Objetivos • Caracterización cinética de la oxidación de diversas fenotiazinas comerciales, catalizada por lacasa, mediante un método espectrofotométrico, útil para posibles ensayos de gestión de la calidad en industrias farmacéuticas. • Desarrollo de un método espectrofotométrico apropiado, para la caracterización cinética de sustratos fenólicos de lacasa, que originan productos cromofóricos inestables. • Optimización de la biodegradación enzimática de clorofenoles recalcitrantes como TCP y PCP, con peróxido de hidrógeno y peroxidasa sin mediadores sintéticos. • Optimización de la biodegradación enzimática de TCP por oxígeno molecular, catalizada por lacasa en presencia de mediadores naturales, sin mediadores sintéticos ni peróxido de hidrógeno. • Determinación enzimática y espectrofotométrica de tioles, y aplicación a ensayos de gestión de la calidad de fármacos tiólicos, superando a otros métodos instrumentales alternativos. • Análisis cuantitativo de ácido ascórbico, en muestras sintéticas y en fármacos, utilizando un nuevo método enzimático y espectrofotométrico, capaz de superar a otros métodos ópticos y electroquímicos. Metodología Ensayos espectrofotométricos Los espectros de absorción fueron registrados con un espectrofotómetro de visible-ultra violeta Perkin-Elmer Lambda 35, otros datos cinéticos o de punto final en la zona del visible fueron obtenidos mediante un lector de microplaca SpectraMax 340PC384. Ensayos de cromatografía líquida líquida de alta resolución (HPLC) Los cromatogramas realizados se llevaron a cabo con un cromatógrafo HPLC Agilent 1200 Rapid Resolution. Las especies eluídas fueron monitorizadas a diferentes longitudes de onda, tomando el máximo de absorción para cada una de ellas. Ensayos de cromatografía de gases acoplada a detector de espectrometría de masas (GC-MS) Los espectros de masas fueron realizados con un espectrómetro de masas Agilent 5975 acoplado a un cromatógrafo de gases Agilent 7890N. Ensayos espectrofluorométricos Los espectro de fluorescencia fueron registrados con un lector de placas fluorescente GeminiTM XPS. Ensayos oximétricos Las medidas de evolución de consumo de oxígeno fueron medidas con un electro de tipo Clark acoplado a un oxígrafo Hansatech. Caracterización cinética de fenotiazinas y sustratos fenólicos La oxidación de diferentes fenotiazinas y sustratos fenólicos por lacasa procedente de Trametes villosa (TvL), fue seguida por la absorbancia de cada uno de los cationes radical cromofóricos. Parámetros cinéticos como la absorbancia máxima (Amax), o su cuadrado (Amax2) y la velocidad en estado estacionario VSS fueron determinados. Biodegradación enzimática de clorofenoles La biodegradación de contaminantes clorados fue llevada a cabo por dos tipos de enzimas, lacasa (TvL) como enzima principal de estudio, y peroxidasas de sofá y rábano (SBP y HRP, respectivamente), con el fin de contrastar los rendimientos de biodegradación del 2,4,6-triclorofenol y del pentaclorofenol (PCP). Conclusiones • Se ha caracterizado cinéticamente la oxidación de varias fenotiazinas comerciales por lacasa, comprobando los efectos de diversas variables experimentales, sobre la formación enzimática y la destrucción no enzimática, de sus correspondientes radicales cromofóricos. • Se ha conseguido desarrollar un método espectrofotométrico simple, fiable y eficaz para la caracterización cinética de sustratos fenólicos de lacasa que originan productos cromofóricos inestables, superando los inconvenientes de los métodos espectrofotométricos de velocidad inicial. • El uso de peróxido de hidrógeno con peroxidasas de rábano picante (HRP) y de soja (SBP), ha demostrado ser una buena alternativa para la biodegradación enzimática de clorofenoles recalcitrantes, como TCP y PCP. • Se ha conseguido optimizar el proceso, ofreciendo un método rápido, eficaz, sin peróxido de hidrógeno, y medioambientalmente sostenible, superando a otros métodos que utilizan mediadores sintéticos, con alto coste y toxicidad. • La elevada reproducibilidad de los métodos enzimáticos con lacasa para la determinación de tioles y de ácido ascórbico, ha indicado una satisfactoria precisión de los mismos. • La validez de los métodos enzimáticos con lacasa respecto a métodos de referencia, para la determinación de D-penicilamina o de ácido ascórbico en fármacos, ilustra su aplicabilidad para el análisis de muestras reales, especialmente de