En esta tesis se estudió la biología y la ultraestructura del género Haematococcus pluvialis y se evaluó el contenido lipídico de las células para la obtención de biodiesel. La ultra-estructura general de las células vegetativas es común a muchas Chlorophyceae, sin embargo, la cubierta celular y la configuración absoluta del aparato flagelar presentaron características particulares del género. En este estudio, se propone una nueva interpretación de la cubierta celular, formada por un estrato externo delgado y fibrilar y un estrato interno constituido por vesículas muy próximas entre sí. Además se describe el proceso de formación, en el cual inter-viene el sistema de endomenbranas. Bajo condiciones de culti-vo adversas las células vegetativas formaron cistos. Durante el proceso de enquistamiento las células perdieron movilidad, aumentaron de tamaño, sintetizaron una pared gruesa y acumularon un pigmento llamado astaxantina. La pared celular estuvo compuesta por una capa externa trilaminar de algae-nano, un componente medio formado por material electrónica-mente denso y un componente más interno, formado por dis-tintos estratos de morfología variada. Se describe por primera vez el proceso de germinación de los cistos en H. pluvialis, con particular atención al comportamiento de los distintos componentes de la pared durante este proceso y la liberación de los zooides. Las capas trilaminar y media se rompieron con el incremento de tamaño del cisto, sin embargo, el componen-te interno acompañó la expansión del mismo durante la germi-nación. El diferente proceso de formación de cada uno de los componentes de la pared explicaría el comportamiento distinto de estos, durante el proceso de germinación. Se evaluó el contenido lipídico de H. pluvialis y su posible aplicación en la obtención de biodiesel. Se logaron optimizar las condiciones específicas de cultivo para un crecimiento óptimo y para la síntesis de lípidos bajo condiciones de estrés, duplicando el contenido lipídico en cultivos estresados (35 g de lípidos en 100 g de biomasa) con respecto a los cultivos control. Se evaluaron distintos métodos de extracción lipídica y se realizó la caracterización de los ácidos grasos, siendo la fracción neu-tra la mayoritaria en cultivos control y estresados. El perfil de los ácidos grasos en ambas condiciones de cultivo fue similar y los principales ácidos grasos fueron el palmítico, esteárico, oleico, linoleico, linolelaídico y linolénico. Se obtuvo biodiesel por los métodos convencional de transesterificación y de me-tanol supercrítico. El rendimiento de la reacción de transesteri-ficación por catálisis ácida fue del 70%. Este valor puede con-siderarse aceptable considerando que la materia prima utili-zada, no sólo contenía triglicéridos sino además otros lípidos y pigmentos. A través del método supercrítico fue factible la extracción lipídica utilizando metanol a alta temperatura y presión, como también se efectivizó la transesterificación de los triglicéridos. La calidad lipídica de H. pluvialis indica el potencial que posee esta microalga como materia prima para la obtención de biodiesel. Este estudio provee información de base útil para futuras investigaciones tendientes a buscar las condiciones más adecuadas para mejorar el rendimiento lipídico, la extracción de lípidos y el proceso de obtención de biodiesel. / In this thesis the biology and ultrastructure of the genus Haematococcus pluvialis were studied. The evaluation of lipid content for biodiesel production was also performed. The general ultrastructure of vegetative cells is common to many Chlorophyceae; however, the cell coat and the absolute configuration of the flagellar apparatus showed particular ge-neric characteristics. In this study a new interpretation of the cell coat was proposed. The cell coat consisted of a fibrillar-thin outer layer and an inner one composed of vesicles close together. In addition, its formation process that involved en-domembrane system was described. Under adverse growing conditions, vegetative cells formed cysts. During cyst forma-tion, the cells lost mobility, increased in size, synthesized a thick wall and accumulated a pigment called astaxanthin. The cell wall was composed of a trilaminar outer layer of algaenan, a middle component that was made of electronically dense material and an innermost component, consisting of various layers of varied morphology. The cyst germination process in H. pluvialis was described for the first time. During germination the trilaminar layer broke down, carrying the adjacent secon-dary component, and the extensible tertiary component accompanied the cyst in its size increase and its shape change. Lipid content and its possible application for biodiesel production were evaluated. The optimization of specific culture conditions for optimum growth and lipid synthesis under stress conditions were achieved. The lipid content in stressed cultures doubled (35 g lipid in 100 g biomass) compared with control cultures. Different lipid extraction methods were evaluated and characterization of fatty acids was performed, being major the neutral fraction in both control and stressed cultures. The fatty acid profile in both culture conditions was similar and the main fatty acids were palmitic, stearic, oleic, linoleic, linolenic and linolelaidic acids. Biodiesel by conventional transesterification and supercritical methanol methods was obtained. The yield of the transes-terification reaction by acid catalysis was 70%. This value can be regarded as acceptable considering that the feedstock contained not only triglycerides but also other lipids and pigments. H. pluvialis lipid quality showed the potential of this microalga as a promising feedstock for biodiesel production. This study provides baseline information useful for future researches tending to find more suitable conditions in order to improve lipid yield, lipid extraction and the biodiesel production process.

Las bahías y estuarios se caracterizan por presentar una abundante y diversa comunidad de peces. El planteo de estrategias de manejo adecuadas para cada región requiere de información biológica y ecológica de estas comunidades y del análisis del estado de explotación de las mismas. La región costera de Bahía Anegada, (Buenos Aires, Argentina), posee un importante valor ecológico dada la alta diversidad y complejidad ambiental que presenta, sin embargo, la información cuantitativa sobre la biota existente en esta región es escasa y focalizada sólo en algunas especies. Este trabajo de tesis representa el primer estudio sobre la biología y ecología de las especies que componen la comunidad íctica de la región de Bahía Anegada. Se presentan por primera vez estimaciones de parámetros biológicos clave para Myliobatis goodei. Las especies capturadas fueron identificadas al menor nivel taxonómico posible y sus abundancias fueron estimadas para los distintos sitios de muestreo y estaciones del año. Se estimaron parámetros ecológicos como la riqueza, diversidad y uniformidad de la comunidad. Para evaluar las variaciones espaciales y temporales de la estructura y composición de esta, se realizó un análisis permutacional no paramétrico de la variancia (NPMANOVA). La relación entre la composición en número, por especies, estación del año y lugar de muestreo se ordenaron mediante análisis de componentes principales (ACP) y análisis de agrupamiento jerárquico. La época de reproducción de cada una de las especies se determinó mediante el índice gonadosomático (IGS), el que fue calculado por sexo y estación del año. Este índice también se empleó para calcular la talla de primera madurez (L50). A fines comparativos, la L50 también se calculó a partir de las estimaciones macroscópicas del estado de madurez gonadal. La composición dietaria se examinó utilizando el índice de importancia relativa porcentual (%IRI). Las diferencias en la composición dietaria se evaluaron mediante NPMANOVA. La estrategia alimentaria de cada especie se determinó mediante una modificación del método gráfico de Costello. El grado de superposición dietaria entre las especies se estimó mediante dos métodos: la diversidad beta (1Db) y el índice de Horn. Se calculó el nivel trófico de cada especie. Durante las campañas de muestreo en Bahía Anegada se capturaron un total de 2797 ejemplares, comprendidos en 13 especies de osteictios y siete de condrictios. La mayor riqueza específica se registró en primavera y verano. La diversidad de especies fue mayor en primavera y verano, mientras que en otoño e invierno se registró mayor uniformidad. La composición de la comunidad presentó variaciones temporales y no espaciales. Las diferencias en la composición y estructura de la comunidad de peces entre las estaciones cálidas y las frías, puede explicarse en parte por los movimientos migratorios de Mustelus schmitti, M. goodei y Cynoscion guatucupa, que ingresan a la bahía con fines reproductivos, de alimentación y refugio, y en parte al comportamiento reproductivo de Odontesthes argentinensis. Los individuos adultos de M. schmitti estuvieron presentes exclusivamente en primavera y verano, estaciones en las cuales también se registraron individuos cuyas tallas fueron menores a la talla de primera madurez, lo que sugiere que la especie utilizaría este ambiente como área de cría. M. schmitti presentó una dieta compuesta principalmente por crustáceos decápodos y poliquetos, y una estrategia alimentaria oportunista y levemente generalista. Myliobatis goodei presenta una dinámica poblacional compleja, con movimientos migratorios relacionados con la obtención de alimento y la reproducción. De la misma manera que M. schmitti, esta especie utiliza la bahía como área de cría y alimentación. M. goodei presentó una dieta compuesta principalmente por moluscos bivalvos, seguidos por crustáceos anfípodos y poliquetos, y una estrategia alimentaria con características oportunistas. Cynoscion guatucupa realiza movimientos migratorios relacionados con la reproducción, ingresando a la bahía en otoño y primavera. La dieta de esta especie estuvo compuesta mayormente por peces y crustáceos decápodos y presentó una estrategia alimentaria oportunista. El patrón de abundancia de O. argentinensis en Bahía Anegada está relacionado con la reproducción, siendo activos y formando cardúmenes en las estaciones frías y dispersándose en las estaciones cálidas. Squatina guggenheim probablemente utilice este ambiente como área de cría y alimentación, de la misma manera que lo hace en otras bahías y estuarios de la provincia de Buenos Aires. La dieta de