Estudio de la bibliografía especializada y realización de ensayos preliminares que permitan la proposición de un mecanismo de reacción sometido a análisis cinético, que aporte expresiones útiles para un diseño experimental , aplicable para comprobar la validez del mecanismo de reacción planteado, así como para la caracterización cinética de los sistemas enzimáticos investigados, superando a otros métodos descritos en la bibliografía. • Caracterización cinética y optimización de la biodegradación enzimática por peroxidasas, de los colorantes Índigo Carmín (IC) y Remazol Brilliant Blue Royal (RBBR), mediante un método espectrofotométrico. • Caracterización cinética y optimización de la biodegradación de IC, por sistemas enzima-mediador en presencia de mediadores naturales. • Caracterización cinética y optimización de la biodegradación de RBBR por sistemas enzima-mediador en presencia de mediadores naturales. • Caracterización cinética y optimización de la determinación de fenoles con aplicaciones biotecnológicas, mediante un método espectrofotométrico y ultrasensible de bioanálisis enzimático. Metodología Ensayos espectrofotométricos Los espectros de absorción fueron registrados con un espectrofotómetro de visible-ultra violeta Perkin-Elmer Lambda 35, otros datos cinéticos o de punto final en la zona del visible fueron obtenidos mediante un lector de microplaca SpectraMax 340PC384. Ensayos de cromatografía líquida líquida de alta resolución (HPLC) Los cromatogramas realizados se llevaron a cabo con un cromatógrafo HPLC Agilent 1200 Rapid Resolution. Las especies eluídas fueron monitorizadas a diferentes longitudes de onda, tomando el máximo de absorción para cada una de ellas. Biodegradación de IC con peroxidasas La reacción se realizó en tubos de plástico con una concentración de enzimas HRP y SBP que varió entre 2.5-30 nM , la concentración de contaminante entre 10-120 M y la de peróxido de hidrógeno también entre 10 y 120 M , todo ello a pH óptimo de 10 mM de tampón citrato de pH 5.0 y 4.0 para HRP y SBP respectivamente, a 25 ºC.Se analizaron las reacciones en el espectrofotómetro y en el HPL, determinando los parámetros cinéticos como la absorbancia máxima (Amax), la velocidad en estado estacionario VSS y la constante de biodegradación (). Biodegradación de IC con sistemas lacasa/peroxidasa-mediador Se comparó el estudio a 25 ºC de SBP con el de TvL para la degradación de IC entre con los mediadores MSG, ASG, SGA y SGO con el fin de contrastar los rendimientos de biodegradación del colorante. Biodegradación de RBBR con sistemas lacasa-mediador Se optimizaron las condiciones de reacción para la degradación de RBBR con sistemas EML a temperatura ambiente, eligiendo el sistema mediador más eficaz para dicha reacción. Bioanálisis enzimático de fenoles Se diseña y optimiza un método de análisis enzimático espectrofotométrico para el análisis de distintos tipos de fenoles industriales (fármacos, contaminantes y fitoquímicos). La reacción se realiza en presencia de AA como reductor acoplado y biomolécula detectora, catalizada por HRP. Conclusiones • Se ha caracterizado cinéticamente y optimizado la biodegradación enzimática de IC y RBBR por H2O2, catalizada por las peroxidasas HRP y SBP, mediante un método espectrofotométrico • Se ha conseguido la caracterización cinética y la optimización de la biodegradación enzimática del IC, por varios sistemas enzima-mediador (EMS). En concreto, las enzimas SBP con H2O2 y TvL con O2, en presencia del premediador natural SGO, y de los mediadores naturales, MSG, ASG y SGA. • Se ha estudiado la caracterización cinética y la optimización de la biodegradación enzimática de RBBR por TvL con O2, ante el premediador natural SGO y los mediadores naturales MSG, ASG y SGA. • Se ha desarrollado un método espectrofotométrico y ultrasensible de bioanálisis enzimático, útil para la determinación de concentraciones nanomolares, de diferentes contaminantes, fármacos y fitoquímicos fenólicos de interés biotecnológico. En consecuencia, se han alcanzado satisfactoriamente, los objetivos propuestos al comienzo de esta Tesis Doctoral. / Kinetic characterization and optimization of a spectrophotometric method, for the enzymatic biodegradation by peroxidases, of the dyes Indigo Carmine (IC) and Remazol Brilliant Blue Royal (RBBR). • Kinetic characterization and optimization of the IC biodegradation, by enzyme-mediator systems in the presence of natural mediators. • Kinetic characterization and optimization of the RBBR biodegradation, by enzyme-mediator systems with natural mediators. • Kinetic characterization and optimization of the determination of bioactive phenols, by using a spectrophotometric and ultrasensitive method of enzymatic bioanalysis. Methodology Spectrophotometric assays Absorption spectra were recorded in a visible-ultraviolet Perkin-Elmer Lambda 35 spectrophotometer and other data adquisition in endpoint or kinetic were recorded with an absorbance microplate reader SpectraMax 340PC384. Liquid chromatography Chromatograms were realized with an HPLC Agilent 1200 Rapid Resolution chromatograph. The monitoring of the eluted species was performed at different wavelengths, taking the maximum absorbance wavelengths of the different substances. Biodegradation of the dyes IC and RBBR by POD. This chapter describes a new ecofriendly alternative for removal Remazol Brilliant Blue (RBBR) and Indigo Carmine by soybean (SBP) and horseradish (HRP) peroxidases. Thus, studies for optimization of reaction conditions (pH, concentration of enzymes/substrates/hydrogen peroxide) have been proposed. Biodegradation of IC by enzyme-mediator systems. A reaction mechanism is proposed beside the pH results. This mechanism involves enzymatic and nonenzymatic reactions, in which a premediator (PM), mediator (M) and the mediator radical (MR) are considered. Vss values were determined from enzymes, mediator and IC effects. Thus, the assay conditions for biodegradation of IC, with the enzyme-mediator systems, were optimized. Vss values were determined from enzyme, mediator and RBBR effects. The experimental data obtained confirmed the reliability of the reaction mechanism proposed. Thus, the assay conditions for biodegradation of RBBR, with the enzyme-mediator systems, were optimized. Biodegradation of RBBR by laccase-mediator systems. Remazol Brilliant Blue Royal (RBBR) biodegradation was carried out by laccase from Trametes villosa (TvL) using the natural mediators ASG, MSG, SGA and SGO Enzymatic bioanalysis of phenols. A number of analytical methods with different sensitivity, complexity, quickness and cost have been proposed The aim of this chapter is the possible determination of phenols of biotechnological interest, in nanomolar concentrations, by using an enzymatic and spectrophotometric method of bioanalysis, easy, quick and with low cost. Conclusions • It has characterized kinetically and optimized the enzymatic biodegradation of IC and RBBR by H2O2, catalyzed by the peroxidases HRP and SBP, with a spectrophotometric method. • It has reached the kinetic characterization and the optimization of the enzymatic biodegradation of IC, by several systems enzyme-mediator (EMS). In particular, the enzyme SBP with H2O2 and TvL with O2, in presence of the natural premediator SGO and the natural mediators MSG, ASG and SGA. • It has been studied the kinetic characterization and the optimization of the enzymatic biodegradation of RBBR by TvL and O2, with the natural premediator SGO and the natural mediators MSG, ASG and SGA. • It has carried out a spectrophotometric and ultrasensible method of enzymatic biodegradation, useful for the determination of nanomolar concentrations of different phenolic contaminants, drugs and phytochemicals of biotechnological interest. In consequence, the proposed objectives at the beginning of this Doctoral Thesis have been successfully reached.