principios activos reductores como tioles y ácido ascórbico. En consecuencia, se han alcanzado satisfactoriamente, los objetivos propuestos al comienzo de esta Tesis Doctoral. / Objectives • Kinetic characterization of the oxidation of several commercial phenothiazines catalyzed by laccase, using a spectrophotometric assay, useful for quality management assays in pharmaceutical industries. • Development of an appropriate spectrophotometric assay, for the kinetic characterization of phenolic substrates, which produce unstable chromophoric products. • Optimization of the enzymatic biodegradation of recalcitrant chlorophenols like TCP and PCP, with hydrogen peroxide and peroxidase in the absence of synthetic mediators. • Optimization of the enzymatic biodegradation of TCP by molecular oxygen, catalysed by laccase in the presence of natural mediators, and without synthetic mediators neither hydrogen peroxide. • Enzymatic and spectrophotometric determination of thiols, and application in quality management assays of thiolic drugs, with improved performance than other instrumental alternative assays. • Quantitative analysis of ascorbic acid, in synthetic samples and drugs, using a new enzymatic and spectrophotometric assay, that offer better specifications than other optical and electrochemical assays. Methodology Spectrophotometric assays Absorption spectra were recorded in a visible-ultraviolet Perkin-Elmer Lambda 35 spectrophotometer and other data adquisition in endpoint or kinetic were recorded with an absorbance microplate reader SpectraMax 340PC384. Liquid chromatography Chromatograms were realized with an HPLC Agilent 1200 Rapid Resolution chromatograph. The monitoring of the eluted species was performed at different wavelengths, taking the maximum absorbance wavelengths of the different substances. Gas chromatography/Mass spectrometry Mass spectra were realized with a Mass spectrometer Agilent 5975 coupled to a gases chromatograph Agilent 7890N. Spectrofluorometric assays Fluorescence spectra were recorded in a fluorescence microplate reader GeminiTM XPS. Oxymetric assays Oxygen evolution was measured with a Clark-type electrode coupled to a Hansatech Oxygraph. Kinetic characterization of phenothiazines and phenolic substrates The oxidation of different phenothiazines and phenolic substrates by laccase from Trametes villosa (TvL), was monitored recording the absorbance of each chromophoric radical cation. Kinetic parameters as maximum absorbance (Amax), maximum square absorbance (Amax2) and the steady-state rate VSS were determined. Enzymatic biodegration of chlorophenols The biodegradation of chlorophenolic pollutants were carried out with two kind of enzymes, laccase (TvL) as the main research one, and peroxidase (SBP and HRP) to constrast the biodegradation yields of 2,4,6-trichlorophenol (TCP) and pentachlorophenol (PCP). Conclusions • The oxidation of several commercial phenothiazines with laccase has been kinetically characterized, checking the effects of many experimental variables, on the enzymatic formation and non-enzymatic breakdown, of their corresponding chromophoric radicals. • A simple, reliable and effective spectrophotometric method has been developed, for the kinetic characterization of phenolic substrates of laccase that generate unstable chromophoric products, overcoming the drawbacks of the spectrophotometric methods of the initial rate. • The use of hydrogen peroxide with horseradish peroxidase (HRP) and soybean peroxidase (SBP), has demonstrated to be a great alternative for the enzymatic biodegradation of recalcitrant chlorophenols, like TCP and TCP. • The process has been optimized, offering a method that is fast, effective, without hydrogen peroxide, and environmentally sustainable, overcoming other methods that use synthetic mediators, with high cost and toxicity. • The high reproducibility of the enzymatic methods with laccase to determine thiols and ascorbic acid, has shown a successful precision of these methods. • The validity of the enzymatic methods with laccase with respect to reference methods, for the determination of D-penicillamine or ascorbic acid in drugs, show their applicability to analyse real samples, especially reductant active ingredients like thiols and ascorbic acid. In consequence, the proposed objectives at the beginning of this Doctoral Thesis have been successfully reached.

