Recent years have seen tremendous developments in methods for computational modeling of (bio-) molecular systems. Ever larger reactive systems are being studied with high accuracy approaches, and high-level QM/MM calculations are being routinely performed. However, applying high-accuracy methods to large biological systems is computationally expensive and becomes problematic when conformational sampling is needed. To address this challenge, classical force field based approaches such as free energy perturbation (FEP) and empirical valence bond calculations (EVB) have been employed in this work. Specifically: Force-field independent metal parameters have been developed for a range of alkaline earth and transition metal ions, which successfully reproduce experimental solvation free energies, metal-oxygen distances, and coordination numbers. These are valuable for the computational study of biological systems. Experimental studies have shown that the epoxide hydrolase from Solanum tuberosum (StEH1) is not only an enantioselective enzyme, but for smaller substrates, displays enantioconvergent behavior. For StEH1, two detailed studies, involving combined experimental and computational efforts have been performed: We first used trans-stilbene oxide to establish the basic reaction mechanism of this enzyme. Importantly, a highly conserved and earlier ignored histidine was identified to be important for catalysis. Following from this, EVB and experiment have been used to investigate the enantioconvergence of the StEH1-catalyzed hydrolysis of styrene oxide. This combined approach involved wildtype StEH1 and an engineered enzyme variant, and established a molecular understanding of enantioconvergent behavior of StEH1. A novel framework was developed for the Computer-Aided Directed Evolution of Enzymes (CADEE), in order to be able to quickly prepare, simulate, and analyze hundreds of enzyme variants. CADEE’s easy applicability is demonstrated in the form of an educational example. In conclusion, classical approaches are a computationally economical means to achieve extensive conformational sampling. Using the EVB approach has enabled me to obtain a molecular understanding of complex enzymatic systems. I have also increased the reach of the EVB approach, through the implementation of CADEE, which enables efficient and highly parallel in silico testing of hundreds-to-thousands of individual enzyme variants.

As lipases têm um papel importante no desenvolvimento da biotecnologia e são empregadas na química orgânica como biocatalisadores com alta regio- quimio- e enantiosseletividade. Além de permitir sínteses mais sustentáveis e que estão em concordância com os princípios da Química Verde. A resolução enzimática de aminas racêmicas tem se mostrado uma maneira eficiente de obter aminas enantiomericamente puras, que podem ser empregadas na síntese assimétrica de fármacos e agroquímicos. Neste trabalho a resolução enzimática de 4 aminas primárias sendo elas 2-amino-heptano 1, 2-metil-cicloexil amina 3, 1-metil-3-fenilpropilamina 2, 1,2,3,4-tetra-hidro-1-naftilamina 4, foram estudadas obtendo-se resultados relevantes. Para a 2-amino-heptano 1 resultados semelhantes aos da literatura foram obtidos com uma redução de 2,4 vezes no tempo reacional quando a resolução cinética foi em hexano na presença de CAL-B e acetato de etila como acilante obteve-se uma conversão na (R)-N-(1-metil-hexil)acetamida 4 de 42% e um excesso enantiomérico de 88% (tempo = 7h). Observaram-se também os efeitos da concentração de lipase no meio reacional, da temperatura e de diferentes solventes frente a 11 lipases. Os primeiros estudos de resolução cinética enzimática com a 2-metilcicloexil-amina 3 são apresentados neste trabalho com conversões de até 98% porém sem excesso enantiomérico. Uma outra característica das lipases é a capacidade de catalisar reações diferentes da sua função natural (promiscuidade), o que permite que elas catalisem reações de adição de Michael, além de suas reações normais que são a hidrólise e esterificação. A adição de Michael catalisada por lipases entre as 4 aminas primárias já citadas e acrilonitrila foi estudada com e sem a influência da irradiação micro-ondas, demonstrando a maior estabilidade de lipases imobilizadas sob irradiação micro-ondas. Os adutos de Michael obtidos (3-[(1-metil-hexil)amino]propanonitrila 9, 3-[(1-metil-3-fenilpropil) amino]propanonitrila 10, 3-[(2-metil cicloexil)amino]propanonitrila 11 e 3-(1,2,3,4-tetra-hidronaftaleno-1-amino)propanonitrila 12) foram sintetizados pela primeira vez com a metodologia onde foi utilizada a água, acrilonitrila e irradiação micro-ondas e os adutos 9, 10 e 11 não são descritos na literatura. Outro viés do trabalho foi a clonagem e expressão da álcool desidrogenase de Bacillus subtilis que foi clonada, expressa e purificada com sucesso. O interesse em tal enzima deve-se a resultados obtidos na literatura onde a utilização de células íntegras de B. subtilis apresentou a redução de cetonas a álcoois com alta enantiosseletividade. / Lipases present an important role in the development of biotechnology and are employed as biocatalysts in organic chemistry with high regio-, quimioand enantioselectivity. Besides allowing more sustainable syntheses that are consistent with the principles of Green Chemistry. The enzymatic resolution of amines has been shown to be an efficient way to obtain enantiomerically pure amines, which can be used in asymmetric synthesis of pharmaceuticals and agrochemicals. In this work the enzymatic resolution of 4 primary amines them being 2-amino-heptane textbf 1, 2-methyl-cyclohexyl amine 3, 1-methyl-3-phenylpropylamine 2 1.2 ,3,4-tetrahydro-1-naphthylamine 4 were studied by obtaining relevant results. For the 2-amino-heptane 1 promoted results similar to the literature and were obtained with a 2.4 times reduction of the reactional time when the kinetic resolution was in hexane in the presence of CAL-B and ethyl acetate as acylating obtained a conversion in (R)-N-(1-methyl-cyclohexyl) acetamide 4 by 42 % and an enantiomeric excess of 88 % (time = 7h). We studied the effects of the concentration of lipase in the reaction, temperature and solvent using 11 different lipases. The first studies of enzymatic kinetic resolution with 2-methyl-cyclohexyl- amine 3 are presented in this work with conversions up to 98% but without enantiomeric excess. The ability of lipases to catalyze reactions with different natural function (promiscuity) is an important property, which allows them to catalyze Michael addition reactions beyond their normal reactions, the hydrolysis and esterification. The Michael addition catalyzed by lipases between the four aforementioned primary amines and acrylonitrile was studied with and without the influence of microwave irradiation, demonstrating the greater stability of immobilized lipases under microwave irradiation. The Michael adducts obtained (3 - [(1-methylhexyl) amino] propanonitrile 9, 3 - [(1-methyl-3-phenylpropyl) amino] propanonitrile 10, 3 - [(2 - methyl cyclohexyl) amino] propanonitrile 11 and 3 - (1,2,3,4-tetrahydronaphthalene-1-amino) propanonitrile 12) were first synthesized with the method where water is used, acrylonitrile and microwave radiation, the adducts 9,10 and 11 are not described in the literature. Another investigation of this study was the cloning and expression of alcohol desidrogrenase of Bacillus subtilis which has been cloned, expressed and purified successfully. Interest in the enzyme due to results in the literature where the use of whole cells of B. subtilis showed the reduction of ketones with high enantioselectivity.

