Aphanius iberus es un Ciprinodóntido endémico de la Península Iberica que está catalogado como especie En Peligro de Extinción en diversos listados nacionales e internacionales. Sus poblaciones presentes en la Región de Murcia se encuentran entre las más importantes para la conservación de la especie en el sureste peninsular.La escasez y ausencia de conocimientos sobre la biología de especies amenazadas es un importante factor que incrementa su riesgo de extinción. El presente trabajo evaluando, de forma continua a lo largo de vario años, el rango de distribución, la variabilidad genética, parámetros de su estrategia de vida, la demografía y el estatus de conservación de A. iberus establece las bases para la gestión y conservación de la especie en la Región. Además, el presente estudio es el primero realizado sobre la biología de la especie en el área meridional de su rango de distribución.Esta Tesis Doctoral se encuadra completamente en los axiomas de la Biología de la Conservación y se centra en la gestión de especies amenazadas. / Aphanius iberus is an endemic cyprinodontid (Pisces) of the Iberian Peninsula that is catalogued as "in danger of extinction" in several national and international lists. Its populations from the Murcian Region are among the most important for the conservation of A. iberus in the southeast of the Iberian Peninsula.Lack of knowledge about the biology of endemic ichthyofauna is an important factor responsible for the serious danger of extinction. This several years long continuous study of A. iberus distribution range, genetic variability, life history traits, demography and conservation status has established the bases for the management and conservation of the species in this region. Moreover, the present study is the first about its biology in the southern area of its distribution range.This doctoral thesis is a work framed completely in the axioms of the conservation biology and it is focused in the management of endangered species.

Las enzimas son catalizadores orgánicos que aceleran una reacción, volviéndola mucho más rápida.

Apenas se han utilizado cultivos organotípicos tridimensionales (3D-OC) para el análisis de la interacción entre las bacterias y el tejido cerebral, por ello, hemos estudiado por primera vez la infección de 3D-OC de cerebros de rata con L. monocytogenes. L. monocytogenes es un organismo modelo para microbiólogos e inmunólogos, por lo que resulta interesante utilizar esta bacteria para el estudio ex vivo de las interacciones con el sistema nervioso central (SNC). En este sentido, hemos examinado la infección del tejido cerebral con L. monocytogenes mediante microscopía. A través de la utilización de matrices de PCR en tiempo real, hemos analizado los genes implicados en la respuesta inmunitaria y en la autofagia del hospedador frente a la infección. Finalmente, hemos estudiado la interacción de Listeria con células primarias obtenidas de los 3D-OC. Estos cultivos constituyen una herramienta versátil para investigar, en condiciones experimentalmente controladas, una gran variedad de vías biológicas relevantes durante la neurolisteriosis, y sirven como modelo para el estudio de otros microorganismos neurotrópicos relevantes. / Three-dimensional organotypic cultures (3D-OC) has hardly been used for the analysis of the interaction between bacteria and brain tissue , therefore, we have studied for the first time the infection of 3D-OC rat brains with L. monocytogenes. L. monocytogenes is a model organism for microbiologists and immunologists , so it is interesting to use this bacteria to study ex vivo interaction with the central nervous system (CNS). In this regard, we examined brain tissue infection with L. monocytogenes by microscopy . Through the use of arrays of real time PCR, we have analyzed genes involved in the host immune response and autophagy against infection. Finally, we have studied the interaction of Listeria with primary cells obtained from the 3D-OC. These cultures are a versatile tool to investigate, in experimentally controlled conditions, a variety of relevant biological pathways during neurolisteriosis, and serve as a model for the study of other relevant neurotropic microorganisms.