Las poliaminas son pequeñas moléculas con carga positiva esenciales para los procesos de crecimiento, proliferación, diferenciación y apoptosis celular. En mamíferos, los niveles intracelulares de poliaminas están altamente regulados a través de distintos mecanismos, como su biosíntesis, degradación y transporte a través de la membrana plasmática. La regulación post-traduccional de ornitina descarboxilasa (ODC), enzima clave de la ruta biosintética, está principalmente mediada por la acción de una familia de proteínas denominadas antizimas (AZs), cuya síntesis se estimula cuando los niveles de poliaminas son elevados. Las AZs se unen y inhiben ODC, e inducen su degradación proteasomal sin ubiquitinación. Además, las AZs inhiben la captación de poliaminas extracelulares, probablemente por interaccionar con el transportador de poliaminas. Además de las AZs, la actividad ODC está también indirectamente regulada por una familia de proteínas denominadas inhibidores de antizimas (AZINs). Estas proteínas, homólogas a ODC pero sin actividad enzimática, también interaccionan con las AZs, incluso de manera más eficiente que ODC, contrarrestando los efectos de las AZs sobre ODC. En mamíferos, la familia de los AZINs está compuesta por dos miembros: AZIN1 y AZIN2. Mientras que AZIN1 es una proteína de expresión ubicua que regula los niveles intracelulares de poliaminas y el crecimiento celular, AZIN2 se expresa mayoritariamente en testículo y cerebro, y su función fisiológica es menos conocida. El presente trabajo se ha centrado en el estudio de la expresión del gen Azin2 en tejidos de ratón, así como en profundizar en el conocimiento de diferentes aspectos funcionales y estructurales de AZIN2, proteína caracterizada por primera vez en nuestro laboratorio, comparando los mismos con los de sus proteínas homólogas ODC y AZIN1. Los objetivos del trabajo planteados, relacionados con la expresión, estructura, y función de AZIN2, fueron los siguientes: 1) Estudio de la expresión de AZIN2 y proteínas homólogas, así como la de las AZs en diferentes tejidos de ratón adulto mediante RT-PCR a tiempo real; 2) expresión de AZIN2 en testículo de rata y en testículos de ratones con alteraciones en la espermatogénesis; 3) influencia de AZIN2 y proteínas relacionadas con el metabolismo de poliaminas sobre el transporte de agmatina e influencia sobre el mismo de compuestos amino-guanidinios; 4) predicción de la estructura tridimensional de AZIN2 mediante modelado comparativo por homología, y estudio de la estructura cuaternaria de AZIN2 en células de mamífero; 5) análisis de la zona de unión a AZs (AZBE) en AZIN2 y sus parálogos, e influencia de los residuos conservados en las propiedades de las proteínas; 6) estudio de la vida media de AZIN2 y sus parálogos en células de mamífero, y de su posible mecanismo de degradación. En general, la metodología utilizada para la realización de este trabajo puede describirse como una combinación de técnicas de bioquímicas y de biología molecular, análisis de expresión génica mediante RT-PCR a tiempo real y aproximaciones computacionales. Además, se utilizaron tanto líneas celulares, principalmente para los experimentos de transfección, como animales de laboratorio. En particular, se realizaron tratamientos específicos para la destrucción de células germinales haploides del testículo. Las conclusiones obtenidas del trabajo experimental son las siguientes: 1. El análisis mediante RT-PCR a tiempo real mostró que, además de cerebro y testículo, AZIN2 se expresa de manera significativa en otros tejidos de ratón adulto como epidídimo, glándula adrenal, páncreas, corazón y pulmón, mientras que su expresión en diversas líneas celulares humanas de origen tumoral fue prácticamente indetectable. 2. Diversos modelos experimentales corroboran que en el testículo murino la gran mayoría del ARNm de AZIN2 se encuentra localizado en las células germinales haploides, descartando una expresión significativa en otros tipos celulares testiculares como las células intersticiales. 3. El patrón de expresión postnatal de AZIN2 y AZ3 en el testículo de rata es similar al encontrado en ratón, sugiriendo que estas proteínas también podrían estar participando en el proceso de espermiogénesis en esta especie. 4. La sobreexpresión de ODC o AZIN2 estimula la entrada de agmatina a las células COS7, mientras que las AZs la inhiben. En condiciones basales, dicho transporte, a concentraciones próximas a las fisiológicas, parece tener lugar a través del transportador general de poliaminas. 5. La estructura tridimensional de AZIN2, deducida mediante modelado comparativo, es similar a la descrita para sus parálogos ODC y AZIN1 en lo referente a los dominios barril / y hoja plegada , aunque difiere en regiones menos conservadas como ciertos bucles y las regiones N- y C-terminal. 6. A diferencia de ODC, AZIN2 es incapaz de formar homodímeros o a heterodimerizar con monómeros de ODC, aunque comparte con esta proteína la capacidad para interaccionar con las tres antizimas conocidas. 7. El análisis comparativo de la secuencia de la región AZBE en los diferentes ortólogos de AZIN2 y los de sus parálogos AZIN1 y ODC reveló la existencia de cinco residuos conservados (K116, A124, E139, L140 y K142 en la secuencia de AZIN2 de ratón). 8. Mientras que las mutaciones simples de cada uno de estos residuos en AZIN2 apenas afectaron la interacción de esta proteína con las AZs, las mutaciones dobles o triples de algunos de ellos anularon la capacidad de AZIN2 para interaccionar con las AZs, de manera independiente de la repercusión de dichas mutaciones sobre la carga eléctrica neta del elemento AZBE. 9. Los residuos conservados en la secuencia AZBE de ODC parecen ser muy importantes para la función de la enzima, ya que todas las mutaciones simples de los mismos, con la excepción de A123, disminuyeron notablemente la actividad catalítica de la enzima. 10. Los residuos E138 y L139 son críticos para la funcionalidad de ODC, ya que su sustitución por alaninas disminuye grandemente la homodimerización de la proteína, produciendo además la del segundo un gran aumento en su estabilidad por anular su interacción con AZ1. 