Realiza una investigación experimental, transversal y prospectiva cuyo propósito fue la obtención del colorante de la pulpa del fruto de Mangifera indica L. (mango), fruto de una especie arbórea perteneciente a la familia Anacardiaceae, que fue obtenido en el caserío Longar, provincia y departamento de Ica. Se buscó optimizar la obtención del colorante mediante la metodología Superficie Respuesta (MSR) para determinar los factores óptimos de obtención del colorante tales como: solvente, temperatura, relación entre muestra y solvente, pH y tiempo, los cuales se verificaron experimentalmente con el fin de mejorar la obtención del colorante. Para la optimización y el análisis estadístico se empleó el programa informático Minitab 18 y Statgraphic centurión XVI. La parte experimental consistió de tres etapas: primero, una etapa preliminar donde se determinó solvente, temperatura, relación entre muestra y solvente, pH y tiempo; la segunda etapa, que consistió en realizar un diseño factorial completo general donde se probaron los factores relación entre muestra y solvente, pH y tiempo; la tercera etapa, donde se realizó un diseño Box Behnken del método Superficie Respuesta para determinar las condiciones óptimas de obtención del colorante. Se obtuvo un extracto de una concentración de 49,09 µg/µL del colorante de la pulpa del fruto de Mangifera indica L. (mango), a una relación entre muestra y solvente de 20, 5 % a pH 9,1, y durante 2,16 horas de tratamiento. / Tesis

Seminario de título entregado a la Universidad de Chile en cumplimiento parcial de los requisitos para optar al Título de Bióloga con mención en Medio Ambiente. / La fuerte relación entre la fisionomía foliar y el clima ha sido utilizada para desarrollar modelos de reconstrucción paleo-climática. Asimismo, la densidad estomática y el tamaño de estomas responden, en algunas especies, a las variaciones de temperatura y humedad, como resultado de la compensación entre la pérdida de agua y la absorción de CO2. Sin embargo, el efecto del ambiente en la morfología de estomas es especie-específico, y no ha sido evaluado aún en el género Nothofagus. El presente estudio evalúa la variación de 23 rasgos foliares de N. dombeyi y N. nitida, considerando 21 sitios distribuidos entre los 35,6°S a los 46,5°S. Según los patrones globales descritos y las notables variaciones en temperatura y precipitación de la transición latitudinal del clima mediterráneo-templado, se predice que individuos de mayor latitud presenten hojas y estomas más grandes, mayor densidad estomática y cantidad de dientes, y hojas de menor circularidad. Para determinar la validez de la predicción, se registró la variación morfológica de lámina y estomas para las dos especies, y se evaluó la relación morfología-clima mediante análisis multivariado. A excepción de la forma de la hoja en N. dombeyi, se encontró una respuesta morfológica inversa a la esperada, y se determinó que cuatro rasgos de la morfología foliar pueden ser usados como indicadores paleo-climáticos en esta especie. Además, se postula el tamaño de estomas como posible indicador paleoclimático, previa evaluación de su señal filogenética. Finalmente, se establecen las bajas temperaturas como principal, pero no único, determinante en el tamaño de hojas y estomas en N. dombeyi. / The strong leaf physiognomy-climate relationship has been used for the development of past climate reconstruction models. In addition, stomatal size and density respond, in some species, to temperature and moisture variations, as a result of water and CO2 trade-off. However, the environmental effect on specie-specific stomatal morphology has not been evaluated yet on the genus Nothofagus. The current work evaluates 23 foliar traits variation on N. dombeyi and N. nítida along 21 sample sites distributed between 35.6°S and 46.5°S. According to global patterns described for the leaf-climate relationship, and the wide variation of temperature and moisture between the Mediterranean-Temperate climate transition, individuals growing at high latitudes should have bigger stomata and leaf sizes, higher stomatal density and tooth number, and have less rounded leaf. To determine the veracity of this prediction, leaf and stomatal morphology were recorded for two species, and the leaf morphology-climate relationship was evaluated with a multivariate analysis. For N. dombeyi, the results showed an inverse leaf morphology-climate relationship (except for leaf shape) and that 4 of the 23 foliar traits evaluated can be used as paleoclimate proxies. Moreover, it is proposed that stomatal size could be used as paleoclimate proxy, with prior evaluation of the phylogenetic signal. Finally, low temperature is established as the principal driver, but not the only one, for leaf and stomatal sizes on N. dombeyi. / Proyectos Fondecyt 1120215, 1150690, ICM MINECOM P05-002 IEB, PFB 23.