S. guggenheim estuvo compuesta principalmente por peces y en menor medida, por poliquetos. Se presentan por primera vez estimaciones del L50 para B. aurea, las cuales coinciden con el límite de detección de individuos maduros, correspondiente a 2 años de edad. Los individuos de M. furnieri capturados en esta bahía presentaron tallas cercanas a la máxima mencionada. La dieta de esta especie estuvo compuesta principalmente por crustáceos decápodos, poliquetos y moluscos bivalvos. Callorhynchus callorhynchus en Bahía Anegada presentó una dieta compuesta casi exclusivamente por bivalvos, entre los cuales se halló la especie exótica e invasora Crassostrea gigas. El conjunto de especies cuyas dietas fueron analizadas presentaron una superposición dietaria media, con una 1Db global de 3,58. La mayor superposición dietaria fue observada entre M. goodei, M. schmitti y M. furnieri. La dieta de C. callorhynchus fue diferente a las de C. guatucupa y S. guggenheim, sin embargo estas dos presentaron, entre sí, dietas marcadamente superpuestas. La especie con mayor nivel trófico (NT) fue S. guggenheim (4,23), seguido de C. guatucupa (4,05), M. schmitti (3,5) y M. furnieri(3,5), y M. goodei (3,2) y C. callorhynchus (3,17) que presentaron los menores valores de NT. Este trabajo constituye la primera investigación sobre la ecología y biología de la comunidad de peces de Bahía Anegada, además de proveer información inédita para algunas de las especies que la integran. La información provista en esta tesis contribuye potencialmente a la generación de planes de manejo de los recursos pesqueros de la reserva. Trabajos adicionales sobre la bioecología de las comunidades marinas, como por ejemplo de invertebrados bentónicos, podrían reforzar los resultados de esta tesis, ayudando a esclarecer la naturaleza de las tramas tróficas del ecosistema marino de Bahía Anegada. / Coastal areas, like bays and estuaries are characterized by an abundant and diverse fish community. Designing management strategies for these regions requires adequate and precise biological, ecological and exploitation status information regarding these communities. Anegada Bay is located at the south of Buenos Aires province, and has an important ecological value, given its high environmental diversity and complexity. However, quantitative information about its biota is lacking, and focused only in some species. This study constitutes the first record of a biological and ecological study of the community of fishes for Anegada Bay. Estimations of key biological parameters for Myliobatis goodie are presented for the first time. Each fish species captured in Anegada Bay was identified at the least taxonomic level, and its relative abundance in both number and weight estimated, for each site and season. Community richness, diversity and uniformity were estimated for each site and season. In order to evaluate spatial and temporal variations in the structure and composition of the fish community, a permutational analysis of variance (NPMANOVA) was performed. Principal component analysis (PCA) and cluster analysis were used to explore the relationship between number abundance of each species by site and season. Reproduction season was determined with the gonadosomatic index (GI), which was calculated for each individual, by species, sex and season, and also used to estimate length at first maturity (L50). Standard technique to estimate L50 by means of macroscopic estimation of maturity was also employed. Dietary composition was examined by means of the percentage index of relative importance (%IRI). NPMANOVA was used to test for differences in the dietary composition. Feeding strategy was evaluated by a modification of Costello’s graphical method. Trophic overlap between species was estimated with both Horn index of overlap, and beta diversity (1Db). Trophic level was also estimated for each species. A total of 2797 fish were caught during the fish surveys in Anegada Bay, belonging to 13 species of boney fishes and 7 of cartilaginous fishes. The higher richness and diversity was found in spring and summer, while uniformity was higher in autumn and winter. The fish community composition showed temporal dynamics, while spatial differences were not found to occur. These seasonal differences in the fish assemblage can be explained by the migratory movements of Mustelus schmitti, M. goodei and Cynoscion guatucupa. These species enter Anegada Bay to reproduce, feed and to find shelter. The reproductive behavior of O. argentinensis also influences the seasonal variation. Adult Mustelus schmitti individuals were registered only during the warm seasons, while neonates and juveniles were found in both the warm and the cold seasons. This suggests this species use Anegada Bay as a nursery area. The diet of M. schmitti was composed mainly of decapods crustaceans and polychetes, and presented an opportunistic and generalist feeding strategy. Myliobatis goodei presented a complex population dynamic, with similar movement patterns, mainly related with feeding and reproduction. As well as M. schmitti this species likely uses Anegada Bay as nursery grounds. The diet of M. goodei was composed mainly of bivalves and amphipods, and presented an opportunistic feeding strategy. Cynoscion guatucupa showed migratory movements related with reproduction, entering the bay in autumn and winter. The diet of C. guatucupa was composed mainly of fish and decapods crustaceans, and presented an opportunistic feeding strategy. The abundance pattern of Odontesthes argentiniensis in the bay was related with reproduction, being active and clustering in spawning schools during the cold seasons, to then disperse in the warm seasons. As it does in other bays and estuaries of Buenos Aires province, Squatina guggenheim likely uses Anegada bay as nursery grounds. The diet of S. guggenheim was composed almost exclusively of fish and in least proportion, polychetes. Length at first maturity is presented by the first time for Brevoortia aurea. The length determined matches the threshold of detection for mature individuals on coastal waters, which is 2 years old. Length recorded for Micropogonias furnieri were close to the maximum reported for the species. The diet of M. furnieri was composed almost exclusively of decapods crustaceans and in least proportion, polychetes and bivalves. The diet of Callorhynchus callorhynchus was composed mainly of bivalves and in least proportion, among which was Crassostrea gigas, an exotic and invasive species. The overall overlap among the species analyzed was moderate, with a global 1Db of 3.58 of the six species considered. Te highest overlap was between M. goodei, M. schmitti and M. furnieri. There was a low overlap between C. callorhynchus and C. guatucupa and S. guggenheim. However, these last two presented a high overlap. Th especies with the highest trophic level in Anegada Bay was S. guggenheim (4.23), followed by C. guatucupa (4.05), M. schmitti (3.5) and M. furnieri(3.5), and M. goodei (3.2) and C. callorhynchus (3.17) which presented the lowest trophic level. This thesis constitutes the first research conducted on ecology and biology of the fish assemblage of Anegada Bay, and also provides the first estimation of key biological parameters for some of its species. The information provided here, contributes to the development of management plans for the fish resources of the bay. Additional research conducted for the marine communities of the reserve, for instances, the benthic invertebrate assemblage, might strengthen the results exposed here, aiding in unveiling the trophic web of Anegada Bay’s ecosystem.

El embalse Paso de las Piedras, fuente de agua potable de la ciudad de Bahía Blanca y alrededores, se encuentra eutrofizado. El arroyo El Divisorio, afluente directo, aporta altas concentraciones de nutrientes a dicho embalse. Por otro lado, tanto las aguas subterráneas como el arroyo El Divisorio, aportan concentraciones de arsénico que superan los límites permitidos por el Código Alimentario Argentino y la Organización Mundial de la Salud (10 μg/L). Desde hace décadas, el uso de humedales artificiales para la remediación de aguas residuales y eutrofizadas es una técnica aprobada y utilizada con éxito, ya que es una alternativa ecológica, económica y de fácil manejo. El método se basa, al igual que en los humedales naturales, en la combinación de procesos físicos, químicos y biológicos en un medio diseñado, construido y manejado por el hombre. Las plantas de los humedales juegan un rol importante en el proceso de depuración del agua ya que las mismas puede tener papeles activos derivados de la actividad fisiológica y papeles pasivos, en los que intervienen procesos físicos por efecto de la presencia de las plantas en el sistema. Muchas especies de macrófitas son utilizadas como biofiltros en humedales artificiales. La selección de las especies vegetales debe realizarse de acuerdo a la adaptabilidad de las mismas al clima local y a condiciones climáticas diversas, capacidad de transporte de oxígeno de la superficie a la rizósfera, de su tolerancia a altas concentraciones de contaminantes así como de su capacidad para asimilarlos, de su alta presencia en la zona donde se va a instalar el sistema, de la facilidad para recolectarlas y posterior transporte y su fácil autogeneración. En la cuenca del Sauce Grande se encuentra presente la macrófita Senecio bonariensis (Compositae) y la macroalga Cladophora surera (Chlorophyta). Se construyeron dos humedales funcionando en paralelo en la ribera del arroyo El Divisorio cerca de la desembocadura al embalse Paso de las Piedras y se realizaron bioensayos de laboratorio con ambas especies, utilizando el agua del arroyo y también empleando medios de cultivo variando la concentración de nutrientes y de arsénico. Los objetivos del estudio fueron:1) Determinar la eficiencia de S. bonariensis, para la remoción de nutrientes y de arsénico del agua del arroyo El Divisorio. 2) Analizar la capacidad de bioacumulación de fósforo y nitrógeno de S. bonariensis estableciendo una relación con la producción de biomasa para optimizar el funcionamiento del humedal artificial. 3) Establecer la capacidad de retención de arsénico en los tejidos de S. bonariensis mediante ensayos de laboratorio. 