Las deficiencias nutricionales de las presas vivas usadas como primer alimento exógeno en el cultivo de larvas de peces marinos hacen necesaria la suplementación de las dietas con nutrientes que satisfagan los requerimientos de las larvas. Los liposomas constituyen una herramienta con gran potencial ya que pueden formularse con nutrientes hidrosolubles disueltos en su fase acuosa y liposolubles inmersos en el ambiente lipofílico entre las cadenas de ácidos grasos de los fosfolípidos. Este estudio valora el empleo de liposomas para suministrar nutrientes a larvas de peces marinos a través de dos vías. La primera plantea la vehiculación de nutrientes a larvas de peces a través de la bioencapsulación de liposomas ricos en nutrientes esenciales en nauplios de Artemia. La segunda alternativa está relacionada con la administración directa a las larvas mediante inmersiones de éstas en suspensiones de liposomas ricos en nutrientes. Liposomas como enriquecedores de ArtemiaEl estudio se inicia con un análisis preliminar sobre la integridad de los liposomas en condiciones de enriquecimiento de Artemia. Los resultados indican que los liposomas liberan parte de las sustancias disueltas en su fase acuosa interna. En cuanto a la estabilidad química, los resultados muestran que los liposomas son menos susceptibles a la peroxidación que otros enriquecedores convencionales. Por último, el estudio sobre el cambio de tamaño de los liposomas durante el enriquecimiento indica que no muestran alteraciones importantes que puedan comprometer su rendimiento como producto enriquecedor.A la vista de estos resultados preliminares, se escogieron unas formulaciones de liposomas para su utilización en el enriquecimiento de Artemia en ácidos grasos esenciales (EFAs), vitaminas (A y C) y aminoácidos. La mejora del contenido en EFAs de nauplios de Artemia se llevó a cabo con liposomas formulados con fosfolípidos marinos. Los resultados muestran que estos liposomas pueden igualar los contenidos de EFAs de los nauplios enriquecidos con productos comerciales de uso habitual. Además, se presenta un protocolo óptimo de utilización para maximizar los niveles de EFAs en los nauplios.Como ya se ha comentado anteriormente, los liposomas poseen una estructura que permite la inclusión, junto a los fosfolípidos, de otros nutrientes esenciales como las vitaminas y los aminoácidos. Los resultados revelan la capacidad de liposomas para aumentar el contenido en vitamina A de los nauplios. En cuanto a la vehiculación de nutrientes hidrosolubles, los experimentos realizados muestran que los liposomas unilamelares tienen una escasa eficacia enriquecedora en este tipo de sustancias. No obstante, los liposomas de tipo multilamelar exhibieron una mayor eficacia logrando aumentar los niveles de metionina (hidrosoluble) libre de los nauplios en comparación a nauplios tratados con metionina simplemente disuelta.El estudio sobre la utilización de liposomas como enriquecedores de Artemia se completa con la realización de experimentos de alimentación larvaria. Estos ensayos demuestran la posibilidad de utilizar nauplios enriquecidos con liposomas como alimento de larvas de peces marinos sin que se observen diferencias en la supervivencia y el crecimiento obtenidos con respecto a tratamientos con un producto comercial de eficacia contrastada.Suministro directo de nutrientes a larvas mediante liposomasSe realizaron inmersiones de larvas de peces con liposomas ricos en nutrientes esenciales. Los resultados evidencian la posibilidad de tratar larvas de peces marinos con liposomas formulados con nutrientes esenciales de naturaleza diversa sin detrimento de la supervivencia de los animales. Sin embargo, la utilidad de esta vía de administración de nutrientes no ha sido demostrada a pesar de los numerosos mecanismos de interacción larva-liposoma implicados. La utilización de nutrientes marcados, así como la determinación de índices de condición nutricional que constaten las ventajas nutricionales derivadas de la incorporación de los nutrientes liposomados, se vislumbran como líneas futuras de investigación. / Nutritional deficiencies of live preys used as first exogenous feeding in the rearing of marine fish larvae make necessary the supplementation of the diets with certain nutrients in order to fulfill the requirements of the fish. In most cases, larval nutrition studies have been focused on the essential fatty acid demands, but other compounds as phospholipids, vitamins and free amino acids have been proposed as crucial elements in the early development stages of several species of marine fish. The present study assesses the use of liposomes, phospholipid vesicles enclosing an internal aqueous space, for the delivery of both lipophilic and hydrophilic nutrients to marine fish larvae. Two different administration ways were studied. Firstly, liposomes were used as an enrichment product of live preys. Secondly, a direct system was assessed by immersing marine fish larvae in liposome suspensions.Bioencapsulation of liposomes in Artemia naupliiSeveral liposome formulations were employed for the enrichment of Artemia nauplii in some essential nutrients such as fatty acids, vitamins and amino acids. Liposomes formulated with marine phospholipids demonstrated the improvement of the essential fatty acid content in the nauplii, and an optimal protocol of use with this product was established. Additionally, our results showed that liposomes are useful tools for the enrichment of Artemia in both liposoluble (vitamin A) and hydrosoluble compounds (methionine).Immersion of marine fish larvae in liposome suspensionsA novel technique to transfer nutrients to fish larvae consists of the immersion of larvae in liposomated substances, obviating their bioencapsulation in the live preys and avoiding their consequent metabolic activity over the administered substances. Several studies were carried out with the purpose of detecting the incorporation of lipophilic (EFA) and hydrophilic (ascorbate and methionine) nutrients into marine larvae by means of liposome baths. Results would indicate a low entry of liposomated nutrients into the larvae, although analyses seem to reflect slightly higher average contents of EFA and ascorbate nutrient in larvae treated with liposomes compared to control non-treated larvae. These results could be confirmed optimizing the experimental designs.