Evalúa el efecto del fluido folicular como suplemento en el medio de maduración sobre las tasas de maduración in vitro de ovocitos de alpaca. Las muestras biológicas fueron colectadas en el camal municipal de Huancavelica y trasladadas en una solución de NaCl al 0.9% a 4 ºC. En el laboratorio, los complejos cumulus-oophorus (CCO) fueron aislados de los folículos mediante dos métodos (aspiración y cortes) y los CCOs seleccionados fueron colocados en un medio de maduración suplementado con suero fetal bovino (SFB), fluido folicular (FF) o ambos (SFB+FF) y cultivados a 38.5 ºC, 5% de CO2 y 100% de humedad relativa durante 32 a 36 horas. La madurez de los ovocitos fue evaluada post-cultivo mediante la presencia del primer cuerpo polar. Para determinar la capacidad de los ovocitos maduros para completar los procesos de fertilización y desarrollo embrionario se realizaron 4 ensayos de FIV. Se trabajó con espermatozoides aislados de la zona caudal del epidídimo los que fueron seleccionados por el método de swim-up. La fertilización se realizó con una concentración de 2x106 esp/mL en medio HAM suplementado con heparina y PHE como agentes capacitantes. Los espermatozoides y ovocitos se cultivaron juntos bajo condiciones similares a las usadas para la maduración durante 18 horas, luego del cual, los ovocitos fueran lavados y cultivados en medio KSOM suplementado con SFB, piruvato sódico y gentamicina durante 7 días. En primer lugar, se comparó el promedio de CCO aislados mediante los métodos utilizados. Se obtuvo un promedio de 2.1 CCO aislados por ovario mediante el método de aspiración, mientras que con el método de cortes se obtuvo un promedio de 1.2 CCO por ovario, encontrándose diferencia significativa entre estos resultados (p˃0.05). En conclusión, los resultados sugieren que el método de aspiración muestra una mayor proporción de aislamiento de CCO en comparación con el método de cortes, asimismo se demuestra que el FF puede ser usado como un suplemento natural equivalente al SFB en los medios de maduración in vitro para ovocitos de alpaca. / Tesis

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Determina el efecto fotodinámico de ftalocianina de aluminio tetrasulfonada clorada (PcAlClS4) en el tratamiento de leishmaniasis cutánea inducida en Mesocricetus auratus (hámster dorado) con Leishmania (L.) amazonensis. Dos grupos de hámsteres de 6 semanas fueron inoculados intradérmicamente en la zona sacro lumbar con cultivos de promastigotes; estos fueron monitoreados hasta por 7 meses. Luego de 56 días de inoculación aparecieron lesiones características de la enfermedad, sobre las cuales se les aplicó PcAlClS4 tanto en crema como en solución; luego fueron irradiados de inmediato con una lámpara LED en campo oscuro. Después de 12 semanas pos-tratamiento se evidenció la disminución de la zona afectada, ocurriendo sólo con la aplicación en solución. Asimismo, se observó la diseminación (metástasis) del parásito hacia otras partes del organismo, esto se evidenció a través de cortes histológicos de los tejidos tratados y fueron coloreados con hematoxilinaeosina, permitiendo observar la presencia de células plasmáticas y amastigotes del parásito en todas las muestras analizadas. Los resultados obtenidos en la presente investigación permiten reformular propuestas alternativas en el uso de PcAlClS4 como TFD y sus limitaciones en el tratamiento de la leishmaniasis cutánea. / Tesis

La expresión de hemoxigenasa 1 (HO-1) ha demostrado estar sobre-regulada en el cáncer colorrectal (CCR), pero el papel que desempeña en este tipo de cáncer aún no se ha dilucidado. Los objetivos de este estudio han sido analizar la expresión de HO-1 en CCR invasivo humano, evaluar su correlación con parámetros clínicos -histopatológicos e investigar los mecanismos por los cuales la enzima influye en la progresión tumoral. Se confirmó que HO-1 fue sobre-expresada en CCR invasivo humano y se encontró que la expresión de la enzima se asocia con un mayor tiempo de supervivencia global de los pacientes. Además, se observó, en un modelo de CCR en ratas inducido químicamente con 1,2-dimetilhidrazina que la expresión total y nuclear de HO-1 aumenta con la progresión tumoral. El estudio de los mecanismos implicados en la acción de la HO-1 en CCR demostró que la proteína reduce la viabilidad celular a través de la inducción de la detención del ciclo celular y de la apoptosis; y que se requiere la proteína supresora de tumores p53 funcional para estos efectos. Esta reducción en la viabilidad celular se acompaña por la modulación de los niveles de p21, p27, ciclina D1, Bax, uPARP y por la modulación de las vías de caspasa-3, Akt y PKC´s. También, en modelos animales murinos, se demostró que la modulación genética y farmacológica de HO-1 reduce la tasa de crecimiento y la carga tumoral cuando p53 se encuentra en su estado salvaje. En adición, se observó que la sobre-expresión de HO-1 reduce la migración e invasión celular. En conclusión, estos resultados demuestran un papel antitumoral de HO-1 apuntando a la importancia de la condición de p53 en esta actividad antitumoral. / The expression of heme oxygenase-1 (HO-1) was shown to be up-regulated in colorectal cancer (CRC), but the its role in this type of cancer has not yet been elucidated. The objectives of this study were to analyze the expression of HO-1 in human invasive CRC, to evaluate its correlation with clinical-histopathological parameters and to investigate the mechanisms by which the enzyme affects tumor progression. It was confirmed that HO-1 was over-expressed in invasive human CRC and was found that the expression of the enzyme is associated with an increased overall survival time of patients. Furthermore, it was observed in a chemical animal model of CRC induced in rats with 1,2-dimethylhydrazine that the total and the nuclear expression of HO-1 increased with tumor progression. The study of the mechanisms involved in the action of HO-1 protein in CRC, showed that the protein reduces cell viability through induction of cell cycle arrest and apoptosis; and functional suppressor protein p53 is required for this purpose. This reduction in cell viability is accompanied by modulation of the levels of p21, p27, cyclin D1, Bax, uPARP and modulation of caspase-3, Akt and PKC's pathways. Also, in animal murine models, it was demonstrated that genetic and pharmacological modulation of HO-1 reduces the rate of growth of tumors and the tumor load when wild type p53 is present. In addition, we observed that overexpression of HO-1 decreases migration and cell invasion. Altogether, this results show an antitumor role of HO-1 pointing to the importance of p53 status with its antitumor activiy.

