Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 431159.pdf: 8354772 bytes, checksum: 8abf5160038abef327a3d35aa522175e (MD5) Previous issue date: 2011-03-25 / A tuberculose ? uma doen?a infecciosa cr?nica, causada principalmente pelo Mycobacterium tuberculosis, e requer novas iniciativas urgentes para o seu tratamento e cura em decorr?ncia do surgimento de cepas resistentes a drogas, sua abrang?ncia global, e o significativo aumento de pessoas infectadas entre pacientes imunodeprimidos; al?m do grande n?mero de pessoas infectadas com a forma latente da tuberculose, que atuam como reservat?rio da doen?a. As enzimas que constituem as vias de metabolismo de nucleot?deos s?o alvos promissores para o desenvolvimento de novas drogas para o tratamento da tuberculose, tanto na sua forma ativa quanto latente. A enzima orotato fosforibosiltransferase (OPRT), pertencente ? via de s?ntese de novo de nucleot?deos de pirimidina, catalisa a transfer?ncia revers?vel do grupamento fosforibosil da mol?cula de 5 -fosfo-?-Dribose 1 -difosfato (PRPP) para o ?cido or?tico (OA), formando orotidina 5 - monofosfato (OMP), mol?cula precursora dos demais nucleot?deo de pirimidina. Este trabalho descreve a clonagem, amplifica??o e caracteriza??o do produto do gene pyrE de M. tuberculosis H37Rv como uma enzima OPRT funcional; a determina??o de suas constantes cin?ticas aparentes e verdadeiras para as rea??es direta e inversa; ensaio de inibi??o pelos produtos; e a determina??o do mecanismo cin?tico da rea??o como sendo Mono-Iso Ordenado Bi Bi, mecanismo que at? ent?o n?o havia sido descrito para uma enzima pertencente ? fam?lia das fosforibosiltransferases do tipo I. As constantes termodin?micas e o perfil de discrimina??o termodin?mica permitiram a identifica??o dos modos de intera??o dos substratos naturais da enzima com seu s?tio de liga??o. A caracteriza??o da rea??o catalisada pela enzima OPRT micobacteriana ? uma etapa essencial para o desenvolvimento de novas drogas de a??o espec?fica que permitam o melhor controle da tuberculose. Os dados resultantes da caracteriza??o da enzima foram utilizados como ponto de partida para o planejamento, sele??o e teste de inibidores seletivos contra a OPRT de M. tuberculosis. Um composto inicial, com valores de na faixa de concentra??o de nanomolar, foi identificado como potencial composto l?der, sendo submetido a diferentes protocolos de derivatiza?ao qu?mica, permitindo a obten??o de uma mol?cula derivada com valores de constantes inibit?rias e perfil de discrimina??o termodin?mica aprimorados. Estes dois compostos foram caracterizados como inibidores competitivos e incompetitivos em rela??o aos substratos naturais da OPRT, OA e PRPP, respectivamente; onde o conhecimento do singular mecanismo cin?tico de rea??o da enzima de M. tuberculosis foi utilizado para o planejamento de mol?culas capazes de formar um complexo tern?rio n?o catal?tico ( ? ? ), inibindo a s?ntese de nucleot?deos de pirimidina e sequestrando mol?culas de PRPP do meio celular, afetando ainda, outros processos metab?licos essenciais. Os resultados deste trabalho colaboram ainda para uma melhor compreens?o do metabolismo de nucleot?deos de micobact?rias e fornecem informa??es relevantes para o avan?o do desenvolvimento de inibidores de a??o seletiva sobre alvos moleculares espec?ficos para o tratamento e profilaxia da tuberculose

Made available in DSpace on 2015-04-11T13:38:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Romison de Souza Teixeira.pdf: 2655520 bytes, checksum: 912befbc1a9853e2770823a1c20a8402 (MD5) Previous issue date: 2011-06-17 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / In Brazil there are over 190 species of bees of the tribe Meliponini, especially Melipona the genre that are more targeted for production of honey and pollen. Among the native species, "the stingless bee" Melipona scutellaris Latreille, 1811 popularly known as the Northeast Uruçu, stands out as economically useful, providing livelihood for several Brazilian families with products that exploit their creation activity called Meliponiculture. However, the creators make the intense multiplication of the hives without regard to the value of the selection or genetic improvement as a factor in increasing productivity. This study aimed to use microsatellite loci to comparing Melipona scutellaris colonies after genetic selection in order to verify a