En esta Tesis se evalúa por primera vez la sensibilidad de una especie del Phylum Nematomorpha a contaminantes de origen antrópico. La especie estudiada, Chordodes nobilii, pertenece a la Clase Gordiida. Considerando que en la cuenca del río Sauce Grande (Sierra de la Ventana, Provincia de Buenos Aires) se ha observado una disminución en la abundancia y diversidad de gordiidos y que no existe información previa sobre el efecto de los contaminantes sobre el ciclo vital del grupo, el objetivo principal de la tesis fue evaluar el efecto de distintas variables (ambientales y antrópicas) sobre el ciclo de vida de Chordodes nobilii. Los estudios realizados se basaron en la hipótesis de que los Gordiida son vulnerables a la disminución de la calidad del agua de su hábitat. El estrés ambiental afecta su capacidad de infección y su abundancia en los ambientes acuáticos donde habitan y altera, así, el desarrollo normal del grupo. Se propuso como objetivo la evaluación del efecto de contaminantes de origen antrópico y del rango de tolerancia térmica en las distintas etapas de vida libre (embriones, larvas y adultos) de C. nobilii. / This Thesis evaluates the sensibility of a species of Phylum Nematomorpha to anthropogenic pollutants for the first time. The studied species, Chordodes nobilii, belongs to the Phylum Nematomorpha, class Gordiida. Considering that there has been a noted decrease in the amount and diversity of gordiidos in the Sauce Grande river basin (Sierra de la Ventana, Buenos Aires) and that there is no prior information about the effect of contaminants on the life cycle of the group, the aim of this thesis was to evaluate the effect of different variables (environmental and antropic) on the life cycle of Chordodes nobilii. The conducted studies were based on the hypothesis of Gordiida being vulnerable to decreases in the quality of the water they inhabit. Environmental stress affects their infective capacity and their numbers in their aquatic habitat. The evaluation of the effects of contaminants of antropic origin and of the range of termic tolerance in the different free-living stages (embryos, larvae and adults) of C. nobilii was proposed as the aim of this thesis.

INTRODUCCIÓN: La adquisición del fenotipo de resistencia a múltiples fármacos (MDR) en células tumorales las convierte en resistentes a fármacos antineoplásicos y es una de las principales causas del fracaso de la quimioterapia en algunos tumores. La expresión de glicoproteína P (MDR-1, P-gp, ABCB1) contribuye a esta resistencia expulsando los fármacos o regulando la muerte celular programada. Por otro lado, la sobreexpresión de miembros anti-apoptóticos de la familia Bcl-2 observada en tumores sanguíneos se ha asociado a la resistencia a quimioterapia en varios cánceres humanos. También es importante estudiar alteraciones en las rutas de señalización de MAPKs y la secreción de citocinas en las células con fenotipo MDR. OBJETIVOS: El propósito de este trabajo fue encontrar un estímulo capaz de inducir sensibilidad colateral en células leucémicas murinas y humanas con fenotipo MDR, y caracterizar el tipo de muerte celular inducida. El segundo propósito fue estudiar la contribución de MDR-1, caspasas, proteínas de la familia Bcl-2, MAPKs y citocinas al proceso de sensibilidad colateral. MATERIALES Y MÉTODOS: Para alcanzar nuestros objetivos, usamos células leucémicas murinas L1210 y su sublínea celular resistente L1210R, así como una línea celular procedente de la línea L1210 transfectada con un plásmido que contenía el gen MDR-1 (CBMC-6). Se realizó western-blot para estudiar la expresión de proteínas, inhibición de MAPKs y caspasas y silenciamiento de ARN de MDR-1, Bcl-xL, Bcl-2 y Bax para estudiar el papel de estas proteínas. RESULTADOS: Se encontró que las células leucémicas resistentes con sobreexpresión de P-gp, pero no sus parentales sensibles, son hipersensibles a estrés hipotérmico produciéndose apoptosis a temperaturas por debajo de 4ºC. La transfección de la línea celular parental con un plásmido que contiene P-gp las convierte en sensibles a estrés hipotérmico, demostrando la asociación entre la expresión de P-gp y la muerte celular provocada por el frío. También observamos un incremento de la expresión basal y actividad del fragmento activo de caspasa 3 a temperatura fisiológica (37ºC) en las células MDR. La inhibición de caspasa 3 rescató parcialmente a las células leucémicas MDR de la apoptosis inducida por el frío, lo que sugiere que el mecanismo de muerte celular depende de caspasa 3. Esto demuestra que la expresión de P-gp juega un papel importante en la supervivencia de las células MDR y es acompañada por un proceso de sensibilidad colateral a estrés hipotérmico. Se observó que la línea parental leucémica (L1210) y la línea celular CBMC-6 presentan una alta expresión de la proteína anti-apoptótica Bcl-xL, mientras que la expresión de Bcl-2 es baja. Por el contrario, en las células L1210R se observó una disminución de la expresión de Bcl-xL y un aumento de Bcl-2. La inhibición de dirigida de proteínas anti-apoptóticas confirma que la expresión de Bcl-xL es un regulador clave de la supervivencia de las células leucémicas. En contraste, el silenciamiento de Bcl-2 muestra que la supervivencia de las células L1210R no depende del nivel de expresión de Bcl-2. Así, nuestros datos demuestran que la supervivencia de la línea celular parental depende de la expresión de Bcl-xL, pero la adquisición del fenotipo MDR elimina esta dependencia y podría depender de varios miembros anti-apoptóticos de la familia Bcl-2. Además, los resultados obtenidos en las células CBMC-6 demuestran que P-gp tiene poca influencia sobre las proteínas de la familia Bcl-2. Resultados similares se obtuvieron bajo condiciones de estrés hipotérmico y exposición al fármaco daunomicina. En relación a la ruta de señalización de MAPKs, demostramos su importancia en el desarrollo del