La recirculación del potasio (K+ ) es un proceso indispensable para la audición, que tiene lugar en el órgano de Corti (OC). Ante la presencia de estímulos sonoros, el K+ ingresa a las células ciliadas, despolarizándolas. Luego, este ion es extruido de estas células, atravesando las células de soporte y la stria vascularis, desde donde es secretado nuevamente hacia la endolinfa. La salida de K+ de las células ciliadas externas (CCEs) es llevada a cabo fundamentalmente por el canal Kv7.4. Estos están formados por 4 subunidades iguales codificadas por el gen Kcnq4, que se disponen en forma de anillo y delimitan un poro en el centro a través del cual ocurre el paso selectivo de K + . La sordera DFNA2 es causada por mutaciones en Kv7.4. Esta enfermedad se desarrolla como una pérdida auditiva (PA) neurosensorial de herencia autosómica dominante que progresa con la edad, produciendo una sordera leve a moderada en las etapas iniciales, hasta alcanzar una sordera profunda que comienza alrededor de los 50 años en las frecuencias sonoras altas. En sus comienzos, la PA alcanza hasta 60 dB de intensidad, lo cual correlaciona con un mal funcionamiento de las CCEs. Luego, en la adultez, la sensibilidad auditiva disminuye aún más, indicando que otros mecanismos intervienen en la PA. Hasta el momento, no está claro cuáles son las consecuencias a nivel celular y molecular del mal funcionamiento o de la ausencia de los canales Kv7.4 en las células ciliadas. Además, los modelos animales empleados para el estudio de esta patología no han logrado ser útiles para descubrir los eventos que causan la PA avanzada. En esta tesis, se descifraron nuevos roles funcionales que cumplen los canales Kv7.4 en las CCEs y en el oído interno y se dilucidaron los mecanismos celulares y moleculares que subyacen a la degeneración celular en las dos etapas de la sordera. Como modelo de estudio de la enfermedad, se emplearon ratones de la cepa C3H que carecen de la expresión de los canales Kv7.4 (Kcnq4-/-). El capítulo I se enfocó en el análisis de la degeneración tisular en la cóclea de los animales Kcnq4-/-, cuyo alelo se expresó en la cepa murina C3H/HeJ. En primer lugar, analizamos si la expresión de los canales Kv7.4 en la cóclea de los ratones C3H WT y la funcionalidad del sistema auditivo era similar a la reportada para otras cepas. Mediante inmunofluorescencia (IF) y PCR cuantitativa (qPCR) se encontró que esta proteína se localiza en las CCEs del OC y su expresión es más intensa en el giro coclear basal (GCB). A través de la tecnología de super resolución del microscopio confocal, se pudo determinar que estas proteínas se localizan en la membrana plasmática del polo basal de las CCEs mientras que PRESTINA, la proteína motora de las CCEs, se sitúa en la membrana plasmática lateral. A nivel histológico y funcional, se notó que la cepa C3H conserva las células ciliadas y su función auditiva por lo menos, hasta el año de edad, lo cual permitió utilizarla para evaluar los mecanismos que intervienen en la sordera causada por ausencia de Kv7.4, excluyendo la influencia de la edad. En segundo lugar, se realizó la caracterización espacio-temporal de la supervivencia de las células ciliadas mediante citococleogramas y de las neuronas del ganglio espiral (NGEs) en ratones WT y Kcnq4 -/-. Se detectó que en los animales Kcnq4-/-, las CCEs degeneran progresivamente a lo largo de toda la cóclea, comenzando en el GCB a edades jóvenes, tan pronto como a las 3 semanas de edad (W). También se determinó la velocidad de degeneración de las CCEs en las distintas regiones cocleares. Esta es mucho mayor en el GCB y disminuye hacia el ganglio coclear apical (GCA), en correlación con el gradiente de expresión de Kv7.4. El análisis de supervivencia celular reveló que el número de las CCIs disminuye a partir de las 40 W, al igual que las NGEs. Si bien estas células degeneran 37 W más tarde, su velocidad de desaparición es más acelerada. Además, se evaluó la superficie de ambos tipos de células ciliadas a nivel ultraestructural, mediante microscopía electrónica de barrido. Al emplear esta técnica, se descubrieron diferentes alteraciones en los estereocilios de las mismas que podrían afectar la mecanotransducción y transducción de los sonidos, las principales funciones que realizan las CCEs y las células ciliadas internas (CCIs), respectivamente. Por otro lado, se descubrió que Kv7.4 podría contribuir con la compartimentalización de proteínas como PRESTINA. El capítulo II se centró en el estudio de los mecanismos de muerte celular que conducen a la pérdida de las células ciliadas y de las NGEs, en la estimación de la función auditiva de los ratones Kcnq4-/- de distintas edades y en determinar si la sobreestimulación de su sistema auditivo genera mayores daños en el OC. También se evaluó el efecto de una sobreestimulación del sistema auditivo de estos animales mediante un ensayo de trauma acústico. Empleando la técnica de IF, se analizó la vía autofágica y apoptótica. Como resultado, no se encontró activación de autofagia en la cóclea de los Kcnq4-/- jóvenes ni maduros, pero sí se detectó que la apoptosis es una vía activa en las CCEs a edades tempranas y en las NGEs a edades maduras, lo cual contribuye a explicar la disminución en la supervivencia de estas células. Mediante qPCR, se descubrió que los niveles de expresión del gen proapoptótico Bax se encuentran elevados, mientras que los del gen antiapoptótico Bcl-2 están disminuidos en la cóclea Kcnq4-/-. Este hallazgo permite inferir que la activación de la vía apoptótica intrínseca causa la muerte celular en el OC Kcnq4-/-. Para complementar el análisis histológico y evaluar la función auditiva de nuestro modelo animal Kcnq4-/- se realizaron dos ensayos: uno cualitativo y otro cuantitativo. El primero, consistió en la prueba del reflejo de Preyer, que permite estimar si un animal padece de sordera profunda. A través de este, se notó que a medida que progresa la edad, la cantidad de ratones Kcnq4 -/- que no responden al estímulo sonoro, se incrementa. Estos resultados indican que la sordera es progresiva con la edad en los animales Kcnq4 -/-. Las pruebas auditivas cuantitativas incluyeron el test de respuesta auditiva del tronco cerebral (ABRs) y el de emisiones otoacústicas producto de la distorsión (DPOAEs). Se determinó que la función auditiva de los Kcnq4-/- jóvenes está desmejorada ya que los umbrales auditivos aumentaron 20-40 dB en la región coclear de mayor sensibilidad. Además, el ensayo de DPOAEs mostró un aumento de 20 dB en el umbral. Estos datos indican que en etapas tempranas hay un funcionamiento defectuoso de las CCEs. La audición empeora aún más en los Kcnq4 -/- maduros, que mostraron umbrales auditivos mayores a 80 dB, señalando que estos padecen de sordera profunda, lo cual involucra no sólo un mal funcionamiento de las CCEs, sino también de los componentes de la vía auditiva aferente. A nivel histológico, los Kcnq4 -/- jóvenes únicamente mostraron degeneración de las CCEs en el GCB y defectos en los estereocilios de ambas células ciliadas. Mientras que, en los animales de mayor edad, la degeneración de las CCEs progresa afectando toda la longitud del OC, y la supervivencia de las CCIs y NGEs también disminuye en el GCB y ganglio coclear apical. Debido a que los resultados obtenidos a nivel tisular no lograron explicar completamente los obtenidos a nivel funcional, se realizó un análisis supraumbral de los registros de ABR. Este análisis permitió estudiar los mecanismos que intervienen en el procesamiento de la señal auditiva una vez que esta se transmite por la vía aferente, hacia el nervio auditivo. Se determinó que, a edades jóvenes, los ratones Kcnq4 -/- exhiben una reducción en la amplitud de los picos (P) P1, P2 y P5 para frecuencias medias y altas, lo cual revela alteraciones en la transmisión eléctrica de las señales sonoras en el giro coclear medio (GCM) y GCB. Como mecanismos de compensación ante la degeneración celular que ocurre en el OC, descubrimos que existe una hiperactividad a nivel del sistema nervioso central (SNC) para determinadas frecuencias sonoras. A edades maduras, también hallamos que las amplitudes de los distintos picos de la ABR están reducidas, pero a diferencia de lo notado en animales jóvenes, este decremento ocurre a lo largo de toda la cóclea y es generado por la disfunción y degeneración de las CCIs y NGEs. Para analizar la sensibilidad de la cóclea de los animales Kcnq4-/- frente a ruidos intensos, se llevó a cabo un ensayo de trauma acústico. Como resultado, se descubrió que, si bien la exposición a ruidos provocó degeneración y muerte celular de las CCEs por apoptosis en los ratones Kcnq4-/-, estos eventos no provocaron un daño mayor al ya existente debido a la ausencia de los canales Kv7.4. Los hallazgos presentados en esta tesis contribuyen a descifrar los eventos a nivel celular y molecular que intervienen en las distintas fases de la sordera causada por la ausencia de Kv7.4. En la etapa temprana (juvenil) hay una pérdida auditiva leve a moderada. De acuerdo a los mecanismos que se reportan aquí, esta etapa puede subdividirse en tres fases: una temprana, en la que ocurre la disfunción de las células ciliadas debido a despolarización, deslocalización de PRESTINA en las CCEs, y alteraciones en el haz de estereocilios; una intermedia, en la que se activa la vía apoptótica y una tardía, donde tiene lugar la muerte de las CCEs. Finalmente, en la segunda etapa de la PA, hay una sordera profunda producida por la degeneración de las CCIs y NGEs. Si bien existen modelos animales que portan mutaciones equivalentes a las encontradas en humanos, estos no han logrado explicar la PA avanzada. El empleo del ratón Kcnq4-/- nos ha permitido descubrir los eventos que tendrían lugar en ambas fases de la PA, y especialmente, en la segunda, los cuales eran desconocidos hasta el momento. Adicionalmente, estos resultados ayudan a comprender los eventos que subyacen otros tipos de PA que comparten una progresión similar a la sordera DFNA2 / Potassium (K+ ) recirculation is an indispensable process for the audition, which takes place in the organ of Corti (OC). In the presence of auditory stimuli, K+ enters the hair cells, depolarizing them. Then, this ion is extruded out from these cells, moving through the supporting cells and the stria vascularis, from where it is secreted again to the endolymph. K+ exit from the outer hair cells (OHCs) is carried out mainly by Kv7.4 channels. These proteins are formed by four equal subunits, which are codified by the Kcnq4 gene, and are arranged in a ring shape, delimiting a pore in the center through which occurs the selective entrance of K+ . DFNA2 deafness is caused by Kv7.4 mutations. This disease develops as a neurosensorial hearing loss (HL) and it inherits as an autosomal dominant disorder, which is progressive through age. It produces a mild to moderate HL in the initial stage until it reaches profound deafness which starts around 50-year-old in the high frequencies. In the beginning, HL reaches an intensity of 60 dB, which correlates with the inappropriate functioning of OHCs. Then, in adulthood, auditory sensitivity reduces, even more, indicating that other mechanisms develop in HL. So far, it is not clear which are the consequences at the cellular and molecular level of the malfunctioning or absence of the Kv7.4 channels in the hair cells. Additionally, the animal models used for the study of this pathology, are not useful to discover the events causing advanced HL. In this thesis, we deciphered new functional roles of Kv7.4 channels in the OHCs and the inner ear and we elucidated the molecular and cellular mechanisms underlying cell degeneration in the two phases of deafness. As an animal model for this disease, we use C3H mice lacking Kv7.4 expression (Kcnq4 -/-). Chapter I focused on the analysis of tissue degeneration in the cochlea of Kcnq4-/- animals, whose allele was expressed in the C3H/HeJ mouse strain. First, we studied if Kv7.4 channel expression in the WT mice and the auditory system function were similar to those reported in other strains. By using immunofluorescence (IF) and quantitative PCR (qPCR) we found that this protein is localized in the OHCs of the OC and its expression is more intense in the basal cochlear turn (BCT). Through the super-resolution technology of the confocal microscope, we determined that these proteins are localized in the plasma membrane of the OHC basal pole, while PRESTIN is situated in the lateral plasma membrane. At the functional and histological level, we