Diversos biomateriais podem ser aplicados como suportes na imobilização de células totais de fungos filamentosos ou enzimas isoladas, visando a manutenção e o prolongamento da atividade enzimática em processos biocatalíticos. Exemplos promissores de biomateriais são a fibroína da seda e o alginato de sódio. A fibroína é um material protéico com alta estabilidade térmica, elasticidade, resistência à tensão, não sofre ataque microbiano, baixo custo de purificação e alta tenacidade, o alginato é um biopolímero versátil, devido a suas propriedades gelificantes em soluções aquosas. Assim, neste trabalho empregou-se micélios do fungo derivado de ambiente marinho, Penicillium citrinum CBMAI 1186, livres e imobilizados em biopolímeros (fibra de algodão, fibra de fibroína da seda e fibra de paina) na biorredução quimiosseletiva, regiosseletiva e enantiosseletiva da ligação α,β-C=C de enonas α,β-, α,β,γ,δ- e di-α,β-insaturadas previamente sintetizados pela a reação de condensação aldólica. Foi possível a utilização do fungo P. citrinum CBMAI 1186 na redução quimiosseletiva, regiosseletiva e enantiosseletiva da ligação dupla carbono-carbono de sistemas α,β-insaturados. A imobilização do fungo P. citrinum CBMAI 1186 em biopolímeros (algodão, fibroína da seda, paina e quitosana) permitiu a prolongamento da atividade celular do fungo. O protocolo desenvolvido foi capaz de obter compostos até então descritos apenas por síntese clássica. Também foi realizado reações de resolução enzimática de derivados de haloidrinas por diferentes lipases microbianas de: Pseudomonas fluorescens, Candida cylindracea, Rhizopus niveus e Aspergillus niger. A lipase de P. fluorescens foi imobilizada em esferas de fibroína do bicho da seda (método 1, via adsorção) e em blenda com alginato de cálcio (método 2, via encapsulação) em diferentes condições, tais como, variação de solvente, variação da quantidade de enzima imobilizada e tempo de reação. As condições otimizadas foram empregadas em diferentes haloidrinas, rendendo elevados excessos enantioméricos (ee > 99%) e alta razão enanantiomérica (E > 200) para os produtos acetilados. Foi possível desenvolver um protocolo simples, barato e prático para a síntese enantiosseletiva de haloidrina reforçando a versatilidade da fibroína e do alginato como suportes de imobilização para catalisadores heterogêneos. Também foi possível utilizar a lipase imobilizada (método 2) na reação de transesterificação para obtenção do biodiesel etílico. As melhores condições para o bom funcionamento do biocatalisador foram: 30% do biocatalisador, 20% de n-hexano, relação óleo e etanol de 1:4 a 32 ºC por 48 h em agitação magnética (400 rpm). Essas condições permitiram a formação de 42% de rendimento do biodiesel etílico. O biocatalisador apresentou algumas limitações reacionais, tais como, fragilidade frente a elevadas temperaturas (> 32 ºC) e prolongado tempo de agitação magnética. Porém, permaneceu apto no meio por 4 ciclos consecutivas. Conclui-se que os biomateriais (fibroína, alginato e quitosana) podem ser utilizados como alternativas versáteis na imobilização de micélios de fungos filamentoso e de enzimas isoladas para aplicações em biocatalíticas. / Various biomaterials have been used as matrices for immobilization of whole filamentous fungi or isolated enzymes in order to maintain and extend enzyme activity in biocatalytic processes. Promising examples of biomaterials include silk fibroin and sodium alginate. Fibroin is a protein with high thermal stability, elasticity, and tensile strength; the ability to resist microbial attacks; and low purification costs. Owing to its gelling properties in aqueous solutions, alginate is a versatile biopolymer. In this work, we used the mycelia of a marine fungus, Penicillium citrinum CBMAI 1186, in the free form as well as immobilized in biopolymers (cotton fiber, silk fibroin, and kapok fiber) for the chemoselective, regioselective, and enantioselective bioreduction of the α,β-C=C bond of unsaturated α,β-, α,β,γ,δ-, and di-α,β-enones previously synthesized by aldol condensation. P. citrinum CBMAI 1186 successfully performed chemoselective, regioselective, and enantioselective reduction of the double carbon-carbon bond in unsaturated α,β-systems. Immobilization of P. citrinum CBMAI 1186 in biopolymers (cotton, silk fibroin, kapok fiber, and chitosan) prolonged the biocatalytic activity of the fungus. This protocol could be used to obtain compounds that have until now only been produced using classic synthesis methods. Enzymatic resolution of derivatives of halohydrins by lipases from Pseudomonas fluorescens, Candida cylindracea, Rhizopus