El propósito de esta Tesis Doctoral ha sido profundizar y ampliar los conocimientos sobre la distribución, biosíntesis y metabolismo de las furanocumarinas e isoflavonas en B. bituminosa. La importancia y el interés por estos metabolitos secundarios reside en su aplicabilidad en biomedicina, ya que al ser irradiadas con luz UV, establecen uniones covalentes con el ADN y con proteínas, modulando, la regulación génica o la actividad de determinados enzimas. Ha demostrado ser efectivo contra distintas enfermedades autoinmunes y diversos tipos de cáncer. Por otro lado, las isoflavonas, son consideradas moduladores selectivos del receptor de estrógenos (SERM´s), pudiendo estar implicadas tanto en el crecimiento como en la muerte celular. Uno de nuestros objetivos, ha sido la de encontrar un material vegetal, con una producción lo suficientemente alta como para establecerse como materia prima para la producción comercial de estos compuestos, y B. bituminosa ha mostrando uno de los mayores niveles de FC´s e isoflavonas de todos los materiales vegetales analizados. Durante el presente trabajo, se ha optimizado un método analítico, rápido, preciso y eficaz, y se han analizado los niveles de FC´s e isoflavonas, de distintas variedades y poblaciones de B. bituminosa, por toda la cuenca mediterránea e Islas Canarias. Seleccionando aquellas, que presentaban una biosíntesis mayoritaria de FC´s lineales y por otro lado, individuos con una biosíntesis mayoritaria de FC´s angulares. Se establecieron plantaciones experimentales, de las cuales surgieron dos clones de B. bituminosa, clon Psoraleno (96% de FC´s lineales) y B. bituminosa, clon Angelicina (75% de FC´s angulares). Se estudió tanto la evolución en la acumulación de FC´s como su distribución en planta, así como la modulación de su ruta biosíntética. Observándose un patrón de distribución característico, donde las FC´s se localizan predominantemente en la parte aérea de la planta, mientras que las isoflavonas, se localizan en la parte radicular, siendo inducidas ambas moléculas, por determinados precursores, como el ácido cinámico o umbeliferona, por metales como el Mg2+ o el Cu2+ y por algunos efectores hormonales como el MeJa. Además se ha identificado, purificado y caracterizado bioquímica y molecularmente una enzima, implicada directamente en el metabolismo de las FC´s, como es una ß-glucosidasa específica de furanocumarinas glicosiladas, (BbFCbG), la cual, pertenece a la familia 1 de las glicosil hidrolasas. Esta enzima, presenta una alta especificidad por las FC´s conjugadas, debido a la sustitución de un residuo de ácido glutámico, en el centro activo, por uno de glutamina. Este hecho ocurre con sustratos que tienen una reactividad lo suficientemente alta como para no necesitar catálisis ácida, y en el caso de las furanocumarinas, la catálisis básica recaería sobre el grupo hidroxilo del grupo carboxilo presente en el anillo lactona de la propia furanocumarina, lo que podría ser la razón de la elevada especificidad de esta enzima por las furanocumarinas. Esta enzima además, está implicada en la respuesta defensiva frente a heridas, mostrando una inducción de su transcripción al realizar heridas en la planta o al tratarla con MeJa. Por último, se llevó a cabo un estudio del metabolismo de FC´s durante el proceso germinativo y se analizó cómo varían los niveles de BbFCbG durante dicha etapa del desarrollo vegetal, mostrando una hidrólisis de FC´s conjugadas en los cotiledones, así como un aumento en la expresión de esta enzima en ese órgano. Además, en la activación de BbFCbG están implicadas fitohormonas como el GA3 y el MeJa y en menor medida la 6-BA. Para el desarrollo de estos objetivos se han utilizado numerosas técnicas de instrumentación científica (HPLC, MS/MS, TOF, RMN), así como técnicas bioquímicas y moleculares, las cuales, nos han permitido avanzar en el conocimiento del metabolismo de estos compuestos. / SUMMARY The aim of this