fenotipo MDR, así como en el desarrollo de sensibilidad colateral a estrés hipotérmico, demostrando que la inhibición de ERK y JNK puede proteger, parcialmente, de la muerte celular inducida por el frío en las células L1210R y CBMC-6. CONCLUSIONES: El proceso de sensibilidad colateral a estrés hipotérmico está asociado al fenotipo MDR en células murinas, y ocurre a través de un proceso de apoptosis dependiente de caspasas. La expresión y funcionalidad de MDR-1 está asociada a la sensibilidad a hipotermia en células murinas. El desarrollo del fenotipo MDR está acompañado de cambios en la expresión de proteínas Bcl-2, pero éstas no influyen en la sensibilidad colateral. La señalización a través de ERK y JNK está implicada en la sensibilidad colateral observada en las células MDR. La señalización a través de citocinas podría tener un papel importante en la respuesta a estrés de las células MDR. / INTRODUCTION: The acquisition of a multidrug-resistant (MDR) phenotype by tumor cells that renders them unsusceptible to anti-neoplasic agents is one of the main causes of chemotherapy failure in human malignancies. The increased expression of P-glycoprotein (MDR1, P-gp, ABCB1) in tumor cells contributes to drug resistance by extruding chemotherapeutic agents or by regulating programmed cell death. In the other hand, over-expression of anti-apoptotic Bcl-2 family members has been reported in hematologic malignancies and has been associated with chemotherapy resistance in various human cancers. As these findings, it is important to study alterations in MDR cells on MAPKs pathway and citokines secretion. OBJECTIVES: The aim of this work was to find a stimulus able to induce collateral sensitivity in murine and human leukemic MDR cells, and to characterize the type of death induced. The second aim was to study the contribution of MDR-1, caspases, family Bcl-2 proteins, MAPKs and citokines to this collateral sensitivity process. MATERIALS AND METHODS: To reach our objectives we used L1210 murine leukemia cells and its resistant derived cell line L1210R, as well as a transfected with a plasmid containing MDR-1 cell line obtained from L1210 (CBMC-6). It was used western-blot to study proteins expression, inhibition of MAPKs and caspases and RNAm silencing of MDR-1, Bcl-xL, Bcl-2 and Bax family to study the role of this proteins. RESULTS: It was found that resistant leukemic cells with P-gp over-expression, but not their sensitive counterparts, are hypersensitive to cold-induced cell death when exposed to temperatures below 4ºC. Transfection of parental cells with a P-gp-expressing plasmid makes these cells sensitive to cold stress, demonstrating an association between P-gp expression and cell death at low temperatures. Furthermore, we observed increased basal expression and activity of effector caspase-3 at physiological temperature (37ºC) in MDR cells. Treatment with a caspase-3 inhibitor partially rescues MDR leukemic cells from cold-induced apoptosis, which suggests that the cell death mechanism may require caspase-3 activity. Taken together, these findings demonstrate that P-gp expression plays a role in MDR cell survival, and is accompanied by a collateral sensitivity to cold stress. We demonstrate that parental leukemic (L1210) and CBMC-6 cells display high constitutive expression of anti-apoptotic Bcl-xL protein, while Bcl-2 protein expression was very low. By contrast, leukemic cells L1210R display a decrease of Bcl-xL and up-regulation of Bcl-2 protein expression levels. Furthermore, targeted inhibition of individual anti-apoptotic proteins by RNA silencing confirms that Bcl-xL expression is a key regulator of leukemic cells survival. In contrast, the silencing of Bcl-2 shows that L1210R survival doesn’t depend on Bcl-2 expression level. Together, our data demonstrate that parental leukemic cells survival are largely dependent on Bcl-xL protein expression, but acquisition of MDR phenotype by such cells abrogate such survival dependence and suggests that resistant cells became probably dependent on more than one anti-apoptotic protein for survival at physiological conditions. Additionally, the results obtained with CBMC-6 cells demonstrate that P-gp exert slight influence in the expression level of Bcl-2 family members. Similar results were obtained under cold stress and drug exposure. Related to MAPKs signaling pathway, we have addressed it importance in MDR phenotype development, as well as in hypothermia collateral sensitivity, showing that ERK and JNK inhibition can protect, partially, against stress-cold induced-death in L1210R and CBMC-6 cell lines. CONCLUSIONS: Collateral sensitivity to cold stress is associated to MDR phenotype in murine cells, and it occurs by a caspase-dependent apoptosis process in murine cells. Expression and functionality of MDR-1 is strongly associated to hypothermia sensitivity in murine cells. MDR phenotype development is accompanied by changes in Bcl-2 family proteins expression, but it is not shown an association with collateral sensitivity. ERK and JNK signaling pathways are implicated in collateral sensitivity process observed in MDR cells. Citokines signaling could play an important role on MDR cells stress response.

Objetivo general: Analizar distintas condiciones de simulación de la digestión gastrointestinal <i>in vitro</i> de proteínas de amaranto y caracterizar las muestras obtenidas. Objetivos específicos: » Evaluar diferentes condiciones de digestión gastrointestinal simulada sobre un aislado proteico de amaranto, variando relaciones enzimas/sustrato y tiempos de reacción. » Analizar, junto con el grado de hidrólisis, la potencial actividad antioxidante de los digeridos obtenidos y seleccionar las condiciones óptimas de digestión. » Aplicar las condiciones seleccionadas sobre un hidrolizado proteico de amaranto obtenido por acción de la alcalasa. » Analizar la composición molecular de los digeridos.

