Investiga la resistencia bacteriana al ión mercurio (Hg2+) en 55 cepas de Escherichia coli aisladas de diferentes ambientes marinos de la costa limeña: Bahía de Pucusana, Bahía de Miraflores y Bahía del Callao (Lima-Perú). Se determinan los diferentes serogrupos de las cepas, utilizando sueros polivalentes EPEC, EIEC y EHEC; la resistencia al mercurio es evaluada realizando pruebas de MIC a cloruro de mercurio: 30, 50, 80, 100, 200, 300 y 400 µM/mL disuelto en caldo LB. Se evalúa las cepas mercurio-resistentes frente a antibióticos clínicos por la técnica de difusión en placa usando los siguientes antibióticos en discos: Cloramfenicol (C), 30 µg; Norfloxacina (Nor),10 µg; Amikacina (Ak), 30 µg; Kanamicina (K), 30 µg; Ampicilina (A), 10 µg; Sulfaperazone (Sfp), 30 µg; Tetraciclina (Te), 30 µg; Aztreonam (Az), 30 µg; Ceftazidima (Caz), 30 µg; Gentamicina (Ge), 10 µg; Amoxicilina (Amx), 25 µg; Sulfametoxazol-trimetoprim (Sxt), 25 µg; Ácido Nalidíxico (W), 30 µg; Ciprofloxacina (Cip), 5 µg. El origen de la resistencia al mercurio mediada por plásmidos se comprueba mediante la técnica de curación con SDS (10 % p/v); se realiza la técnica de conjugación de plásmidos tomando la cepa receptora E. coli DH5α. Para la visualización de los plásmidos conjugativos se realiza la técnica de extracción de plásmidos con el método de Lisis Alcalina con SDS en las cepas receptoras mercurio-resistentes. Así mismo se evalúa la presencia del gen merA, que se encuentra en el operón mer, por el método del PCR tomando como DNA molde los plásmidos aislados. Del total de las cepas de E. coli (n=55) estudiadas, el 29,1 % (n=16) resultan ser positivas para los serogrupos EPEC, de éstas: 31,25 % EPEC poliA, 50 % EPEC poliB, 18,75 % EPEC poliC. El 74,54 % (n=41) son resistentes al mercurio en distintas concentraciones, de éstas el 34,15 % son resistentes a antibióticos; se observa la resistencia al mercurio mediada por plásmidos en el 80,5 %. De las cepas mercurio resistentes, el 14,63 % (n=6) muestran ser portadores de plásmidos conjugativos, observándose la presencia de estos en las cepas receptoras mercurio resistentes. Se observa la presencia truncada o aberrante del gen merA en los plásmidos aislados, confirmando la frecuencia del operón mer en el 14,63 % de las cepas mercurio resistentes. / Tesis

En la siguiente Tesis Doctoral hemos analizado la influencia de la testosterona (T) exógena sobre el metabolismo de esteroides sexuales y la fisiología de la gónada de la dorada (Sparus aurata L.). Además hemos descrito la presencia de un mecanismo de procesamiento alternativo del ARN, para el receptor de andrógenos (AR), cuya expresión varía con el estado reproductor y se correlaciona con el nivel de T. Esta forma truncada del AR está presente en los granulocitos acidófilos (GAs), descubriéndonos así nuevos mecanismos de regulación en la biología de los neutrófilos de vertebrados. El uso de la dorada como ejemplar de estudio se debe a que es una especie de alto interés comercial en el Mar Mediterráneo. La dorada es un teleósteo marino que presenta un hermafroditismo protándrico, siendo los ejemplares machos durante sus dos primeros años de vida, y pudiendo cambiar de sexo a partir del segundo año. El ciclo reproductor (CR) de los ejemplares macho se caracteriza por presentar cuatro etapas secuenciales: espermatogénesis (ES), puesta (P), post-puesta (PP) y quiesciencia (Q) durante el primer CR. La etapa de Q es sustituida por una etapa de involución testicular (IT), en el segundo CR que permite el cambio de sexo. Tras la puesta, el testículo suele sufrir una serie de cambios morfológicos, entre los que se encuentra una infiltración masiva de leucocitos, la cual es mayor en la etapa IT, antes del cambio de sexo. En primer lugar, quisimos comprobar la capacidad de la T exógena para modificar el balance de las hormonas sexuales esteroideas y la fisiología de la gónada. Con este fin, incorporamos la T en las doradas utilizando el sistema de micropartículas in situ (ISM) (T-ISM). La T exógena promueve un incremento supra-fisiológico en los niveles plasmáticos de T y una disminución de los niveles de 17β-estardiol (E2). Sin embargo, no se vieron alterados los niveles de 11-cetotestosterona (11KT). La T, además, bloquea la proliferación de las células germinales del testículo aunque el incremento en la expresión del gen que codifica para dmrt1 podría prevenir la eliminación completa de las células germinales. Por otra parte, comprobamos que los andrógenos, al igual que había sido demostrado