PhD Thesis has been deepen and broaden the knowledge about the distribution, biosynthesis and metabolism of furanocoumarins (FC´s) and isoflavones in B. bituminosa. The importance and interest of these secondary metabolites is its aplicability in biomedicine, such to be able to, when they are irradiated with UV light, to establish covalents unions with both DNA and proteins, modulating gene regulation or activity of certain enzymes, which has been demostrated to be effective agains various autoinmune diseases and cancers. Furthermore, isoflavones are considered selective estrogen receptor modulators (SERM´s) and they may be involved in both cell growth and cell death. One of our goals in this report, has been to find a plant material, with a high enough production of these metabolites in order to establish itself as raw material for commercial production of these compunds and so B. bituminosa has been shown one of the highest amounts of FC´s and isoflavones content in the analyzed plant kingdom. In this work, it has been optimized an analytical, fast, accurate and efficient method for quantification of differents FC´s and isoflavones, previously identified in B. bituminosa. In addition, It has done a prospecting, analyzing FC´s and isoflavones levels of several varieties and populations of B. bituminosa throughout the mediterranean basin and Canary Islands, selecting all of them, that met with our requirements: a majority biosynthesis of linear FC´s, or angular FC´s. We have been established two experimental plantations with selected plants, in which, we selected two plants to be candidates, one of them, called Psoralen clone (96% linear FC´s content) and other one, called, Angelicin clone (75% angular FC´s content). It has been studied the evolution in FC´s accumulation, their distribution in plants and the modulation of the biosynthetic pathway. We observed a characteristic pattern of distribution, where FC´s are located predominantly in the aerial parts of the plants while isoflavones are located in the root part of the plant, being both molecules induced by certain precursors, such as cinnamic acid and umbelliferone, by metals, such as Mg2+ or Cu2+ and some hormonal effectors as MeJa. Otherwise, it has been identified, purified and characterized an enzyme directly involved in the metabolism of the FC´s, as specific ß-glucosidase of furanocoumarins (BbFCbG), which belongs to family 1 of glycosyl hidrolases. This enzyme has a high specifity againts conjugate FC´s, due to the sustitution of a glutamic acid residue, located at the active site of the enzyme, by a glutamine one. This fact occurs with substrates that have a reactivity high enough to not require acid catalysis, and with furanocoumarins, base catalysis would be carried out by the hydroxyl group, content in the carboxyl group of lactone ring in FC´s. These could be the reason of the highest specifity of this enzyme on furanocoumarins. This reaction mechanism, is the first time that it is purposed, as well as, the identification and characterization of an furanocoumarin conjugated specific ß-glucosidase. Also, this enzyme is involved in the defense response to wounds, showing an induction of its transcription when made tissue damage or by treatment with MeJa. Finally, we studied about the FC´s metabolism during the germination process and was analyzed the variation of expression levels of BbFCbG during this stage of plant development, showing a FC´s conjugates hydrolysis in cotyledons during development and an increase of the transcription levels of BbFCbG in this organ. Also, in the activation of BbFCbG are implicated some phytohormones as GA3 and MeJa, and to a lesser extent 6-BA. For accomplish these objectives, we have been used numerous scientific instrumentation techniques (HPLC, MS/MS, TOF, RMN), biochemical and molecular techniques, which have allowed us to advance our knowledge of the metabolism of these compounds.

INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS: el metabolismo óseo es un sistema complejo en el que intervienen numerosos actores, como la vitamina D. Los farmacos antiepilépticos (FAEs) clásicos como la carbamacepina (CBZ), la fenitoína (PHT) o el ácido valproico (VPA), se han relacionado con la aparición de una osteoporosis prematura en los pacientes epilépticos y se recomienda la suplementación con vitamina D, pero la dosis e incluso el tipo de suplementación no está clara. También se desconoce el impacto de los nuevos FAEs en la salud ósea de los pacientes, por lo que se planteó como objetivo del estudio determinar la posible afectación del metabolismo óseo en pacientes epilépticos tratados con FAEs de nueva generación, mediante parámetros densitométricos, y bioquímicos, comparados con pacientes tratados con fármacos clásicos, y, por otro lado, determinar el efecto de la suplementación con vitamina D en estos mismos parámetros, tanto en pacientes tratados con FAEs clásicos como de nueva generación, de forma crónica. MÉTODO: se realizó un estudio observacional prospectivo en una muestra de pacientes diagnosticados de epilepsia, de la Unidad de Epilepsia del Hospital Universitario Virgen de la Arrixaca (Murcia), que se encontraban en monoterapia estable con un FAE clásico (CBZ, PHT or VPA) de nueva generación (levetiracetam (LEV), lacosamida (LCM) o eslicarbacepina (ESL)) y que fueran a empezar con suplementación con vitamina D y calcio, según práctica clínica habitual. Se seleccionó una muestra similar de pacientes que no tomaron suplementación, como grupo control. Se recogieron datos clínicos, nivel de ejercicio físico, fototipo cutáneo, encuesta nutricional y parámetros bioquímicos generales. Se procedió a determinar la densidad mineral ósea (DMO) en los pacientes mediante densitometría de absorción dual (DEXA) en columna lumbar y cuello femoral izquierdo, a nivel basal y tras seis meses, así como los niveles de vitamina D y los marcadores bioquímicos de remodelación ósea. Igualmente se determinaron los polimorfismos de los genes relacionados con el metabolismo óseo a nivel basal. RESULTADOS: se estudiaron 27 pacientes en suplementación con vitamina D (400 UI de colecalciferol y 1500 mg carbonato cálcico), y 37 pacientes se siguieron como controles. No hubo diferencias en las características basales entre el grupo con suplementación (grupo vitD) y el grupo control, en cuanto a los antecedentes clínicos ni los parámetros bioquímicos generales, excepto en el porcentaje de fumadores, que fue mayor en el grupo control. Se encontró que la glucemia era un factor de confusión que se controló en los análisis estadísticos posteriores. El polimorfismo del gen ESR1P-PVU se relacionó con los cambios en la z/t femoral de forma independiente (p = 0,046), así como la toma de suplementación con vitamina D (p = 0,031). Los pacientes en tratamiento con FAEs neutros (LEV o LCM) presentaron niveles de vitamina D basales similares a los encontrados en los pacientes con FAEs inductores (CBZ, PHT o ESL) o inhibidores (VPA): 20,10 ± 9,92 vs 15,65 ± 6,56 vs 21,30 ± 8,12 ng/ml, respectivamente. Los niveles de osteocalcina basal, fueron más elevados en el grupo de pacientes tratados con LEV que en los tratados con VPA (p = 0,044). La DMO lumbar de los pacientes con FAEs neutros fue significativamente superior a la de los pacientes con FAEs inductores (1,106 ± 0,15 vs 0,970 ± 0,14 g/m2, p = 0,025). En el grupo suplementado, el número de pacientes con niveles de vitamina D por encima de 30 ng/ml aumentó de 3 a 7 (del 12 al 28%), los pacientes en rango de insuficiencia del 44 al 56% y mientras los que se encontraban en rango de deficiencia disminuyeron de 11 a 4, (p = 0,019). En los que presentaban una deficiencia o insuficiencia de vitamina D basal, los parámetros de formación y resorción ósea disminuyeron, mientras que en grupo control aumentaron los determinantes de resorción de forma significativa. La DMO y z/t lumbares aumentaron significativamente en los pacientes del grupo suplementado, en comparación con el grupo control (0,027 ± 0,047 g/m2 vs -0,003 ± 0,064 g/m2, p = 0,025), y la DMO y z/t femorales aumentaron pero no alcanzaron la significación estadística. El tipo de FAE no demostró ninguna influencia sobre el cambio en los niveles de vitamina D o los parámetros densitométricos. CONCLUSIONES: LEV no produjo cambios en la DMO en nuestra muestra, pero mostró un perfil similar al de los inductores enzimáticos en cuanto a déficit de vitamina D. Además, detectamos una tendencia a la disminución de la formación ósea durante los seis meses de evolución, no dependiente de la suplementación con vitamina D y calcio. La suplementación con 400 UI de vitamina D y 1500 mg de carbonato cálcico diaria se asoció a un aumento de los parámetros densitométricos femorales y lumbares, siendo significativo para la z/t-score femoral, sin que el tipo de fármaco antiepiléptico influyera en ello. Esta