11. En células transfectadas, AZIN2 es una proteína más lábil que ODC, mostrando una vida media de aproximadamente 90 minutos, y que a diferencia con ODC se estabiliza grandemente al interaccionar con las antizimas. 12. A diferencia con lo observado para ODC y AZIN1, la inhibición de la maquinaria proteasomal con lactacistina o MG132 produce una marcada disminución de la proteína AZIN2, sugiriendo que su degradación pudiera estar mediada por una vía alternativa a la del proteasoma 26S. / Polyamines are small cationic molecules essential for cell growth, proliferation, differentiation and apoptosis. In mammals, the intracellular polyamine levels are tightly controlled by the regulation of different processes including their biosynthesis, degradation and transport across the plasma membrane. Post-translational regulation of ornithine decarboxylase (ODC), the key biosynthetic enzyme, is mainly mediated by the action of a family of small proteins named antizymes (AZs), whose synthesis is stimulated by high polyamine levels. AZs bind and inhibit ODC and target it to proteasomal degradation. Furthermore, AZs inhibit extracellular polyamine uptake presumably by interacting with the polyamine transport system. In addition to AZs, the ODC activity is also indirectly regulated by a family of proteins named antizyme inhibitors (AZINs). These proteins, closely related to ODC but without enzymatic activity, also interact with antizymes, even more efficiently than ODC, counteracting the effects of antizymes on ODC. In mammals, the AZIN family is formed by two members: AZIN1 and AZIN2. Whereas AZIN1 is a ubiquitous protein that regulates intracellular polyamine levels and cell growth, AZIN2 is mainly expressed in testis and brain and its physiological role is mostly unknown. In this work we have focused on the study of the expression of the Azin2 gene in mouse tissues and the determination of different functional and structural aspects of AZIN2, protein first characterized in our laboratory, comparing the results with those of the homologous proteins ODC and AZIN1. The specific aims of this work were: 1) To determine the expression pattern of AZIN2 and homologous proteins, as well as those of AZs, in different adult mouse tissues by real-time RT-PCR; 2) to elucidate the AZIN2 expression in rat normal testes and in mouse testes with impaired spermatogenesis; 3) to analyse the effect of AZIN2 and proteins related to the polyamine metabolism and the influence of aminoguanidine compounds on agmatine transport; 4) to predict the tridimensional structure of AZIN2 by comparative modeling and to determine whether AZIN2 is able to form homodimers or heterodimers with ODC in mammalian cells; 5) to analyse the AZBE region of AZIN2 and its paralogs and the effect of conserved residues in the functionality of these proteins; 6) to study the half-life and the mechanism of degradation of AZIN2 and its paralogs in mammalian cells. In general the experimental methodology involved methods of molecular biology and biochemistry, gene expression analyses using real-time RT-PCR and computational approaches. In addition, we used several mammalian cell lines, mainly for transient transfection experiments, and laboratory animals. In particular, we performed specific treatments for the selective destruction of haploid germ cells in mouse testis. The conclusions obtained from our experiments were as follows: 1. Real-time RT-PCR analysis showed that, in addition to brain and testis, AZIN2 is expressed significantly in other adult mouse tissues such as epididymis, adrenal glands, pancreas, heart and lung, whereas its expression in several human cancer cell lines is almost undetectable. 2. In mouse testis, most AZIN2 mRNA is located in haploid germ cells, without significant expression in other testicular cells such as the interstitial cells. 3. The postnatal expression patterns of AZIN2 and AZ3 genes in rat testis are similar to those found in mice, indicating a evolutionary conserved expression pattern and suggesting that in the rat both proteins might be also participating in the spermiogenesis. 4. Agmatine uptake in COS7 cells is stimulated by AZIN2, ODC or SSAT overexpression, and inhibited by the presence of AZs. In basal conditions, agmatine uptake occurs through the polyamine transporter when the concentration of agmatine is close to the physiological values. 5. The tertiary structure of AZIN2, predicted by comparative modeling, is similar to those of its paralogs ODC and AZIN1 in the domains TIM / barrel and sheet, but it differs considerably in less conserved regions such as some loops and the N- and C-terminal regions. 6. Unlike ODC, AZIN2 is unable to form homodimers or heterodimers with ODC, but it is able to interact with the three AZ isoforms. 7. The comparative analysis of the AZBE sequences from multiple AZIN1, AZIN2 and ODC ortologs revealed the existence of five conserved residues (K116, A124, E139, L140 and K142 in mouse AZIN2). 8. In AZIN2, the double and triple substitutions of some of the conserved residues, but not single substitutions, drastically affected its interaction with AZs, independently from the effect of the substitutions on the net electric charge of the AZBE region. 9. In the case of ODC, the conserved residues play an important role in the function of the enzyme, since all single substitutions, with the exception of A123, significantly diminished ODC catalytic activity. 10. The residues E138 and L139 are critical for ODC functionality, since their substitution by alanines clearly reduced the formation of homodimers, causing the change L139A a potential increase of the protein stability by decreasing its interaction with AZ1. 11. In transfected cells, AZIN2 is more labile than ODC, having a half-life of approximately 90 minutes and being considerably stabilized by the interaction with AZs. 12. Unlike ODC and AZIN1, AZIN2 protein levels decreased after treatment with proteasome inhibitors, suggesting that its degradation might be mediated by an alternative route to proteasome 26S.