Tesis por compendio de publicaciones / Objetivos: el objetivo fundamental de esta Memoria consiste en profundizar en el mecanismo de acción de la tirosinasa. Se centra la atención de este estudio sobre la actividad monofenolasa y se profundiza en el proceso de inactivación suicida. Se investiga la aportación de cada una de las actividades monofenolasa y difenolasa en dicho proceso. Se aborda la caracterización cinética de monofenoles de interés fisiológico. Metodología: 1. Profundizar en el mecanismo cinético de actuación de la enzima en sus actividades monofenolasa y difenolasa. 2. Estudiar la hidroxilación de umbeliferona a esculetina en la ruta de biosíntesis de cumarinas. 3. Establecer una metodología para investigar si un monofenol es inhibidor o sustrato alternativo de la enzima con la ayuda del peróxido de hidrógeno. 4. Diferenciar las actividades monofenolasa y difenolasa en su implicación en el proceso de inactivación suicida. 5. Profundizar en el estudio del mecanismo de inactivación suicida de la enzima en su acción sobre o-difenoles mediante la determinación del efecto isotópico generado en un medio deuterado. 6. Estudiar y analizar los procesos de catálisis e inactivación en la acción de tirosinasa sobre tres tipos de sustratos: o-difenoles, o-aminofenoles y o-fenilendiaminas. 7. Estudiar la acción de tirosinasa sobre hidroxihidroquinona en los procesos de catálisis e inactivación. 8. Estudiar la reacción de tirosinasa con hidroquinona, un monofenol, utilizado como despigmentante. 9. Caracterizar cinéticamente a hidroquinona como un sustrato de tirosinasa con la ayuda del peróxido de hidrógeno. 10. Estudiar la influencia de ácido ascórbico sobre el proceso de hidroxilación de hidroquinona por tirosinasa. 10. Caracterizar cinéticamente a hidroquinona como un sustrato de tirosinasa con la ayuda de cantidades catalíticas de o-difenol y ácido ascórbico. Resultados: 1. Se ha demostrado que tirosinasa podría participar en la ruta de biosíntesis de cumarinas hidroxilando umbeliferona a esculetina. 2. Peróxido de hidrógeno ayuda a demostrar si un monofenol es sustrato o inhibidor de tirosinasa actuando sobre la forma (metatirosinasa) y transformándola en la forma (oxitirosinasa). 3. Los estudios cinéticos con TBF/TBC demuestran que la enzima se inactiva únicamente al actuar sobre o-difenoles. 4. Un conjunto de estudios de efecto isotópico con D2O han puesto de manifiesto que existe una etapa muy lenta en la que se transfiere un protón. Esta etapa podría ser previa a la inactivación suicida. 5. La catálisis de la oxidación de o-difenoles, o-aminofenoles y o-fenilendiaminas, sigue un mecanismo similar: oxidación/ reducción simultánea sobre los dos átomos de cobre. 6. El proceso de inactivación suicida en la acción de la enzima sobre estos sustratos parece seguir un mismo mecanismo, que podría ser la oxidación/ reducción de uno de los átomos de cobre. 7. Los efectos electrónicos de los sustituyentes de C-4 de o-difenoles, o-aminofenoles y o-fenilendiaminas en las etapas de catálisis e inactivación son más importantes en los o-difenoles y o-aminofenles. 8. El producto de hidroxilación de hidroquinona, la hidroxihidroquinona, es un sustrato suicida de la enzima. 9. Se ha puesto de manifiesto que hidroquinona, un agente despigmentante, es un sustrato de tirosinasa. 10. Se ha demostrado que tirosinasa actúa sobre hidroquinona en presencia de oxígeno molecular y peróxido de hidrógeno, ya que este último pasa metatirosinasa (inactiva sobre hidroquinona) a oxitirosinasa (activa sobre hidroquinona). 11. También se ha puesto de manifiesto que tirosinasa actúa sobre hidroquinona en presencia de oxígeno y ácido ascórbico a altas concentraciones, por el paso de metatirosinasa a desoxitirosinasa. Del mismo modo, cantidades catalíticas de tert-butilcatecol y ácido ascórbico en concentraciones de orden micromolar consiguen la acción de tirosinasa sobre hidroquinona a través del paso de metatirosinasa a desoxitirosinasa. / Objectives: The main objective of this report is to deepen the mechanism of action of tyrosinase. The focus of this study is on the monophenolase activity and deepened in the process of suicide inactivation. The contribution of each of the monophenolase and diphenolase activities in this process is investigated. In this regard, the kinetic characterization of monophenols with physiological interest is studied. 1. Deepen in the kinetic mechanism of tyrosinase in their monophenolase and diphenolase activities. 2. Study the hydroxilation of umbelliferone to scueltin in the cumarin biosynthesis pathway. 3. Establish a methodology to investigate if one monophenol is inhibitor or alternative substrate of tyrosinase with the aid of hydrogen peroxide. 4. Discriminate between the monophenolase and diphenolase activities in its involvement on the suicide inactivation process. 5. Deepen the study of suicide inactivation process of tyrosinase in its action on o-diphenols through the determination of isotopic effect generated in a deuterated medium. 6. Study and analyse the catalysis and inactivation processes in the action of tyrosinase on tree types of substrates: o-diphenols, o-aminophenols and o-phenylendiamines. 7. Study the tyrosinase action on hydroxyhydroquinone in the catalysis and inactivation processes. 8. Investigate the action of tyrosinase on a monophenol, hydroquinone, used as lightening. 9. Kinetically characterize to hydroquinone as a substrate of tyrosinase with the aid of hydrogen peroxide. 10. Study the ascorbic acid influence on the hydroquinone hydroxylation process by tyrosinase. 11. Kinetically characterize to hydroquinone as a substrate of tyrosinase with the help of catalytic amounts of o-diphenol and ascorbic acid. Results: 1. It has been shown that tyrosinase could be involved in the biosynthesis pathway of the coumarins by the hydroxylation of umbelliferone to esculetin. 2. Hydrogen peroxide helps to demonstrate whether a monophenol is a substrate or an inhibitor of tyrosinase acting on the form (metatyrosinase) and converting it into the form (oxytyrosinase). 3. The kinetic studies with TBF / TBC show that the enzyme is only inactivated when it acts on o-diphenols. 4. A set of studies of the isotopic effect in D2O have shown that there is a very slow step in which a proton is transferred. It could be considered as a previous step of the suicide inactivation. 