possible correlation between marker and more and less productives colonies. We sampled 30 colonies (five adult worker bees per colony) from an F2 generation classified as less productive and more for honey and pollen maintained and cultured at the Federal University Recôncavo Baiano of meliponary, city Cruz das Almas - BA. The total DNA sample was extracted and amplified by Polymerase Chain Reaction (PCR) using 10 microsatellite loci heterologous to the evaluation and was developed to two M. bicolor and eight developed for M. seminigra. Genotyping was performed with the aid of automated sequencer and data were analyzed with descriptive statistics programs. All microsatellite loci amplification products generated via polymerase chain reaction. The microsatellite loci proved polymorphic with a total of 56 different alleles, with sizes and varying frequency. The loci developed for M. seminigra and amplified the first time in M. scutellaris, showed heterozygosity observed higher and a number of alleles and higher when compared with the number of alleles and observed heterozygosity found in species of origin of the primers. Observed high frequency of alleles in the two classes of colonies. The average observed heterozygosity and mean genetic diversity for all loci analyzed had similar values for the two classes of colonies. Most loci presented in Hardy-Weinberg equilibrium, and the high frequency of alleles found the study for both classes of colonies reinforces the idea that microsatellite markers may be linked to important genes. Observed alleles with frequencies and sizes for both classes. Thus, you cannot safely infer that are related to productivity in M. scutellaris, requiring more research in this area. / No Brasil existem mais de 190 espécies de abelhas da tribo Meliponini, com destaque para o gênero Melipona que são as mais visadas para produção de mel e pólen. Dentre as espécies nativas, a abelha sem ferrão Melipona scutellaris Latreille, 1811 conhecida popularmente como Uruçu do Nordeste, destaca-se como economicamente útil, constituindo sustento de diversas famílias brasileiras que exploram seus produtos com a atividade de criação denominada Meliponicultura. No entanto, os criadores fazem a multiplicação intensa das colméias sem atentar para o valor da seleção ou melhoramento genético como fator de aumento da produtividade. Este trabalho objetivou utilizar locos microssatélites para comparar colônias de Melipona scutellaris após seleção genética visando possível correlação entre marcador e colméias mais e menos produtivas. Foram amostradas 30 colônias (cinco abelhas operárias adultas/colônia) de uma geração F2 classificadas como mais e menos produtivas para mel e pólen, mantidas e cultivadas no meliponário da Universidade Federal do Recôncavo Baiano, cidade Cruz das Almas - BA. O DNA total das amostras foi extraído e amplificado por Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) utilizando 10 locos microssatélites heterólogos para a avaliação, sendo dois desenvolvidos para M. bicolor e oito desenvolvidos para M. seminigra. A genotipagem foi realizada com auxilio de sequenciador automático e os dados obtidos analisados em programas de estatística descritiva. Todos os locos microssatélites geraram produtos de amplificação via PCR. Os locos microssatélites se mostraram polimórficos com um total de 56 alelos diferentes, com tamanhos e frequências variadas. Os locos desenvolvidos para M. seminigra e amplificados pela primeira vez em M. scutellaris, apresentaram heterozigosidade observada superior e um número de alelos maior quando comparado com o número de alelos e heterozigosidade observada encontrados na espécie de origem dos primers. Observou-se alelos de alta frequência nas duas classes de colônias. A média da heterozigosidade observada e a média da diversidade genética para todos os locos avaliados apresentaram valores próximos para as duas classes de colônias. A maioria dos locos se apresentou em equilíbrio de Hardy-Weinberg e, pelas altas frequências de alelos encontrados nas duas classes de colônias reforçam a idéia que microssatélites podem estar ligados a genes importantes. Observaram-se alelos exclusivos com frequências e tamanhos variados para ambas as classes. Desta forma, não é possível inferir com segurança que estejam relacionados com a produtividade em M. scutellaris, necessitando de mais estudos nesta área.