niveus, and Aspergillus niger was also carried out. P. fluorescens lipase was immobilized in silk fibroin spheres (method 1, via adsorption) and in a calcium alginate blend (method 2, via encapsulation) under different conditions, i.e., different solvents, quantity of immobilized enzyme, and reaction time. The optimized conditions were used to resolve different halohydrins, and the acetylated products were obtained at high enantiomeric excess (ee > 99%) and high enantiomeric ratio (E > 200). A simple, inexpensive, and convenient protocol was developed for the enantioselective synthesis of halohydrins. The results highlight the versatility of fibroin and alginate as immobilization matrices for heterogeneous catalysts. The lipase immobilized by method 2 was also used in a transesterification reaction to obtain ethyl biodiesel. The optimum conditions for biocatalysis were: 30% biocatalyst, 20% n-hexane, and oil-to-ethanol ratio of 1:4 at 32°C for 48 h on a magnetic stirrer (400 rpm). Under these conditions, the yield of ethyl biodiesel reached 42%. Biocatalysts have some limitations, such as low stability at temperatures > 32°C and prolonged time of magnetic stirring. However, the catalysts remained active for 4 consecutive cycles. In conclusion, biomaterials (fibroin, alginate, and chitosan) can be used as versatile alternatives for immobilization of fungal mycelium and isolated enzymes for use in biocatalysis.

Neste trabalho foram realizadas as resoluções cinéticas das haloidrinas racêmicas (RS)-1-benziloxi-3-cloropropan-2-ol (4a), (RS)-1-benziloxi-3-bromopropan-2-ol (4b), (RS)-1-cloro-3-(4-metoxifenoxi)propan-2-ol (5a), (RS)-1-bromo-3-(4-metoxifenoxi)propan-2-ol (5b), (RS)-1-aliloxi-3-cloro-propan-2-ol (6a) e (RS)-1-aliloxi-3-bromo-propan-2-ol (6b) empregando-se a lipase comercial de Candida antarctica CALB como catalisador e acetato de vinila como agente acilante. As razões enantioméricas das resoluções cinéticas foram determinadas com o intuito de avaliar a influência dos grupos substituintes halogênios presentes nas haloidrinas na eficiência das resoluções cinéticas desses substratos. Os valores de razão enantiomérica obtidos foram: E = 5,6, 4a; E = 4,3, 4b; E = 98, 5a; E = 6,6, 5b; E = 20, 6a; E = 5,8, 6b. Assim, somente as resoluções cinéticas das cloroidrinas 5a e 6a apresentaram valores de E característicos de resoluções eficientes, fornecendo os produtos (R)-1-cloro-3-(4-metoxifenoxi)propan-2-ol 5a com rendimento de 46% e ee = 40%; (S)-acetato de 1-cloro-3-(4-metoxifenoxi)propan-2-ila 8a com rendimento de 40% e ee = 97%; (R)-1-aliloxi-3-cloro-propan-2-ol (R)-6a com rendimento de 45% e ee = 72% e (S)-acetato de 1-aliloxi-3-cloro-propan-2-ila (S)-9a com rendimento de 41% e ee = 81%. Realizou-se também uma triagem com os fungos de origem marinha Bostryospharia sp. Br09, Eutypella sp. Br23, Hidropisphaera sp. Br27, Xylaria sp. Br61, Aspergillus sydowii Ce19, Aspergillus sydowii Ce15, Penicillium raistriicki Ce16, Penicillium oxalicum F30 e Penicillium citrinum F53 frente aos produtos naturais sclareol, ambrox e sclareolide, a fim de selecionar os micro-organismos capazes de promover reações de bio-oxidação nesses substratos. Os metabólitos hidroxilados obtidos nas reações de biotransformação foram: 3β-hidroxi-ambrox 10a (rendimentos de 17% e 11%, com os fungos Br09 e Br23, respectivamente); 1β-hidroxi-ambrox 10b (rendimento de 14% com o fungo Ce19); 3β-hidroxi-sclareol 11a (rendimentos de 31%, 69% e 55%, com os fungos Br61, Br09 e Br23, respectivamente); 18-hidroxi-sclareol 11b (rendimento de 10% com o fungo Br61); 3β-hidroxi-sclareolide 12a (rendimentos de 34% e 7%, com os fungos Br09 e Br23, respectivamente). Realizou-se também um estudo utilizando-se três meios de cultura líquidos (meio sintético, meio YM e meio PDB) para a reação de biotransformação do sclareol 11 no composto ambradiol 13 com a levedura Hyphozyma roseonigra. Observou-se que a reação com o meio de cultura líquido PDB apresentou os melhores resultados, com uma grande eficiência na conversão do substrato no produto de interesse, o qual foi obtido com um rendimento de 82%. Esta reação foi realizada também através de um processo fermentativo conduzido em biorreator, apresentando bons resultados quanto à conversão da reação, porém com a desvantagem do alto custo do meio de cultura PDB, o que dificulta a realização deste processo fermentativo em larga escala. / In this work we performed kinetic resolutions of the racemic halohydrins (RS)-1-benzyloxy-3-chloropropan-2-ol (4a), (RS)-1-benzyloxy-3-bromopropan-2-ol (4b), (RS)-1-chloro-3-(4-methoxyphenoxy)propan-2-ol (5a), (RS)-1-bromo-3-(4-methoxyphenoxy)propan-2-ol (5b), (RS)-1-allyloxy-3-chloro-propan-2-ol (6a) and (RS)-1-allyloxy-3-bromo-propan-2-ol (6b) using the lipase from Candida antarctica CALB as catalyst and vinyl acetate as acylating agent. The enantiomeric ratios of the kinetic resolutions were determined in order to evaluate the influence of the halogen substituents present in halohydrins in the efficiency of the kinetic resolutions of these substrates. The enantiomeric ratio values obtained were: E = 5.6, 4a; E = 4.3, 4b; E = 98, 5a; E = 6.6, 5b; E = 20, 6a; E = 5.8, 6b. Thus, only the kinetic resolutions of the chlorohydrins 5a and 6a showed characteristic values of E of efficient resolutions, providing the products (R)-1-chloro-3-(4-methoxyphenoxy)propan-2-ol 5a with 46% yield and ee = 40%; (S)-1-chloro-3-(4-methoxyphenoxy)propan-2-yl acetate 8a with 40% yield and ee = 97%; (R)-1-allyloxy-3-chloro-propan-2-ol (R)-6a with 45% yield and ee = 72% and (S)-1-allyloxy-3-chloro-propan-2-yl acetate (S)-9a with 41% yield and ee = 81%. We also performed a screening with the marine fungi Bostryospharia sp. Br09, Eutypella sp. Br23, Hidropisphaera sp. Br27, Xylaria sp. Br61, Aspergillus sydowii Ce19, Aspergillus sydowii Ce15, Penicillium raistriicki Ce16, Penicillium oxalicum F30 and Penicillium citrinum F53 using the natural products ambrox, sclareol and sclareolide in order to select the microorganisms capable of promoting bio-oxidation reactions of these substrates. The hydroxylated metabolites obtained from the biotransformation reactions were: 3β-hydroxy-ambrox 10a (17% and 11% yield with Br09 and Br23, respectively); 1β-hydroxy-ambrox 10b (14% yield with Ce19); 3β-hydroxy-sclareol 11a (31%, 69% and 55% yield with Br61, Br23 and Br09, respectively); 18-hydroxy-sclareol 11b (10% yield with Br61); 3β-hydroxy-sclareolide 12a (34% and 7% yields with Br09 Br23, respectively). We also performed a study employing three liquid culture media (synthetic, YM and PDB media) for the biotransformation reaction of sclareol 11 into ambradiol 13 using Hyphozyma roseonigra as catalyst. The reaction with the liquid culture media PDB showed the best results, with a high efficiency in the conversion of the substrate into the desired product, which was obtained in 82% yield. This reaction was also performed using a fermentation process conducted in a bioreactor, with good results, however with the disadvantage of the high cost of culture media PDB, which hinders the performance of this large-scale fermentation.

O capítulo 1 descreve o estudo da biorredução do grupo carbonílico de cetoazidas e β-ceto-1,2,3-triazois para a produção de β-hidroxi-1,2,3-triazois enantiomericamente puros ou enriquecidos. Cinco linhagens de fungos de origem marinha foram avaliadas para a redução da 2-azido-1-feniletanona 1 e duas linhagens, A. sydowii CBMAI 935 e M. racemosus CBMAI 847, foram selecionadas também para a biorredução das 2-azido-1-feniletanonas 2-4 para a produção dos (R)- e (S)-2-azido-1-feniletanois 2a-4a. Os azidoálcoois enantiomericamente enriquecidos obtidos 1a-4a das reações biocatalíticas foram empregados como material de partida para a síntese dos β-hidroxi-1,2,3-triazois 7a-10a enantiomericamente enriquecidos através da click reaction entre a azida terminal e o alcino, fenilacetileno. Uma segunda abordagem para a obtenção de β-hidroxi-1,2,3-triazois enantiomericamente enriquecidos foi o estudo da biorredução de β-ceto-1,2,3-triazois, que são cetonas contendo dois substituintes volumosos. Uma triagem inicial para a biorredução do β-ceto-1,2,3-triazol 7 foi realizada com seis linhagens de fungos de origem marinha, na qual a linhagem do fungo P. citrinum CBMAI 1186 foi selecionada para estudos de otimização da reação biocatalítica. Estudos com variação do meio reacional, utilização de co-solvente e efeito do pH mostraram que as condições ótimas de reação foram utilizando-se tampão fosfato (Na2HPO4/KH2PO4, 0,07 M) em pH 5 e metanol 5% (v/v) como co-solvente. O fungo P. citrinum CBMAI 1186 foi empregado na biorredução dos β-ceto-1,2,3-triazois 8-12 com excelentes resultados de rendimento e seletividade para a produção dos (S)-β-hidroxi-1,2,3-triazois 8a-12a. O Capítulo 2 apresenta a síntese multienzimática da diidropinidina, um alcaloide de origem natural. A nonano-2,6-diona utilizada como material de partida foi obtida através da descarboxilação do dicetoéster, 2-butiril-5-oxo-hexanoato de etila. Estudos para a otimização tanto da síntese do dicetoéster quanto da etapa de descarboxilação foram realizados. Condições ótimas de produção do 2-butiril-5-oxo-hexanoato de etila foram obtidas através da reação da but-3-em-2-ona com o 3-oxo-hexanoato de metila