5. The catalysis of the oxidation of o-diphenols, aminophenols and o-phenylenediamines occurs through a similar mechanism: simultaneous oxidation / reduction of the two copper atoms. 6. The process of suicide inactivation in the action of the enzyme on these substrates seems to follow the same mechanism which could suppose the oxidation / reduction of one of the copper atoms. 7. The electronic effects of the substituents on the carbon atom C-4 of o-diphenols, o-aminophenols and o-phenylenediamines during the catalytic and inactivation steps are more significant in the case of the o-diphenols and o-aminophenols. 8. The product of the hydroxylation of hydroquinone, hydroxyhydroquinone, is a suicide substrate of the enzyme. 9. It has been shown that hydroquinone, a depigmenting agent, is a substrate of tyrosinase. 10. It has been shown that tyrosinase acts on hydroquinone in the presence of molecular oxygen and hydrogen peroxide because the latter converts metatyrosinase (inactive on hydroquinone) to oxytyrosinase (active on hydroquinone). 11. It has also been found that tyrosinase acts on hydroquinone in the presence of molecular oxygen and ascorbic acid at high concentrations, by transforming metatyrosinase to desoxytyrosinase. Similarly, catalytic amounts of tert-butylcatechol and ascorbic acid at micromolar concentrations induce the action of tyrosinase on hydroquinone by the conversion of metatyrosinase to desoxytyrosinase step.

El treball presentat en aquesta memòria es centra en l'estudi dels mecanismes pels quals el quimioteràpic metotrexat (MTX) desenvolupa resistència en cèl·lules canceroses. Dins d'aquest objectiu es creen dues línies d'estudi que són, trobar nous mecanismes d'inhibició de la dihidrofolat reductasa (DHFR), principal causant de la resistència al MTX, i la troballa de nous gens que puguin estar implicats en aquest procés de resistència.En el present estudi, hem analitzat la resistència al MTX en cèl·lules de càncer de mama. S'han realitzat microarrays d'expressió amb dues línies cel·lulars sensibles i resistents al MTX, els quals han originat com a únic gen en comú entre les cèl·lules resistents d'ambdues línies la família de les UDP-glucuronosil transferases (UGT1A). Hem estudiat aquesta família de gens, i s'ha identificat la UGT1A6 com la principal responsable de la sobrexpressió de les UGTs a les cèl·lules resistents. En aquest treball s'ha analitzat la implicació de la UGT1A6 en la resistència al MTX. També hem analitzat la inducció transcripcional del MTX sobre la UGT1A6, així com els factors transcripcionals involucrats en aquest procés. A més, s'han estudiat les repercussions terapèutiques que pot tenir la sobrexpressió de la UGT1A6 quan es dóna MTX en combinació amb altres fàrmacs glucuronidables.Dins de la recerca de nous mètodes per inhibir la DHFR diferents als quimioteràpics clàssics com el MTX, trobem els basats en teràpia gènica. En treballs anteriors del nostre grup s'havien desenvolupat diversos tipus de molècules per disminuir l'expressió de la dhfr, tal com oligonucleòtids antisentit (aODNs), siRNAs i Triplex forming oligonucleotides (TFOs).En aquest treball hem desenvolupat Template-PPRHs i Coding-PPRHs, hairpins destinats a unir-se a la cadena motlle o codificant del DNA i mRNA, respectivament. Hem estudiat la capacitat citotòxica que tenen els PPRHs en cèl·lules de càncer de mama utilitzant com a model el gen dhfr humà, així com el mecanisme d'acció pel qual aquestes molècules inhibeixen la DHFR. També hem analitzat la capacitat in vitro dels hairpins d'unir-se a la seva seqüència diana i la influència que té la presència d'interrupcions de purines en la cadena de polipirimidines i la forma de minimitzar els seus efectes. Així mateix, hem estudiat l'estabilitat d'aquestes molècules, la seva especificitat i l'activació de la resposta immune. S'ha analitzat l'aplicació terapèutica a partir de l'utilització de PPRHs contra la dhfr en cèl·lules de càncer de mama resistents al MTX, així com el disseny de diferents PPRHs dirigits contra gens amb importància terapèutica en càncer. / The main objective of this work is the study of the mechanisms that lead to resistance to the chemotherapeutic methotrexate (MTX) in cancerous cells. To study this phenomenon there have been two approaches: the search of new strategies to inhibit the expression of the dihydrofolate reductase (DHFR), the main responsible for MTX resistance; and the study of new genes that could be involved in MTX resistance.A microarrays analysis between two breast cancer cell lines sensitive and methotrexate resistant pointed out the UDP-glucuronosyltransferase 1A (UGT1A) family as a common deregulated node in both cell lines. UGT1A6 was the main isoform responsible for UGT1A family overexpression in these cells and this overexpression was not due to gene amplification. The importance of UGT1A6 overexppression in MTX resistance was studied as well as the induction of UGT1A6 mRNA levels and enzymatic activity carried out by MTX through the transcription factors ARNT (HIF-1) and AhR/ARNT. Cells incubated with anticancer drugs susceptible to glucuronidation together with MTX, showed a lesser degree of cytotoxicity, due to UGT1A6 induction. The pharmacological effect of this induction should be taken into account when combining MTX with other drugs that are glucuronidated.Polypurine Reverse-Hoogsteen hairpins, PPRHs, are dsDNA molecules formed by two polypurine stretches linked by a pentathymidine loop. These two polypurine domains are bound by intramolecular Reverse-Hoogsteen bonds, allowing the formation of a hairpin structure. PPRHs bind to their targets by Watson-Crick, forming triplex structures. We designed two types of PPRHS: Template-PPRHs and Coding-PPRHs. Template-PPRHs are designed to bind the template DNA strand, whereas Coding-PPRHs target the mRNA and the coding DNA strand. The dhfr gene was selected as a target in breast cancer therapy. Both PPRHs caused a high degree of cytotoxicity and a decrease in DHFR mRNA and protein levels, but through different mechanisms of action. Template-PPRHs decrease mRNA levels since they interfere with the transcription process. Coding-PPRHs interfere with the splicing process by competing with U2AF65 for binding to the polypyrimidine target sequence, leading to a lower amount of mature mRNA. PPRHs can be considered as new molecules to decrease gene expression.