Objetivos generales de la tesis: Con el desarrollo de esta propuesta se espera contribuir al conocimiento que sirva de base para el diseño de una vacuna más efectiva contra pertussis, no sólo en términos generales, sino en lo que se refiere a su efectividad en Argentina, determinando la definición de la/s cepas / componentes a incluir en una nueva formulación. Objetivos específicos de la tesis: En este marco conceptual y tomando como hipótesis la divergencia de la población bacteriana circulante respecto a las cepas vacunales hoy en uso, se proponen los siguientes objetivos: 1-Caracterizar mediante la aplicación de técnicas de genómica funcional los aislamientos de B. pertussis locales. Identificar de nuevos inmunógenos. Los aislamientos clínicos de nuestra colección han sido previamente agrupados en base a sus divergencias a nivel de las secuencias que codifican para antígenos específicos, así como en su genoma completo a través de los ensayos de PFGE y los años en que fueron aislados. Proponemos abordar la búsqueda de diferencias específicas, a nivel de expresión génica, entre los aislamientos circulantes y las cepas que hoy se usan en la producción de vacunas. Para ello hemos emplearemos herramientas de genómica funcional, proteómica e inmunoblot; para identificar potenciales candidatos vacunales a incorporar en una formulación acelular. 2-Analizar la relevancia de la divergencia genética entre la Población Bacteriana Circulante (PBC) y las cepas vacunales respecto a la protección contra pertussis. Para abordar este punto emplearemos el modelo animal de desafío intranasal. Consideramos que la información obtenida marcará la necesidad o no de incluir determinadas variantes polimórficas para obtener una nueva vacuna más efectiva. El abordaje de este aspecto se espera también contribuya al conocimiento general de la adaptación y evolución bacteriana bajo la presión de selección ejercida por las diferentes estrategias de vacunación (celular/acelular). / Tesis digitalizada en SEDICI gracias a la Biblioteca Central de la Facultad de Ciencias Exactas (UNLP).