para los estrógenos, están implicados en la migración de leucocitos hacia la gónada. Además, la T de los T-ISM promueve una disminución de la expresión de los genes que codifican receptores Toll-like (tlrs), quedando inhibida la capacidad de reconocer y responder a patógenos. Posteriormente, identificamos una variante, constitutivamente activa, del AR que carece de dominio de unión al ligando (ARΔLBD) en testículo y riñón cefálico (RC) de dorada y su expresión varía con el estado reproductor y con los niveles plasmáticos de testosterona. Esta variante se forma por un procesamiento alternativo del ARNm del AR. Nuestros datos sugieren que este procesamiento alternativo es capaz de modificar la fisiología del testículo, debido a que los andrógenos son capaces de modular el procesamiento alternativo del AR. Además, los andrógenos, concretamente la T, es capaz de regular la respuesta inmunitaria a través de la variante ARΔLBD. Otro dato interesante es que sólo los AGs expresan esta forma truncada mientras que los macrófagos (MØs) no la expresan. Además, el procesamiento alternativo del AR también no sólo se ve modulado por T, sino también por estímulos inmunitarios, aunque esta modulación depende del estado reproductor de los individuos. Todos estos datos nos indican una interacción entre los estímulos endocrinos e inmunitarios en la regulación del procesamiento alternativo del AR así como de las funciones de los AGs. Además, la T podría estar implicada en los cambios fisiológicos de la gónada a través de la regulación del ARΔLBD. / During the development of this thesis, we want to analyze the effect of exogenous androgens, mainly testosterone (T), and the activity of androgen receptor (AR) in immune-reproductive interaction in the sparidae, gilthead seabream (Sparus aurata L.). Furthermore, we described the presence of a mechanism, in which the unique AR gene can give diverse transcripts either in testis or immune organs. The gilthead seabream is a marine, protandrous teleost fish with significant economic value in the Mediterranean aquaculture. The specimens of this specie are male during the two first years, and present a reproductive cycle (RC) divided in four stages. In first RC, the stages are spermatogenesis (SG), spawning (S), post-spawning (PS) and resting (R); in the second RC, the last stage is substituted by testicular involution (TI) stage. After spawning there are various changes in gonad, between which are a massive infiltration of leukocytes, being higher in TI and that can lead to sex change. For this motive this specie can being used as a model for studying the immune-reproductive interactions. In first place, we wanted to observe the capacity of exogenous T to modify the balance of sex steroid hormones and on the physiology of the gonad (proliferation, apoptosis, leukocyte influx and immune status) of mature male specimens of the gilthead seabream. To this end, we used the in situ forming microparticle (ISM) system, which delivers sex steroids without promoting significant physiological alterations in gilthead seabream and that has been previously used in our laboratory to show that T modulates the inflammatory response of head kidney (HK) leukocytes in the gilthead seabream. The results suggest that in mature males, exogenous T can blocked the cell proliferation and increase the migratory influx of leukocyte, although decrease the ability to recognize and response to pathogens. Secondly, we identified a truncated form of the AR generated by alternative splicing that lacks the ligand-binding domain (ARΔLBD) either in testis, HK and acidophilic granulocytes (AGs). We studied the modulation of this variant by androgens and immune stimulus in order to demonstrate its mediation in the role of androgens in the immune response. The results showed that T is able to regulate the testicular morphology through the modulation of the expression of ARΔLBD variant. Furthermore, T was also able to regulate the immunecompetence through ARΔLBD variant. Interestingly, ARΔLBD variant only is expressed in AGs but no in macrophages (MØ). Furthermore, the stimulation with bacterial DNA, also regulated the alternative splicing of AR, but depending of the reproductive stage. These data suggest a crosstalk between endocrine and immune stimuli in the regulation of AR alternative splicing and AGs function. Furthermore, T might be implicated, in the migratory influx into gonad and the physiological changes in gonad through by means of regulation of ARΔLBD.