4) Evaluar el rol complementario, en la biorremediación del agua del arroyo, de las macroalgas desarrolladas naturalmente en el humedal artificial, cuantificando la concentración celular de nitrógeno, fósforo y arsénico a través de bioensayos en laboratorio. S. bonariensis mostró una gran capacidad de adaptación a las condiciones artificiales del humedal construido dado que se obtuvieron plantas vigorosas con gran desarrollo de raíces y una biomasa de 2194,3 ± 473,2 g PS/m2. Además, el 82% de las plantas florecieron. Durante el periodo experimental de 7 meses con un humedal de 96 m2 y una densidad de 7 plantas por m2, se pudo remover 70% de nitratos y 50% de fósforo reactivo soluble. S. bonariensis mostró gran capacidad de retención de P y N en sus órganos como así también adaptación a concentraciones de nutrientes elevadas (100 mg/L de nitrógeno total y 60 mg/L de fósforo total). Por otro lado, S. bonariensis resultó ser un potencial agente de biorremediación de aguas arseniosas ya que soporta concentraciones de arsénico de hasta 5000 μg/L no mostrando toxicidad al mismo. Con respecto a C. surera se pudo observar en ensayos de laboratorio una eficiencia de remoción de nitratos del 94% y de fósforo reactivo soluble del 23%. Así mismo, esta especie también demostró tener capacidad de remoción de arsénico desde el agua del arroyo El Divisorio, reduciendo la concentración de arsénico de la columna de agua un 60% en solo 12 días. Por los resultados obtenidos se concluye que S. bonariensis resultó ser una especie apta para ser cultivada en humedales con el fin de ser utilizada como biofiltro para la remoción de nitrógeno y fósforo disueltos en la columna de agua del arroyo El Divisorio. Los cultivos hidropónicos bajo condiciones de laboratorio han indicado que S. bonariensis es una especie que soporta condiciones de hipereutrofia y que demás tolera grandes concentraciones de arsénico. El diseño de un sistema a mayor escala (una hectárea aproximadamente) sería una buena alternativa para mitigar la eutrofización del arroyo El Divisorio como así también para disminuir las concentraciones de arsénico que aporta al embalse Pasos de las Piedras. Además, S. bonariensis podría ser empleado como biofiltros de agua arseniosa de cualquier origen. En un futuro, investigaciones sobre la mecánica de extracción de As por parte de la macroalga C. surera aportarán datos de relevancia para optimizar la utilización de este agente en la remoción de As de una columna de agua de cualquier origen. La utilización de humedales artificiales para el saneamiento de cuerpos o cursos de agua es un método ecológico de bajo costo de mantenimiento y fácil manejo operativo, y además, recrea atractivos espacios verdes embelleciendo el área donde se instalen. / Paso de las Piedras reservoir, provides water drink to Bahia Blanca city and others cities, it is eutrophic. El Divisorio stream, direct tributary, supply high nutrients concentration in reservoir. Moreover, El Divisorio stream and groundwater provides arsenic concentration what excess allowable limits by Código Alimentario Argentino and World Health Organization. A long time, constructed wetlands are a appropriate technique for remediation wastewater and eutrophic water, since this represent alternative ecological low cost and easy operating management. This technique, as in natural wetlands, is based in the physics, chemistry and biology process combination, in constructed wetlands by man. The vegetation play role very important in the depuration process, since them can have active roles derivate of physiology activity and them can have passive roles, in which join in physics process for effects of plants present in the system. Many macrophytas species are enjoy as biofilters. The selection of species vegetation must realized allow for: adaptability thereof to local weather conditions and various weather conditions; oxygen carrying capacity of the surface to the rhizosphere; the same tolerance to high concentrations of pollutants and their ability to assimilate; its high presence in the area where you are installing the system; the facility to collect them and subsequent transport and easy self-generation. In the basin Sauce Grande river inhabit autochthonous species, macrophyte Senecio bonariensis and filamentous macroalgae Cladophora surera, which were used as biofilters. Were constructed wetlands operating in parallel, on El Divisorio stream riverside near of the river mouth in Paso de las Piedras reservoir. Further, bioassays were performed, with both species. Culture mediums were stream water and artificial water, to which it varied the concentration of nutrients and arsenic. The objectives of study were: 1) To determine the efficiency of S. bonariensis, for nutrient an arsenic removal from water El Divisorio stream. 2) Analyze the potential for bioaccumulation of phosphorus and nitrogen in S. bonariensis establishing a relationship with the production of biomass to optimize the functioning of the wetland. 3) Set arsenic retention capacity in tissues of S. bonariensis by laboratory tests. 4) Assess the complementary role, in bioremediation, from macroalgae grow naturally in constructed wetland, quantifying the cellular concentration of nitrogen, phosphorus and arsenic through laboratory bioassays. S. bonariensis showed great adaptability to the artificial conditions of the constructed wetland were obtained as vigorous plants with well developed roots and biomass 2194.3 ± 473.2 g DW/m2. Furthermore, 82% of the plants flowered. During the experimental period of 7 months with a wetland of 96 m2 and a density of 7 plants per m2, it was 70% of nitrate and 50% soluble reactive phosphorus removal. S. bonariensis showed great retention capacity of P and N in their bodies as well as adaptation to high nutrient concentrations (100 mg / L of total nitrogen and 60 mg / L total phosphorus). Furthermore, S. bonariensis proved to be a potential agent arsenius water bioremediation because it supports arsenic concentrations up to 5000 mg / L did not show toxicity to the same. With respect to C. surera was observed in laboratory tests a removal efficiency of 94% nitrate and soluble reactive phosphorus 23%. Also, this species also demonstrated capacity to remove arsenic from the water of El Divisorio stream, reducing the concentration of arsenic in the water column by 60% in just 12 days. The design of a larger scale (approximately one hectare) would be a good alternative to mitigate eutrophication of El Divisorio stream well as to reduce the concentrations of arsenic that gives Paso de las Piedras reservoir. Furthermore, S. bonariensis could be used as biofilters arsenius water from any source. In the future, research on the mechanical extraction of As by the macroalga C. surera provide relevant data to optimize the use of this agent in removing As a column of water from any source. This ecological method is also inexpensive and easy handling operational management, as well as attractive green spaces recreates beautifying the area where it is installed.

El estrés ejerce sus efectos sobre el organismo, no sólo a través de las vías de respuesta fisiológica, sino también a través de vías genéticas y epigenéticas. Muchos autores sostienen que el estrés es un factor clave para explicar el papel evolutivo del sexo en los organismos de modo reproductivo facultativo. Por lo tanto, es esperable que los mismos se crucen más frecuentemente bajo situaciones de estrés, facilitando la adaptación a ambientes cambiantes. Eragrostis curvula es un complejo polimórfico donde la mayoría de sus miembros se reproducen por apomixis, reproducción asexual a través de semillas, que conduce a la generación de progenies genéticamente idénticas a la planta madre. El objetivo de esta tesis fue determinar el efecto de diferentes factores que generan estreses genómicos sobre la expresión de la apomixis en pasto llorón, como el estrés hídrico, el cultivo in vitro, la poliploidización y la hibridación intraespecífica. Para ello, se analizaron sacos embrionarios de plantas de distintos genotipos de pasto llorón luego de haber sido sometidas a dichas condiciones. Además, se realizaron pruebas de progenie con marcadores moleculares y se analizó el nivel de metilación de los genomas luego de los diferentes tratamientos. Antes de evaluar el efecto de situaciones estresantes sobre el modo reproductivo fue necesario analizar la estabilidad del carácter a lo largo del periodo de floración, hallándose que el cv. Tanganyika INTA presenta una sexualidad promedio menor al 2 % en condiciones de invernáculo. Plantas del cv. Tanganyika INTA bajo condiciones de estrés por déficit hídrico mostraron un 14 % de sacos sexuales, indicando un incremento de expresión de la sexualidad respecto de las plantas control. Luego de un periodo de rehidratación mostraron una sexualidad residual del 5,3 %, indicando una disminución significativa de la misma, siendo, sin embargo, significativamente diferente del control. Se realizaron pruebas de progenie con marcadores RAPDs y se detectaron polimorfismos solamente en las plantas sometidas a estrés hídrico, aunque en una proporción menor a la esperada de acuerdo a los análisis citoembriológicos, indicando que no todos los sacos embrionarios sexuales producidos dan lugar a plantas viables. El cv. Tanganyika USDA no evidenció en ningún momento la capacidad de generar sacos sexuales, clasificándoselo como apomíctico obligado. El genotipo facultativo UNST1131 presentó una proporción de procesos sexuales del 18,5 % bajo condiciones de estrés hídrico. Sin embargo este valor no fue significativamente distinto al control (10 %), debido principalmente a la gran variabilidad observada. Para evaluar efectos mediados por ABA se realizaron ensayos de aplicación foliar en plantas del cv. Tanganyika INTA normalmente regadas. El análisis citoembriológico no permitió detectar diferencias significativas en el número de sacos sexuales en relación con el control, descartándose momentáneamente a la concentración de esta hormona como mediadora del efecto generado por estrés. También se analizó el efecto del cultivo in vitro realizando diferentes ensayos en los que se varió el tipo de explanto, el medio de cultivo y la duración de los mismos. Se evaluaron los cultivares Tanganyika USDA y Tanganyika INTA. Solo uno de los ensayos (exposición a medios selectivos) generó un efecto significativo sobre el número de sacos sexuales producidos, que incrementaron, demostrando una cierta plasticidad del carácter en situaciones de estrés. Estos resultados indicarían que situaciones de estrés previas y durante la etapa de floración podrían estar regulando la expresión de la sexualidad en genotipos apomícticos facultativos de pasto llorón. Es evidente que en los cvs. Tanganyika USDA, Tanganyika INTA y UNS1131 expresan diferentes niveles