En este curso el alumno basándose en la curiosidad innata del ser humano, adentrará en el conocimiento profundo de la Bioquímica, a fin de obtener la base necesaria que le permita enfrentar los cursos posteriores que se desarrollarán en los siguientes años de su carrera. El objeto de esta guía es encaminar al alumno, bajo la dirección del Docente, por el mundo biológico desde lo más simple a lo complejo; la guía consta de una parte introductoria, con indicaciones generales a tomar en cuenta en todas las prácticas, y las indicaciones específicas por tema a desarrollar.

En este curso el alumno basándose en la curiosidad innata del ser humano, adentrará en el conocimiento profundo de la Bioquímica, a fin de obtener la base necesaria que le permita enfrentar los cursos posteriores que se desarrollarán en los siguientes años de su carrera. El objeto de esta guía es encaminar al alumno, bajo la dirección del Docente, por el mundo biológico desde lo más simple a lo complejo; la guía consta de una parte introductoria, con indicaciones generales a tomar en cuenta en todas las prácticas, y las indicaciones específicas por tema a desarrollar.

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Magister en Ciencias con mención en Biología / La FtsZ polimeriza para formar el anillo Z alrededor del perímetro transversal en el centro de la célula cuando la bacteria E. coli inicia la formación del septo. En este proceso participan varias proteínas Fts para formar el divisoma y FtsZ es la que se encuentra en mayor concentración. Una vez formado el anillo Z no se sabe cómo este induce la división celular. La polimerización de la FtsZ ha sido caracterizada in vitro y se sabe que induce su actividad GTPásica y forma protofilamentos por interacciones longitudinales que dan origen a láminas y túbulos a través de interacciones laterales. Estas características también son propias de la tubulina, proteína que presenta similitud estructural con la FtsZ, por esto, ambas proteínas se consideran homólogas. Se desconoce cuales son los polímeros funcionales dentro de la célula y que tipo de interacciones están involucradas. De allí que un buen modelo para entender las interacciones en los polímeros de la FtsZ son los microtúbulos. Una comparación estructural entre la tubulina y la FtsZ mostró que la hélice H3 de la FtsZ, donde se destaca la presencia de aminoácidos cargados, y el “loop” formado entre la hebra beta S3 y la hélice H3, rica en glicinas, estarían involucrados en las interacciones laterales. Con el fin de demostrar la importancia de las interacciones laterales de la FtsZ en la formación de los polímeros funcionales en la división celular de E. coli se construyeron mutantes puntuales de la EcFtsZ: E83Q y R85Q en la hélice H3 y G67P en el “loop” S3-H3. Los resultados mostraron que la viabilidad se redujo en las células que expresan solo las EcFtsZ mutantes con respecto al tipo silvestre en el siguiente orden: tipo silvestre > E83Q > G67P > R85Q. La caracterización in vitro de estas mutantes mostró que su polimerización decreció en el mismo orden que la viabilidad y que la actividad GTPásica decreció de manera diferente, de acuerdo al siguiente orden: tipo silvestre > G67P > E83Q > R85Q. Estos resultados muestran que hay una relación directa entre la polimerización y la viabilidad y que la velocidad de hidrólisis de GTP no está relacionada en forma directa con la viabilidad. Se concluye que en la polimerización de EcFtsZ y por ende en la división celular de E. coli son necesarias las interacciones intermoleculares de EcFtsZ mediadas por la hélice H3 y el “loop” S3-H3. / FtsZ polymerizes forming the Z ring around the perimeter in the middle of the E. coli dividing cell. In this process many Fts proteins are involved to form the divisome and FtsZ is the most abundant protein. After the Z ring formation, the mechanism that induces