l cultivar de tomate MT presenta una serie de características fenotípicas, como un corto ciclo biológico (inferior a 3 meses) y pequeño tamaño (menos de 20 cm), que hacen que sea más adecuado para estudios en laboratorio que otros cultivares de tomate. El objetivo general planteado al iniciar este trabajo fue determinar el comportamiento in vitro del cv. MT, así como llevar a cabo un estudio de los perfiles de metabolitos secundarios y de los patrones de expresión proteica en suspensiones celulares sometidas a la elicitación con MJ, en presencia y en ausencia de dos tipos de β-CDs: metiladas al azar (CDsM) o hidroxipropiladas al azar (CDsH). El fin último es explorar el potencial de las suspensiones celulares derivadas del cv. MT para utilizar este sistema en la producción de metabolitos con alto valor añadido. Para abordar este objetivo se han utilizado diversas técnicas de análisis cromatográfico (HPLC-MS y GC-MS), electroforético (SDS-PAGE e IEF), citológico (TTC y FDA) y espectrofotométrico (determinaciones de metabolitos y de diversas actividades enzimáticas); también se ha llevado a cabo la microsecuenciación de fragmentos peptídicos por nanoLC ESI MS/MS y se han utilizado las herramientas bioinformáticas correspondientes para el análisis de los resultados. Las suspensiones celulares presentaron una acumulación de compuestos fenólicos y triterpenos máxima durante la fase de crecimiento exponencial. La elicitación de las suspensiones celulares con MJ y CDsM o CDsH, separadamente o en combinación, dio lugar a un aumento de los niveles de isofucosterol,sitosterol y taraxasterol, si bien los mayores cambios se registraron en los tratamientos con CDsM. Sin embargo, los mayores niveles de fenoles solubles totales se obtuvieron en los tratamientos combinados, sobre todo en el tratamiento CDsM+MJ. Además, ambos elicitores (CDs+MJ) actuaron de forma sinérgica en la producción de ácido cafeico en el medio intracelular, indicando que la naturaleza fisicoquímica de las CDs influyó en su capacidad para estimular la producción de metabolitos y para actuar como agentes secuestrantes. Por otra parte, en los tratamientos de elicitación se observó, en general, una diminución de las actividades enzimáticas peroxidasa, PAL, endoquitinasa y 1,3-glucanasa en presencia de CDsM y un aumento de dichas actividades enzimáticas en presencia de CDsH, en los tratamientos con MJ y, sobre todo, en los combinados (CDs+MJ), lo que indica que las CDs y el MJ son capaces de regular diferencialmente la actividad de estas enzimas. El análisis del proteoma extracelular de las suspensiones celulares mediante separación monodimensional en geles de poliacrilamida y microsecuenciación en las suspensiones elicitadas con CDsM+MJ permitió la identificación de diez fragmentos trípticos cuyas secuencias de aminoácidos mostraron homología con varías proteínas PR de S. lycopersicum, quitinasas, una proteína asociada a la muerte celular biótica y una peroxidasa catiónica. Estas proteínas podrían formar parte de las respuestas de defensa en suspensiones celulares de tomate MT. Además de las proteínas inducidas en el tratamiento de elicitación, se identificaron una serie de proteínas constitutivas, como proteínas PR del tipo PR-1 y PR-5, endoquitinasas, quitinasas, peroxidasas, una proteína inhibidora de endoglucanasas fúngicas específicas de xiloglucano (XEGIP) y otras enzimas hidrolíticas implicadas en la ruptura de xilanos y arabinoxilanos como la LeXYL2 y la α-L-Arabinofuranosidasa, que pueden estar implicadas en la modificación de la arquitectura de la pared celular durante el crecimiento del cultivo. / ABSTRACT The tomato cultivar Micro-Tom displays several phenotypic characteristics such as small size (less than 20 cm) and a reduced life cycle (less than three months), which make it more suitable for laboratory experiments than standard cultivars. The overall objective proposed in this research is to know the in vitro behavior of Micro-Tom as well as analyzing the response of MT cell cultures to elicitation with methyl jasmonate (MJ) and two cyclodextrins (randomly methylated cyclodextrins, CDsM, and randomly hydroxypropyl -cyclodextrins, CDsH), alone or in combination, exploring the changes on both secondary metabolite and protein expression patterns that occur in these cell cultures in the presence of these elicitors. To address this objective, a variety of different techniques including: chromatographic (HPLC-MS and GC-MS), electrophoretic (SDS-PAGE and IEF), cytological (TTC and FDA) and spectrophotometric (for the determination of metabolites and enzymatic activities) methods were used. Moreover, tryptic fragments of SDS-PAGE bands of interest were analyzed by nanoLC ESI MS/MS and the LC-ESI-MS/MS spectra submitted to the database-mining tool for protein identification. An accumulation of both phenolic and triterpenoids compounds was seen during the exponential phase of non-elicited cell suspension cultures. Under elicitation conditions, an increase in the levels of isofucosterol, -sitosterol and taraxasterol was observed, although the highest levels of these compounds were found in CDsM-treated cells. In contrast, the highest levels of phenolic compounds were detected in the presence of both elicitors, especially in CDsM+MJ-treated cells. Moreover, both elicitors act synergistically to stimulate the production of caffeic acid in the intercellular medium, suggesting that the physicochemical properties of CDs have a great influence in their ability to induce the production of secondary metabolites and in their metabolite-sequestering properties. On the other hand, a decrease in the enzymatic activities of peroxidase, PAL, endochitinase and -1,3-glucanase was observed in CDsM-treated cells whereas an increase of these enzymatic activities occurred in the presence of CDsH, MJ, and in the combined treatments, indicating that both elicitors are able to differentially regulate the activity of these enzymes. Analysis of the extracellular proteome showed the presence of amino acid sequences homologous to several pathogenesis-related (PR) proteins, a cationic peroxidase, and a biotic cell death-associated protein, which suggests that MJ and CDs could play a role in mediating defense-related gene product expression in MT. Moreover, several constitutive proteins were also identified such as PR 1 and 5 proteins, endochitinases, chitinases, peroxidases, an inhibitor protein of xyloglucan-specific fungal endoglucanase (XEGIP), and other hydrolytic enzymes like LeXYL2 and L-arabinofuranosidase, which are cell wall-degrading enzymes involved in the breakdown of xylans and arabinoxylans, suggesting their involvement in the modification of the cell wall architecture during cell culture growth.