de apomixis/sexualidad, desde cero a 33%. Por otro lado, este estudio permitió demostrar que no solo las condiciones externas promueven estreses genómicos que alteran la expresión de la apomixis en pasto llorón. Condiciones como la poliploidización y la hibridación intraespecífica también afectan al modo reproductivo. El análisis de la expresión de la apomixis a través del tiempo en dos híbridos (105 y 60) obtenidos a partir de la cruza entre materiales contrastantes para el modo reproductivo mostró diferencias en la expresión del carácter. El primero (105) mostró un comportamiento errático en las proporciones de procesos apomíctico/sexuales, con estabilización del carácter tendiente a una relación 1:1 mientras que el otro, (60) presentó solo sacos sexuales en las dos primeras floraciones y una pequeña proporción de sacos apomícticos en la tercera. Los resultados obtenidos en las pruebas de progenie mostraron correlación con los observados por estudios citoembriológicos. Dada la relación entre la apomixis y el ambiente, podría especularse que los genes involucrados en el modo reproductivo son controlados por factores epigenéticos como la metilación del ADN. Se realizaron análisis comparativos sobre los genomas (AFLP) y epigenomas (MSAP) de varios grupos de plantas con el fin de establecer el efecto de estreses genómicos sobre el genoma y epigenoma. Los grupos de plantas comparadas fueron: 1) tratadas por estrés hídrico y plantas control del cv. Tanganyika INTA y 2) plantas híbridas del primer año de análisis y luego de tres años. En el primer caso, no se hallaron cambios genéticos en el tiempo en las plantas sometidas a estrés hídrico y control, mientras que las comparaciones con marcadores MSAP permitieron evidenciar un gran número de marcadores polimórficos debidos a procesos de metilación y desmetilación del ADN entre los dos tiempos de muestreo. Si bien no existe una diferencia estadística entre la suma de cambios ocurridos en el tiempo entre el grupo de plantas control y tratadas, se observó un alto grado de correlación (R2= 0,7949) entre los porcentajes de cambios ocurridos en el tiempo y los porcentajes de sexualidad calculados a través del análisis citoembriológico para cada individuo. En el híbrido 60 no se hallaron cambios genéticos en el tiempo, pero si se hallaron en el híbrido 105. En el análisis de los perfiles epigenéticos, el híbrido 60 mostró una mayor proporción de procesos de metilación, mientras que el 105 reveló una tendencia mayoritaria hacia la desmetilación del ADN. Esto podría atribuirse a una mayor inestabilidad genómica, que podría asociarse a un comportamiento más errático del modo reproductivo. La secuenciación de una muestra de los polimorfismos obtenidos por AFLP y MSAP mostró una alta proporción (55 %) de secuencias sin homología con regiones conocidas del genoma, pudiendo tratarse de metilaciones y desmetilaciones en regiones no codificantes o en secuencias del genoma aún no informadas. Las secuencias que mostraron homología con secuencias previamente anotadas fueron principalmente elementos transponibles. Los resultados aquí presentados y los previos obtenidos por el grupo de trabajo nos permiten hipotetizar que existe una región determinante de la apomixis, que estaría ausente en las plantas tetraploides sexuales. La misma podría contener regiones repetitivas y con redundancia génica que estarían silenciando la sexualidad en plantas apomícticas. Existen numerosas evidencias sobre el control mediado por pequeños ARNs en el silenciamiento de regiones repetitivas y elementos transponibles. Ante determinadas circunstancias, como condiciones de estrés prolongado, en esta región podría estar ocurriendo un efecto de des-represión epigenética, permitiendo un aumento en la proporción de procesos sexuales. Si bien aún resta trabajo experimental para comprobar esta hipótesis, los procesos de metilación y desmetilación observados y los elementos transponibles secuenciados serían evidencias preliminares a considerar. / Stress affects the organisms generating physiological, genetic and epigenetic responses. Many authors argue that stress is a key factor to explain the evolutionary role of sex in organisms with facultative reproductive mode. Therefore, it is expected that facultative organisms will cross more frequently under stress, facilitating the adaptation to changing environments. Eragrostis curvula constitutes a polymorphic complex where most of its members reproduce by apomixis, asexual reproduction through seeds, which leads to the generation of progenies genetically identical to the mother plant. The aim of this work was to study the effect of different factors that generate genomic stress on the expression of apomixis in weeping lovegrass, such as water stress, in vitro culture, polyploidization and intraspecific hybridization. For this purpose, embryo sacs of different weeping lovegrass genotypes were observed after being the plants subjected to these stress conditions. Moreover, progeny tests were conducted by using molecular markers and the genome methylation status after different treatments was also assessed. Before evaluating the effect of the mentioned stressors on the reproductive mode it was necessary to analyze the stability of the trait throughout the flowering period, finding that plants of the cv. Tanganyika INTA growing in the greenhouse exhibited an average of sexuality less than 2 %. Plants of this cultivar subjected to water stress showed an average of 14% of sexual embryo sacs, indicating an increased expression of sexuality compared to control plants. After a rehydration period these plants showed an average of sexuality of 5.3 %, indicating a significant reduction in the number of sexual embryo sacs, being, however, significantly different from control plants. Progeny tests were performed with RAPDs markers detecting polymorphisms only in plants subjected to water stress, although in a less ratio than the expected according to the cyto-embryological analysis, indicating that not all the sexual embryo sacs produced develop into viable plants. Plants of the cv. Tanganyika USDA did not show at any time the ability to generate sexual embryo sacs and being classified as full apomictic one. The facultative genotype UNST1131 showed an expression of sexual processes of 18.5 % under water stress conditions, however this value was not significantly different to the control (10%), mainly due to the large variability exhibited by this material. To assess effects mediated by ABA, foliar application were performed on normally watered cv. Tanganyika INTA plants. The cyto-embryologic analysis was unable to detect significant differences in the number of sexual embryo sacs compared to the control, dismissing for the moment the hormone concentration as a mediator of the effect generated by stress. The effect of in vitro culture was also analyzed performing different tests in which the explant type, culture media and time under culture were changed. Tanganyika USDA and Tanganyika INTA cultivars were evaluated. In only one of the trials (exposure to selective media) a significant effect on the number of sexual embryo sacs was observed, which increased, showing a certain plasticity of the trait when the plants were growing under stress conditions. These results indicate that stress situations before and during the flowering stage might be regulating the expression of sexuality in facultative apomictic genotypes of weeping lovegrass. It is evident that Tanganyika USDA, Tanganyika INTA and UNS1131 cultivars express different levels of apomixis/sexuality ratios, from zero to 33%. This study also demonstrated that not only external conditions promote genomic stresses that alter the expression of apomixis in weeping lovegrass. Conditions such as intraspecific hybridization and polyploidization also affect the reproductive mode. The analysis of the expression of apomixis over time in two hybrids (#105 and #60) obtained from crosses between sexual X apomictic materials showed differences in the expression of the trait. The first one (#105) showed an erratic behavior in the ratio of apomictic/sexual processes, ending after two years with a ratio of 1/1, while the other (#60), only showed sexual embryo sacs on the two first blooms and a small proportion of apomictic embryo sacs during the third one. The results of progeny tests correlated very well with the cytoembryological observations. Given the close relationship between apomixis and environment, it might be speculated that the genes involved in the control of the reproductive mode could be subjected to epigenetic regulation, involving DNA methylation in some way. Comparative analyses at genomic (AFLP) and epigenetic (MSAP) levels were performed on different groups of plants in order to analyze the effect of genomic stresses. The groups compared were: 1) plants under water stress and normally watered plants (control) belonging to cv. Tanganyika INTA; 2) recently hybridized plants (first blooming) and the same plants in the third blooming period. In the first case (water stressed vs. control plants), no genetic changes over time were observed while comparisons with MSAP showed a large number of polymorphic markers due to processes of DNA methylations and de-methylations, showing a high correlation level (R2 = 0.7949) between the percentages of changes over time and the number of sexual embryo sacs. In the hybrid #60 no genetic changes were detected as it was in the #105. However, the analysis of epigenetics profiles showed a higher proportion of methylation processes in the hybrid #60 than in #105, while DNA demethylation levels were in the opposite direction. This could be associated with a higher genomic instability in #105 than in #60 that could be correlated with an increased erratic behavior of the reproductive mode. The sequencing of a sample of the polymorphic AFLP and MSAP bands showed a high proportion (55 %) of sequences without homology to previously annotated sequences, being probably noncoding regions or unknown genes. The other sequences were mainly transposable elements. The results presented here and those previously reported by our group allow us to hypothesize that there is a critical region conditioning apomixis, which would be absent in sexual tetraploid plants. This region could contain repetitive elements and gene redundancy that might be silencing sexuality in apomictic plants. Under certain circumstances, such as long stress periods, the control could be relaxed, allowing an increase in the proportion of sexual processes.