catalisada por CeCl3/NaI. A descarboxilação do dicetoéster foi avaliada através do método de Krapcho empregando-se sais de cloro e água em altas temperaturas, entretanto, a elevada formação de subprodutos estimulou a busca por uma diferente metodologia para a obtenção da nonano-2,6-diona. Foram avaliadas diferentes lipases e esterases para a hidrólise enzimática do dicetoéster seguida por descarboxilação por HCl, na qual a esterase de fígado de porco foi selecionada e promoveu a hidrólise de até 1,6 M de dicetoéster para a produção da nonano-2,6-diona. Diferentes transaminases (TAs) foram estudadas para a aminação redutiva assimétrica da nonano-2,6-diona e duas linhagens foram selecionadas para a produção da (R)- e (S)-2-metil-6-propil-2,3,4,5-tetra-hidropiridina, as TAs de Arthrobacter sp. e Arthrobacter citreus, respectivamente empregando-se isopropilamina como amino doador. As (R)- e (S)-2-metil-6-propil-2,3,4,5-tetra-hidropiridina foram avaliadas pela redução assimétrica para a síntese da diidropinidina por imina redutases (IREDs) e duas linhagens foram selecionadas, a IRED de Mesorhizobium sp. e Norcardiopsis alba, respectivamente. TAs e IREDs foram acopladas em um sistema one-pot multienzimático utilizando como material de partida a nonano2,6-diona (100 mM) para a obtenção dos isômeros cis da diidropinidina com excelentes excessos diastereoisoméricos. / The Chapter 1 describes the bioreduction of the carbonyl group of ketoazides and β-keto-1,2,3-triazoles to produce enantiomerically pure or enriched β-hydroxy-1,2,3-triazoles. Five marine-derived fungi strains were screened to perform the reduction of 2-azido-1-phenylethanone 1. The strains from A.sydowii CBMAI 935 and M. racemosus CBMAI 847 were selected for the bioreduction of the 2-azido-1-phenylethanones 2-4 to yield the (R)- and (S)-2-azido-1-phenylethanols 2a-4a. The enantiomerically enriched azidoalcohols 1a-4a obtained from biocatalytical reactions were used as starting materials for the synthesis of enantiomerically enriched β-hydroxy-1,2,3-triazoles 7a-10a through the click reaction between the terminal azide and phenylacetylene. A second approach for obtaining enantiomerically enriched β-hydroxy-1,2,3-triazoles was the bioreduction of β-keto-1,2,3-triazoles, which are ketones with two bulky substituents. The screening for the bioreduction of the β-keto-1,2,3-triazol 7 was performed with six marine-derived fungi strains and P. citrinum CBMAI 1186 was selected for the optimization studies for the biocatalytic reduction of β-keto-1,2,3-triazoles 8-12.Studies about the composition of reaction medium, use of cosolvent and pH effect showed that the optimal conditions was in phosphate buffer (Na2HPO4/KH2PO4, 0.07 M) at pH 5 and methanol 5% (v/v) as cosolvent. P. citrinum CBMAI 1186 was applied to the bioreduction of β-keto-1,2,3-triazoles 8-12 and good yields and selectivities were obtained for the (S)-β-hydroxy-1,2,3-triazoles 8a-12a. The Chapter 2 describes the multienzymatic synthesis of dihydropinidine, a natural alkaloid. The nonane-2,6-dione used as starting material was obtained through the reduction of the diketoester, methyl butyryl-5-oxohexanoate, and the optimization studies for both diketoester synthesis and decarboxylation reaction were performed. Optimal conditions for the synthesis of methyl butyryl-5-oxohexanoate were obtained by the reaction between but-3-en-2-one and 3-oxohexanoate catalyzed by CeCl3/NaI. The diketoester decarboxylation step was evaluated by the Krapcho method using chlorine and water at high temperatures. However, because of the production of side products by this method, a different procedure for the synthesis of nonane-2,6-dione was studied. Different enzymes (lipases and esterases) were evaluated for the diketoester hydrolysis followed by decarboxylation by HCl. The porcine liver esterase was selected to promote the diketoester hydrolysis up to 1.6 M, yielding nonane-2,6-dione. Different transaminases (TAs) were applied to the asymmetric reductive amination of the nonane-2,6-dione and TAs from Arthrobacter sp. e Arthrobacter citreus were selected for the production of (R)- and (S)-2-methyl-6-propyl-2,3,4,5-tetrahydropyridine, respectively, using isopropylamine as the amine donor. The asymmetric reduction of (R)- and (S)-2-methyl-6-propyl-2,3,4,5-tetrahydropyridine by imine reductases (IREDs) was evaluated and the IREDs from Mesorhizobium sp. and Norcardiopsis alba were selected. TAs and IREDs were coupled in multienzymatic one-pot system using nonane-2,6-dione (100 mM) as starting material for the syntheses of cis isomers of dihydropinidine in excellent diastereoisomeric excess.