Objetivos. En el presente trabajo se han cumplido dos objetivos concretos: 1. Desarrollo de un nuevo sistema chivato basado en la luciferasa para el estudio de promotores tanto constitutivos como inducibles en el contexto de un organismo completo. 2. Estudio del papel extracurricular del componente de ARN de la telomerasa (TR) en la hematopoyesis usando el pez cebra como modelo. - Metodología. Embriones de pez cebra han sido manipulados genéticamente mediante la microinyección de plásmidos, morfolinos y ARN (solos o en combinación) en el estadío de desarrollo de 1-8 células para recrear las distintas condiciones experimentales de estudio. Para el abordaje del primer objetivo, el estudio de la actividad promotora en el contexto de un organismo completo se ha llevado a cabo mediante la medida de luminiscencia. Para el cumplimiento del segundo objetivo, el recuento de los distintos tipos de células sanguíneas en las distintas condiciones experimentales se ha abordado mediante la tinción específica con TSA (neutrófilos) o con o-dianisidina (eritrocitos), o mediante el uso de distintas líneas de pez cebra transgénico que expresan proteínas fluorescentes en neutrófilos y en macrófagos. La funcionalidad de los neutrófilos se ha estudiado mediante ensayos de reclutamiento a una herida y de respuesta a una infección bacteriana. El estudio de la actividad telomerasa se ha realizado mediante una técnica específica y cuantitativa llamada Q-TRAP basada en la amplificación de la secuencia telomérica, y la longitud de los telómeros se ha cuantificado mediante Q-FISH, que consiste en una hibridación in situ con una sonda telomérica fluorescente. El estudio de la expresión de genes se ha llevado a cabo mediante RT-PCR y PCR a tiempo real, y también mediante hibridación in situ con sondas de ARN. Peces cebra han sido mantenidos según se indica en el manual del pez cebra. Todos los experimentos cumplen con la directiva de la Unión Europea (86/609/EU) y han sido aprobados por el Comité de Bioética del Hospital Clínico Universitario “Virgen de la Arrixaca” (España) y por el Comité Institucional del Cuidado y Uso Animal del Hospital Infantil de Boston (EEUU). - Resultados y conclusiones. Para el desarrollo del primer objetivo se combinaron las ventajas que tiene el ensayo clásico de la doble luciferasa con las que tiene el pez cebra como modelo vertebrado para desarrollar una técnica que permita analizar la actividad promotora y la función génica en el contexto de un organismo completo. El resultado fue una técnica rápida y sensible que puede ser utilizada como una nueva herramienta para caracterizar in vivo la mínima región promotora de un gen, la respuesta de promotores inducibles ante distintos estímulos, la validación de construcciones genéticas y la función de un gen de interés. La técnica desarrollada resulta muy valiosa cuando se combina con las ventajas que ofrece el pez cebra para hacer escrutinios a gran escala basados en el fenotipo, convirtiéndose en un sistema muy prometedor para la identificación y la validación de fármacos o genes que, por ejemplo, reviertan el fenotipo. El desarrollo del segundo objetivo de esta tesis muestra varias evidencias que apoyan al pez cebra como modelo para estudiar el papel del componente de ARN de la telomerasa (TR) en la disqueratosis congénita, que es una enfermedad hereditaria de envejecimiento prematuro, cuyos pacientes mueren principalmente debido al fallo de la médula ósea. En este modelo, la inhibición genética de TR resultó en la afectación de la mielopoyesis, a pesar de que el desarrollo de las células madre hematopoyéticas fue normal. Sorprendentemente, la neutropenia causada por la ausencia de TR fue independiente de la longitud telomérica y de la actividad telomerasa. El análisis genetico mostró que TR modula la decisión del destino mieloide/eritroide mediante el control de los niveles de los factores de transcripción mieloide y eritroide spi1 y gata1, respectivamente, mediante la estimulación de gcsf y mcsf. Este modelo de pez cebra deficiente en TR ilumina el papel extracurricular de TR, y podría establecer dianas terapéuticas para la disqueratosis congénita. / The zebrafish (Danio rerio) as a model to study in vivo the role of telomerase in hematopoiesis - Objectives. The specific objectives of the present work are: 1. Development of a new luciferase-based reporter system for studying both constitutive and inducible promoters in the context of a whole organism. 2. Study the non-canonical role of the telomerase RNA component (TR) in hematopoiesis using the zebrafish. - Methodology. Zebrafish embryos were genetically modified by injecting plasmids, morpholinos and RNA (alone or in combination) whitin the 1- to 8-cell developmental stage to simulate the different experimental conditions. For approaching the first goal, the study of the promoter activity in the context of a whole organism was carried out by measurement of luminiscence. To addressing the second goal, the counting of the different blood cells in the different experimental conditions was carried out by specific staining with TSA (neutrophils) or o-dianisidine (erythrocytes), or by using different transgenic zebrafish lines expressing fluorescent proteins in neutrophils or macrophages. The neutrophil functionality was studied by quantifying the recruitment to a wound and the response to a bacterial infection. The telomerase activity was determined by using a specific and quantitative assay based in the amplification of the telomere sequence and called Q-TRAP, and the telomere length was quantified by a whole-mount in situ hybridization with a fluorescent telomeric probe (Q-FISH). The study of gene expression was carried out by RT-PCR and real time PCR, and also by in situ hybridization with RNA probes. Zebrafish were maintained as described in the zebrafish handbook. The experiments performed comply with the Guidelines of the European Union Council (86/609/EU). Experiments and procedures were performed as approved by the Bioethical Committee of the University Hospital “Virgen de la Arrixaca” (Spain) and by the Children's Hospital Boston institutional Animal Care and Use Committee (USA). - Results and conclusions. Firstly, we have adapted the classical dual luciferase reporter assay from cell lines to whole zebrafish embryos/larvae. The result is a rapid and sensitive technique that can be used as a new tool to characterize the minimum promoter region of a gene as well as the in vivo response of inducible promoters to different stimuli. We have illustrated the usefulness of this system for studying both constitutive and inducible promoters. This assay has several advantages compared with the classical in vitro (cell lines) and in vivo (transgenic mice) approaches. Among others, the assay allows a rapid and quantitative measurement of the effects of particular genes or drugs in a given promoter in the context of a whole organism and it can also be used in high throughput screening experiments. We have showed several evidences supporting the zebrafish as a new model to study the role of the telomerase RNA component (TR) in DC, which is an inherited premature disease whose patients usually die of bone marrow failure. In this model, genetic depletion of TR results in impaired myelopoiesis, despite normal development of hematopoietic stem cells (HSCs). Interestingly, the neutropenia caused by TR depletion is independent of telomere length and telomerase activity. Genetic analysis shows that TR modulates the myeloid-erythroid fate decision by controlling the levels of the master myeloid and erythroid transcription factors spi1 and gata1, respectively, through stimulation of gcsf and mcsf. This model of TR deficiency in the zebrafish illuminates the non-canonical roles of TR, and could establish therapeutic targets for DC.