El nematodo de vida libre Caenorhabditis elegans es un organismo modelo para el estudio del sistema nervioso y enfermedades humanas. Este nematodo del suelo ofrece un gran potencial para análisis genéticos, en parte debido a su rápido ciclo de vida (3-días), pequeño tamaño (1,5 mm de largo) y fácil cultivo en el laboratorio.Progresos sustanciales en la identificación de genes que codifican para un gran número de proteínas responsables de la liberación de neurotransmisores, la detección postsináptica y las señales corriente abajo, han avanzado nuestro entendimiento de la mecanística de cómo las neuronas se comunican he interactúan. Caenorhabditis elegans es también un valioso modelo para el estudio de agentes antihelmínticos relacionados al sistema nervioso. Los receptores “Cys-loop” musculares de nematodos son de importancia clínica porque son blancos de drogas antihelmínticas. Los nematodos parásitos causan sustanciales muertes y morbidez en humanos y pérdidas en el ganado y animales domésticos. C. elegans es entonces una valiosa plataforma para el estudio de blancos antihelmínticos porque comparte características fisiológicas y farmacológicas con los nematodos de vida parasitaria, y es sensible a la mayoría de las drogas antihelmínticas. También ha emergido como un organismo modelo útil para el estudio de enfermedades neuromusculares humanas y testeo de drogas. En este trabajo de Tesis nosotros exploramos a diferentes niveles los receptores involucrados en la coordinación de la locomoción de los gusanos. En C. elegans los músculos de la pared del cuerpo reciben innervación de las neuronas motoras colinérgicas (excitatorias) y GABAérgicas (inhibitorias). La acetilcolina (ACh) liberada desde las neuronas motoras estimula la contracción muscular sobre un lado del cuerpo, y simultáneamente activa una neurona motora inhibitoria que se proyecta hacia el lado opuesto del cuerpo y libera GABA, el cual relaja los músculos. Debido a que C. elegans contiene un receptor de GABA y dos tipos farmacológicamente diferentes de receptores de ACh (AChR), el AChR sensible a levamisol (L-AChR) y el AChR sensible a nicotina (N-AChR), decidimos dividir este trabajo en dos capítulos para una lectura más conveniente. En el Capítulo I, exploramos los AChRs. El AChR es un miembro de la familia de receptores “Cys-loop”, la cual media la transmisión sináptica rápida en vertebrados e invertebrados. AChR pueden ensamblarse de cinco subunidades tipo-α idénticas ‒ formando receptores homoméricos ‒ como el receptor de vertebrados α7 o el N-AChR de C. elegans (ACR-16) o de diferentes subunidades α y no-α formando receptores heteroméricos, como los nicotínicos musculares de vertebrados y los L-AChRs musculares de nematodos. El músculo de C. elegans contiene siete diferentes subunidades de AChRs, cinco de las cuales han sido mostradas como componentes del L-AChR adulto. Para dilucidar la razón de tal diversidad de subunidades, exploramos sus roles funcionales en células musculares de la Larva 1 (L1). Por medio de ensayos de canal único y corrientes macroscópicas demostramos que las subunidades tipo-α UNC-38 y UNC-63 como la no-α UNC-29 son requeridas para L-AChRs funcionales. Asimismo exploramos en detalle la contribución de las subunidad tipo-α LEV-8 y ACR-8. Nuestro estudio revela que la subunidad LEV-8 es un componente del L-AChR nativo en L1 pero se comporta como una subunidad no esencial. Esta juega un rol clave en el mantenimiento de una baja velocidad y extendido de la desensibilización de los L-AChRs. También mostramos que en ausencia de la subunidad tipo-α ACR-8, la propiedades de los canales de L-AChRs no son modificadas, por lo tanto indicando que ACR-8 no es un componente del L-AChR en L1. Este estudio revela que las células L1 expresan un tipo principal de L-AChR compuesto de cinco diferentes subunidades: UNC-38, UNC-63, UNC-29, LEV-1, y LEV-8. El análisis de una doble mutante nula lev-8;acr-8, la cual muestra un fenotipo descoordinado y es resistente a levamisol, revela que ACR-8 puede reemplazar a LEV-8 en su ausencia, por lo tanto atribuyéndosele un rol a esta subunidad. En el Capítulo II, exploramos el UNC-49R. Los canales de cloro activados por GABA juegan un importante rol inhibitorio en el sistema nervioso de vertebrados e invertebrados. El receptor muscular de GABA de C. elegans está codificado por el gen unc-49, el cual es traducido en tres subunidades: UNC-49A, UNC-49B y UNC-49C. Ha sido mostrado que en el estado adulto de C. elegans el receptor de GABA está compuesto de las subunidades B y C. Los UNC-49Rs comparten superposiciones estructurales y farmacológicas con los receptores GABAA de mamífero en algunos aspectos y difieren grandemente en otros. Estas diferencias podrían ser explotadas en el diseño de drogas antiparasíticas. Sin embargo, la información sobre las propiedades funcionales de los receptores de nematodos es todavía escasa. Por medio de ensayos de corrientes macroscópicas y de canal único desciframos como los receptores de GABA de células musculares al estadio L1 de C. elegans son activados y modulados por agonistas y agentes antihelmínticos. Mostramos que muscimol, el cual es un agonista selectivo de los GABAARs, y piperazina, un antihelmíntico ampliamente utilizado, son ambos capaces de activar al UNC-49R. Los efectos de estas drogas a nivel molecular están relacionados con efectos comportamentales en ensayos de parálisis. Es interesante el hecho de que nuestros resultados revelan que la ivermectina (IVM), la cual es un modulador de muchos receptores “Cys-loop”, inhibe los receptores de GABA como también los L-AChRs de C. elegans, ambos involucrados en el movimiento coordinado. Más aún, la IVM muestra efectos sinérgicos sobre la parálisis inducida por ambos agonistas GABAérgicos y colinérgicos. Por lo tanto, reforzando la importancia de la investigación sobre la combinación de drogas antihelmínticas como estrategia tendiendo a reducir el incremento de problemas de resistencia a drogas. En general, nuestros estudios en el capítulo II proveen nueva información concerniente a la activación de los GABAARs en el músculo de C. elegans. Mostramos por primera vez la actividad de canal único del UNC-49R nativo, como también que muscimol y piperazina son agonistas de este receptor. Nuestro estudio también provee más información sobre los complejos y pleiotrópicos efectos de la IVM. La IVM es un inhibidor de los receptores de GABA y L-AChR. La elucidación de las bases estructurales y mecanísticas bajo las acciones pleiotrópicas de la IVM en la familia de receptores “Cys-loop” puede abrir puertas para el diseño de nuevas drogas. En resumen, en esta Tesis doctoral caracterizamos el L-AChR y la activación del UNC-49R, ambos involucrados en la locomoción coordinada. La caracterización de estos receptores “Cys-loop” en un organismo genéticamente manipulable y modelo de nematodos parásitos provee nuevas avenidas de exploración para drogas selectivas, como también para definir los determinantes estructurales de la activación y modulación en la familia de receptores “Cys-loop”. / The free-living nematode Caenorhabditis elegans is a model organism to study the nervous system and human diseases. This soil nematode offers great potential for genetic analysis, partly because of its rapid (3-day) life cycle, small size (1.5-mm-long adult) and ease of laboratory culture. Substantial progress in the identification of genes encoding for a large number of proteins responsible for neurotransmitter release, postsynaptic detection and downstream signaling has advanced our understanding of the mechanisms by which neurons communicate and interact. Caenorhabditis elegans is also a valuable model for the study of anthelmintic agents related to the nervous system. Nematode muscle Cys-loop receptors are of clinical importance because they are targets of anthelmintic drugs. Nematode parasites cause substantial mortality and morbidity in humans and losses in livestock and domestic animals. C. elegans is a valuable platform for the study of anthelmintic targets because it shares physiological and pharmacological characteristics with parasitic nematodes, and it is sensitive to most anthelmintic drugs. It has also emerged as a useful model organism for studying human neuromuscular diseases and for drug testing. In this Thesis we have explored at different levels the receptors involved in worm coordinated locomotion. In C. elegans, the body wall muscles receive innervations from both cholinergic (excitatory) and GABAergic (inhibitory) motor neurons. Acetylcholine released from motor neurons stimulates muscle contraction on one side of the body, and simultaneously activates an inhibitory motor neuron that projects to the opposite side of the body to release GABA. Since muscle cells contain one GABA and two different pharmacological types of acetylcholine receptors (AChR), the levamisole-sensitive AChR (L-AChR) and the nicotine-sensitive AChR (N-AChR), we decided to divide this work into two chapters for a more suitable lecture. In Chapter I, we explored AChRs. The AChR is a member of the Cys-loop receptor family, which mediates fast synaptic transmission in vertebrates and invertebrates. AChRs can assemble from five identical α-type subunits, forming homomeric receptors, such as vertebrate α7 or C. elegans ACR-16 (N-AChR) or from different α and non-α subunits forming heteromeric receptors, such as vertebrate and C. elegans muscle L-AChRs. Caenorhabditis elegans muscle contains seven different AChR subunits, five of which have been shown to be components of the adult levamisole-sensitive AChRs (L-AChRs). To elucidate the reason for such subunit diversity, we explored their functional roles in the larva 1 (L1) muscle cells. By single-channel and macroscopic current recordings we demonstrate that the -type UNC-38 and UNC-63 as well as the non- UNC-29 subunits are required for functional L-AChRs. We explored in detail the contribution of the α-type LEV-8 subunit. Our study reveals that it is a component of native L1 L-AChRs but behaves as a non-essential subunit. It plays a key role in maintaining a low rate and extent of desensitization of L-AChRs. We also show that in the absence of the α-type ACR-8 subunit, L-AChR channel properties are not modified, thus indicating that ACR-8 is not a component of L1 L-AChRs. This study reveals that L1 muscle cells express a main L-AChR type composed of five different subunits: UNC-38, UNC-63, UNC-29, LEV-1, and LEV-8. The analysis of a double lev-8; acr-8 null mutant, which shows an uncoordinated and levamisole-resistant phenotype, reveals that ACR-8 can replace LEV-8 in its absence, thus attributing a functional role to this subunit. In Chapter II, we have explored the UNC-49R. The GABA-gated chloride channels play an important inhibitory role in the nervous system of vertebrates and invertebrates. The C. elegans muscle GABA receptor is encoded by the unc-49 gene, which is translated into three subunits: UNC-49A, UNC-49B, and UNC-49C. In adult C. elegans the GABA receptor has been shown to be composed of B and C subunits. UNC-49 receptors share significant structural and pharmacological overlap with mammalian GABAA receptors in some aspects and differ greatly in others. These differences could be exploited in parasitic drug design. However, the information about functional properties of nematode receptors is still scarce. By analyzing at the macroscopic and single-channel level we deciphered how GABA receptors from C. elegans L1 muscle cells are activated and modulated by agonists and anthelmintic agents. We show that muscimol, which is a GABAAR selective agonist, and piperazine, a widely used anthelmintic, are both able to activate the UNC-49R. The effects of these drugs at the molecular level are related to behavioral effects in paralysis assays. Interestingly, our results reveal that ivermectin, which has been shown to modulate several Cys-loop receptors, inhibits C. elegans GABA receptors as well as L-AChRs, which are also involved in the coordinated movement. Moreover, ivermectin shows synergistic effects on the paralysis induced by both GABAergic and nicotinic agonists, thus reinforcing the importance of research on anthelmintic drug combinations as a strategy tending to reduce the increasing problem of drug resistance. In general, our study from chapter II provides novel information regarding GABAA receptor activation in C. elegans muscle. It shows for the first time single-channel activity of UNC-49 native receptor, and reveals that muscimol and piperazine, a widely used anthelmintic agent, are agonists. Our study also provides further information about the complex and pleiotropic effects of IVM: IVM is an inhibitor of C. elegans GABAR and levamisole-sensitive AChRs. Elucidation of the structural and mechanistic bases underlying the pleiotropic actions of IVM at the Cys-loop receptor family may open doors for novel drug design. In summary, in this doctoral thesis we characterized the L-AChR and the activation of the UNC-49R, both involved in the coordinated locomotion.The characterization of these Cys-loop receptors in a genetically tractable organism and model of parasitic nematodes provides new avenues of exploration for selective drugs as well as for defining structural determinants of activation and modulation in Cys-loop receptor family.