Os polímeros tornaram-se relevantes em nossa vida cotidiana devido à variedade de utilidades que estes possuem. Ao observarmos a nossa volta percebemos que estamos imersos em um mundo cheio de materiais poliméricos. A grande demanda destes materiais exige o incremento da produção global de polímeros. Isto traz consigo um maior consumo de recursos fósseis, acelerando o esgotamento dos mesmos e aumentando a geração e poluentes ambientais. Neste sentido, a polimerização enzimática tem sido considerada uma alternativa importante às técnicas convencionais de polimerização química. Existem descritos na literatura uma variedade de polímeros que foram preparados por polimerização enzimática e em alguns casos usando monômeros de origem biológica comercialmente disponíveis. Na grande maioria dos casos, esses compostos (monômeros) possuem sua reatividade bem estabelecida na literatura. Este projeto teve como motivação o estudo e desenvolvimento de metodologia visando obter novas poliamidas mediante polimerização enzimática em condições de fluxo contínuo, usando monômeros sintetizados a partir da integração de reações fotocatalíticas e reações enzimáticas. Em um primeiro momento, decidiu-se preparar o primeiro intermediário sintético, o 3-carbamoiloctanoato de metila (I), a partir da reação radicalar de amidação do trans-2-octenoato de metila com a formamida. Este composto foi usado como bloco de construção de novos monômeros. O amido-éster I desejado foi obtido a partir de três metodologias: Método fotocatalítico em condições de fluxo contínuo, utilizando como fotoiniciadores acetona e benzofenona; Método fotocatalítico em batelada, usando como fotocatalisador decatungstato de tetrakis(tetrabutilamônio) e método redox catalisado por Fe(II) em presença de ácido viii sulfúrico e peróxido de hidrogênio. A melhor condição reacional avaliada forneceu o composto com 47% de rendimento. Visando obter os monômeros de amida, uma vez obtido o primeiro intermediário de síntese, iniciou-se o estudo da reação de aminólise catalisada enzimaticamente deste substrato com mono e diaminas, em batelada e em fluxo contínuo, para compreensão da reatividade deste tipo de composto. Não foi possível obter o monômero desejado, ao invés disso, foi isolado o produto resultante da reação de aminólise de 1 equivalente do 3-carbamoiloctanoato de metila (I) com a 1,6-hexanodiamina. Este produto foi obtido com 11 % de rendimento. Paralelamente, com o desejo de obter poliamidas a partir de monômeros de base biológica, foi realizado um estudo da reação de aminólise do anidrido itacônico e itaconato de dimetila, com aminas alifáticas catalisada enzimaticamente sob condições de fluxo contínuo. Não foram obtidos os produtos desejados, ao invés disso, foi obtida a lactama correspondente com 70% de rendimento. / Polymers have become relevant in our lives due to their wide variety of applications. As we look around we realize that we are immersed in a world full of polymeric materials. The high demand for these materials requires an increase in the overall production of polymers. As a consequence, a higher consumption of fossil resources and an increasing generation of environmental pollutants would be expected. In this sense, enzymatic polymerization has been considered an important alternative to the conventional chemical polymerization techniques. A wide variety of polymers have been described in the literature, which have been prepared by enzymatic polymerization and in some cases using commercially available monomers from biological sources. In most cases, these compounds (monomers) have their reactivities well established in the literature. This project had as motivation a study and development of methodology to obtain new polyamides by enzymatic polymerization under continuous flow conditions, using monomers synthesized from the integration of photocatalytic reactions and enzymatic reactions. Initially, it was decided to prepare the synthetic intermediate (amide-ester I), from the amidation reaction of methyl trans-2-octenoate with formamide. This compound will be the building block for the new monomers. The desired amide-ester I was obtained from three methodologies: Photocatalytic method under continuous flow conditions, using acetone and benzophenone as photoinitiators; photocatalytic method using tetrabutylammonium decatungstenate photocatalyst and Fe (II) catalyzed redox method in the presence of sulfuric acid and hydrogen peroxide. The best reaction condition provided the compound in 47% yield. x In order to obtain the amide monomers, we began a study to understand the reactivity of this type of compound in aminolysis reaction with mono and diamines catalyzed by lipase, under batch and continuous flow conditions. The desired monomer could not be obtained, instead the product resulting from the aminolysis reaction of 1 equivalent of the methyl 3-carbamoyloctanoate (I) with the 1,6-hexanediamine was isolated. This product was obtained in 11% yield. In parallel, also aiming to obtain polyamides from biologically based monomers, a study of aminolysis reaction of itaconic anhydride and dimethyl itaconate with aliphatic amines catalyzed by lipase was carried out under continuous flow conditions. The desired products were not obtained, instead, the corresponding lactam in 70% yield was obtained.

Os ésteres são importantes compostos orgânicos, obtidos por síntese química ou extraídos de alguns produtos naturais utilizando-se solvente em meio adequado. Estudos mostram que enzimas, em particular lipases, podem ser aplicadas na síntese de diversos ésteres. O principal objetivo deste trabalho foi a obtenção de acetato de butila, um éster de aroma característico de abacaxi, utilizando lipase de Geotrichum candidum produzida em fermentação submersa e imobilizada em matriz polimérica de alginato de bário e gelatina reticulada com glutaraldeído. A caracterização bioquímica foi realizada tanto para a lipase na forma livre como para a lipase na forma imobilizada. O rendimento em conversão molar de substrato foi determinado por cromatografia gasosa. A enzima apresentou atividade enzimática máxima após 48 horas de fermentação de 37,7 U/mL. Os valores ótimos para pH e temperatura da enzima na forma livre e imobilizada foram pH 6,5 e 40 °C e pH 7,5 e 45 °C, respectivamente. A enzima na forma livre foi estável do pH 6,0 ao 8,0 e à temperatura de 35 a 45 °C, já na forma imobilizada, foi estável do pH 5,5 ao 8,5 e na faixa de temperatura de 30 a 55 °C. A lipase imobilizada teve seus parâmetros cinéticos determinados, e os valores obtidos para o Km e Vmax, foram 0,115 mmol e 0,718 µmol.mL-1.min-1, respectivamente. As melhores condições de síntese do bioaroma para a enzima