the cell cleavage is not totally understood. In vitro FtsZ polymerization induces the GTPase activity and form protofilaments, by longitudinal interactions, that assemble into sheets and tubes by lateral interactions. These characteristics are also observed in tubulin, which has a similar tridimensional structure with FtsZ, therefore both proteins are considered homologues. The FtsZ functional polymers in the living cells are unknown as well as the interaction involved. Thus, microtubules are a good model to understand the interactions involved in the FtsZ polymers. The structural comparison between tubulin and FtsZ indicates that lateral interaction of FtsZ through charged aminoacids, could be mediated by the H3 helix as found in tubulin. The same is valid for the glycine rich loop β strand S3–helix H3. To know, the role of the FtsZ lateral interactions in the E. coli dividing cells the following point mutations were constructed in the EcFtsZ: E83Q and R85Q located in the H3-helix and G67P in the S3-H3 loop. The viability of the cells that express the mutant EcFtsZ was reduced respect to the wild type in the following order: wild type > E83Q > G67P > R85Q. The in vitro characterization of these mutants showed that the polymerization decreased in the same order that the viability and the GTPase activity decreased in a different manner with following order: wild type > G67P > E83Q > R85Q. These results indicate that a direct relation exists between the viability of the cells and the polymerization of EcFtsZ and that the hydrolysis rate of GTP is not directly related with the viability. It is concluded that in the EcFtsZ polymerization, hence in the cellular division of E. coli, the intermolecular interactions of EcFtsZ, mediated by H3 helix and S3-H3 loop, are necessary.

Doctor en Ciencias con Mención en Biología Molecular, Celular y Neurociencias / La proteínaquinasa CK1 es una enzima altamente ubícua y conservada en todos los eucariontes estudiados y, particularmente, dentro de los vertebrados. En estos organismos, la enzima existe como una familia de siete miembros genéticamente distintos, denominados CK1#, #, #1, #2, #3, # y #. Hasta el momento se ha determinado que los mensajeros de tres de estas isoformas, #, #1 y #3, sufren procesamiento alternativo, dando lugar así a nuevas variantes. En particular, el mRNA de la isoforma a da origen a 4 subisoformas, definidas por la presencia o ausencia de 2 segmentos adicionales, llamados inserto L e inserto S. El primero se ubica en medio del dominio catalítico de la enzima, en la llamada region “bisagra” y el segundo se encuentra localizado en el extremo C-terminal. La coexistencia de algunas o todas estas variantes se ha descrito anteriormente en rata, pollo y humano y las secuencias de los insertos se encuentran altamente conservadas entre estas especies. En esta Tesis, se clonaron las cuatro variantes de procesamiento de CK1# de pez cebra ( Danio rerio ) y se expresaron tanto en células de E. coli como en células eucarióticas en cultivo. La caracterización bioquímica de las variantes recombinantes expresadas en bacterias determinaron que las que contienen el inserto L tienen una menor afinidad por ATP, al igual que por el inhibidor específico, CKI-7, que compite por el sitio de unión del nucleótido. Estas variantes, además, muestran una mayor actividad hacia #-caseína, aunque no existen diferencias en el valor de la Km aparente entre las cuatro isoformas con respecto a los sustratos proteicos y peptídicos ensayados, #-caseína, fosvitina y el péptido RRKDLHDDEEDEAM SITA, derivado del inhibidor-2 de la proteína fosfatasa 1 (PPI2). Las variantes L también exhiben una mayor termolabilidad a 40°C, comparadas con las que no contienen este inserto. Esta secuencia contiene además un sitio canónico para la fosforilación por PKA y, al ser incubadas con esta enzima, la