La Ca2+-ATPasa de RS puede hidrolizar ATP a través de una ruta alternativa en la que solo intervienen conformaciones de la proteína que no unen Ca2+. El mecanismo molecular de esta actividad hidrolítica implica un cambio conformacional inducido por ATP que produce aproximaciones de los dominios citosólicos. El uso de indicadores fluorescentes y compuestos que movilizan Ca2+ permite caracterizar flujos y depósitos intracelulares de Ca2+ que están implicados en la generación de señales intracelulares de Ca2+ en células H9c2. La mitocondria es capaz de interpretar señales citosólicas de Ca2+ que se generan en el retículo sarco-endoplásmico (RSE). El efecto apoptótico que se observa en presencia del inhibidor Tapsigargina (TG) es dependiente de la concentración usada. La muerte celular se produce antes cuando TG provoca apertura del poro de permeabilidad transitoria mitocondrial. El daño producido en el RSE activa la ruta apoptótica mitocondrial con participación de cas pasa 8 en un lazo que amplifica la cascada degradativa de las caspasas. Las células disponen de mecanismos alternativos de muerte celular en los que no participan caspasas.

Publicación a texto completo no autorizada por el autor / Evalúa las lagunas altoandinas (Tranca Grande, Habascocha, Tipicocha, Huascacocha, Pomacocha, Cucancocha y Ayhuin) de la región Junín sometidas a cultivo intensivoen jaulas de Oncorhynchus mykiss (Walbaum, 1792) “trucha arco iris” durante 1996, 2007 y 2013 y propone alternativas para su recuperación y manejo sustentable. Los muestreos se realizan en una estación fija en la zona de mayor profundidad (aproximadamente a 50 m de las jaulas de cultivo), para ello se toman muestras de agua superficiales y de fondo, así como sedimentos para los análisis físicos, químicos y biológicos de la comunidad del macrobentos. El manejo acuícola inadecuado en el cultivo de engorde de trucha constituye una de las causas de la eutrofización, tal como se demuestra con el incremento de la materia orgánica (>40%) y los bajos índices de diversidad del macrobentos (0,0 a 1,31 bits/ind). La variación temporal de los factores fisicoquímicos muestra diferencias significativas (p<0,05) a escala temporal, diferenciación influenciada por el acelerado proceso de eutroficación. Los fondos presentan concentraciones bajas de oxígeno disuelto (>0,1mg/l). La retención de residuos orgánicos de 0,64 ton./año por tonelada de trucha producida, mediante las trampas colectoras muestra la alta carga orgánica. Se concluye que la mayoría de las lagunas están eutroficadas por el cultivo de trucha y que la capacidad de carga es el principal elemento a tomar en cuenta en el manejo del cultivo. Se propone como alternativa para un desarrollo sustentable de la truchicultura, aprovechar los nichos ecológicos para el desarrollo acuícola extensivo con peces nativos y mejorar la productividad del cultivo en jaulas con la crianza integrada multi-trófica, entre otros. / Tesis

Evalúa el efecto hepatoprotector del extracto acuoso de Gentianella nitida (hercampuri) en un modelo experimental inducido por paracetamol. Para evaluar el efecto de hepatoprotección del extracto de Gentianella nitida se emplea paracetamol como inductor del daño hepático. Se analiza in vitro la capacidad antioxidante (DPPH, ABTS, FRAP), el contenido de fenoles totales y flavonoides del extracto acuoso de Gentianella nitida. En el modelo in vivo se trabaja con 24 ratas Holtzman hembras de 2 meses, formándose 4 grupos (n= 6): grupo control, grupo paracetamol, grupo silimarina y grupo Gentianella nitida. Al grupo Gentianella nitida se administró una dosis de 200 mg/kg de peso corporal durante 7 días, seguido del paracetamol 300 mg/kg de peso corporal por 4 días más. Se utiliza silimarina 50 mg/kg de peso como estándar de referencia. En el homogenizado de hígado se midió catalasa, superóxido dismutasa, glutatión S- transferasa, glutatión, TBARs, proteínas totales. En el análisis estadístico se aplica prueba Kruskal-Wallis, y como prueba pos hoc Mann Whitney. Se trabaja con una significancia p < 0,05. La capacidad antioxidante equivalente a ácido ascórbico (AAEAC-DPPH) fue 56 µg AA/mg ss y la capacidad antioxidante equivalente a trolox (TEAC-ABTS) fue 87,7 µg trolox/mg ss. Expresado en FRAP fue 98,5 µg FeSO4/mg ss. Fenoles totales fue 65,8 µg EAG/mg ss y de flavonoides, 11,7 µg EQ/mg ss. En el modelo in vivo, el grupo Gentianella nitida tuvo resultados significativos en la actividad de SOD y TBARs (aumento; p < 0,05) y en la actividad de glutatión S-transferasa y glutatión (disminución; p < 0,05). El extracto de Gentianella nitida exhibe capacidad antioxidante en correlación con el contenido de fenoles totales, protegiendo la actividad de las enzimas antioxidantes hepáticas frente al daño de las ROS producidas por el paracetamol. / Tesis