discovered that the C3H strain preserves the hair cells and its auditory sensitivity for at least, to one-year-old. This allowed us its use to evaluate the mechanisms participating in the HL caused by Kv7.4 absence, excluding the age factor. Then, we performed the spatio-temporal characterization of the hair cell survival by cytococleograms. and of the spiral ganglion neuron (SGN) survival in WT and Kcnq4 -/- mice. We detected that in young Kcnq4-/- mice, OHCs degenerate progressively along the cochlea, starting at the BCT, as soon as 3-week-old (W). Moreover, we determined the speed of CCE degeneration in the different cochlear regions. This is greater in the BCT and it reduces towards the apical cochlear turn (ACT), correlating with the Kv7.4 gradient expression. The survival analysis revealed that the IHC number reduces from 40 W, in the same way as SGNs. Even though these cells degenerate 37 W later, their velocity of death is more accelerated. Moreover, we investigated the surface of both types of hair cells at the ultrastructural level, by scanning electron microscopy. By using this technique, we discovered different alterations in the hair cell stereocilia, which could affect the mechanotransduction and sound transduction, the main functions of these cells, respectively. On the other hand, we found that Kv7.4 channels may contribute to PRESTIN compartmentalization given that their absence produces its mislocalization. Chapter II focused on the study of the cellular death mechanisms leading to the loss of hair cells and SGNs; on the auditory function estimation of Kcnq4 -/- mice at different time points, and on determining if auditory overstimulation produces more damage in the OC. By IF, we analyzed the autophagic and apoptotic pathways. As a result, we did not find autophagy activation in Kcnq4-/- cochlea from young and middle-aged mice. However, we detected apoptosis activation in the OHCs from young mice and in the SGNs from middle- aged animals, which contributes to explaining their reduced survival. By qPCR, we discovered that the expression levels of the proapoptotic gene Bax are elevated, while those of the antiapoptotic gene Bcl-2 are reduced in the Kcnq4-/- cochlea. These findings allowed us to infer that the activation of the intrinsic apoptotic pathway causes cellular death in the Kcnq4-/- OC. To complement the histological analysis and to evaluate the auditory function in our animal model, we used two tests, one qualitative and the other quantitative. The first one consisted of Preyer’s reflex test, which allowed us to estimate if an animal suffers from profound HL. Through this, we found that as age progresses, the amount of Kcnq4 -/- mice that do not respond to the stimulus, increases. These results indicate that HL is progressive with age in the Kcnq4 -/- animals. The quantitative auditory tests include the auditory brainstem response (ABR) and the distortion product otoacoustic emissions (DPOAEs). By using these tests, we discovered that auditory sensitivity is impaired in the young Kcnq4 -/- mice given that auditory thresholds elevate 20-40 dB in the most sensitive cochlear region. This data indicates that since young ages there is an altered function of CCEs. The audition impairs even more in the middle-aged mice, which showed auditory thresholds greater than 80 dB, indicating that these animals suffer from profound deafness. This involves not only the malfunction of OHCs but also of the afferent auditory pathway components. At the histological level, young Kcnq4-/- mice showed OHC degeneration in the BCT and stereocilia defects in both types of hair cells. While in the older animals, OHC degeneration progresses affecting the whole length of OC, and the IHC and SGN survival also is reduced in the BCT and ACT. Due to the results obtained at the tissue level not explain completely those obtained at the functional level, we performed a suprathreshold analysis of ABR registers. This analysis allowed us to study the mechanisms involved in the auditory signal processing once this one is transmitted through the afferent pathway to the auditory nerve. We determined that in young Kcnq4 -/- mice, the amplitudes of P1, P2, and P5 are reduced for the middle and high frequencies, revealing alterations in the electric transmission of sound signals in the middle cochlear turn and the BCT. As a mechanism of compensation before the cellular degeneration in the OC, we discovered that there is hyperactivity at the central nervous system level (CNS) for certain sound frequencies. In the middle-aged animals, we noticed that ABR peak amplitudes are also reduced, but differently respecting young animals. The amplitude diminishment was detected along the whole cochlea and is generated by IHC and SGN degeneration and dysfunction. To analyze the auditory sensitivity in the Kcnq4 -/- cochlea to loud noises, we carried out an experiment of acoustic trauma. As a result, we discovered that even though the noise exposure triggered OHC death by apoptosis in the Kcnq4 -/- mice, these events did not generate greater damage than the existing ones due to the lack of Kv7.4. The findings presented in this thesis contribute to deciphering the cellular and molecular events involved in the different phases of deafness caused by Kv7.4 absence. In the early phase, there is a mild to moderate HL. According to the mechanisms reported in this work, this phase can be divided into three phases: early, in which occurs hair cell dysfunction due to its depolarization, PRESTIN mislocalization, and stereocilia alterations; intermediate, in which apoptosis is activated, and late, where CCEs dye. Finally, in the second phase of HL, there is a profound deafness caused by IHC and SGN degeneration. Although there are different animal models carrying human equivalent mutations, these animals did not be able to explain the advanced HL. The use of Kcnq4 -/- mice allowed us to discover the events taking part in both phases of DFNA2 and especially in the second one, which were unknown so far. Additionally, these findings help to understand the mechanisms underlying other types of HL, which share a similar progression with DFNA2 deafness