suplementación no consiguió normalizar los niveles de vitamina D séricos en la mayoría de los pacientes, por lo que dosis más elevadas e individualizadas serían necesarias. Además, los pacientes que presentaban, a nivel basal, deficiencia o insuficiencia de vitamina D, se beneficiaron de forma más evidente de la suplementación. Por otro lado, la presencia del alelo “p” del polimorfismo ESR1P-PVU favoreció la mejoría del z/t-score femoral en los pacientes suplementados. / VITAMIN D SUPPLEMENTATION IN EPILEPSY: STUDY IN PATIENTS ON CLASSICAL AND NEW GENERATION ANTIEPILEPTIC DRUGS. INTRODUCTION AND PURPOSE: Bone metabolism is a complex system where numerous actors are involved, including vitamin D. Classical antiepileptic drugs (AED) as carbamazepine (CBZ), phenytoin (PHT) and valproic acid (VPA) are strongly related to disturbances in bone metabolism in persons with epilepsy, and can lead to a premature osteoporosis. Vitamin D supplementation has been recommended but dosage, and even type of supplementation, are still not clear. Moreover, we don’t know if newer AEDs have an impact on bone, though, the aim of this study was to determine if newer AEDs are related to bone metabolism impairment, compared to classical AEDs, in terms of densitometric and biochemical parameters, and if vitamin D administration as performed in everyday clinical practice is related to a better outcome on densitometry or biochemical parameters in patients on chronic AEDs. METHODS: a prospective observational study was conducted on adult epileptic outpatients from the Epilepsy Unit of Arrixaca’s Hospital (Murcia), on stable monotherapy with AEDs, either classical (CBZ, PHT or VPA) or new (levetiracetam (LEV), eslicarbazepine (ESL), lacosamide (LCM)), that were going to start vitamin D supplementation. A similar sample of patients not taking vitamin D was collected as control group. Clinical data, level of exercise, skin phototype, nutritional status and general biochemical parameters were collected. Bone mineral density (BMD) at lumbar level and neck of left femur was studied by dual energy X-ray absorptiometry at the beginning of the study and after 6 months, as well as vitamin D levels and bone remodeling biomarkers. Polymorphisms of genes related to bone metabolism were determined at baseline. RESULTS: 27 patients on vitamin D supplementation (400 UI cholecalciferol and 1500 mg calcium carbonate) and 37 controls were studied. There was no difference between the two groups (vitD and control group), in terms of clinical characteristics and general biochemical parameters, excepting for smokers that were more frequent in the control group. Glycemia was found to be a confounding factor, which was controlled in statistical analysis. ESR1P-PVU polymorphism was independently related to changes in femoral z/t score (p _ 0,046) and with vitamin D supplementation (p = 0,031). Patients treated with neutral AEDs (LEV and LCM) had similar vitamin D levels as patients on enzyme-inducers (CBZ, PHT or ESL) and inhibitors (VPA): 20,10 ± 9,92 vs 15,65 ± 6,56 vs 21,30 ± 8,12 ng/ml, respectively. Baseline osteocalcin levels were higher in pacients on LEV compared to VPA (p = 0,044). Lumbar BMD was higher in patients on neutral AEDs compared to inducers (1,106 ± 0,15 vs 0,970 ± 0,14 g/m2, p = 0,025). In the supplemented group, the number of patients with vitamin D sufficiency increased from 3 to 7 (12 to 28%), insufficient patients grew from 44 to 56% and deficient patients decreased from 11 to 4, (p = 0,019). Bone remodeling biomarkers, both formation and resorption markers, decreased significantly in patients with vitamin D levels < 30 ng/ml, while resorption markers increased in patients in control group. Lumbar BMD and z/t score increased significantly in supplemented patients, compared to controls (0,027 ± 0,047 g/m2 vs -0,003 ± 0,064 g/m2, p = 0,025), and femoral BMD and z/t score also increased but did not reach statistical significance. Vitamin D levels or densitometric parameters were not influenced by AED type. CONCLUSIONS: LEV was not associated to BMD changes in this study, but it was related to low vitamin D levels, as were enzyme-inducer AEDs. Moreover, a tendency to a decrease in bone formation after six months was detected, not depending on vitamin D and calcium supplementation. Administratio of 400 IU of vitamin D and 1500 mg of calcium carbonate was associated to an increase of femoral and lumbar densitometric parameters, reaching statistical significance for femoral z/t score, and AED did not show any influence on it. Normalization of vitamin D levels was not reached with this dosage of supplementation, thus an individualized higher dose could be recommended. In addition, patients that were insufficient or deficient at baseline showed a more evident improvement in the studied patterns. Presence of “p” allele of ESR1P-PVU polymorphism was related to an improvement of femoral z/t-score in supplemented patients.