Considerando el enorme perjuicio en tiempo y esfuerzo que la contaminación con micoplasmas causa a los laboratorios que utilizan los cultivos celulares como sustrato para estudios virales, para la obtención de anticuerpos monoclonales o para distintos estudios metabólicos o inmunológicos y teniendo en cuenta que en nuestro país no se conocían datos concretos de esta problemática, los objetivos propuestos fueron: - Estimación del índice de contaminación de los cultivos en nuestro medio - Identificación de los organismos contaminantes a fin de conocer el origen más probable de la contaminación - Desarrollo de una metodología tendiente a la curación de los cultivos infectados.

Es bien conocido que las sustancias hidrofóbicas en medios acuosos, deben ser conducidas por agentes "solubilizadores", debido a que las mismas presentan una muy escasa o nula solubilidad en agua. Ciertas moléculas orgánicas, entre las que se encuentran moléculas lipídicas y vitaminas hidrosolubles, presentan dicha propiedad de hidrofobicidad. En los líquidos biológicos tanto extra como intracelulares, dichos compuestos son asociados son transportados por proteínas específicas que actúan como agentes "solubilizadores". A nivel intracelular se conocen varias proteínas que transportan en forma mas o menos específica a los distintos tipos de lípidos como también a las distintas formas biológicas de la vitamina A. En el medio intracelular los ácidos grasos de cadena larga son conducidos por la proteína transportadora de ácidos grasos (FABP: fatty acid binding protein) desde y hacia las organelas donde se produce una activa utilización metabólica de los mismos. Esta proteína fue identificada por primera vez en el año 1972 por un grupo de investigadores conducidos por Robert K. Ockner, quienes trabajaron con la fracción citosólica aislada de varios órganos de rata. En la actualidad, se cuenta con varias evidencias que sugieren que ésta proteína no sólo media el movimiento intracelular de ácidos grasos, sino también que cumple importantes funciones en el metabolismo celular de estas y algunas otras sustancias hidrofóbicas. No obstante, existe gran confusión acerca de la composición lipídica de esta proteína. En cuanto al transporte intracelular de la vitamina A, se conocen varias proteínas que transportan en forma muy específica a los distintos derivados de esta vitamina liposoluble; retinol, retinal, ácido retinoico, pero no ha sido identificada ninguna proteína que actúe como transportador específico de los ésteres de retinol, forma principal de almacenamiento de retinoides en el tejido hepático. Teniendo en cuenta estas discrepancias, el presente trabajo de Tesis pretende evaluar la interacción de la proteína transportadora de ácidos grasos, obtenida de citosol de hígados de ratones Mus musculus, con distintas moléculas hidrofóbicas, incluyendo fosfolípidos, ácidos grasos y derivados de vitaminas A, incorporados en membranas naturales y/o artificiales.