fosforilación es estimulada en 2 veces para CK1#, 6 veces para #S, 16 veces para #L y aproximadamente 70 veces para #LS. Esto sugiere que la PKA fosforila a CK1#, en particular dentro de los insertos y especialmente el inserto L. Por otro lado, las cuatro variantes poseían actividad autofosforilativa y tirosinaquinasa. Otro aspecto abordado en esta Tesis fue la fosforilación de NFAT4 por CK1. El trabajo de Zhu y col. (1998) demuestra que este factor de transcripción es fosforilado in vivo por CK1# y que esta fosforilación previene la entrada de NFAT4 al núcleo. En esta publicación se describe un putativo sitio de acoplamiento o “docking” dentro de la secuencia donde interactúa CK1. En nuestro estudio se utilizaron péptidos sintéticos que abarcaban las regiones conservadas A y Z y la región “linker” entre ellas (L). Tanto las variantes de CK1a de pez cebra como CK1 nativa purificada de hígado de rata fosforilaban residuos no canónicos contenidos en la región A2, pero no la Z, a diferencia de lo encontrado por Zhu y col. (1998). Una extensión de residuos acídicos presentes en la región L demostró ser esencial para la fosforilación eficiente del dominio A2, como se pudo determinar por un aumento en la Km de un orden de magnitud provocada por la deleción de la región L o por la sustitución de los residuos acídicos por glicinas o alaninas. Este resultado también difiere de los de Zhu y col., que habían ubicado el sitio “docking” en la región A2. Por otro lado, al reemplazar una de las serinas del extremo N-terminal de la región A2, la Ser177, por fosfoserina, se desencadena un efecto jerárquico que provoca un aumento dramático en la eficiencia de fosforilación del péptido. Estos datos son consistentes con un mecanismo bifásico de fosforilación, en que la región L provee un sitio “docking” funcional que facilita la fosforilación no canónica de la Ser177, la que, consiguientemente, gatilla una cadena de fosforilaciones jerárquicas río debajo de este residuo. Con objeto de realizar estudios sobre el comportamiento in vivo de las variantes de CK1#, se transfectaron células Cos-7 con construcciones de CK1# y CK1#L. Mediante inmunocitoquímica, se determinó que la CK1# se localizaba en forma generalizada dentro de la célula, predominantemente en el citoplasma. CK1#L, en contraste, se localizaba en forma predominante en el núcleo, lo que sugiere que la secuencia PVGKRKR, contenida dentro del inserto L, constituiría una señal de localización nuclear funcional. La variante más larga también exhibió una vida media 4 veces menor que CK1#, siendo de 97 y 400 minutos, respectivamente, como fue determinado por experimentos de pulso y caza en células transfectadas y marcadas metabólicamente con 35 S. Mediante experimentos de RT-PCR utilizando RNA total de embriones y adultos de pez cebra, se determinó que la proporción relativa de los transcritos de las cuatro subisoformas varía a lo largo del desarrollo y en adulto, observándose un aumento relativo de #S y una caída en el nivel de #L entre los estadíos de 1 célula y larva (4-5 días). Además, por hibridación in situ utilizando una sonda general para las cuatro variantes de CK1#, se observó una expresión generalizada de los mensajeros de esta isoforma de CK1 hasta las 24 h de desarrollo y, entre los 2 y 3 días, una localización más específica en la cabeza y el primordio de la aleta pectoral. En síntesis, la presencia del inserto L confiere a la enzima algunas propiedades que la distinguen de las variantes que no contienen este inserto: Altera el sitio de unión a ATP, disminuyendo levemente la afinidad por el nucleótido, disminuye la estabilidad de la enzima, tanto in vivo como in vitro frente a una temperatura de 40°C, aumenta el nivel de fosforilación de la CK1# en presencia de PKA y concentra la enzima en el núcleo, probablemente debido a la secuencia PVGKRKR contenida en el inserto L.