Objetivo general Estudiar los mecanismos patogénicos moleculares en tipos celulares claves en la infección experimental por CVB3. Objetivos específicos e hipótesis de trabajo 1. Estudiar la expresión de los receptores celulares y su correlación con la susceptibilidad a la infección por virus Coxsackie B (CVB) en células cardíacas murinas y humanas y en ratones de distintas cepas Acorde a trabajos previos (Kandolf et al. 1985; Gomez et al. 1993), los cardiomiocitos murinos y humanos son susceptibles a la infección por CVB. Partiendo de la hipótesis que la susceptibilidad a la infección correlaciona con la expresión del o los receptores virales, se propone estudiar en modelos in vitro de cardiomiocitos humanos derivados de células embrionarias madres totipotenciales (hESC-C) y en cardiomiocitos murinos recién nacidos y adultos, la infección con CVB a nivel de la replicación viral, y la sobrevida celular y su correlación con los niveles de expresión del receptor viral CAR y DAF, en el caso humano. Asimismo se buscará determinar si existen cambios en los niveles de CAR entre distintas cepas de ratones y la asociación de estos eventuales cambios con la susceptibilidad a la infección viral. Para ello se procederá a inocular ratones de distintas cepas con CVB3 para determinar en los mismos los niveles de replicación viral en corazón; el grado de injuria tisular y los niveles tisulares de CAR. Estos estudios podrán determinar la susceptibilidad de hESC-C a la infección por CVB3, la correlación con la expresión de los receptores y las eventuales diferencias en el sistema murino donde DAF no es utilizado y clarificar el rol de la expresión de CAR en la miocarditis y si aquellas cepas de ratones que expresan más o menos CAR son más o menos susceptibles a la replicación viral y a la subsecuente enfermedad. 2. Estudiar la infección de macrófagos por CVB Considerando como hipótesis de trabajo que los macrófagos juegan un rol esencial en la miocarditis y sus secuelas, se intentará caracterizar la infección de CVB3 en macrófagos teniendo en cuenta los niveles de replicación viral, el estado de activación y/o diferenciación celular y el efecto en la síntesis de moléculas con eventual rol en la patogénesis de la infección por CVB3. 3. Estudiar el rol de macrófagos en la miocarditis viral y la fibrosis Partiendo de la hipótesis ya mencionada, se analizará el rol de los macrófagos en la replicación de CVB3 in vivo y su estado de activación en los distintos estadios de la infección viral. Asimismo se buscará correlacionar la activación de macrófagos, la expresión de Gal-3 y la activación de fibroblastos con la fibrosis cardíaca y las consecuencias por la depleción de macrófagos.