OBJETIVOS 1. Evaluar como influye la función renal glomerular, medida por TFGe, en la concentración de NT-proBNP urinario. 2. Evaluar la relación entre las concentraciones de marcadores bioquímicos específicos de función renal glomerular y tubular y las concentraciones de NT-proBNP, para ayudar a identificar su mecanismo de eliminación renal. 3. Evaluar el valor pronóstico de los niveles de NT-proBNP urinario y compararlo con el de NT-proBNP plasmático en pacientes con ICA. MATERIAL Y MÉTODOS Se incluyeron prospectivamente 138 pacientes consecutivos ingresados, diagnosticados de ICA, en el Hospital Virgen de la Arrixaca. Se recogieron simultáneamente muestras de sangre y orina al ingreso. Los parámetros de laboratorio medidos en suero fueron: glucosa, creatinina, urea, albúmina, sodio, ácido úrico, PCR, Troponina T, cistatina C, BTP y NT-proBNP. Y en orina: alfa-1 microglobulina, albúmina (MAU) y NT-proBNP. RESULTADOS 1. NT-proBNP plasmático y urinario fue más elevado en pacientes con un mayor deterioro de la TFGe (p<0,001). NT-proBNP plasmático correlacionó positivamente con los valores de NT-proBNP urinario (r=0,61, p<0,001) Las correlaciones TFGe - NT-proBNP también fueron significativas aunque menos potentes (r=-0,44; NT-proBNP plasmático y r=-0,37; NT-proBNP urinario, p<0,001 para ambos). TFGe, tras ajuste multivariable, tan sólo fue predictora independiente de las concentraciones plasmáticas de NT-proBNP (y de una forma débil). El principal predictor independiente de las concentraciones urinarias de NT-proBNP fue el NT-proBNP en plasma. 2. Los niveles urinarios de alfa-1 microglobulina (β = 0,50; p <0,001) y el NT-proBNP plasmático (β = 0,29; p <0,001) fueron los principales predictores independientes de los niveles de NT-proBNP urinario mientras que la creatinina, MDRD, cistatina C, BTP y MAU no alcanzaron significación estadística. 3. Los pacientes que presentaron eventos clínicos tenían una concentración plasmática superior de NT-proBNP (4.561 pg/ml [2.191-8.631] frente a 2.906 pg/ml [1.643-5.823]; p=0,03) pero su concentración urinaria de NT-proBNP fue similar (78 pg/ml [42-294] frente a 71 pg/ml [41-189]; p=0,62) en comparación con las de los pacientes que no sufrieron eventos clínicos. En los análisis de regresión de Cox univariables y multivariables, la concentración plasmática de NT-proBNP por encima de la mediana (3.345 pg/ml) se asoció a un mayor riesgo de eventos clínicos adversos (HR=2,35; IC del 95%, 1,41-3,93; p=0,001). Sin embargo, la concentración urinaria de NT-proBNP por encima de la mediana (73 pg/ml) no alcanzó significación estadística como factor predictivo del pronóstico de eventos en el análisis univariable (HR=1,2; IC del 95%, 0,79-1,96; p=0,46) CONCLUSIONES 1. El deterioro de la función renal glomerular se asocia con un aumento de las concentraciones de NT-proBNP plasmáticas y urinarias. Sin embargo, el filtrado glomerular renal no es predictor independiente de NT-proBNP urinario. 2a. NT-proBNP plasmático fue el mayor predictor de las concentraciones urinarias de NT-proBNP. Podría deberse a una mayor producción de NT-proBNP a nivel cardiaco como consecuencia del mayor estrés cardiovascular de los enfermos con afectación cardiaca y renal concomitante. 2b. Sugerimos que la presencia de disfunción tubular renal podría estar implicada en el aumento de niveles de NT-proBNP urinarios observados en pacientes con IR ya que, a diferencia de los marcadores de filtrado glomerular renal, alfa-1 microglobulina (parámetro de función tubular renal) fue predictor independiente de NT-proBNP urinario. Así, una disminución de la reabsorción de NT-proBNP a nivel del túbulo proximal favorecería un aumento de los niveles urinarios de NT-proBNP. 3. Consideramos que NT-proBNP urinario no debe ser utilizado con fines pronósticos en pacientes con ICA debido a que los niveles plasmáticos de NT-proBNP se asocian de forma independiente con el pronóstico de los pacientes con ICA pero, por el contrario, los niveles urinarios de NT-proBNP no presentan asociación con la aparición de eventos durante el seguimiento en este tipo de pacientes. / OBJECTIVES 1. Evaluate how glomerular renal function, as measured by eGFR, influences on urinary NT-proBNP concentration. 2. To evaluate the relationship between specific glomerular and tubular renal function biomarkers and NT-proBNP concentrations, to help identify the mechanism of renal elimination. 