Publicación a texto completo no autorizada por el autor / Con la finalidad de esclarecer cual es la fuente de carbono con la que se produce mayor cantidad de RL, en esta investigación se compara la producción de RL por P. aeruginosa 6K11 en cinéticas de crecimiento manteniendo parámetros constantes usando 5 fuentes de carbono: glucosa (G) al 3%, 4% y 5%; glicerol (Y) al 3%, 4% y 5%; aceite de maíz (M) al 6%, 7% y 8%, aceite de pescado (P) al 2%, 3% y 4% y aceite de soya quemado (Q) al 4%, 5% y 6%. Para las cinéticas se usa el medio mineral base Sigmund y Wagner modificado a pH 6.8 y la incubación es a 35°C con 140 rpm de agitación por 250 horas. Los resultados confirman que existe una diferencia significativa (p<0.05) entre las producciones de RL al usar diversas fuentes de carbono. De igual manera se encuentra diferencia entre las diversas concentraciones de la misma fuente de carbono. El orden según producción de RL es: M7% > M8% > M6% > Y4% > Y5% > Q5% > Q6% > Q4% > Y3% > G4% > P2% > P3% > G5% > P4% > G3%. Así mismo se encuentra que el aceite de maíz al 7% es la fuente de carbono que genera la mayor producción de RL equivalente a 17.49 gRL/L. / Perú. Ministerio de la Producción. Programa Nacional de Innovación para la Competitividad y Productividad (Innóvate Perú). Fondo para la Innovación, la Ciencia y la Tecnología (FINCyT) / Tesis

La emergencia y diseminación de resistencias a antimicrobianos supone un problema para la salud pública y la sanidad animal puesto que pone en serio peligro la eficacia del principal tratamiento contra las infecciones bacterianas. Por este motivo son especialmente interesantes los estudios centrados no sólo en la identificación de los determinantes de resistencia, sino también de los mecanismos que intervienen en su dispersión. En este contexto, la presente Tesis Doctoral profundiza en la incidencia y caracterización molecular de elementos genéticos implicados en la captura, diseminación y mantenimiento de genes de resistencia a antimicrobianos por cepas de serotipos no tifoideos de Salmonella enterica, un patógeno bacteriano que, por su carácter zoonótico, podría estar ocupando un lugar relevante como donador y receptor de genes de resistencia. Los puntos desarrollados en este trabajo fueron fundamentalmente tres:1.- Se demostró el importante papel que juegan los integrones de clases 1 y 2, constatando su presencia en un gran número de cepas multirresistentes (mayoritariamente clínicas), aisladas en el Principado de Asturias y el resto de España. Dos hechos destacables fueron: a) la nueva descripción de los integrones de clase 1 con las regiones variables: 2300 pb/estX-smr-aadA1 y 2100 pb/dfrA1-597pb-aadA24; y b) la primera identificación de integrones de clase 2 en los serotipos S. Virchow, S. Grumpensis, S. Panama y S. Worthington. Se confirmó la asociación de estas unidades genéticas con elementos transponibles, observando diferentes configuraciones integrón de clase 1-transposón tipo Tn21 o integrón de clase 2-transposón tipo Tn7. Además, en la mayoría de los casos estas estructuras se encontraban localizadas en plásmidos conjugativos de gran tamaño, a veces portadores de resistencias adicionales no asociadas a integrones.2.- Dada la creciente emergencia de las resistencias a cefalosporinas de tercera y cuarta generación, se rastrearon &#946;-lactamasas de espectro extendido (BLEEs) y enzimas plasmídicas tipo AmpC en cepas alemanas procedentes de alimentos y animales. Subrayar que la familia de cefotaximasas CTX-M-1 era la más frecuente, y se encontraba asociada a secuencias de inserción tipo ISEcp1. Tanto los genes de BLEEs como de enzimas AmpC, se localizaban en plásmidos de tamaño variable, la mayoría conjugativos.3.- Otro hecho alarmante, dentro del panorama de la multirresistencia, es la aparición de plásmidos híbridos de virulencia-resistencia. En esta Tesis Doctoral se identificó y caracterizó parcialmente un plásmido, denominado pUO-SeVR1, que se encontró en un aislamiento de S. Enteritidis, el serotipo con mayor incidencia en infecciones humanas. Los resultados obtenidos sugieren que deriva de pSEV (el plásmido de virulencia específico de S. Enteritidis) por haber adquirido genes de resistencia asociados a un integrón y a diversos elementos transponibles. A la vez se desvelan algunos de los mecanismos que controlan la transmisión estable del plásmido dentro de la población bacteriana. Esta Tesis Doctoral ilustra el concepto de "ingeniería evolutiva" que, aplicado en este contexto, refleja la importancia que las secuencias "acompañantes" de un gen y sus propiedades combinatorias tienen en la adaptabilidad bacteriana. / The emergence and dissemination of antimicrobial resistance is a worrisome problem for human and veterinary medicines, threatening the effectiveness of the main treatment against the bacterial infections. For this reason, studies focused not only on the identification of the resistance determinants but also on the mechanisms involved in their spread, are especially interesting. In this context, this Doctoral Thesis analyzed the incidence and molecular characterization of mobile genetic elements related to the capture, maintenance and dissemination of antimicrobial resistance genes. For this purpose, multidrug resistant strains belonging to different non-typhoidal serovars of Salmonella enterica were studied. This bacterial pathogen, because of its zoonotic quality, might perform a relevant function as donor and recipient of resistance genes. The main objectives developed in this work were the following:1.