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Tesis por compendio de publicaciones / Las rutas de señalización mediadas por MAP quinasas (MAPK) tienen un papel fundamental en la respuesta de células eucariotas frente a estímulos ambientales. La levadura con fisión Schizosaccharomyces pombe representa un modelo particularmente adecuado para abordar estudios básicos sobre dichas rutas de señalización, debido a la gran homología funcional que existe entre sus circuitos reguladores y los de organismos superiores. En S. pombe, la ruta de MAPKs de integridad celular (CIP) participa en la regulación de numerosos procesos biológicos como la construcción de la pared celular, la citocinesis, la morfogénesis, la fusión de vacuolas durante el estrés hipotónico, y la homeostasis iónica mediante la modulación de la activación de la MAPK Pmk1 en respuesta a cambios en las condiciones ambientales. Aunque la GTPasa Rho2 es el principal activador de la ruta de integridad celular a través del ortólogo de PKC Pck2, Pmk1 puede ser activada en ausencia de ambos dependiendo de la naturaleza del estímulo recibido, lo que indica la existencia de elementos reguladores adicionales aguas arriba del módulo de MAPKs. Se ha propuesto a la GTPasa Rho1 como candidata para tal función, mientras que el ortólogo de PKC Pck1 parece regular negativamente la actividad de la CIP. Hemos investigado el posible papel de Rho1 y Pck1 como reguladores de la CIP empleando un mutante hipoactivo de Rho1 (rho1-596) y un mutante carente de Pck1 en distintos fondos genéticos. Las evidencias obtenidas mostraron que Rho1 y Pck1 son activadores de la ruta adicionalmente a Rho2 y Pck2, lo que pone de manifiesto la naturaleza ramificada de los mecanismos de señalización que actúan aguas arriba del módulo de MAPKs. Por otra parte Rho2 se localiza en la membrana plasmática y en el área de división celular, y es farnesilada in vivo en el motivo -CAAX de su extremo C-terminal, siendo esta modificación esencial para su localización y función activadora de la CIP. Sin embargo, la presencia de un residuo de cisteína previo al motivo -CAAX sugiere que Rho2 podría encontrarse palmitoilada en dicho residuo. Para estudiar la relevancia biológica de la palmitoilación de Rho2 creamos una serie de cepas que expresan versiones mutantes tanto de Rho2 como de Rho1 afectadas en lipidación, y estudiamos su localización y función biológica. Los resultados obtenidos permitieron concluir que en la levadura con fisión, la GTPasa Rho2 es palmitoilada in vivo, siendo esta modificación crítica para su correcta localización en membrana plasmática y para ejercer su regulación de la morfogénesis y la ruta de integridad celular. Por último, son numerosos los estudios que han puesto de manifiesto la importancia de la localización subcelular de los componentes de los módulos de MAP quinasas en la respuesta a estrés. En el caso de la ruta de integridad celular, la MAPK Pmk1 muestra una localización núcleo/citoplasmática constitutiva, así como en el huso mitótico, el corpúsculo polar del huso, y en el septo durante la separación celular. Sin embargo, a diferencia del modelo descrito en ERK1/2 en mamíferos, el patrón de localización de Pmk1 no se modifica en respuesta a estrés, lo que indica que tanto la forma activa como inactiva de la MAP quinasa son capaces de entrar en el núcleo. En base a esto, nos planteamos el estudio de la relevancia biológica de la localización nuclear de Pmk1 sobre su función biológica. Para ello recurrimos a la caracterización de mutantes de S. pombe que expresan una versión de Pmk1 anclada a la membrana plasmática y excluida del núcleo constitutivamente en distintos fondos genéticos. Los resultados mostraron que aunque la localización nuclear de Pmk1 en Schizosaccharomyces pombe no es crítica para ejercer la mayor parte de sus funciones biológicas, sí es necesaria para la regulación transcripcional en respuesta al estrés de pared celular, lo que revela la importancia del control espacio-temporal de la actividad de las MAPKs en los organismos eucariotas. / SUMMARY Mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathways play a fundamental role in the response of eukaryotic cells to environmental changes. Fission yeast Schizosaccharomyces pombe has emerged as an excellent model organism to study mechanisms and cellular events linked to MAPK activation, given the significant functional homology between their regulatory circuits and those of higher cells. In S. pombe the cell integrity pathway (CIP) participates in multiple biological processes like cell wall construction, vacuole fusion during hypotonic