El barrenador de los brotes de la soja, <i>Epinotia aporema</i> (Lep. Tortricidae) es una importante plaga de leguminosas en América del sur. En Argentina, este insecto ocasiona reducciones en los rindes de soja de hasta el 40%. Estudios preliminares identificaron a un Granulovirus (EpapGV) como un candidato potencial para el control biológico de Epinotia aporema. En esta tesis se aborda la caracterización molecular de EpapGV. Los análisis de microscopía electrónica (ME) de los cuerpos de inclusión (OBs) de EpapGV indicaron que éstos son ovoides con tamaños de 469 (± 37) nm x 242 (± 22) nm y que contienen un virión con forma de bastón, con una única nucleocápside. El OB está formado mayoritariamente por una proteína de 28,5 ± 0,5 kDa cuya secuencia amino-terminal es muy similar a otras granulinas de los Granulovirus. El mapa de restricción del genoma de EpapGV se determinó a partir del análisis de una biblioteca de fragmentos del DNA de EpapGV mediante digestiones con enzimas de restricción, Southern blot y amplificaciones de PCR con primers que apuntaban hacia afuera de los fragmentos virales. Esta última técnica se empleó para asegurar la contigüidad de los fragmentos. El tamaño del genoma se estimó en 120 kbp y se posicionaron los sitios EcoRI, BamHI, Hindlll y Bglll en el mapa físico. El gen de granulina ubicado en el mapa físico por Southern blot, fue clonado y seCuenciado. Este gen tiene 747 nucleótidos de largo y codifica para una proteína de 29 kDa. La secuencia amino terminal deducida de la secuencia nucleotídica coincidió con la secuencia proteica determinada por degradación de Edman, salvo por la ausencia del residuo de la metionina inicial. El análisis de la secuencia 5' permitió detectar una secuencia promotora tardía característica de este gen (ATAAG) ubicada 29 pb upstream al ATG; además, se describió un posible motivo transcripcional situada entre el promotor y el ATG (WCARNA). El análisis de la presencia de genes inhibidores de apoptosis (iap) mediante Southern blot, identificó una región genómica que codifica para un iap con similitud a los iap-3 de los baculovirus. Este gen codifica para un polipéptido de 256 aminoácidos y su secuencia presenta dos motivos BIR y un motivo RING-Finger característicos de estas proteínas. Por otra parte, un análisis filogenético agrupó a EpapGV IAP-3 con proteínas IAP-3 de baculovirus y de lepidópteros. La caracterización de las secuencias parciales del genoma de EpapGV (aproximadamente un 30% del genoma), reveló la presencia de 36 ORFs con homólogos en otros organismos. Por otra parte, se localizaron seis secuencias repetidas del tipo palíndromes imperfectos, distribuidas en diferentes lugares del genoma y repeticiones pequeñas situadas en regiones 5' no codificantes de varios genes. La presencia de ORFs compartidos por pares de fragmentos se usó, entre otras cosas, para confirmar la contigüidad de fragmentos en el mapa físico. El análisis filogenético de los baculovirus obtenido a partir de apilamientos de proteínas mayoritarias de cuerpo de inclusión coincidió con el árbol filogenético generado a partir del alineamiento de 20 proteínas conservadas en todos los baculovirus de lepidópteros totalmente secuenciados. Los resultados indicaron que EpapGV pertenece al grupo I del género Granulovirus y esta muy relacionado con CpGV, pero posee una organización génica diferente. En otro orden de cosas, se ha puesto a punto un ensayo de ELISA de captura para la detección y cuantificación de rutina de EpapGV, basado en anticuerpos policlonales específicos para granuiina de EpapGV. Este ensayo posee una alta sensibilidad para EpapGV, detectando hasta 0,53 ng/ml de granuiina, equivalentes 1.000 OBs por fosa. El ensayo de ELISA permitió cuantificar OBs de EpapGV en diluciones que contenían hasta 5 x 10<SUP>3</SUP> OB por pg de formulado bioinsecticida. Por otra parte, el ensayo se utilizó para determinar el progreso de la infección en larvas, estableciendo la presencia de granuiina a partir de las 24 h p.i. Los resultados de esta metodología indicaron que la misma es una alternativa rápida y barata para la detección y cuantificación de rutina de EpapGV en mezclas complejas. En conclusión, se ha provisto evidencia sustancial sobre el genoma de EpapGV y de su proteína mayoritaria del cuerpo de inclusión. Estos datos avalan la clasificación tentativa del virus aislado de E. aporema dentro del género Granulovirus de la familia Baculoviridae. Finalmente, estos estudios en conjunto con otros realizados por nuestro equipo de investigación, sientan las bases para el registro comercial de este virus que permitirán en el futuro, su uso en agricultura como agente de control biológico de E. aporema. / Tesis digitalizada en SEDICI gracias a la Biblioteca Central de la Facultad de Ciencias Exactas (UNLP).

Publicación a texto completo no autorizada por el autor / Aisla, cultiva y obtiene la biomasa microalgal de dos especies de Chlorella de ecosistemas acuáticos costeros de Lima. Se realizan colectas en los humedales de Ventanilla y las Salinas de Chilca (Laguna La Milagrosa y La Mellicera). Las especies se aislan por el método de placa de agar 1.6% con el Medio Basal de Bold y medio f/2 estándar. La identificación de las especies se logra sobre la base de características morfológicas y reproductivas que se complementan con pruebas bioquímicas (medio Basal inorgánico) y fisiológicas (solución nutritiva básica). El cultivo y producción de biomasa de C. minutissima y C. peruviana se realiza en Medio Basal de Bold y en medios f/2 estándar y modificados (0.75, 1, 1.5 y 3 M) respectivamente. C. minutissima posee un diámetro de 4 – 5 µm, cloroplasto parietal en forma de copa, reproducción por división binaria y autosporulación, las pruebas bioquímicas y fisiológicas señalan su crecimiento en un rango de 1-1.5% NaCl y pH 5.5 - 6.5, estos permiten una identificación precisa de la especie, la cual crece óptimamente en Medio Basal de Bold hasta una densidad celular de 58.22 x106 cel/ml, produciendo 413.15 mg/l de biomasa. C. peruviana posee un diámetro de 2–4 µm, cloroplasto parietal y reproducción semejante a la especie anteriormente descrita. Las pruebas bioquímicas y fisiológicas de C. peruviana son citadas por primera vez, siendo una microalga eurihalina, capaz de crecer desde 40 - 180% NaCl y pH 5.5 – 8. C. Además, esta especie crece de igual forma en medio f/2 estándar hasta una densidad celular de 42.36 x106 cel/ml, produciendo 397.97 mg/l de biomasa, en el medio f/2 modificado 0.75 M alcanza un 38.24 x106 cel/ml y 390.47 mg/l de biomasa. / Tesis