Los ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga (LC-PUFAs) son nutrientes esenciales altamente demandados por las industrias acuícola, nutracéutica y alimentaria. Actualmente, el principal recurso que abastece de LC-PUFAs a la industria es el aceite de pescado. Sin embargo, las diversas problemáticas asociadas a su producción hacen necesaria la búsqueda de recursos alternativos. Ciertas microalgas marinas producen naturalmente estos compuestos por lo que surgen como una fuente alternativa prometedora de LC-PUFAs. Además, su síntesis puede modificarse manipulando las condiciones de crecimiento y, frente a condiciones de baja temperatura, ciertas especies responden sintetizando aún más LC-PUFAs. Sobre la base de estos antecedentes, el objetivo de esta Tesis fue aislar microalgas nativas del estuario de Bahía Blanca y desarrollar estrategias de cultivo que involucren el estrés por baja temperatura. Se plantearon como objetivos específicos aislar potenciales especies productoras de PUFAs e identificarlas morfológica y molecularmente; caracterizar su crecimiento a escala de laboratorio; cultivarlas en fotobiorreactor bajo condiciones óptimas y estresantes en términos de temperatura determinando su efecto sobre parámetros de crecimiento, producción de biomasa y cantidad, calidad y producción lipídica, con especial énfasis en LC-PUFAs, y de otros compuestos de alto valor como esteroles, pigmentos y/o proteínas. De las tres especies de diatomeas aisladas, se seleccionó a Cylindrotheca closterium por presentar los mejores resultados en cuanto crecimiento y producción de biomasa. Se corroboró la identidad de la cepa mediante análisis del gen cloroplástico rcbl. Se realizaron cultivos en fotobiorreactor de C. closterium a 20°C (control), y disminuyendo abruptamente la temperatura a 10oC durante la fase exponencial de crecimiento (EBTEx) y la fase estacionaria de crecimiento (EBTEs). La condición EBTEs, fue la estrategia de cultivo más adecuada para incrementar la producción de biomasa, lípidos y LC-PUFAs esenciales, particularmente en términos de ácidos eicosapentaenoico (EPA) y araquidónico (ARA). A su vez, la presencia de esteroles y aminoácidos esenciales para organismos acuáticos revelaron el valor de la biomasa para su posible uso en acuicultura. Por otra parte, otra especie aislada fue identificada como Pavlova gyrans (Haptophyta) a partir de sus características morfológicas y estudios moleculares en base al gen nuclear 18s rARN. P. gyrans mostró ser robusta para el crecimiento bajo las condiciones empleadas en el laboratorio. Se ensayaron cultivos en fotobiorreactor a una temperatura óptima (20oC) y bajo EBTEs. Ésta última condición demostró ser efectiva para incrementar la producción de biomasa y LC-PUFAs, particularmente los ácidos grasos EPA y docosapentaenoico (DPA). Además, la presencia de fitoesteroles y pigmentos otorgaron aún más valor a la biomasa. Finalmente, se analizó la calidad de los lípidos teniendo en cuenta indicadores de calidad nutricional de los mismos. P. gyrans mostró valores similares a los reportados para diferentes aceites de pescado por lo que puede considerarse una especie para uso alimentario. En conjunto, estos resultados evidencian el potencial de las cepas nativas C. closterium y P. gyrans como una posible fuente alternativa de LC-PUFAs. / Long-chain polyunsaturated fatty acids (LC-PUFA) are essential nutrients highly demanded by aquaculture, nutraceutical and food industries. Currently, the main source that supplies LC-PUFAs to the industry is fish oil. However, various problems associated with its production make it necessary to search for alternative resources. Certain marine microalgae naturally produce these compounds, emerging as promising alternative sources of LC-PUFA. Furthermore, its synthesis can be modify by manipulating their growth conditions and faced with low temperature conditions, certain species respond by synthesizing even more LC-PUFA. Based on this background, the objective of this Thesis was to isolate native microalgae from the Bahía Blanca Estuary and develop culture strategies involving low temperature stress. The specific objectives were to isolate possible PUFA- producing species and identify them morphologically and molecularly; characterize their growth on a laboratory scale; cultivate them in a photobioreactor under optimal and stressful conditions in terms of temperature, determining their effect on growth parameters, biomass production and quantity, quality and lipid production, with special emphasis on LC-PUFA, and other high-value compounds such as sterols, pigments and/or proteins. Of the three isolated diatom species, a Cylindrotheca closterium was selected as it showed the best results in terms of growth and biomass production. The identity of the strain was confirmed by analysis of the rcbl chloroplast gene. C. closterium cultures were performed in a photobioreactor at 20°C (control), and the temperature was abruptly decreased to 10oC during the exponential growth phase (EBTEx) and the stationary growth phase (EBTEs). The EBTEs condition was the most suitable culture strategy to increase the production of biomass, lipids and LC-PUFAs, particularly in terms of eicosapentaenoic (EPA) and arachidonic (ARA) acids. In turn, the presence of sterols and essential amino acids for aquatic organisms revealed the value of the biomass for its possible use in aquaculture. On the other hand, another isolated species was identified as Pavlova gyrans (Haptophyta) based on its morphological characteristics and molecular studies based on the nuclear 18s rRNA gene. P. gyrans was shown to be robust for growth under laboratory conditions. Cultures were also performed in a photobioreactor at optimal temperature (20oC) and under EBTEs. This last condition proved to be effective in increasing the production of biomass and LC-PUFAs, particularly EPA and docosapentaenoic (DPA) fatty acids. In addition, the presence of phytosterols and pigments added even more value to the biomass. Finally, lipids were analyzed taking into account indicators of nutritional quality. P. gyrans showed similar values to those reported for different fish oils, so it can be considered a species for food use. Taken together, these results show the potential of two native strains, C. closterium and P. gyrans, as alternative sources of LC-PUFAs.