Tesis por compendio de publicaciones / El objetivo fundamental de esta tesis fue ahondar en los procesos de evolución molecular de algunas de las distintas familias de ADN repetido que se usan de forma rutinaria en los trabajos de taxonomía, filogeografía y filogenética de plantas, para con herramientas de biología molecular (PCR, clonación, secuenciación…) y citogenética molecular (FISH) poner a prueba las teorías generalmente aceptadas sobre los procesos de variación y homogeneización de tales secuencias repetidas. En el primer trabajo de esta tesis como compendio de artículos, utilizando la secuencia de ADN satélite E180 previamente descrita para el género Medicago, diseñamos primers específicos para (1) evaluar la robustez y sensibilidad tanto de la PCR como del FISH para detectar familias de ADN repetido, (2) obtener nuevos datos sobre la evolución genómica (cariotípica) del género Medicago usando ADNsat como marcador, y (3) evaluar el rastro filogenético dejado por una familia de ADNsat en un género tan particular como Medicago, donde se tiene la evidencia de que complejos patrones de hibridación han jugado un papel fundamental en su historia evolutiva. Nuestros resultados demuestran que la detección tanto por técnicas moleculares como citogenéticas de la familia repetida E180 es altamente reproducible a través del género, y que los patrones cromosómicos sirvieron para diferenciar complejos de especies estrechamente relacionados (son taxón-específicos). El segundo trabajo de esta tesis vino motivado por las continuas referencias bibliográficas que usaban las secuencias de la familia de ADN ribosomal nuclear 5S como marcador genético en la práctica de concatenar partes diferentes de dos genes seguidos para usarlas como pertenecientes a un mismo gen, en la creencia de que la homogeneización de secuencia dentro de la familia era completa. En consecuencia comparamos la integridad de la secuencia (longitud, motivos universales conservados y estructura secundaria) y el comportamiento filogenético de zonas 5S codificantes completas en comparación con las quiméricas (concatenadas) de un grupo de genes de ADNrn 5S obtenido de varias especies estrechamente relacionadas. Los resultados que se desprenden sugieren que la homogeneización de secuencias no está operando, ni siquiera dentro de un mismo tándem, en la región codificante del ADNrn 5S, la cual había sido tradicionalmente considerada como un ejemplo de secuencia altamente conservada. De esta manera, la generalizada práctica de concatenar secuencias de genes 5S puede incrementar la diversidad haplotípica, distorsionando los patrones de evolución génica y conduciendo a relaciones haplotípicas incorrectas en algunas reconstrucciones evolutivas. En el tercer y último trabajo de la tesis, estudiamos la secuencia del espaciador intergénico (IGS) del ADNr 45S de Ginkgo biloba y Medicago arborea respectivamente. En el caso de G. biloba, y basándonos en trabajos previos, intentamos discernir si las familias de ADNrn 45S y 5S estaban o no combinadas en el mismo locus. Usando técnicas de citogenética molecular y secuenciación de ADN mostramos que la única organización existente en esta especie es la asociada (primera vez que se demuestra en gimnospermas), donde el gen 5S aparece insertado dentro del IGS 45S.

Publicación a texto completo no autorizada por el autor / Determina el estado de las características estructurales y funcionales del macrobentos de fondo blando asociado a un periodo de post-pesca del recurso Ensis macha, en Morro Quemado. Las características del macrobentos, posterior al cierre de las actividades de extracción del recurso Ensis macha (Molina 1782), evidencian una mayor representatividad de la abundancia y biomasa en el estrato 12 – 14 m; y de los índices comunitarios (número de taxas y diversidad de Shannon), posiblemente explicados por eventos ecológicos de asentamiento y colonización, sobretodo de especies de alta tasa reproductiva como Spiophanes norrisi, Rynchospio glutaea y Prionospio peruana. En tanto, se determina cambios en la composición específica de las especies dominantes correspondientes a evaluaciones realizadas en el tercer momento de la pesquería de E. macha y este estudio. El comportamiento del ensamble del macrobentos es heterogéneo mostrando signos de un estado alternativo de equilibrio. Asimismo, se observa una segregación entre los ensambles del tercer momento de la pesquería de E. macha y los periodos evaluados de este estudio, lo cual implicaría un posible efecto dado por la intensidad del esfuerzo de pesca. Por otro lado, las características post-pesca del macrobentos evidencia cambios en la composición de gremios tróficos (rasgo funcional) de una comunidad dominada por carroñeros y/o carnívoros a una dominada por alimentadores del depósito superficial; y adicionalmente una baja representatividad de organismos del grupo de los suspensívoros-filtradores, formadores de estructuras biogénicas, que facilitarían los procesos de asentamiento de especies; incluyendo a las de objeto de pesca. Si bien se observan cambios en las características estructurales y funcionales del macrobentos, es necesario sustentar en las estrategias de manejo el entorno físico del recurso y los procesos ecológicos, considerando un enfoque ecosistémico. / Tesis

Publicación a texto completo no autorizada por el autor / Caracteriza la comunidad macrobentónica asociada a la macroalga filamentosa Chaetomorpha crassa, diferenciando la comunidad que habita en los filamentos del parche y en el sustrato subyacente y adyacente al parche, en el submareal somero de la Isla San Lorenzo – Callao. Los muestreos se realizan en un parche de Ch. crassa ubicado entre los 5 y 7 m. de profundidad, al este de Isla San Lorenzo (12°04’10.6’’ S; 77°13’13.8’’ W - 12°04’12.4’’ S; 77°13’13’’ W), en dos estaciones anuales (invierno y verano) entre los años 2013 y 2015. Los muestreos se distribuyen cronológicamente de la siguiente manera: agosto de 2013: invierno 1 (I-1), diciembre de 2013: verano 1 (V-1), julio de 2014: invierno 2 (I-2) y marzo de 2015: verano 2 (V-2). En cada muestreo se colectan muestras de los filamentos de Ch. crassa (AP), el sustrato subyacente al parche (AS) y el sustrato adyacente al parche (C) (n=10). Cada muestra es procesada en el laboratorio, para la determinación taxonómica de las taxa y el registro del número de individuos y peso húmedo por taxa. En todas las estaciones, los hábitats estudiados albergan una gran diversidad y abundancia de especies, siendo los filamentos de Ch. crassa los que presentan mayor diversidad y abundancia promedio, mientras que el sustrato subyacente al parche de Ch. crassa presenta los menores valores de diversidad y abundancia promedio. Asimismo se encuentran diferencias estacionales en la comunidad macrobentónica del submareal somero de la Isla San Lorenzo, estas diferencias también son observadas, aunque de manera particular, en la comunidad asociada a los filamentos y al sustrato subyacente al parche de Ch. crassa. Por lo tanto, los resultados sugieren que la macroalga filamentosa Chaetomorpha crassa estaría funcionando como un organismo estructurador de hábitat en el submareal somero de la Isla San Lorenzo. / Tesis

[ES] La investigación en Biología de Sistemas se ha expandido en los últimos años. El análisis simultáneo de diferentes tipos de datos ómicos permite el estudio de las conexiones y relaciones entre los diferentes niveles de organización celular. La presente tesis doctoral tiene como objetivo desarrollar y aplicar estrategias de integración multiómica al campo de la biología de sistemas. El elevado coste de las tecnologías ómicas, dificulta que los laboratorios puedan abordar un estudio multiómico completo. No obstante, la gran disponibilidad de datos ómicos en repositorios públicos, permite el uso de estos datos ya generados. Desafortunadamente, la combinación de datos ómicos provenientes de diferentes orígenes, da lugar a la aparición de un ruido no deseado en los datos, el efecto lote. El efecto lote impide el correcto análisis conjunto de los datos y es necesario el uso de los llamados Algoritmos de Corrección de Efecto Lote para eliminarlo. En la actualidad, existe un gran número de éstos algoritmos que se basan en diferentes modelos estadísticos. Sin embargo, los métodos existentes no están pensados para los diseños multiómicos ya que solo permiten la corrección de un mismo tipo de ómica que debe haber sido medida en todos los lotes. Por ello desarrollamos la herramienta MultiBaC basada en la regresión PLS y modelos ANOVA-SCA, que permite la corrección del efecto lote en diseños multiómicos, permitiendo la corrección de datos que no hayan sido medidos en todos los lotes. En este trabajo, MultiBaC fué validado y evaluado en diferentes conjuntos de datos, además presentamos MultiBaC como paquete de R para facilitar su uso. La mayoría de métodos existentes de integración multiómica son métodos multivariantes basados en el análisis del espacio latente. Estos métodos se conocen como ``dirigidos por datos'', y se basan en la búsqueda de correlaciones para determinar las relaciones entre las variables. Estos métodos necesitan de gran cantidad de observaciones o muestras para poder encontrar correlaciones significativas. Lamentablemente, en el mundo de la biología molecular, los conjuntos de datos con un gran número de muestras no son muy habituales, debido al elevado coste de generación de los datos. Como alternativa a los métodos dirigidos por datos, algunas estrategias de integración multiómicas se basan en métodos ``dirigidos por modelos''. Estos métodos pueden ajustarse con un menor número de observaciones y son muy útiles para encontrar relaciones mecanísticas entre los componentes celulares. Los métodos dirigidos por modelos necesitan de una información a priori, el modelo, que normalmente es un modelo metabólico del organismo estudiado. Actualmente, sólo transcriptómica y metabolómica cuantitativa, han sido los dos tipos de dato ómico que se han integrado con éxito usando métodos dirigidos por modelos.Sin embargo, la