na forma livre foram: temperatura de 30 °C, 12,5% de enzima em relação à quantidade de butanol utilizada, proporção molar do substrato 60% de acetato de vinila em um período de 24 horas. O rendimento alcançado neste caso foi de 97,2 % de conversão molar em acetato de butila. Para a enzima imobilizada as melhores condições foram: temperatura de 45 °C, 12,5% de enzima em relação à quantidade de butanol utilizada, proporção molar do substrato 60% de acetato de vinila em um período de 24 horas. O rendimento alcançado neste caso foi de 99,1%, que demonstra que lipase produzida por Geotrichum candidum na forma imobilizada apresenta excelente capacidade de sintetizar acetato de butila (bioaroma de abacaxi). / Esters are important organic compounds obtained by chemical synthesis or derived from some natural products using a solvent in appropriate medium. Studies have shown that enzymes, particularly lipases, ca be applied in the synthesis of various esters. The main objective of this study was to obtain butyl acetate, a characteristic ester aroma of pineapple, using lipase from Geotrichum candidum produced in submerged fermentation and immobilized in a barium alginate and gelatin polymer matrix crosslinked with glutaraldehyde. The biochemical characterization was performed for both free and immobilized lipases. The yield in molar conversion of substrate was determined by gas chromatography. The enzyme showed maximum enzymatic activity after 48 hours of fermentation of 37.7 U/mL. The optimum values for pH and temperature of the enzyme in free and immobilize form were pH 6.5 and 40 °C and pH 7.5 and 45 °C, respectively. The enzyme was stable in free form from pH 6.0 to 8.0 and at temperatures from 35 to 45 °C, and in the immobilized form from pH 5.5 to 8.5 and at temperatures from 30 to 55 °C. Kinetic parameters of the immobilized lipase were determined, and the values obtained for Km and Vmax were 0.115 mmol and 0.718 µmol.mL-1.min-1, respectively. The best conditions for the synthesis of flavor by enzyme in free form were: 30 °C of temperature, 12.5% of enzyme for the amount of butanol used, and molar ratio of substrate 60% of vinyl acetate in a 24 hours period. The yield achieved in this case was 97.2% of molar conversion in butyl acetate. For the immobilized enzyme the best conditions were: 45 °C of temperature, 12.5% of enzyme for the amount of butanol used, and molar ratio of substrate 60% of vinyl acetate in a 24 hours period. The yield achieved in this case was 99.1%, demonstrating that lipase produced by Geotrichum candidum in immobilized form has an excellent ability to synthesize butyl acetate (pineapple flavor).

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Submitted by Ricardo Cedraz Duque Moliterno (ricardo.moliterno@uefs.br) on 2017-07-12T22:04:17Z No. of bitstreams: 1 Tese vers?o final com ficha.pdf: 2919026 bytes, checksum: e0cf3c8db3a8cc81cb105cb2fbb154b3 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-12T22:04:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese vers?o final com ficha.pdf: 2919026 bytes, checksum: e0cf3c8db3a8cc81cb105cb2fbb154b3 (MD5) Previous issue date: 2016-08-03 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior - CAPES / The flavonoid rutin (3-0-rutinos?deo-quercetin) stands out among the natural products as a promising alternative in the fight against degenerative diseases and related to aging. However, the low solubility and stability thereof in different media, especially lipophilic limited applications in pharmaceutical preparations. The biocatalytic transformation by enzymatic acylation has been suggested by several authors, with good reaction yields. In this sense, the objective of this study was to promote the enzymatic acylation of rutin, using castor oil as acylating agent and lipase as a catalyst, to characterize the formed product, estimate the efficiency of bioconversion, and to investigate in vitro the antioxidant activity and cytotoxic effect opposite the reaction product Vero cells. The catalytic transformation occurred at 50?C for 120 hours. The product was subjected to column chromatography, followed by filtration by Sephadex LH-20. The chemical structure of rutin-O-ricinoleate was determined by Nuclear Magnetic Resonance (NMR) 1H and 13C and by liquid chromatography / mass spectroscopy (HPLC/MS). In another experiment, it was observed the formation of the ester content by High Performance Liquid Chromatography coupled to a detector diode arrangements (HPLC-DAD) under conditions which allow assessing the reaction yield over 120 hours. The analytical method proposed has been validated considering the linearity parameters, accuracy, precision, limit of quantification and detection proved to be suitable for quantification of ricinoleato rutin. It was found by this method that the reaction product maintained the antioxidant capacity of rutin and there was no evidence of cytotoxicity. / O flavonoide rutina (quercetina-3-0-rutinos?deo) se destaca entre os produtos naturais como uma alternativa promissora no combate ?s doen?as degenerativas e relacionadas ao envelhecimento. No entanto, a baixa solubilidade e estabilidade da mesma em diferentes meios, especialmente lipof?licos, limitam as aplica??es em prepara??es farmac?uticas. A transforma??o biocatal?tica, atrav?s da acila??o enzim?tica, tem sido sugerida por diversos autores, com bons rendimentos reacionais. Neste sentido, o objetivo do presente trabalho foi promover a acila??o enzim?tica da rutina, utilizando ?leo de mamona como agente acilante e lipase como catalizador, caracterizar o produto formado, estimar o rendimento da bioconvers?o, al?m de investigar in vitro a atividade antioxidante e o efeito citot?xico do produto reacional frente ?s c?lulas Vero. A transforma??o catal?tica ocorreu em temperatura de 50?C, durante 120 horas. O produto foi submetido ? cromatografia em coluna, seguida de filtra??o por Sephadex LH-20. A estrutura qu?mica da rutina-O-ricinoleato, foi determinada por Resson?ncia Magn?tica Nuclear (RMN) 1H e de 13C e por cromatografia l?quida/espectroscopia de massas (CLAE/EM). Em outro experimento, foi verificado o teor de forma??o do ?ster por Cromatografia ? L?quidos de Alta Efici?ncia acoplado a um detector de arranjos Diodos (CLAE-DAD), em condi??es que permitiram avaliar o rendimento reacional ao longo de 120 horas. O m?todo anal?tico proposto foi validado considerando os par?metros de linearidade, exatid?o, precis?o, Limites de quantifica??o e de detec??o mostrando-se adequado para a quantifica??o da rutina ricinoleato. Verificou-se pelos m?todos avaliados, que o produto reacional manteve a capacidade antioxidante da rutina e que n?o houve evid?ncia de citotoxicidade.