El péptido relacionado a la hormona paratiroidea (PTHrP) está involucrado en la iniciación y progresión de distintos tumores. El rol de PTHrP en células de cáncer colorrectal (CCR) fue abordado en estos últimos años por las Dras. Gentili y Calvo directora y co-directora, respectivamente, de esta Tesis y a partir de los antecedentes generados, en este Trabajo se propuso investigar los efectos de PTHrP en la angiogénesis y la transición epitelio- mesénquima (TEM) evaluando el comportamiento de las células tumorales y también su comunicación con su microambiente. Los resultados obtenidos revelan que PTHrP aumenta la expresión de los factores pro-angiogénicos VEGF, HIF-1α, MMP-7 y MMP-9 en las células Caco-2 y HCT116 de CCR y promueve la angiogénesis asociada al tumor a través de VEGF. Estos efectos son mediados por las vías PI3K/Akt y ERK1/2. Previo al inicio de este Trabajo de Tesis se había confirmado que PTHrP induce la activación de β-catenina en estas células de CCR, evento vinculado a la plasticidad celular, por lo que se procedió seguidamente a explorar si PTHrP modula el programa de la TEM. Se observó que en las células HCT116, PTHrP disminuye la expresión de los marcadores epiteliales CK-18 y E- cadherina y aumenta la expresión de N-cadherina y ZEB-1, proteínas asociadas a un estado mesenquimal. Además el péptido favorece cambios morfológicos asociados a este estado. El medio condicionado proveniente de las células endoteliales HMEC-1 tratadas con PTHrP (MCE) disminuye la expresión de E-cadherina en las células HCT116 y favorece también un fenotipo mesenquimal sugiriendo que estos MCEs podrían participar de la TEM en las células de CCR. En este Trabajo de Tesis se halló que PTHrP modula la expresión de SPARC, una proteína asociada al fenotipo agresivo de CCR, en las células HCT116. El tratamiento de las células HMEC-1 con PTHrP incrementa la expresión de esta proteína y su secreción al medio extracelular. Además, SPARC exógeno en las células tumorales acentúa el efecto de PTHrP en la disminución de la expresión de E-cadherina y en el incremento de la migración celular. También PTHrP induce cambios en la expresión de microARNs relevantes en la TEM. El péptido administrado a un modelo in vivo promueve cambios morfológicos y moleculares que validan lo observado in vitro. Finalmente mediante un análisis bioinformático en muestras de pacientes con CCR se observó que los marcadores modulados por PTHrP tanto in vitro como in vivo se vinculan con la progresión de la enfermedad. Los datos presentados en esta Tesis revelan los efectos de PTHrP en la modulación de la angiogénesis y la TEM del CCR y evidencian la importancia de los marcadores estudiados, provenientes del tumor y de su microambiente, en el desarrollo del fenotipo agresivo en los modelos experimentales de CCR empleados. Este trabajo se enmarca dentro de un proyecto global que pretende aportar conocimientos con el fin de orientar en la identificación de marcadores en muestras de pacientes de CCR con potencial valor pronóstico, predictivo y/o con aplicabilidad en el diagnóstico precoz de esta enfermedad. / Parathyroid hormone-related peptide (PTHrP) is involved in the initiation and progression of different tumors. The role of PTHrP in cells from colorectal cancer (CRC) has been addressed in the last years by Dr. Gentili and by Dr. Natalia Calvo director and co-director, respectively, of this Thesis and based on the background information generated, this Thesis work aimed to investigate the effects of PTHrP on angiogenesis and the epithelial- mesenchymal transition (EMT), evaluating the behavior of tumor cells and also their communication with tumor microenvironment. The results obtained reveal that PTHrP increases the expression of the pro-angiogenic factors VEGF, HIF-1α, MMP-7 and MMP-9 in Caco-2 and HCT116 cells from CRC and also promotes tumor-associated angiogenesis through VEGF. These effects are mediated by PI3K/Akt and ERK1/2 pathways. Before to start this Thesis, it had been confirmed that PTHrP induces the activation of β-catenin in these CRC cells, and since this event is linked to cell plasticity, then we explored whether PTHrP modulates the EMT program. We observed that in HCT116 cells, PTHrP decreases the expression of the epithelial markers CK-18 and E-cadherin and increases the expression of N-cadherin and ZEB-1, which are proteins associated with a mesenchymal state. In addition, the peptide favors morphological changes associated with this state. Conditioned medium from PTHrP-treated HMEC-1 endothelial cells (ECM) decreases E- cadherin expression in HCT116 cells and favors a mesenchymal phenotype, suggesting that these ECMs could participate in the EMT in CRC cells. In this Thesis Work it was found that in HCT116 cells PTHrP modulates the expression of SPARC, a protein associated with CRC aggressive phenotype. The treatment of HMEC-1 cells with PTHrP increases the expression of this protein and its secretion to the extracellular medium. Furthermore, exogenous SPARC treatment on tumor cells accentuates PTHrP effect on the downregulation of E-cadherin expression and in the increment of cell migration. PTHrP also induces changes in the expression of relevant microRNAs in EMT. The peptide administered to an in vivo model promotes morphological and molecular changes that validate the findings obtained in vitro. Finally, through a bioinformatic analysis in samples from CRC patients, we observed that the markers modulated by PTHrP both in vitro as in vivo are linked to the progression of the disease. The data showed in this Thesis reveal the effects of PTHrP in the modulation of the angiogenesis and EMT program of CRC and show the importance of the studied markers from the tumor and its microenvironment in development of the aggressive phenotype in the experimental models of CRC employed. This work is part of a global project that aims to provide knowledge to help in the identification of markers in samples from CRC patients as potential candidates to be used in the detection of CRC at early stages and/or with prognostic/predictive value of this disease.