Dado que una simbiosis exitosa requiere bajos niveles de N biodisponible en el suelo y que ciertas evidencias sugieren que la escasez de nutrientes podría favorecer la capacidad infectiva de los rizobios sobre las raíces de las leguminosas (por ejemplo Kijne et al., 1988; Brelles Mariño et al., 1996; Lodeiro et al, 2000), puede plantearse la alternativa de preparar inoculantes en medios de alta relación C/N. Los medios de cultivo empleados comúnmente para la obtención de caldos de rizobios para inoculantes son diversos, pero en todos los casos están bien balanceados y se procura obtener con ellos altas concentraciones bacterianas, con lo cual generalmente se trata además de medios ricos. Esta condición podría dar por resultado inoculantes poco infectivos no sólo por la abundancia de nutrientes, sino porque los sistemas de percepción del quorum en estos cultivos densos podrían determinar la liberación de bradioxetina y la posterior inhibición de la expresión de los genes nod (Loh et al, 2001; 2002). El método más común de aplicación de los inoculantes en soja consiste en ponerlos en contacto con las semillas antes de sembrar y permitir su adhesión a las mismas. Este método es muy conveniente desde el punto de vista práctico debido a su simplicidad y a que no requiere de operaciones adicionales ni equipos especiales. Sin embargo, la inoculación sobre las semillas puede constituir otro problema para la eficiencia final obtenida con cualquier inoculante por su mala distribución en el suelo debida a los problemas de movilidad que ya hemos analizado. Por lo tanto, debería compararse esta metodología de aplicación del inoculante con otras que lo distribuyan mejor en el sustrato en el cual crecen las raíces. En vista de estos problemas hemos enfocado nuestro trabajo de Tesis al estudio de la eficiencia de los rizobios para nodular, asociada a aspectos del metabolismo bacteriano bajo diversos grados de limitación de N y a la distribución de los rizobios respecto de la zona infectable de la raíz. En particular, es de nuestro interés investigar si la limitación en N favorece o no el desarrollo de las etapas tempranas de preinfección e infección y encarar el análisis de la competitividad de rizobios cultivados bajo nuestras condiciones de limitación o suficiencia de N frente a poblaciones como las naturalizadas en los suelos. / Tesis digitalizada en SEDICI gracias a la Biblioteca Central de la Facultad de Ciencias Exactas (UNLP).

El objetivo del presente trabajo de tesis doctoral es estudiar y caracterizar la formación de un complejo físico-funcional entre el cotransporte sodio/bicarbonato electrogénico Na<SUP>+</SUP>/HCO<SUB>3</SUB><SUP>-</SUP> (NBCe1) y la AC IX.