metabolómica cuantitativa no está muy extendida y la mayoría de laboratorios generan metabolómica no cuantitativa, la cuál no puede integrarse con los métodos actuales. Para contribuir en esta cuestión, desarrollamos MAMBA, una herramienta de integración multiómica dirigida por modelos y basada en métodología de optimización matemática, que es capaz de analizar conjuntamente metabolómica no cuantitativa con otro tipo de ómica asociada a genes, como por ejemplo la trascriptómica. MAMBA fue comparado con otros métodos existentes en cuanto a la capacidad de predcción de metabolitos y fué aplicado al conjunto interno de datos multiómicos. Este conjunto de datos multiómicos fue generado dentro del proyecto PROMETEO, en el cuál está enmarcada esta tesis. MAMBA demostró capturar la biología conocida sobre nuestro diseño experimental, además de ser útil para derivar nuevas observaciones e hipótesis biológicas. En conjunto, esta tesis presenta herramientas útiles para el campo de la biología de sistemas, y que cubren tanto el preprocesado de datos multiómicos como su posterior análisis estadístico integrativo. / [CA] La investigació en Biologia de Sistemes s'ha expandit els darrers. L'anàlisi simultània de diferents tipus de dades òmiques permet l'estudi de les connexions i les relacions entre els diferents nivells d'organització cel·lular. Aquesta tesi doctoral té com a objectiu desenvolupar i aplicar estratègies dintegració multiòmica al camp de la biologia de sistemes. L'elevat cost de les tecnologies òmiques dificulta que els laboratoris puguin abordar un estudi multiòmic complet. Això no obstant, la gran disponibilitat de dades òmiques en repositoris públics permet l'ús d'aquestes dades ja generades. Malauradament, la combinació de dades òmiques provinents de diferents orígens, dóna lloc a l'aparició d'un soroll no desitjat en les dades, l'efecte lot. L'efecte lot impedeix la correcta anàlisi conjunta de les dades i cal utilitzar els anomenats algorismes de correcció d'Efecte lot per eliminar-lo. Actualment hi ha un gran nombre d'aquests algorismes que corregeixen l'efecte lot que es basen en diferents models estadístics. Tot i això, els mètodes existents no estan pensats per als dissenys multiòmics ja que només permeten la correcció d'un mateix tipus de dada òmica que ha d'haver estat mesurada en tots els lots. Per això desenvolupem la nostra eina MultiBaC basada en la regressió PLS i models ANOVA-SCA, que pot corregir l'efecte lot en dissenys multiòmics, permetent la correcció de dades que no hagin estat mesurades a tots els lots. En aquest treball, MultiBaC ha sigut validat i avaluat en diferents conjunts de dades, a més a més, presentem MultiBaC com a paquet de R per facilitar l'ús de la nostra eina. La majoria de mètodes d'integració multiòmica existents són mètodes multivariants basats en l'anàlisi de l'espai latent. Aquests mètodes es coneixen com a "dirigits per dades", i es basen en la cerca de correlacions per determinar les relacions entre les diferents variables. Els mètodes dirigits per dades necessiten gran quantitat d'observacions o mostres per poder trobar correlacions significatives entre les variables. Lamentablement, al món de la biologia molecular, els conjunts de dades amb un gran nombre de mostres no són molt habituals, degut a l'elevat cost de generació de les dades òmiques. Com a alternativa als mètodes dirigits per dades, algunes estratègies d'integració multiòmiques es basen en mètodes "dirigits per models". Aquests mètodes poden ajustar-se amb un nombre menor d'observacions i són molt útils per trobar relacions mecanístiques entre els components cel·lulars. Tot i això, els mètodes dirigits per models necessiten una informació a priori, el model, que normalment és un model metabòlic de l'organisme estudiat. Actualment, únicament transcriptòmica i metabolòmica quantitativa, han estat els dos tipus de dada òmica que s'han integrat amb èxit usant mètodes dirigits per models. No obstant això, la metabolòmica quantitativa no està gaire estesa i la majoria de laboratoris generen metabolòmica no quantitativa, les quals no es poden integrar amb els mètodes actuals. Per contribuir en aquesta qüestió, hem desenvolupat MAMBA, una eina d'integració multiòmica dirigida per models i basada en la metodologia d'optimització matemàtica, que és capaç d'analitzar conjuntament metabolòmica no quantitativa amb un altre tipus d'òmica associada a gens, com per exemple la trascriptòmica. MAMBA va ser comparat amb altres mètodes existents quant a la capacitat de predcció de metabòlits i va ser aplicat al conjunt intern de dades multiòmiques. Aquest conjunt de dades multiòmiques va ser generat dins del projecte PROMETEO, en el qual està emmarcada aquesta tesi. Es demostra que MAMBA capturar la biologia coneguda sobre el nostre disseny experimental, a més de ser útil per derivar noves observacions i hipòtesis biològiques. En conjunt, aquesta tesi presenta eines útils per al camp de la biologia de sistemes, i que cobreixen tant el preprocessament de dades multiòmiques com la seua posterior anàlisi estadística integrativa. / [EN] Systems Biology research has expanded over the last years together with the development of omic technologies. The combination and simultaneous analysis of different kind of omic data allows the study of the connections and relationships between different cellular layers. Indeed, multiomic integration strategies provides a key source of knowledge about the cell as a system. The present Ph.D. thesis aims to study, develop and apply multiomic integration approaches to the field of systems biology. The still high cost of omics technologies makes it difficult for most laboratories to afford a complete multiomic study. However, the wide availability of omic data in public repositories allows the use of these already generated data. Unfortunately, the combination of omic data from different sources provokes the appearance of unwanted noise in data, known as batch effect. Batch effect impairs the correct integrative analysis of the data. Therefore, the use of so-called Batch Effect Correction Algorithms is necessary. As of today, there is a large number of such algorithms based on different statistical models and methods that correct batch effect and are part of the data pre-processing steps. However, the existing methods are not intended for multi-omics designs as they only allow the correction of the same type of omic data that must be measured across all batches. For this reason, we developed MultiBaC algorithm, which removes batch effect in multiomic designs, allowing the correction of data that are not measured across all batches. MultiBaC is based on PLS regression and ANOVA-SCA models and was validated and evaluated on different datasets. We also present MultiBaC as an R package to facilitate the use of this tool. Most existing multiomic integration approaches are multivariate methods based on latent space analysis. These methods are known as data-driven as they are based on the search for correlations to determine the relationships between the different variables. Data-driven methods require a large number of observations or samples to find robust and/or significant correlations among features. Unfortunately, in the molecular biology field, data sets with a large number of samples are not very common, again due to the high cost of generating omic data. As an alternative to data-driven methods, some multiomic integration strategies are based on model-driven approaches. These methods can be fitted with a smaller number of observations and are very useful for finding mechanistic relationships between different cellular components. However, model-driven methods require a priori information, which is usually a metabolic model of the organism under study. Currently, only transcriptomics and quantitative metabolomics have been successfully integrated using model-driven methods. Nonetheless, quantitative metabolomics is not very widespread and most laboratories generate non-quantitative or semi-quantitative metabolomics, which cannot be integrated with current methods. To address this issue, we developed MAMBA, a model-driven multiomic integration method that relies on mathematical optimization problems and is able to jointly analyze non-quantitative or semi-quantitative metabolomics with other types of gene-centric omic data, such as transcriptomics. MAMBA was compared to other existing methods in terms of metabolite prediction accuracy and was applied to a multiomic dataset generated within the PROMETEO project, in which this thesis is framed. MAMBA proved to capture the known biology of our experimental design and was useful for deriving new findings and biological hypotheses. Altogether, this thesis presents useful tools for the field of systems biology, covering both the pre-processing of multiomic datasets and their subsequent statistical integrative analysis. / Ugidos Guerrero, M. (2023). Statistical Methods Development for the Multiomic Systems Biology [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/193031