Publicación a texto completo no autorizada por el autor / Detecta la presencia de tripanosomátidos y Trypanosoma cruzi en sangre de primates no humanos mantenidos en cautiverio, mediante PCR anidada. Para realizar la identificación por PCR de T. cruzi en primates no humanos, se optimiza un protocolo anidado usando dos pares de cebadores dirigidos al gen 24S alfa de la subunidad mayor de ribosoma. Se analizan muestras de sangre de mono colectadas en tubos con EDTA y tarjetas FTA provenientes de siete ciudades peruanas: Yurimaguas (n=69), Pucallpa (n=29), Puerto Maldonado (n=26), Iquitos (n=1), Moyobamba (n=17), Lima (n=34), y Cuzco (n=18). Las muestras son colectadas entre noviembre 2011 y mayo 2012 por la ONG Wildlife Conservation Society (WCS) mediante un muestreo no probabilístico por conveniencia. De cada muestra también se realizan frotis y gota gruesas para detección de hemoparásitos por microscopía. Los productos de amplificación de la primera reacción son de aproximadamente 240-280 pb y amplificaron secuencias conservadas en todos los tripanosomátidos, mientras que los de la segunda PCR son de 110-130 pb y amplifican una secuencia interna, exclusiva de T. cruzi. No se observa una reacción cruzada con ADN de mamífero (Aotus, humanos) ni con otros parásitos como Plasmodium spp. El límite de detección del protocolo es de 1,5 pg de ADN para tripanosomátidos y de 15 fg para T. cruzi; lo que equivale aproximadamente a 4,5 y 0,045 parásitos, respectivamente. Sin embargo, como la cantidad de ADN de T. cruzi varía entre cepas y clones, este rango podría ser más amplio y detectar solo 12,5 parásitos en la primera reacción y 0,12 en la segunda. Al comparar la PCR con el diagnóstico por microscopía, se determina que esta última es menos específica (97,96%) y sensible (82,86%). Finalmente, al emplear el protocolo de PCR en las muestras de primates no humanos, se encuentra que la prevalencia de tripanosomátidos es de 26,49% y la de T. cruzi 3,24%. / Tesis

Publicación a texto completo no autorizada por el autor / Realiza una revisión sistemática integral de las poblaciones de individuos de tamaño pequeño de Neacomys presentes en el nororiente y centro del Perú asociados a Neacomys minutus. Es decir, aclara la situación taxonómica de Neacomys minutus y de las poblaciones de tamaño pequeño relacionadas a ella presentes en el Perú, describe morfológicamente a las poblaciones de tamaño pequeño del género Neacomys presentes en el nororiente y centro de Perú, establece el número cromosómico de las poblaciones del nororiente y centro del Perú y caracteriza molecularmente las poblaciones del nororiente y centro del Perú empleando como marcador molecular al gen Citocromo b. / Tesis

