench fermentor has been shown interesting as bacteriocin production at industrial level.

O objetivo desse trabalho foi avaliar o chocolate meio amargo, uma matriz alimentícia pouco explorada no mercado de produtos probióticos, porém muito atrativa para os consumidores, para a adição de Lactobacillus acidophilus (LA3) e Bifidobacterium animalis subsp. lactis (BLC1) na forma livre ou encapsulada. Na primeira etapa do trabalho, micropartículas sólidas lipídicas (MSL) foram produzidas por spray chilling ou recobertas por interação eletrostática dos polímeros (PLRIE), sendo em seguida caracterizadas para verificar se os métodos de encapsulação foram eficientes para a proteção dos probióticos. Na segunda etapa, foram elaboradas e caracterizadas amostras de chocolate meio amargo adicionadas dos probióticos nas formas livre ou encapsulada por spray chilling. Além disso, os produtos foram avaliados sensorialmente por 100 provadores para verificar sua aceitação sensorial. Em relação ao ensaio de sobrevivência dos micro-organismos aos fluidos gastrointestinais simulados, as contagens das populações de LA3 e BLC1 livres, antes de serem aplicados em chocolate, reduziram respectivamente 2,5 e 4 log UFC/g. Após a aplicação dos probióticos em chocolate meio amargo, LA3 e BLC1 livres apresentaram reduções em suas populações de 0,25 e 0,30 log UFC/g, respectivamente, sendo que ambas as contagens das populações encapsuladas apresentaram um decréscimo de aproximadamente 0,50 e 1,10 log UFC/g. Após 120 dias de estocagem do chocolate a 25 °C, as contagens das populações de LA3 e BLC1, na forma livre, apresentaram reduções de 1,40 e 0,70 log UFC/g, enquanto que para as populações dos micro-organismos encapsulados, as contagens foram abaixo do limite de detecção do método. As amostras de chocolate apresentaram aw abaixo de 0,6, pH entre 5,77 - 5,87, teor de gordura e de fenólicos, respectivamente de 34% e 15 mg de ácido gálico equivalente/g de chocolate. Em relação à textura, foi verificado que todas as amostras de chocolate apresentaram um ligeiro incremento da dureza após o período de armazenamento. Por meio do microscópio eletrônico de varredura (MEV) foi visualizada a presença de cristais de gordura, fat bloom, após 120 dias de estocagem em todas amostras de chocolate, o que pode ser relacionado também com o aumento do índice de brancura. Na avaliação sensorial, todas as amostras apresentaram nota de aceitação acima de 7,1, na escala hedônica de 9 pontos. Além disso, todos os produtos apresentaram pelo menos 75% de intenção de compra. Portanto, demonstrou-se que o chocolate meio amargo é uma ótima matriz alimentícia devido a sua composição e características físico-químicas para incorporação de probióticos, não sendo necessária a refrigeração do produto para manter a população dos probióticos durante esse período de estocagem, somando-se ao fato do produto não ter sido alterado sensorialmente após a adição dos micro-organismos probióticos. / The aim of this study was to evaluate the semisweet chocolate, a food matrix little explored in the market of probiotic products, however, very attractive for consumers, for the addition of Lactobacillus acidophilus (LA3) and Bifidobacterium animalis subsp. lactis (BLC1) in free form or encapsulated. In the first stage of the work, solid lipid microparticles (SLM) were produced by spray chilling or covered by electrostatic interaction of polymers (LPCEI), and then characterized to verify if encapsulation methods were efficient for the protection of probiotic cells. In the second stage, semisweet chocolate samples added of probiotics in free form or encapsulated by spray chilling were prepared and characterized. Moreover, the products were evaluated sensorially by 100 panelists to verify their global acceptance.With respect to the test of microorganism survival to simulated gastrointestinal fluids, the counts of LA3 and BLC1 in free form, before being added to chocolate, have reduced respectively 2,5 and 4 log CFU/g. After the application of probiotics in semisweet chocolate, LA3 and BLC1 free have shown reductions in their populations of 0,25 and 0,30 log CFU/g, respectively, and both counts of encapsulated populations have decreased approximately 0,50 and 1,10 log CFU/g. After 120 days of storage of the chocolate at 25 ° C, the counts of LA3 and BLC1 in free form showed reductions of 1,40 and 0,70 log CFU/g, while in the populations of encapsulated microorganisms, the counts were below method detection limit. The samples of chocolate presented aw below 0,6, pH between 5,77 to 5,87, fat and phenolic, respectively, 34% and 15 mg gallic acid equivalent/g of chocolate. Concerning the texture, it has been found that all samples chocolate showed a slight increase in the hardness after storage. Scanning electron microscope (SEM) has been used to visualize the presence of fat crystals and all samples of chocolate presented fat bloom after 120 days of storage, which can also be correlated with the increase in whiteness index. Regarding the sensory evaluation, all samples have shown acceptance mark above 7,1, on a hedonic scale of 9 points. In addition, all products have had at least 75% of purchase intent. Therefore, it has been demonstrated that the semisweet chocolate is an excellent food matrix due to its composition and physical-chemical properties for incorporation of probiotics, adding to the fact that is not necessary to cool the product to maintain the bacterial population during this storage period, as well as it has not been altered sensory after the addition of probiotics microorganisms.