3. To evaluate the prognostic value of urinary NT-proBNP levels compared with plasmatic NT-proBNP levels in patients with AHF. METHODS We prospectively included 138 consecutive patients, diagnosed of ICA in Hospital Virgen de la Arrixaca. Blood and urine samples were simultaneously collected on admission. Laboratory parameters were measured in serum: glucose, creatinine, urea, albumin, sodium, uric acid, CRP, troponin T, cystatin C, and NT-proBNP BTP; and in urine: alpha-1 microglobulin, albumin (MAU) and NT-proBNP. RESULTS 1. Plasma and urinary NT-proBNP was higher in patients with a lower eGFR (p <0.001). Plasma NT-proBNP concentration correlated positively with urinary NT-proBNP (r = 0.61, p <0.001) Correlations eGFR - NT-proBNP were also significant although less robust (r = -0.44, NT-proBNP r = -0.37, NT-proBNP, p <0.001 for both). After multivariable adjustment, eFGR was only an independent predictor of plasma NT-proBNP concentrations. Plasma NT-proBNP was the main independent predictor of urinary NT-proBNP concentration. 2. Urinary Alpha-1 microglobulin levels (β = 0.50, p <0.001) and plasma NT-proBNP (β = 0.29, p <0.001) were the main independent predictor of urinary NT-proBNP concentration while creatinine, MDRD, cystatin C, BTP and MAU concentrations were not accepted as statistically significant. 3. Patients with clinical events had a higher plasma NT-proBNP concentration (4.561 pg / ml [2191-8631] vs 2,906 pg / ml [1643-5823], p = 0.03) but urinary NT-proBNP concentration was similar (78 pg / ml [42-294] vs 71 pg / ml [41-189], p = 0.62) compared with those patients who did not experience clinical events. In Cox regression univariate and multivariate analysis, the plasma NT-proBNP concentration above the median (3345 pg / ml) was associated with an increased risk of adverse clinical events (HR = 2.35, 95% , 1.41 to 3.93, P = 0.001). However, the urinary NT-proBNP concentration above the median (73 pg / ml) did not reach statistical significance as a predictor of prognosis of events in the univariate analysis (HR = 1.2, 95%, 0, 79 to 1.96, P = 0.46) CONCLUSIONS 1. Glomerular kidney disfunction is associated with increased plasma and urinary NT-proBNP concentration. However, glomerular filtration rate is not an independent predictor of urinary NT-proBNP. 2a. Plasma NT-proBNP was the main predictor of urinary NT-proBNP concentration. This may be due to increased cardiac production of NT-proBNP as a result of increased cardiovascular stress of patients with concomitant cardiac and renal involvement. 2b. Because alpha-1 microglobulin (renal tubular function parameter) was an independent predictor of urinary NT-proBNP unlike renal glomerular filtration biomarkers, we suggest that the presence of renal tubular dysfunction could be involved in increased urinary NT-proBNP levels observed in patients with renal disfunction. Thus, a decrease in NT-proBNP reabsorption at the proximal tubule would favor an increase urinary NT-proBNP levels. 3. We consider that urinary NT-proBNP should not be used for prognostic purposes in patients with AHF because plasma NT-proBNP levels was independently associated with prognosis of patients with AHF but, instead, urinary NT-proBNP levels have no association with the occurrence of events during follow-up in these patients.

Entre los biopolímeros, las proteínas de soja tienen la capacidad de formar películas comestibles y biodegradables con gran potencial para reemplazar en al menos algunas aplicaciones a los sintéticos derivados del petróleo. Respecto de los polímeros sintéticos, las películas proteicas presentan excelentes propiedades barrera a gases, lípidos y aromas; pero existen aspectos que aún deben ser resueltos para aumentar su difusión y que son foco de investigaciones en la actualidad: i) obtener materiales con mejoras en sus propiedades (ej. compuestos, nanocompuestos, activos), ii) avanzar en el procesamiento de estos materiales a mayor escala, iii) explorar nuevas aplicaciones específicas para este tipo de materiales adecuadas. El objetivo general de la presente tesis fue estudiar distintas alternativas para mejorar la funcionalidad y aplicabilidad de películas en base a proteínas de soja, combinando estrategias de formulación y procesamiento y analizando algunas aplicaciones específicas, en las que las desventajas de los materiales para otros usos se transforman en aspectos deseables. En particular en este trabajo se estudió: - el agregado conjunto de nanorefuerzos y aditivos que otorgan alguna otra propiedad adicional a la formulación, específicamente nanoarcillas (MMT) y colorantes comestibles, y nanofibras de celulosa y aceite esencial de clavo de olor (<i>Syzygium aromaticum</i> L.). - el desarrollo de materiales por tape casting, como técnica de escalado de proceso húmedo, analizando las condiciones óptimas del proceso, y el agregado de fibra y cera a la formulación. - el uso de estos materiales para la formación de liberadores de principios activos, útiles para realizar tratamientos poscosecha de vegetales en el envase durante el almacenamiento: pads contenedores-liberadores de 1-metilciclopropeno, un inhibidor de la acción de etileno, para extender la vida útil de frutos de tomate, y matrices liberadoras (generators) de dióxido de azufre por activación de las películas con sulfito de sodio para retrasar el pardeamiento de manzanas mínimamente procesadas.