Publicación a texto completo no autorizada por el autor / Identifica larvas plerocercoides de Diphyllobothrium sp. de peces marinos de la costa peruana de mayor consumo humano mediante técnicas moleculares, utilizando los marcadores moleculares ITS y 18S rDNA. Para ello se muestrean 831 ejemplares de Sciaena deliciosa “Lorna”, 5 de Sarda chilensis “Bonito”, 201 de Scomber japonicus “Caballa”, 40 de Galeichthys jordani “bagre marino“, 34 de Trachurus murphyi “jurel”, 18 de Merluccius gayi “merluza”,5 de Coryphaena hippurus “perico” y 2193 de Engraulis ringens “anchoveta”; adquiridos en diferentes periodos estacionales y diferentes puertos de las ciudades de Chiclayo, Lima, Ica y Moquegua de la costa peruana. Se extrae el ADN genómico de 36 larvas plerocercoides colectadas y se evalúa la calidad del mismo mediante electroforesis y espectrofotometría. Se amplifica los fragmentos ITS, 18S rDNA y COI (control interno) de las larvas plerocercoides mediante PCR y se analizan filogenéticamente utilizando los métodos de Neighbor-Joining (NJ) y Máxima Parsimonia (MP). Los resultados muestran que al analizar morfológicamente las larvas plerocercoides, se observan tres formas diferentes de escólex: lanceolada, acorazonada y redondeada, según Mondragón (2017). En el análisis filogenético se observa que para cada uno de los marcadores moleculares utilizados, las secuencias de las larvas plerocercoides son agrupadas en un solo clado, junto con las secuencias obtenidas de la base de datos de NCBI de A. pacificus y D. pacificum, manteniendo una distancia marcada con las otras especies de Diphyllobothrium reportadas como zoonóticas. En conclusión, los datos demuestran que, a nivel de morfología de escólex, las larvas plerocercoides presentan alta plasticidad; por ende, esta no es una característica útil ni válida para la identificación a nivel de especie. De acuerdo a los análisis filogenéticos basados en el gen 18S rDNA y ITS, se determina que las larvas plerocercoides se agrupan en un mismo clado con A. pacificus y probablemente se trate de una sola especie la que esté presente en la zona costera del Perú. / Tesis

Publicación a texto completo no autorizada por el autor / El documento digital no refiere asesor / Se realizó la evaluación nutricional, microbiológica y del tiempo de vida útil del ch’arki de sangre de origen bovino elaborado en el Centro Piloto del Puesto de Salud de Ccochapucro - provincia de Andahuaylas, departamento de Apurímac. De la evaluación nutricional, utilizando los métodos de la AOAC, se obtuvieron: 7,97 g% de humedad; 83,59 g% de proteínas; 0,8 g% de grasas; 7,58 g% de cenizas; 341,56 Kcal/100 g de energía total; 7,92 de pH; 0,0174 g% de acidez; 2,75 g% de cloruro de sodio; 0,302 de actividad de agua y 0,078 g% de nitrógeno amoniacal. Utilizando el método de Absorción Atómica se obtuvieron (en mg%): 218,68 de hierro; 114,3 de calcio; 132,7 de potasio; 228 de magnesio; 230 de sodio; 0,63 de cobre; 3,13 de zinc y por el método espectrofotométrico, se obtuvo 52,4 mg% de fósforo. De la evaluación microbiológica, utilizando los métodos de la ICMSF y Mossel et al., se obtuvieron: recuento de aerobios mesófilos, 21 x 102 UFC/g; mohos, 10 UFC/g; levaduras, < 10 UFC/g; coliformes totales, < 3 NMP/g; Staphylococcus aureus, < 10 UFC/g; detección de Salmonella sp. (en 25 g), ausente y Clostridium perfringens, < 10 UFC/g. De la evaluación del tiempo de vida útil en tiempo real por un periodo de almacenamiento de 35 días, no se observó variación en las características organolépticas; la humedad varío significativamente (p < 0,05) a partir del día 21 hasta el día 35, siendo mayor en 26,72 %; los valores de pH, acidez y nitrógeno amoniacal, no presentaron diferencias significativas (p > 0,05); el recuento de mesófilos aerobios varió significativamente (p < 0,05) a partir del día 28 al día 35, siendo mayor en 10,84 %; no hubo variación en el recuento de levaduras (< 10 UFC/g) y no se encontró mohos (< 10 UFC/g). El ch’arki de sangre almacenado durante 35 días a temperatura ambiente se mantuvo estable. / Tesis