Los estuarios son cuerpos de agua que conectan la tierra con el océano, y se extienden desde las condiciones puramente marítimas hacia sectores donde el agua marina es diluida por flujos de agua dulce. Estos sistemas proveen de varios servicios ecosistémicos, aunque en las últimas décadas, los estuarios han recibido diversas alteraciones humanas (polos industriales, asentamientos urbanos, puertos, entre otros), que ingresan elementos contaminantes al sistema, como los metales. El cangrejo cavador, Neohelice granulata, es una especie clave de estos ecosistemas porque produce bioturbación, contribuyendo a la oxigenación de los sedimentos, así como a los cambios en la mineralización y biodisponibilidad de la materia orgánica. A su vez, esta especie posee diversas características (primeros eslabones de las redes tróficas, poseer escasa movilidad y fácil crianza en laboratorio, otras) que la configuran en un buen biomonitor de sistemas costeros, específicamente en las costas del Océano Atlántico Sudoccidental, donde se distribuyen sus poblaciones. En la presente tesis se evaluaron las concentraciones espacio-temporales de metales (Cd, Cu, Zn, Pb, Ni, Mn, Cr, Fe) en sedimentos finos y en el hepatopáncreas de N. granulata, un organismo biomonitor representativo del estuario de Bahía Blanca (EBB), en tres sitios (PC, PR, VM) con distinto impaco antrópico. Además, se analizaron las metalotioneínas (MT) como indicadores de alerta temprano (IAT) del impacto por metales y se evaluó la la posibilidad de aplicar otros indicadores bioquímicos como potenciales IAT de este sistema: catalasa (CAT), glutatión–S–transferasa (GST), peroxidación lipídica (LPO) a través de TBARS, peróxido de hidrógeno (H2O2) y glutatión reducatasa (GR). Se identificó la actividad de los parámetros hidrológicos que caracterizan este estuario (temperatura, salinidad, pH) como reguladores de la síntesis de estos IAT en el organismo estudiado. Finalmente se evaluó la recuperación de los distintos IAT seleccionados en la misma especie luego de ser sometidos a una fase de depuración; y se analizó la presencia de gránulos ricos en metales (GRM) como estrategia de reserva y/o de detoxificación de metales. A partir de los resultados obtenidos se pudo concluir que I) Las diferencias temporales en las concentraciones de algunos metales en los sedimentos (Cu, Pb, Cr) pueden resultar dependientes de la mayor actividad biológica de organismos bioturbadores. Las divergencias espaciales pueden deberse a una mayor actividad humana y a las características hidrodinámicas que gobiernan el transporte de partículas y metales asociados; II) N. granulata resultó ser un buen biomonitor del impacto por metales en los sedimentos con mayor bioacumulación de metales esenciales (Cu y Zn); III) Las MT no resultaron buenos biomarcadores bioquímicos de este proceso, y presentaron una función como primera línea de defensa antioxidante, ya que se correlacionaron con la mayoría de los biomarcadores de estrés oxidativo; IV) La actividad de los IAT se encuentra estrechamente asociada a la actividad estacional de los cangrejos y a la acumulación de metales a modo de reservas energéticas; y V) El proceso de depuración de metales en N. granulata resultó especie- específico, variable y dependiente de la tolerancia ambiental de las poblaciones que habitaban en los sitios estudiados. / Estuaries are water bodies that connect the land with the ocean and extend from purely maritime conditions to sectors where freshwater flows dilute seawater. These systems provide various ecosystem services, although, in recent decades, estuaries have received various human alterations (industrial and urban settlements, ports, among others), which input anthropic elements into the system, such as metals. The burrowing crab, Neohelice granulata, is a key species within these ecosystems because it produces bioturbation, contributing to the oxygenation of the sediments and changes in both the mineralization and bioavailability of organic matter. In turn, this species has several characteristics (bottom of the food webs, low mobility and easy breeding in the laboratory, others) that make it a good biomonitor of coastal systems, specifically on the coasts of the Southwest Atlantic Ocean where its populations are widely distributed. In the present thesis, the spatio-temporal concentrations of metals (Cd, Cu, Zn, Pb, Ni, Mn, Cr, Fe) were evaluated in fine sediments and the hepatopancreas of N. granulata, a representative biomonitoring species of the Bahia Blanca estuary (BBE), in three sites (PC, PR, VM) with different human impacts. In addition, metallothioneins (MT) were analyzed as early warning signals (EWS) of metal pollution and the possibility of applying other biochemical indicators as potential EWS of this ecosystem was also evaluated: catalase (CAT), glutathione-S-transferase (GST), lipid peroxidation (LPO) through TBARS, hydrogen peroxide (H2O2) and glutathione reductase (GR). The activity of the hydrological parameters that characterize this estuary (temperature, salinity, pH) was identified as regulators of the synthesis of these EWS in the chosen organism. Finally, the recovery of the different selected EWS in the same species was evaluated after being subjected to a depuration experiment; and the presence of metal-rich granules (GRM) was examined as a reserve and/or metal detoxification strategy. From the results obtained, it was possible to conclude that I) Temporal differences in the concentrations of some metals (Cu, Pb, Cr) may depend on bioturbating organisms' greater biological activity. Spatial divergences may be due to increased human activity and hydrodynamic characteristics that govern the transport of particles and associated metals; II) N. granulata was a good biomonitor of metal pollution in sediments with greater bioaccumulation of essential metals (Cu and Zn); III) MTs were not suitable biochemical biomarkers of metal pollution and presented a function as the first line of antioxidant defence since they correlated with most oxidative stress biomarkers; IV) EWS activity was closely associated with the seasonal activity of crabs and the accumulation of metals as energy reserves; and V) The metal depuration process in N. granulata was species-specific, variable and dependent on the environmental tolerance of the populations that inhabit the studied sites.