- The important role played by class 1 and class 2 integrons was demonstrated by ascertaining their presence in many multidrug resistant strains (mostly from clinical origin), isolated in the Principality of Asturias and the rest of Spain. Two remarkable facts were: a) the new description of class 1 integrons with the variable regions: 2300 bp/estX-smr-aadA1 and 2100 bp/dfrA1-597bpaadA24; and b) the first identification of class 2 integrons in serovars S. Virchow, S. Grumpensis, S. Panama and S. Worthington. The linkage between these genetic units and transposable elements was also established, finding different class 1 integron-Tn21-like transposon or class 2 integron-Tn7-like transposon configurations. Moreover, in most cases these structures were located on large conjugative plasmids, some of them carrying additional non integron-associated resistances.2.- Due to the increasing emergence of the resistance to the third- and fourth-generation cephalosporins, the presence of extended spectrum &#946;-lactamases (ESBLs) and plasmidic AmpC enzymes was analyzed in German isolates of animal and food origin. The CTX-M-1 family was the prevalent, and was associated with insertion sequences ISEcp1-like. The ESBL and AmpC encoding genes were in all cases located on plasmids of variable sizes, mainly self-transferable.3.- Another alarming trend in the multidrug resistance background, is the emergence of virulence-resistance hybrid plasmids. In this Doctoral Thesis, the identification and partial characterization of the plasmid pUO-SeVR1 (found in a S. Enteritidis isolate) was carried out. The results obtained suggest that it derived from pSEV (the virulence plasmid specific of S. Enteritidis), through acquisition of resistance genes associated with a class 1 integron and diverse transposable elements. Some mechanisms involved in the stable inheritance of the plasmid were also identified.This Doctoral Thesis illustrates the concept of "evolutionary engineering" which, used in this context, shows the significance that "adjacent" sequences to a particular gene and their combinatorial properties have in the bacterial adaptability.

Objetivos: (i) caracterizar los mutantes delecionados en las rutas de consumo/producción de acetato y determinar las consecuencias de su deleción a distintos niveles celulares, (ii) estudiar la regulación in vivo del metabolismo de acetato por acetilación de proteínas en E. coli , (iii) describir el contexto genómico de los genes de las enzimas responsables de la acetilación de proteínas en E. coli (cobB y patZ) y estudiar su regulación transcripcional, (iv) discernir el papel de la acetilación de proteínas en las diferencias metabólicas observadas entre las cepas de E. coli K12 y BL21, (v) identificar los patrones de acetilación de proteínas en distintas condiciones y fondos genéticos en E. coli y (vi) caracterizar la funcionalidad de la acetilación de proteínas en el metabolismo del acetato y la regulación transcripcional. Metodología: durante esta Tesis se utilizaron la cepa de Escherichia coli BW25113 y sus mutantes delecionados en algunos genes de interés. Además se utilizaron técnicas para determinar expresión génica (RT-PCR, DNA-microarrays y vectores sonda de promotor), actividades enzimática en extractos crudos y enzimas purificadas, western blot, cuantificación de metabolitos por HPLC y espectrometría de masas de alta resolución para proteómica. Resultados. La deleción de la mayor vía de producción de acetato alteró el metabolismo central a distintos niveles, desde la transcripción a los niveles energéticos celulares, mostrando la conexión de este metabolismo y el central, y también mostrando la importancia de un funcionamiento equilibrado de este metabolismo. La sirtuina CobB y la acetiltransferasa PatZ alteraron la actividad in vivo de la enzima acetil-CoA sintetasa. El gen cobB se expresa constitutivamente mientras que la expresión génica de patZ se activa transcripcionalmente por el factor de transcripción CRP, al igual que el gen de la enzima acetil-CoA sintetasa, teniendo dos sitios de unión en su región aguas arriba de su secuencia. La ausencia de las proteínas CobB y PatZ en la cepa BL21 alteró mas severamente el metabolismo del acetato que en la cepa K12. Esto indicó que probablemente la regulación diferencial de estas enzimas puede ser la clave de porque ambas cepas tienen un metabolismo del acetato distinto. La actividad desacetilasa de CobB es global y contribuye a la desacetilación de numerosos substratos , generando un gran efecto sobre la fisiología. La acetilación de la isocitrato liasa contribuye al ajuste fino del ciclo del glioxilato y la acetilación de la lisina 154 de RcsB previene