D.L. A 455-2007

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Fondo de Investigaciones Sanitarias (FIS 92/0811 y FIS 95/0053.1)

CICYT (BIO-093-0600-C04-03); Generalitat Valenciana (GV-1170/93)

CICYT (PB95-0695)

El presente trabajo ha sido subencionado en parte por los proyectos: BI093-0660-CO4-03 CICYT y GV-1170793 Generalitat Valenciana.

En España, como en todos los países de la zona mediterránea, la clorosis férrica es uno de los mayores problemas nutricionales de los cultivos. En el Levante español, las aproximadamente 250.000 ha destinadas al cultivo de cítricos, las 60.000 ha al tomate o las 35.000 ha de la uva de mesa necesitan tratamientos de hierro cada año al igual que las 90.000 ha dedicadas al cultivo de frutales en el valle del Ebro. Podemos estimar en 36 millones de euros cada año, el gasto en fertilizantes férricos. A pesar de que los estudios sobre la clorosis férrica comenzaron a principios del siglo XX, casi 100 años después, todavía no se entiende completamente este problema y los medios disponibles para evitar la clorosis férrica no son del todo satisfactorios. El quelato sintético FeEDDHA ha sido considerado durante los últimos 30 años la fuente más eficaz para la corrección de la clorosis inducida por carbonatos. Sin embargo, uno de sus mayores problemas es su excesivo costo para un uso general. Las sustancias húmicas y aminoácidos tienen destacados efectos en las propiedades físicas, químicas y biológicas de los suelos así como sobre el crecimiento y desarrollo vegetal, concretamente en el caso de la toma de hierro por parte del vegetal, podemos encontrar en la bibliografía referencias que señalan aumentos significativos en la asimilación de Fe, reduciendo el riesgo de que la planta sufra una deficiencia en este elemento y desarrolle los síntomas característicos de la clorosis férrica. En este trabajo se han aplicado de manera conjunta, localizada y en la misma proporción el quelato de hierro Fe-EDDHA con sustancias húmicas o aminoácidos según tratamientos, y se ha evaluado su influencia en la nutrición vegetal y en la calidad de los frutos, en cultivos de tomate, limón y uva. Los resultados permitieron sustituir distintos porcentajes de la dosis del quelato de hierro aplicado por sustancias húmicas obteniendo mejoras en la nutrición férrica, y observando efectos protectores frente a las condiciones de salinidad sobre las que se desarrollaron los cultivos y mejoras en la calidad de los frutos en parámetros como peso, tamaño, contenido en vitamina C y ácido cítrico. / In Spain, as in other Mediterranean countries, iron chlorosis is one of the most important problems in plant nutrition. In East Spain, the approximately 250.000 ha of citrus, the 60.000 ha of tomato or the 35.000 ha of table grape need treatments of iron every year, as well as the 90.000 ha of fruit trees in the Valley of the Ebro river. We estimate the cost of iron fertilizer in 36 millions of euros per year. Although, the study of iron chlorosis started at the beginning of the XX century, 100 years later, this problem is not completely known and the methods available to relieve iron chlorosis are not satisfactory enough. The synthetic iron FeEDDHA has been considered in the last 30 years, the more effective treatment to correct “lime induced chlorosis”, a problem mainly attributed to calcareous soils. However, a main inconvenient is its high price for general use. Humic substances and amino acids have important effects on the physical, chemical and biological properties of the soil and on plant growth. Respect to iron uptake by plants, we can find references in the literature that show significant increases in foliar content of iron when these organic compounds are added, and so the plant has less risk of suffering iron deficiency and developing the characteristic symptoms of this nutritional disorder. In this work, we have applied together, and in the same proportion, the iron chelate FeEDDHA with humic substances or amino acids, and we have evaluated the influence of these mixes on the plant nutrition and on the quality of the fruits, in tomato, lemon and grape. According to the results obtained in this experiment, The progressive substitution of the iron chelate by humic substances was assayed. Improvement in iron nutrition, plant growth and protective effects under salinity conditions, were observed as well as the improvement in fruit quality respect to weight, size, vitamin C and citric acid.

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