El objetivo general de este estudio es avanzar en el esclarecimiento de mecanismos fisiopatológicos responsables del desarrollo de cambios en el metabolismo y la función esteroidogénica adrenal y ovárica como consecuencia de una modificación de la acción androgénica, ya sea por una hiperandrogenemia temprana como por un bloqueo de los receptores de andrógeno a edad neonatal. Está postulado que la androgenización pre-o neonatal en el sexo femenino interaccionaría con factores genéticos, el medio ambiente (dieta, etc.) o la combinación de ellos, afectándose la programación en la diferenciación de tejidos blanco para andrógenos y modificando la insulino-sensibilidad durante la edad reproductiva. Sin embargo, aún no existe consenso internacional sobre los mecanismos involucrados en las alteraciones inducidas por el temprano exceso androgénico, se infiere que las modificaciones estarían vinculadas a la producción adrenal/ovárica de andrógenos, y las modificaciones endócrinas adipocitarias que puedan afectar el estado metabólico del individuo. Estos estudios podrían aportar al esclarecimiento del desarrollo de insulino-resistencia y la contribución androgénica al desarrollo sexual de la rata hembra, dependientes de una temprana alteración de la actividad de los esteroides sexuales. <i>(Párrafo extraído del texto a modo de resumen)</i>

El presente trabajo de tesis tiene por objetivo desarrollar una estrategia de control de la enfermedad psorosis de los cítricos mediante el uso de cítricos transgénicos resistentes a <i>Citrus psorosis virus</i> (CPsV), agente causal de la enfermedad. Para ello se trabajó con plantas de <i>Citrus sinensis</i> que expresaban un fragmento del gen que codifica para la proteína de cubierta de CPsV en una estructura de tipo hairpin (horquilla), inductora del silenciamiento génico. Este mecanismo otorgó a estas plantas transgénicas resistencia al virus, y en el contexto de esta tesis, se estudió la estabilidad de esta resistencia mediada por silenciamiento a lo largo del tiempo y de sus propagaciones vegetativas por injerto sobre un pie de <i>Citrus jambhiri Lush</i>. Se analizó además la transmisión del silenciamiento a través del injerto y el movimiento de sus señales a larga distancia. Finalmente se desafió a los injertos con CPsV para evaluar el impacto de la transmisión del silenciamiento sobre la resistencia al virus.

Con el fin de obtener conocimientos que sirvan de aporte para futuros desarrollos de alimentos funcionales que contengan a las proteínas de amaranto como uno de sus ingredientes, en este trabajo nos hemos propuesto estudiar los aspectos básicos de la actividad antitrombótica de las proteínas de amaranto. Se estudiaron diversos protocolos de hidrólisis sobre los aislados proteicos de amaranto como una herramienta que nos permitiese generar distintos polipéptidos y péptidos activos. En todos los casos se observó que el tratamiento enzimático sobre las proteínas de amaranto generó péptidos con potencial actividad antitrombótica, siendo mucho más efectivo cuando la hidrólisis fue realizada por las enzimas gastrointestinales utilizadas en la simulación. Los resultados prometedores obtenidos con el aislado sometido a la digestión gastrointestinal nos impulsaron a seleccionarlo para ahondar en la búsqueda de péptidos con actividad antitrombótica presentes en las proteínas de amaranto, realizándose determinaciones in vitro, in vivo y ex vivo sobre la muestra. En los ensayos realizados con animales se pudieron estudiar parámetros asociados a las distintas etapas de la hemostasia, sugiriendo los resultados que el aislado proteico de amaranto es un potencial agente antitrombótico. Los péptidos que se encuentran encriptados en las proteínas de amaranto, una vez liberados durante la digestión gastrointestinal serían capaces de ejercer un efecto antiplaquetario y/o anticoagulante. Con el objeto de intentar comprobar la hipótesis anteriormente mencionada, se buscó purificar aquellos péptidos responsables de la actividad antitrombótica y estudiar la potencial biodisponibilidad de los mismos. Se logró, de este modo, obtener una fracción con muy alta actividad antitrombótica in vitro y las pruebas de absorción realizadas utilizando esta fracción activa, junto con su secuenciación nos permitieron encontrar péptidos potencialmente bioactivos, algunos de los cuales lograron atravesar el epitelio intestinal representado por la monocapa celular desarrollada en el inserto. Los resultados encontrados a lo largo de este trabajo de tesis fueron consistentes y nos inducen a pensar que en las proteínas de amaranto se encuentran encriptados péptidos bioactivos capaces de ejercer una actividad antitrombótica. Queda aún pendiente esclarecer el o los mecanismos de acción involucrados.