Las fórmulas infantiles desempeñan un papel indispensable sobre todo después de 4 a 6 meses de vida de un recién nacido ya que la leche materna ya no es suficiente para satisfacer todas las necesidades nutricionales a esta edad. Aunque las fórmulas infantiles deben ser similares a la leche materna madura en términos de sus macronutrientes y micronutrientes, por lo general no tienen, ni cualitativa ni cuantitativamente, los ingredientes funcionales que se encuentran en la leche humana, ni tienen la misma composición de proteínas y la diversidad de oligosacáridos de la leche materna. Por lo tanto, es muy importante agregar estos ingredientes de las fórmulas infantiles. La evolución en la composición las fórmulas infantiles con mejoras en sus procesos de fabricación permiten ejercer más efectos positivos en un grupo grande de los recién nacidos que no pueden ser alimentados con leche materna como fuente primaria por distintas causas. Por lo tanto, el objetivo del presente estudio ha sido evaluar la funcionalidad de lactoferrina humana recombinante (rhLf), hidrolizada de rhLf y GOS en las fórmulas infantiles. A este fin, el estudio se dividió en cuatro experimentos: 1. Objetivos de la tesis 1. Evaluación in vitro de la biodisponibilidad del hierro de las fórmulas infantiles suplementadas con diferentes concentraciones de rhLf y/o GOS, usando la cantidad de ferritina sintetizados por las células Caco-2 como criterio. 2. Evaluación in vitro del efecto anti-inflamatorio de diferentes concentraciones de rhLf y el hidrolizado de rhLf. 3. Evaluación in vitro de la actividad prebiótica de rhLf y/o GOS. 4. Evaluación in vitro del efecto de la digestión simulada in vitro sobre la fraccionación de rhLf y el perfil de los ácidos grasos de cadena larga (LCFAs). 2. Metodolgía 1. Diseño de fórmulas infantiles con la suplementación de rhLf y/o GOS con leche materna madura como un modelo. 2. En la digestión simulada in vitro de muestras suplementadas con diferentes concentraciones de rhLf y/o GOS para determinar la (bio)-disponibilidad del hierro de fórmula infantil mediante células Caco-2 (Frontela et al., 2009). Un kit de ELISA se usa para cuantificar la ferritina formada por las células la que se utiliza como un criterio de la disponibilidad de hierro. 3. En la digestión simulada in vitro de las muestras, los digeridos obtenidos se guardaron para investigar el efecto in vitro de la digestión sobre la fraccionación de rhLf y el perfil de los ácidos grasos de cadena larga mediante el análisis de western blot, HPLC-masas y GC. 4. Para investigar los efectos anti-inflamatorios de rhLf y el hidrolizado de rhLf, se utilizaron dos tipos de células Caco-2 y RAW 264.700 (Tanoue et al., 2008) y con el estímulo de las células de RAW 264.700 por el lipopolisacárido (LPS) (de la Escherichia coli). En este modelo, el efecto del LPS en la monocapa de células y el efecto anti-inflamatorio de rhLf y el hidrolizado de rhLf pueden visualizarse utilizando la determinación de algunos parámetros: TEER, ROS, IL-8 y NO. 5. Para investigar el efecto prebiótico de rhLf y/o GOS mediante cultivos por lotes utilizando como sistema de fermentación, se midieron algunos parámetros como el pH y los ácidos grasos de cadena corta. 3. Conclusiones y trabajo del futuro 1. Además de los transportadores específicos de hierro hemo y no-hemo para la absorción de hierro en las células duodenales, se ha demostrado que rhLf tiene un sitio específico para la absorción de formas ferrosos y férricos de hierro. Los resultados obtenidos del estudio llevado a cabo con células Caco-2 modelo confirmó la importancia de la suplementación de las fórmulas infantiles con Lf y GOS que llevó a aumentar ferritina formada por los cultivos celulares. Los resultados confirmaron que la solubilidad no es el único factor correlacionado con la mejora de la biodisponibilidad del hierro, por lo tanto, es útil investigar el papel de algunos genes relacionados con la biodisponibilidad del hierro como DMT1. 2. rhLf y su hidrolizado ejercen su actividad anti-inflamatoria a través de su capacidad para unirse a LPS y posteriormente modular la producción de citoquinas. El mecanismo de acción de Lf también depende en gran medida de su capacidad para influir en las respuestas tempranas, incluyendo la modulación de la producción de ROS intracelular. La actividad anti-inflamatoria de rhLf y el hidrolizado de rhLf, esta última se ha mostrado más eficaz y es considerado como un destacado agente terapéutico que se debe tener en cuenta durante el diseño de las fórmulas infantiles. 3. Los resultados del estudio llevado a cabo con cultivos por lotes utilizando como sistema de fermentación ha mostrado que tanto la rhLf y/o GOS influyen en la obtención de productos finales de fermentación como los ácidos grasos de cadena corta, este proceso fermentativo además lleva a la disminución de bacterias patógenas y de forma complementaria el incremento de las bacterias bifidogénicas. 4. Los resultados obtenidos confirmaron que rhLf es más estable que Lf humana, por lo que se considera un factor importante para la suplementación de las fórmulas infantiles. Aunque se necesitan estudios complementarios para descubrir y detectar esta característica, los resultados propuestos un papel de GOS a proteger Lf contra las enzimas digestivas. Del mismo modo, los resultados obtenidos confirman la importancia de la lactancia materna relacionada a los ácidos grasos liberados por la digestión. 5. En conjunto, los resultados obtenidos confirman y apoyan la urgente necesidad de suplementación con Lf y/o GOS de las fórmulas infantiles. Los resultados demostraron la importancia del hidrolizado de rhLf como un nuevo aditivo y puede ser en un futuro próximo nuevas fórmulas contienen el hidrolizado de rhLf será visto en los mercados. / Infant formulas, as milk substitute, play an indispensable role especially after 4-6 months of infant life where human milk is no longer sufficient to meet all necessary nutritional requirements. Although infant formulas should be similar to mature human milk in terms of its macronutrients and micronutrients, normally it do not have the functional ingredients that are found in human milk, nor do they have the same protein composition and the diversity of oligosaccharides as human milk. So it is critically important adding these ingredients to infant formulas. This evolution of infant formulas manufacturing allow to exert more functionalities in a large group of infants who cannot feed human milk as a primary source and for several physiological as well as social reasons. For mimicking the structure of human milk, galactooligosaccharides (GOS, as prebiotic) and recombinant human lactoferrin (rhLf) are strongly added to infant formulas to obtain similar functionalities for what human milk has. Thus, the present study is aimed to explore the functionality of rhLf, rhLf hydrolysate and GOS whether alone or added in infant formulas. The present study is divided into four experiments: 1. Objectives of the PhD Thesis 1. In vitro assessment of the bioavailability of iron from infant formulas supplemented with different concentrations of rhLf and/or GOS, using the amount of ferritin synthesized as criteria 2. In vitro evaluation of the anti-inflammatory effect of different concentrations of rhLf and rhLf hydrolysate. 3. In vitro evaluation of the prebiotic activity of rhLf and/or GOS. 4. In vitro evaluation of the effect of simulated gastrointestinal digestion on the added rhLf fractionation and long chain fatty acids (LCFAs) profile. 2. Methodology 1. Design of infant formulas with the supplementation of rhLf and/or GOS with mature human milk as a model. 2. In the in vitro simulated digestion of samples supplemented with different concentrations of rhLf and/or GOS aimed to determine the (bio)-availability of iron of infant formula by using Caco-2cell model (Frontela et al., 2009). An ELISA kit for the analysis of ferritin formed by the cells which is used as a criterion of the availability of iron. 3. In the in vitro simulated digestion of supplemented samples, the digests were kept to investigate the effect of the in vitro digestion on the fractionation of rhLf and the profile of the long-chain fatty acids by using the western blot, HPLC-mass and GC. 4. To investigate the anti-inflammatory effects of rhLf and rhLf hydrolysate, it were used two types of cells are Caco-2 and RAW 264.7 (Tanoue et al., 2008) and with the stimulation of the RAW 264.7 cells by lipopolysaccharide (LPS) (from Escherichia coli). In this model, the effect of LPS on the monolayer of cells and the anti-inflammatory effect of rhLf and rhLf hydrolysate and can be viewed using the extent of some parameters: TEER, ROS, IL-8 and NO. 5. To investigate the prebiotic effect of rhLf and/or GOS by using batch fermentation culture system, some parameters were measured as pH and short-chain fatty acids. 3. Conclusions and future work 1. Beside heme and non-heme specific transporters for the absorption of iron in duodenal cells, it has been proved that rhLf has a specific site for the absorption of ferrous and ferric forms of iron. The obtained results of the study carried out using Caco-2 cell model confirmed the importance of the supplementation of infant formulas with rhLf and GOS where it led to increase ferritin formed by cell cultures. The results confirmed that solubility is not the only factor correlated with improvement of iron bioavailability, therefore it is useful investigate the role of some genes related with iron bioavailability such as rhLf hydrolysate exert their anti-inflammatory activity through its ability to bind LPS and subsequently modulate cytokine production. The mechanism of Lf’s action is also largely dependent on its ability to influence early responses, including the modulation of intracellular ROS production. Between rhLf and rhLf hydrolysate, rhLf is more effective and is considered a prominent therapeutic agent, which must to be taken into account during infant formulas design. 2. The results of study carried out using batch culture fermentation system proposed that rhLf and/or GOS influenced the fermentation end products such as SCFAs. This fermentation process lead to a decreasing of the pathogenic bacteria and complementary an increase of the bifidogenic ones. 3. The obtained results confirmed that rhLf is more stable than human Lf and thus it is considered a prominent factor for infant formulas supplementation. Although many studies are needed to discover this characteristic, the results proposed a role for GOS in protect rhLf against the digestive enzymes. Likewise, the results confirmed the importance of the breastfeeding pattern concerning with the released free fatty acids by digestion. 4. Overall, the obtained findings confirm and support the urgently need to supplementation with rhLf and/or GOS of infant formulas. The results demonstrated the importance of the hydrolysate of human recombinant lactoferrin as a new additive and may be in the near future new formulas contain the hydrolysate of rhLf will be seen in the markets.