Magíster en Ciencias Biológicas con mención en Ecología y Biología Evolutiva

In the last two decades, the increasing appearance of new complex network systems, which includes a large number of state variables and even greater amount of interconnections (represented in hundreds of parameters) became a demanding task for modeling, especially in the areas of pharmacology and bioengineering. Nowadays, there exists a serious recognition of the importance of Identifiability (ID) since parameters can be non-identifiable when it comes to make experimental design. As biological models contain a considerably large amount of parameters, it is difficult to make a proper estimation of them. Building a dynamic biological model involves not only the input and output quantification but also the structural components considering the importance of the information about the internal structure of a system and their components in biology [4]. After many years of development , complex dynamic systems can be modeled using Ordinary Differential Equations (ODE)s, which are capable of describing suitably the dynamical systems behavior. Nevertheless, in the majority of cases, the parameters values of a system are unknown; consequently, it is necessary to do estimation based on experimental data to determine their values. Biological models , commonly complex dynamic systems, include a large number of parameters and few variables to measure hence the estimation of them represents a major challenge. An important step is to do a previous identifiability analysis of the parameters before their estimation. The concept of structural or a priori identifiability involves the question of examining whether a system is identifiable or not given a set of ideal conditions (noise-free and enough input-output data) before a parameter estimation. Through the years, different approaches and their respective software applications to perform a structural identifiability analysis have been developed; however, does not have suitable measures to repair the non-identifiable problem [11] [12]. On the contrary, the method developed by Li and Vu [9] takes into consideration this subject by using parameter correlations as the indicator of the non-identifiability problem and remedy this challenge by defining proper initial conditions. For all these reasons, the main goal of this work is to implement the method of structural identifiability proposed previously, which allows the clarification of the identifiability analysis for linear dynamic models and gives relevant information about the conditions for a posterior experimental design and remedy if the model results nonidentifiable. As the level of mathematical difficulty is not high since the basic idea is the use of the output sensitivity matrix by calculations of Laplace transform and manageable linear algebra, the implementation is efficient and simple, taking less than a minute to analyze identifiability in simple models even examining different scenarios (values of initial states, absence of input) at the same time in comparison to the calculation of all the procedure by hand. As Maple is one of the best software to compute symbolic calculations in the market today, is the application of choice to work with models containing unknown parameters. / Tesis

Memoria para optar al Título Profesional de Antropóloga Física

La leishmaniasis, tiene un fuerte impacto social, alta morbilidad y se manifiesta por la presentación de cuadros clínicos severos. En el Perú, las formas clínicas más frecuentes son la Leishmaniasis Cutánea (LC); Leishmaniasis Cutáneo Mucosa (LCM) y Leishmaniasis Cutánea Difusa (LD) causadas principalmente por Leishmania (Viannia) peruviana, Leishmania (Viannia) braziliensis y Leishmania (Leishmania) amazonensis respectivamente. En este contexto, se evaluó la actividad fotodinámica in vitro de ftalocianina de aluminio tetrasulfonada clorada (AlPcClS4) sobre promastigotes y amastigotes de L.(V.) peruviana, L.(V.) braziliensis y L. (L.) amazonensis. La actividad del fotosensibilizador AlPcClS4 sobre promastigotes se determinó por la prueba colorimétrica trimetiltetrazolium (MTT) y su actividad tóxica en amastigotes por qPCR. Los resultados para promastigotes fueron expresados en Concentración Inhibitoria 50 (IC50) y para amastigotes en porcentajes (%) de reducción de ADN parasitario. Se encontró que la actividad de AlPcClS4 a 100 µM, 24 horas post tratamiento fue fototóxica en promastigotes, inhibiendo el crecimiento de L. (V.) peruviana, L.(V.) braziliensis y L.(L).amazonensis en 65,6; 49,6 y 43,9% frente al control respectivamente; Concentraciones inferiores a 50 µM de AlPcClS4 no tuvieron efectos significativos en ninguna de las tres especies con respecto al control (p>0.05). En cambio para amastigotes intracelulares de las tres especies, la AlPcClS4 expuesta a 200 µM, 72 horas post tratamiento logró una reducción del número de amastigotes con respecto al control en un 57,82; 37,13 y 34,85% respectivamente. Asimismo, se observaron alteraciones morfológicas que podrían estar asociados a procesos de apoptosis. Los resultados de avance permiten indicar que la TFD con nuevos fotosensibilizadores como AlPcClS4 serían una probable alternativa en el tratamiento de leishmaniasis, sin embargo se requiere contar con ensayos in vivo en animales de experimentación. / Tesis