La enfermedad celíaca (EC) es una enteropatía crónica de base inmune que se desarrolla en individuos genéticamente susceptibles ante la ingesta de un grupo de proteínas derivadas del gluten. Su prevalencia está estimada en un 1-3%. En EC se observa daño a nivel de la mucosa del intestino delgado, caracterizado por atrofia de vellosidades, hiperplasia de criptas y un marcado infiltrado linfocitario, tanto a nivel de la lamina propria como en el compartimento intraepitelial. Estos cambios conducen a la pérdida de la funcionalidad del intestino delgado y a un síndrome de malabsorción asociado a diversos signos clínicos. La EC es un desorden multigénico, cuyo factor de susceptibilidad genética más importante está ubicado en el locus del HLA. Prácticamente el 100% de los pacientes, presenta los alelos del HLA codificantes para las moléculas DQ2 o DQ8. Por fuera de este locus, existen varias regiones que han sido asociadas a EC y que albergan genes con funciones inmunes. El infiltrado de linfocitos T CD4<SUP>+</SUP> (Th1) específicos de péptidos de gluten y restringidos al HLA-DQ2/DQ8, presentes en la lamina propria de la mucosa duodenal, juega un rol relevante al activarse y producir IFN<SUB>&gamma;</SUB>, aportando un microambiente altamente proinflamatorio. También es crítico el accionar de los linfocitos intraepiteliales, que se ven aumentados en el curso de la patología, y cuya citotoxicidad sobre enterocitos colaboraría en la instauración de la atrofia de la mucosa. Varios son los aspectos de la inmunopatogenia que aún no fueron descriptos. En este trabajo de Tesis abordaremos el estudio de genes candidatos, los mecanismos de migración y de muerte celular en la mucosa de intestino delgado. Implementando una estrategia de elección de genes candidato posicionales, hemos evidenciado tres genes diferencialmente expresados en el tejido blanco de esta patología: RUNX3, THEMIS y PTPRK, definiéndolos de esta manera como candidatos funcionales. Hemos demostrado además, la participación del eje quimiotáctico CXCR3/CXCL10 en el reclutamiento activo de células mediadoras de daño hacia la mucosa intestinal de pacientes con EC activa, tanto en eventos disparadores de la enfermedad como en el sostenimiento del proceso inflamatorio crónico. Estos resultados sientan precedentes para la evaluación de la determinación sérica de CXCL10 como biomarcador en EC y la inhibición de esta quimoquina como una posible estrategia terapéutica. Finalmente, hemos abordado el análisis de la expresión de moléculas asociadas a estrés de retículo y a vías de muerte celular, pudiendo evidenciar un epitelio intestinal con un marcado estrés de retículo. Nuestras observaciones sugieren que distintas vías de muerte, y no sólo la apoptótica extrínseca como había sido extensamente propuesto, podrían participar activamente en los mecanismos de daño en la mucosa intestinal en EC activa.

Objetivo general: Determinar el rol de la angiogénesis insular en el mecanismo por el cual el INGAP-PP induce un aumento de la masa y función secretora de las células β pancreáticas. Objetivos particulares: Modelo <i>in vivo</i> (administración de INGAP-PP a ratas normales durante 10 días): - Determinar los cambios en distintos parámetros séricos (glucemia, insulinemia, trigliceridemia, TBARS). - Determinar el patrón de secreción de insulina en respuesta a diferentes concentraciones de glucosa. - Determinar los cambios ocurridos sobre el tamaño insular. - Verificar la expresión de distintos marcadores de desarrollo y función β. - Determinar los cambios ocurridos a nivel de la expresión génica del VEGF-A y de su receptor (VEGF-A R2) en las células endoteliales insulares. - Determinar los cambios ocurridos en la cantidad de células endoteliales insulares utilizando CD31 como marcador de las mismas. - Cuantificar los cambios ocurridos en el componente mayoritario de las membranas basales insulares (lamininas). Modelo <i>in vitro</i> (cultivo de islotes normales en presencia o ausencia de INGAP-PP durante 4 días): - Estudiar el efecto directo del VEGF-A sobre la secreción de insulina en respuesta a la glucosa. - Determinar el efecto de INGAP-PP sobre la liberación de VEGF-A en islotes cultivados.

Teniendo en cuenta la capacidad del polisacárido kefiran de formar geles, se pretende profundizar el conocimiento del comportamiento de este polisacárido en sistemas complejos y utilizar los mismos como vehículo de sustancias bioactivas o microorganismos. Se han propuesto los siguientes objetivos específicos: A. Seleccionar microorganismos aislados de kefir con potencialidad probiótica. B. Utilizar los geles de kefiran como vehículos para la inclusión de componentes activos y/o microorganismos probióticos para el desarrollo de alimentos funcionales. Para ello, se propone explorar la capacidad del kefiran de formar geles mixtos con proteínas de suero de leche y azúcares, y evaluar el comportamiento de los microorganismos probióticos en dicha matriz.