stress, cytokinesis, morphogenesis, and ionic homeostasis by fine tuning of MAPK Pmk1 activation in response to various environmental conditions. Although the small GTPase Rho2 is a main positive regulator operating upstream the CIP through protein kinase C ortholog Pck2, Pmk1 can still be activated in the absence of either Rho2 or Pck2 depending on the nature of the stimulus, suggesting the existence of additional upstream regulatory elements to modulate its activity. The essential GTPase Rho1 is a candidate to control the activity of the CIP, whereas Pck1 appears to negatively regulate Pmk1 activity. To study the role of Rho1 GTPase and PKC ortholog Pck1 in the CIP, we characterized a S. pombe mutant that expresses hypomorphic Rho1 allele (rho1-596) and a mutant lacking Pck1 in distinct genetic backgrounds. The evidences obtained in this study revealed that Rho1 and Pck1 are positive upstream activators of the CIP in addition to Rho2 and Pck2 during cell growth and cell wall stress. This model shows the branched nature of the upstream signal network that regulates the CIP. Rho2 positively regulates the CIP and is involved in the control of cell polarity and cell wall biosynthesis in fission yeast. Rho2 locates along the plasma membrane and the division area and it has been described that becomes farnesylated in vivo at its -CAAX motif. This lipid modification appears essential for both localization and function within the MAPK pathway. Moreover, there is a second conserved cysteine residue upstream the Rho2 CAAX motif which might be palmitoylated in vivo like other Rho GTPases such as human RhoB. To investigate the role of palmitoylation in Rho2-signaling we constructed rho2Δ strains expressing the wild type, unpalmitoylated, or unprenylated versions of Rho2 as well as Rho2 chimeras fused to the carboxyl end from the essential GTPase Rho1, and we study their location and Rho2-dependent signalling within the CIP. Our results showed that in fission yeast Rho2 becomes palmitoylated in vivo and this modification is required for plasma membrane localization and proper signaling to the CIP. Pmk1 is constitutively localized in both cytoplasm and nucleus, as well as in the mitotic spindle and septum during cytokinesis. However, contrary to the current model for ERK1/2, its localization pattern appears unaffected by its activation status. In this context, we questioned the biological significance of nuclear localization of MAPK Pmk1. We have addressed this issue by characterization of mutants expressing Pmk1 versions excluded from the cell nucleus and anchored to the plasma membrane in different genetic backgrounds. We have found that nuclear localization of Pmk1 is not critical to exert their biological functions, although its presence in the nucleus is necessary for transcriptional regulation under cell wall stress. These evidences highlight the relevance of the spatial/temporal activity control of MAPK activity in eukaryotes.

Entendre quin és el cribratge al que estan sotmesos els pèptids abans de poder-se unir a les molècules del complex major d’histocompatibilitat classe II o major histocompatibility complex class II en angles (MHC classe II o HLA classe II en humans) per a més tard ser presentats als limfòcits T és especialment rellevant per les seves implicacions en salut, a l’estar involucrats en diferents processos relacionats amb la defensa de l’organisme, des de la resposta davant d’infeccions a les reaccions autoimmunitàries, passant pel reconeixement de les cèl·lules cancerígenes. L’objectiu d’aquesta tesi ha estat desenvolupar diferents estratègies usant tècniques bioinformàtiques per a identificar els patrons que reconeixen les diferents molècules del HLA alhora de seleccionar els pèptids que més tard presentaran els diferents al·lels i, per extensió, poder arribar a predir si un determinat pèptid tindrà la capacitat d’unir-se a una determinada molècula d’HLA. Un cop desenvolupat l’algoritme de determinació i predicció de patrons es va construir una plataforma web per poder-hi analitzar grans quantitats de pèptids i/o proteïnes mitjançant diferents funcionalitats. Per a poder assolir aquests objectius, el treball es va dividir en tres fases diferents. La primera fase va consistir en construir una base de dades relacional en postgesql per a poder-hi emmagatzemar tant la informació requerida per al correcte funcionament de l’algoritme com les dades resultants de l’anàlisi d’aquesta informació. La informació requerida per al correcte funcionament de l’algoritme està formada per epítops per als quals es coneix si són o no presentats per les diferents