la unión de este factor de transcripción al ADN. Este último efecto de la acetilación activa la biosíntesis de flagelos y proteínas relacionadas con la motilidad, e incrementa la susceptibilidad a estrés. La deleción de la proteín-acetiltransferasa patZ aumenta la acetilación en cultivos con acetato. Esto sugiere que tal vez el papel de esta proteína sea regular los niveles de agentes acetilantes en la célula. Este hecho esto explicaría la activación transcripcional simultanea de los genes de patZ y su sustrato acs. Conclusiones. Los resultados presentados en esta Tesis ofrecen nuevos aspectos de las funciones del metabolismo del acetato y la acetilación de proteinas en E. coli. El metabolismo de acetato está directamente unido al metabolismo central, regulando los niveles de metabolitos clave como el acetil-CoA y el acetil-fosfato, que son clave para la acetilación enzimática y química de los residuos de lisina de las proteínas. Esta regulación post-traduccional es importante para el control del metabolismo pero también en otras funciones celulares como pueden ser la movilidad y la supervivencia a estrés. La proteín-acetiltransferasa PatZ no es responsable, directamente, de la mayor parte de las acetilaciones en E. coli, pero juega un papel importante en la regulación de la acetilación química en E. coli. Summary Objectives: (i) to characterise knockout mutants of the acetate producing/consuming pathways and to determine the consequences of the deletion at different metabolic levels; (ii) to study the regulation in vivo of the acetate metabolism by protein lysine acetylation in E. coli; (iii) to describe the genomic context of the genes that encode for the enzymes involved in protein lysine acetylation in E. coli (cobB and patZ) and to study their transcriptional regulation; (iv) to decipher the role of lysine acetylation in the different acetate metabolism observed between the BL21 and K12 E.coli strains; (v) to identify protein acetylation patterns in different growing conditions and genomic backgrounds; (iv) and to characterise the function of protein lysine acetylation in acetate metabolism and transcriptional regulation. / Methodology: the strain Escherichia coli BW25113 and its knockout mutants deleted in the pathways of interest were used during this PhD thesis. Several techniques were used in order to achieve the objectives mentioned above, such as RT-PCR, promoter probe plasmids, DNA microarray, enzyme activities in cell crude extracts and purified enzymes, metabolite measurement by HPLC and High resolution MS proteomics. Results and discussion. The deletion of the main acetate-producing pathway altered central metabolism at different levels, from the transcripts to the energetic levels, showing the link between this metabolism and central carbon metabolism, and also the importance of a proper-balance of acetate metabolism. The sirtuin CobB and the acetyltransferase PatZ altered the activity of acetyl-CoA synthetase in vivo. the cobB gene is expressed constitutively while the patZ gene expression is activated transcriptionally by the transcription factor CRP, similarly to what has been described for the acetyl-CoA synthetase gene, having two putative binding sites in its upstream region. The absence of the CobB and PatZ protein in the BL21 strain altered more severely the acetate metabolism than in the K12. This indicates that probably the differential metabolic regulation of these enzymes could be the key for this different acetate production. Further, the deacetylase activity of CobB is global, contributes to the deacetylation of a big number of substrates and has a major impact on bacterial physiology. Acetylation of isocitrate lyase contributes to the fine-tuning regulation of the glyoxylate shunt and the acetylation of lysine 154 of RcsB prevents DNA binding. This last effect activates flagella biosynthesis and motility proteins, and increases susceptibility to acid stress. Besides, deletion of the acetyltransferase patZ increased acetylation especially in acetate cultures. These results suggest that the role of PatZ could be the regulation of the levels of acetylating agents in the cell. In fact this last finding would explain the simultaneous transcriptional activation of the protein acetyltransferase (patZ) and acetyl CoA synthetase (acs). Conclusions. The results presented in this PhD thesis offered new insights into the roles of acetate metabolism and lysine acetylation in E. coli. Acetate metabolism is linked to central metabolism regulating the levels of key metabolites, such as acetyl-CoA and acetyl-phosphate, both having been shown involved in protein lysine acetylation. This post-translational modification mechanism is important in the control of metabolism, but also in other important physiological roles such as motility and stress survival. Also, the protein acetyltransferase, PatZ, is not a major protein-acetyltransferase in E. coli, but rather might play a role in the regulation of chemical acetylation in E. coli.