El treball realitzat en aquesta tesi doctoral constitueix un estudi farmacogenòmic de la resistència al metotrexat (MTX) en cèl·lules de càncer humà, mitjançant experiments amb microarrays per tal de comparar l'expressió gènica diferencial entre cèl·lules sensibles i resistents al MTX.En un primer estudi, vam utilizar com a model la línia cel·lular HT29 de càncer de colon, i vam identificar AKR1C1 com un gen sobreexpressat a les cèl·lules resistents al quimioteràpic. Vam analizar la regulació transcripcional d'aquest gen, mitjançada principalment per Sp1, vam determinar la seva relació amb el cicle cel·lular i amb l'apoptosi i vam establir un paper per AKR1C1 en la resistència al MTX.En un estudi posterior amb microarrays representatius del genoma humà complet, vam identificar un conjunt de gens sobreexpressats i amplificats a les cèl·lules HT29 resistents, amb una localització cromosòmica propera al gen dihidrofolat reductasa.L'anàlisi detallada dels gens diferencialment expressats CAV1, E-Cadherina, PKC&#61537;&#61472;i ENO2, ens va permetre determinar per a tots ells un paper en la resistència al MTX, essent els dos primers dianes potencials per al disseny d'una teràpia coadjuvant amb MTX.També vam estudiar la resposta gènica associada a la resistència al MTX en altres línies cel·lulars, representatives de càncer de colon, càncer de mama, càncer de pàncrees, leucèmia eritroblàstica i osteosacoma. Vam realitzar experiments de microarrays per a totes elles i vam obtenir llistes de gens diferencialment expressats. A partir d'aquestes dades, vam construir xarxes d'associació biològica de gens comuns diferencialment expressats en càncer de colon, en càncer de mama o entre les altres tres línies cel·lulars estudiades. Així, vam identificar gens que representaven un node de la xarxa (DKK1), o una xarxa sencera (formada per alguns membres de la família gènica UGT1A) o un gen comú deregulat en càncer de pàncrees, leucèmia eritroblàstica i osteosarcoma (EEF1A1). Validacions funcionals d'aquests gens van mostrar una sensibilització de les cèl·lules vers el MTX. / This thesis represents a pharmacogenomic study on methotrexate (MTX) resistance in human cancer cells. Whole human genome microarrays allowed us to compare the gene expression patterns between cell lines sensitive or resistant to MTX.In a first approach, we used HT29 colon cancer cells as a model, and we identified AKR1C1 as a gene overexpressed in the resistant cells. We analyzed its transcriptional regulation, mainly mediated by Sp1, we determined its relationship with cell cycle and with apoptosis, and established a role for AKR1C1 on MTX resistance.In a second study, we identified a set of genes, located flanking the "dhfr locus", which were overexpressed and amplified in the resistant HT29 cells. Detailed analyses on CAV1, E-Cadherin, PKC&#61537;&#61472;and ENO2, four differentially expressed genes, allowed us to establish a role for all of them in MTX resistance, and to hypothesize that CAV1 and E-Cadherin may constitute potential targets for coadjuvant therapy.We also studied the gene expression profiles of MTX resistance in other cell lines, representative of colon cancer, breast cancer, pancreatic cancer, erythroblastic leukemia and osteosarcoma. We performed microarray experiments for all of them and obtained lists of genes differentially expressed. We generated biological association networks with genes in common between both colon cancer cell lines, between both breast cancer cell lines or among the other three cell lines studied. We identified a highly interconnected node in a network (DKK1), a network formed by some members of UGT1A family, and a gene deregulated in pancreatic cancer, erythroblastic leukemia and osteosarcoma (EEF1A1). Functional validations of these three genes showed a sensitization toward MTX.