molècules d’HLA classe II i diferents proteomes de patògens humans, així com el proteoma humà. A més a més, s’hi ha inclòs una secció privada on els usuaris registrats poden pujar-hi dades d’epítops derivades de les seves pròpies investigacions per poder-los analitzar en combinació amb les dades públiques del sistema per a una mateixa molècula. En la segona fase d’aquest treball es varen desenvolupar dos predictors, el primer usant un sistema basat en matrius de puntuació específiques de posició (position-specific scoring matrices en anglès, també conegudes com a PSSM) i el segon usant màquines d’aprenentatge de vectors de suport (Suport vector machines en anglès o SVM). Les PSSM varen ser desenvolupades usant un protocol iteratiu d’optimització, on es comença usant la informació proporcionada per l’alineament de segments de 9 residus en epítops, identificats com a possibles regions d’interacció amb les molècules d’HLA objectes de estudi, i posteriorment es va afegint informació tant de pèptids que no s’uneixen a la molècula com del grau de conservació dels diferents al·lels. Per a la construcció de la SVM, els segments d’unió dels pèptids a cada una de les molècules d’HLA es van definir a partir les PSSM construïdes per a cada una d’elles i els paràmetres per a la SVM amb una funció de base radial (Radial-basis function o RBF) com a nucli (kernel) varen ser fixades individualment per a cada cas a fi i efecte d’assolir els millors resultats possibles. En la tercera i última fase d’aquest projecte, es van construir dos pàgines web, una per cada predictor. Aquests predictors tenen en comú que els usuaris en general poden introduir-hi llistats de pèptids i/o proteïnes en format FASTA per a ser analitzades. Aquestes anàlisi tornen com a resultat els possibles motius d’unió detectats i la seva localització en els proteomes seleccionats. Una característica particular del predictor basat en PSSM és que els usuaris registrats poden pujar seqüències resultants de la seva pròpia investigació per trobar nous patrons d’unió a molècules d’HLA noves o millorar els existents i fer prediccions amb ells. / Understanding how peptides are selectively bound and presented by major histocompatibility complex class II molecules (MHC class II or HLA class II in humans) is of outmost importance for its broad implications in human health, from infection to autoimmunity or cancer. The aim of this thesis was to develop a computational strategy to identify HLA class II binding patterns for a variety of alleles and use this knowledge to predict their capacity to bind specific peptide sequences. To make an effective use of the prediction algorithm, a web-based platform for the analysis of large peptide or protein sets, including various functionalities, was also devised. In order to accomplish these objectives, the work was divided into three different stages. The first stage consisted in the construction of a postgresql relational database to store all the information required for and generated by the algorithms developed. The required, uploaded information (subject to updates) consisted of known HLA class II epitopes and the translated genomes of a list of pathogenic bacterial species and human. In addition, the database was designed to include a private section for the upload of user-owned epitope information, which the owner may use in combination with the public data. In a second stage two predictors were developed, one using position-specific scoring matrices (PSSMs) and the other one using a support vector machine (SVM). PSSM development was performed using an iterative optimisation protocol, starting from the alignment of known epitopes to identify HLA class II binding cores (9-residue segments) and incorporating additional information such as allele conservation and non-binders at different phases of the refinement. For SVM construction, the epitope core was defined using the corresponding PSSM and the parameters for the SVM with a radial-basis-function (RBF) kernel were set up individually for each molecule to get the best performance. In the third stage, two web pages were constructed, one for each predictor. The servers share a common part in which the user can introduce peptide or protein sequences in Fasta format to perform an analysis that delivers both putative epitopes and their localization in a selected proteome. In addition, the PSSM-based server allows the user to upload his/her own sequences to elucidate new HLA class II binding patterns and perform predictions with them.

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Doctor en Ciencias con mención en Biología