As lipases têm um papel importante no desenvolvimento da biotecnologia e são empregadas na química orgânica como biocatalisadores com alta regio- quimio- e enantiosseletividade. Além de permitir sínteses mais sustentáveis e que estão em concordância com os princípios da Química Verde. A resolução enzimática de aminas racêmicas tem se mostrado uma maneira eficiente de obter aminas enantiomericamente puras, que podem ser empregadas na síntese assimétrica de fármacos e agroquímicos. Neste trabalho a resolução enzimática de 4 aminas primárias sendo elas 2-amino-heptano 1, 2-metil-cicloexil amina 3, 1-metil-3-fenilpropilamina 2, 1,2,3,4-tetra-hidro-1-naftilamina 4, foram estudadas obtendo-se resultados relevantes. Para a 2-amino-heptano 1 resultados semelhantes aos da literatura foram obtidos com uma redução de 2,4 vezes no tempo reacional quando a resolução cinética foi em hexano na presença de CAL-B e acetato de etila como acilante obteve-se uma conversão na (R)-N-(1-metil-hexil)acetamida 4 de 42% e um excesso enantiomérico de 88% (tempo = 7h). Observaram-se também os efeitos da concentração de lipase no meio reacional, da temperatura e de diferentes solventes frente a 11 lipases. Os primeiros estudos de resolução cinética enzimática com a 2-metilcicloexil-amina 3 são apresentados neste trabalho com conversões de até 98% porém sem excesso enantiomérico. Uma outra característica das lipases é a capacidade de catalisar reações diferentes da sua função natural (promiscuidade), o que permite que elas catalisem reações de adição de Michael, além de suas reações normais que são a hidrólise e esterificação. A adição de Michael catalisada por lipases entre as 4 aminas primárias já citadas e acrilonitrila foi estudada com e sem a influência da irradiação micro-ondas, demonstrando a maior estabilidade de lipases imobilizadas sob irradiação micro-ondas. Os adutos de Michael obtidos (3-[(1-metil-hexil)amino]propanonitrila 9, 3-[(1-metil-3-fenilpropil) amino]propanonitrila 10, 3-[(2-metil cicloexil)amino]propanonitrila 11 e 3-(1,2,3,4-tetra-hidronaftaleno-1-amino)propanonitrila 12) foram sintetizados pela primeira vez com a metodologia onde foi utilizada a água, acrilonitrila e irradiação micro-ondas e os adutos 9, 10 e 11 não são descritos na literatura. Outro viés do trabalho foi a clonagem e expressão da álcool desidrogenase de Bacillus subtilis que foi clonada, expressa e purificada com sucesso. O interesse em tal enzima deve-se a resultados obtidos na literatura onde a utilização de células íntegras de B. subtilis apresentou a redução de cetonas a álcoois com alta enantiosseletividade. / Lipases present an important role in the development of biotechnology and are employed as biocatalysts in organic chemistry with high regio-, quimioand enantioselectivity. Besides allowing more sustainable syntheses that are consistent with the principles of Green Chemistry. The enzymatic resolution of amines has been shown to be an efficient way to obtain enantiomerically pure amines, which can be used in asymmetric synthesis of pharmaceuticals and agrochemicals. In this work the enzymatic resolution of 4 primary amines them being 2-amino-heptane textbf 1, 2-methyl-cyclohexyl amine 3, 1-methyl-3-phenylpropylamine 2 1.2 ,3,4-tetrahydro-1-naphthylamine 4 were studied by obtaining relevant results. For the 2-amino-heptane 1 promoted results similar to the literature and were obtained with a 2.4 times reduction of the reactional time when the kinetic resolution was in hexane in the presence of CAL-B and ethyl acetate as acylating obtained a conversion in (R)-N-(1-methyl-cyclohexyl) acetamide 4 by 42 % and an enantiomeric excess of 88 % (time = 7h). We studied the effects of the concentration of lipase in the reaction, temperature and solvent using 11 different lipases. The first studies of enzymatic kinetic resolution with 2-methyl-cyclohexyl- amine 3 are presented in this work with conversions up to 98% but without enantiomeric excess. The ability of lipases to catalyze reactions with different natural function (promiscuity) is an important property, which allows them to catalyze Michael addition reactions beyond their normal reactions, the hydrolysis and esterification. The Michael addition catalyzed by lipases between the four aforementioned primary amines and acrylonitrile was studied with and without the influence of microwave irradiation, demonstrating the greater stability of immobilized lipases under microwave irradiation. The Michael adducts obtained (3 - [(1-methylhexyl) amino] propanonitrile 9, 3 - [(1-methyl-3-phenylpropyl) amino] propanonitrile 10, 3 - [(2 - methyl cyclohexyl) amino] propanonitrile 11 and 3 - (1,2,3,4-tetrahydronaphthalene-1-amino) propanonitrile 12) were first synthesized with the method where water is used, acrylonitrile and microwave radiation, the adducts 9,10 and 11 are not described in the literature. Another investigation of this study was the cloning and expression of alcohol desidrogrenase of Bacillus subtilis which has been cloned, expressed and purified successfully. Interest in the enzyme due to results in the literature where the use of whole cells of B. subtilis showed the reduction of ketones with high enantioselectivity.