Recientemente se han demostrado los efectos beneficiosos de los ácidos grasos omega-3 en un gran número de patologías. Entre los mecanismos responsables de estos efectos protectores, destacan dos nuevas familias de mediadores lipídicos bioactivos derivados de estos ácidos grasos, denominadas resolvinas y protectinas, con importantes efectos protectores y antiinflamatorios en varios modelos de daño experimental.Tanto la enfermedad hepática crónica, como la obesidad y sus complicaciones hepáticas presentan un componente inflamatorio clave para su desarrollo, de manera que los ácidos grasos omega-3 podrían tener efectos protectores en estas patologías. Los objetivos del trabajo fueron investigar los efectos de los omega-3: i-) en la inflamación hepáticaii-) sobre el tejido adiposo y las complicaciones hepáticas asociadas a la obesidad.Para nuestro primer objetivo investigamos los efectos hepatoprotectores de los omega-3 sobre el daño genotóxico y el estrés oxidativo, sobre la necroinflamación hepática inducida por CCl4 en ratón, la generación hepática de mediadores lipídicos bioactivos derivados de los omega-3 y, por último, los efectos biológicos de los mediadores lipídicos bioactivos derivados de los omega-3 en eventos clave de la necroinflamación hepática.Los resultados del primer estudio indican que la administración de una dieta enriquecida con omega-3 induce la formación hepática de 17-HDHA y PD1, que reducen el daño genotóxico y el estrés oxidativo en lo hepatocitos, así como marcadores clave de inflamación en los macrófagos.Para el segundo objetivo investigamos los efectos de los omega-3 sobre la esteatosis hepática, sus efectos sensibilizadores a la insulina y sobre la expresión de adipoquinas, el perfil de eicosanoides y derivados bioactivos de los omega-3 en el tejido adiposo, y la contribución de RvE1 y PD1 en los efectos de los omega-3 sobre la esteatosis hepática y la resistencia a la insulina.Los resultados del segundo estudio indican que los omega-3 atenúan la esteatosis hepática, mejoran la tolerancia a la insulina, inducen genes sensibilizadores a la insulina en tejido adiposo e hígado, aumentan la expresión de adiponectina, activan AMPK e incrementan la formación de resolvinas y protectinas en el tejido adiposo. Además, RvE1 y PD1 reproducen los efectos beneficiosos de sus precursores omega-3 sobre la esteatosis hepática y la resistencia a la insulina.Las conclusiones de esta tesis son las siguientes:Los omega-3 protegen a los hepatocitos del daño genotóxico y del estrés oxidativo; disminuyen la necroinflamación y la degeneración hidrópica de los hepatocitos inducidas por CCl4; inhiben la expresión de COX-2 y 5-LO, así como la formación de PGE2; atenúan la esteatosis hepática en ratones obesos; mejoran la tolerancia a la insulina e inducen genes sensibilizadores a la insulina en el tejido adiposo y el hígado de ratones obesos; inducen la expresión génica y proteica de la adiponectina, sin modular las adipoquinas proinflamatorias resistina, MCP-1, TNF-&#61537; e IL-6; activan AMPK en tejido adiposo y músculo en ratones obesos; son transformados a los mediadores lipídicos bioactivos 17-HDHA y PD1 en el hígado, y 17-HDHA, RvD1 y PD1 en el tejido adiposo de ratón.El 17-HDHA protege a los hepatocitos del daño genotóxico, del estrés oxidativo, reduce la liberación de TNF-&#61537; en macrófagos y activa PPAR&#61543;.RvE1 reduce la esteatosis hepática y los macrófagos en el hígado y aumenta la expresión génica de adiponectina y otros factores sensibilizadores a la insulina en el tejido adiposo de ratones obesos.PD1 induce la expresión de adiponectina en explantes de tejido adiposo de ratón obeso a niveles similares a los de la rosiglitazona.Estos resultados indican que los ácidos grasos omega-3 ejercen efectos protectores en la inflamación hepática y las complicaciones asociadas a la obesidad. Estos efectos beneficiosos están mediados, en parte, por la síntesis de resolvinas y protectinas. / Recently, omega-3 PUFA beneficial effects have been well-established in a number of pathologies. Among the mechanisms responsible for those protective effects, two novel families of bioactive lipid mediators termed resolvins and protectins, are thought to play a key role.Inflammation is a key factor for chronic liver disease, as well as obesity and obesity-induced alterations development. Thus, omega-3 PUFA might display important protective actions on these pathologies. The aim of the current study was to investigate omega-3 PUFA effects on: i-) hepatic inflammation.ii-) adipose tissue and obesity-induced alterations.First, we examined hepatoprotective actions of omega-3 PUFA on genotoxic damage and oxidative stress, CCl4-induced hepatic necroinflammation in mice, hepatic generation of omega-3 PUFA-derived bioactive lipid mediators, and their biological effects in key events for the pathophysiology of hepatic necroinflammation. The results of our first study indicate that an omega-3 PUFA-enriched diet induces 17-HDHA and PD1 hepatic formation, which are able to reduce genotoxic damage and oxidative stress in hepatocytes, as well as key inflammatory markers in macrophages.Second, we examined omega-3 PUFA actions on hepatic steatosis, insulin sensitivity and adipokines expression, eicosanoid and omega-3 PUFA-derived bioactive lipid mediators profile in adipose tissue, as well as RvE1 and PD1 contribution to omega-3 PUFA actions on hepatic steatosis and insulin resistance. The results of our second study indicate that omega-3 PUFA ameliorate hepatic steatosis and insulin tolerance, induce insulin-sensitizing genes in adipose and liver tissue, increase adiponectin expression, activate AMPK and induce resolvins and protectins formation in adipose tissue. Moreover, RvE1 y PD1 reproduce omega-3 PUFA beneficial effects on hepatic steatosis and insulin resistance. Taken together, these results indicate that omega-3 PUFA display potent protective actions on hepatic inflamation and obesity-induced alterations. These beneficial effects are mediated, at least in part, by resolvins and protectins synthesis from their omega-3 PUFA precursors.

Els eicosanoids són els mediadors lípidics inflamatoris més potents i juguen un paper clau en diversos processos fisiològics i patològics modulant la iniciació, progressió i resolució de la inflamació. Per aquest motiu en la present tesi s'ha investigat el paper de les dues vies majoritàries de formació d'eicosanoids, la via de la ciclooxigenasa (COX)-2 i la de la 5-lipooxigenasa (LO), a dos teixits claus a l'homeostasi corporal: el teixit hepàtic i el teixit adipós. Durant el primer estudi, vam examinar la contribució de la COX-2 i la 5-LO en la progressió de la inflamació i fibrosi hepàtica. L'administració de SC-236, un inhibidor de la COX-2, combinat amb el CJ-13,610, un inhibidor de la 5-LO, a ratolins tractats amb CCl4, va reduir la fibrosi i la necroinflamació hepàtica, augmentant l'apoptosi en cèl·lules no parenquimals. Vam confirmar aquests resultats amb ratolins deficients per la 5-LO que van rebre SC-236. Vam realitzar un perfil farmacològic addicional d'aquests compostos en macròfags, on van regular diferentment l'expressió de IL-6. Durant el segon estudi, vam investigar la contribució de la via de la 5-LO a la inflamació del teixit adipós i la disfunció lipídica a l'obesitat. El teixit adipós de ratolins obesos va presentar un increment de la expressió de la proteïna activadora de la 5-LO (FLAP) i els nivells de LTB4. La incubació de explants de teixit adipós amb productes de la 5-LO va produir l'activació del NF-kappaB i va augmentar la secreció d'adipoquines proinflamatòries. A més, el LTB4 va modular el transport d'àcids grassos lliures al teixit adipós. El teixit adipós obès presentava una infiltració de macròfags, elevats nivells d'àcids grassos lliures i esteatosi hepàtica, efectes que van ser revertits amb la inhibició de la FLAP. Aquesta inhibició va modular a més l'AMPK, la HSL i de la secreció de TNFalfa i IL-6. En conjunt, aquests resultats ens indiquen que els eicosanoids, mediadors lipídics derivats de l'àcid araquidònic, tenen una paper regulador de la inflamació tissular. A nivell del fetge la inhibició simultània de la via de la COX-2 i la 5-LO exerceix un efecte preventiu del dany hepàtic necroinflamatori i la fibrogènesi. A nivell de teixit adipós la via de la 5-LO és una nova diana en la prevenció de l'estat inflamatori i de la disfunció lipídica. Això ens indica que aquestes vies representen una potencial estratègia terapèutica en aquests teixits estudiats. / In this thesis we investigated the major eicosanoid formation pathways, cyclooxygenase-2 (COX-2) and 5-lipooxygenase (5-LO), and their role in hepatic and adipose tissue inflammation. In the first study, we examined the contribution of COX-2 and 5-LO to the progression of hepatic inflammation and fibrosis. Separate administration of SC-236, a COX-2 inhibitor, and CJ-13,610, a 5-LO inhibitor, to CCl4-treated mice significantly reduced fibrosis without affecting necro-inflammation. Conversely, combined administration of SC-236 and CJ-13,610 reduced both necro-inflammation and fibrosis and increased the number of apoptotic non-parenchymal liver cells. These findings were confirmed in 5-LO-deficient mice receiving SC-236, which also showed reduced hepatic MCP-1. Additional pharmacological profiling of SC-236 and CJ-13,610 was performed in macrophages, the primary hepatic inflammatory cell type. These drugs differentially regulated IL-6 in macrophages. During the second study, we investigated the contribution of the 5-LO pathway to adipose tissue inflammation and lipid dysfunction in experimental obesity. Constitutive expression of key components of the 5-LO pathway as well as LT receptors were detected in adipose tissue. Adipose tissue from obese mice exhibited increased 5-LO activating protein (FLAP) expression and LTB4 levels. Incubation of adipose tissue with 5-LO products resulted in NF-kappaB activation and augmented secretion of pro-inflammatory adipokines. In addition, LTB4 reduced FFA uptake in adipocytes, whereas 5-LO inhibition suppressed lipolysis. In mice with obesity, elevated FLAP expression in adipose tissue was paralleled with macrophage infiltration, increased FFA levels and hepatic steatosis, phenomena that were reversed by FLAP inhibition. Interestingly, FLAP inhibition induced AMPK in parallel with decreases in HSL activity and the secretion of TNFalpha and IL-6. Taken together, these findings indicate that both COX-2 and 5-LO pathways are contributing factors to hepatic inflammation and fibrosis and that the 5-LO pathway signals the adipose tissue "low-grade" inflammatory state and steatogenic potential in experimental obesity, representing potential targets for therapy.

La arquitectura del genoma y la estructura de la cromatina, junto con los factores de transcripción son actores clave para la autorenovación, la pluripotencia y la diferenciación de las células madre embrionarias (ESCs). Combinando una microscopía cuantitativa de super-resolución (STORM) con simulaciones numéricas hemos sido capaz de definir cómo los nucleosomas están empaquetados en vivo, y hemos identificado un nuevo modelo de organización de la fibra de cromatina. Encontramos que la fibra de cromatina está formada por grupos de nucleosomas de diferentes tamaños, que llamamos "nucleosome clutches" y que estos están intercalados con regiones sin nucleosomas. Además, el número medio de nucleosomas y su nivel de compactación dentro de los clutches, está relacionado con el estado celular. Células madre pluripotentes, tienen en promedio clutches con menos nucleosomas incluidos y de menos densidad con respecto a las células diferenciadas. / Nuclear architecture and chromatin structure, together with the transcriptional network are key players for self-renew, pluripotency and differentiation of embryonic stem cells (ESCs). Combining quantitative super-resolution microscopy (STORM) with computer simulations we resolved how nucleosomes are arranged in vivo, identifying a novel model of organization of the chromatin fiber. We found that chromatin fiber is formed by groups of nucleosomes of varying sizes, which we term “clutches” and these were interspersed with nucleosome-depleted regions. Moreover the median number of nucleosomes and their compaction inside clutches highly correlated with cellular state. Ground-state pluripotent stem cells had, on average, less dense clutches containing fewer nucleosomes with respect to differentiated cells.