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 451400.pdf: 16861193 bytes, checksum: 8e59e1dc262f6d66b6ff62e7eca281b9 (MD5) Previous issue date: 2013-07-30 / Human tuberculosis (TB) is a major global health threat. The disease s increasing prevalence, coupled with the emergence of drug-resistant strains and the devastating effects of co-infection with human immunodeficiency virus (HIV) indicate an urgent need for the development of new and more efficient drugs to combat the disease's causative agent, Mycobacterium tuberculosis. Global health authorities have also begun to recognize the need for drugs that can kill the mycobacteria in its different physiological states including but not limited to latent TB infection. A more comprehensive understanding of the bacilli's nucleotide metabolic pathways, in particular purine and pyrimidine salvage pathways, could aid in the development of new therapeutic strategies to reduce the incidence of TB worldwide. Nucleoside hydrolase catalyzes the irreversible hydrolysis of N-glycosidic bond of ribonucleosides, forming α-D-ribose and the corresponding base. This work describes the amplification, cloning, expression and purification of the iunH-encoding purine nucleoside hydrolase from M. tuberculosis (MtIAGU-NH). Results from steadystate kinetic experiments indicate that MtIAGU-NH has broad substrate specificity, accepting inosine, adenosine, guanosine, and uridine as substrates. Kinetics analysis utilizing fluorescence spectroscopy of ribose binding to MtIAGU-NH suggests that prior to ligand association there are two pre-existing forms of the enzyme. We determined the intracellular concentrations of inosine, uridine, hypoxanthine, and uracil as well as the reaction s thermodynamic parameters. Thermodynamic activation parameters (Ea, ΔG#, ΔS#, ΔH#) for the MtIAGU-NH-catalyzed chemical reaction, along with results from mass spectrometry, isothermal titration calorimetry (ITC), pH-rate profile experiments, multiple sequence alignment, and molecular docking experiments are also presented. Knockout experiments of the iunH gene indicate that this gene is not essential for the growth of M. tuberculosis H37Rv underutilized experimental conditions. The data presented here contribute to our understanding of MtIAGU-NH, providing a solid basis for the development of efficient prophylactic and therapeutic strategies to reduce the global incidence of TB. / A tuberculose humana (TB) ? considerada uma amea?a ? sa?de global. O aumento na preval?ncia da doen?a, a emerg?ncia de cepas resistentes e a coinfec??o com o v?rus da imunodefici?ncia humana levaram ? urgente necessidade do desenvolvimento de novas drogas mais eficientes para o combate do agente causativo da TB, Mycobacterium tuberculosis. Al?m disso, h? a necessidade de novas drogas contra a micobact?ria nos seus diferentes estados fisiol?gicos, incluindo a TB latente. Um maior entendimento sobre as vias metab?licas de nucleot?deos do bacilo da TB, em particular as vias de salvamento de purinas e pirimidinas, levariam ao desenvolvimento de novas estrat?gias terap?uticas para controlar a incid?ncia global de TB. A hidrolase de nucleos?deos catalisa a hidr?lise irrevers?vel da liga??o N-glicos?dica de ribonucleos?deos, dando origem ? α-D-ribose e sua base livre correspondente. Este trabalho descreve a amplifica??o e clonagem do gene iunH, e a express?o e purifica??o da enzima recombinante hidrolase de nucleos?deos pur?nicos de M. tuberculosis (MtIAGU-NH). Os resultados de cin?tica no estado estacion?rio mostram que a MtIAGU-NH possui uma ampla especificidade pelos substratos, utilizando inosina, adenosina, guanosina e uridina como substratos. As medidas cin?ticas da liga??o da ribose ? MtIAGU-NH por espectroscopia fluorim?trica sugerem a exist?ncia de duas formas da enzima em equil?brio, relacionadas ? associa??o ao ligante. As concentra??es intracelulares de inosina, uridina, hipoxantina e uracil foram determinadas e os par?metros termodin?micos, estimados. Os par?metros termodin?micos de ativa??o (Ea, ΔG#, ΔS#, ΔH#) para a rea??o qu?mica catalisada pela MtIAGU-NH, al?m dos resultados de espectrometria de massa, calorimetria de titula??o isot?rmica, experimento de perfil de pH, alinhamento de m?ltiplas sequ?ncias e experimentos de docagem molecular tamb?m s?o apresentados neste trabalho. O nocaute do gene iunH mostrou que este n?o ? essencial para o crescimento do bacilo M. tuberculosis H37Rv nas condi??es experimentais empregadas. Os resultados aqui descritos dever?o ser ?teis para um melhor entendimento sobre a enzima MtIAGU-NH, fornecendo bases s?lidas para o desenvolvimento de estrat?gias terap?uticas e preventivas para diminuir a incid?ncia global da TB.

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 451784.pdf: 974193 bytes, checksum: b53f42e8acb1653e7c655d1d1345a38b (MD5) Previous issue date: 2013-03-27 / Annexin V is an endogenous human protein Ca+2 dependent, with a molecular weight of 35.8 kDa, widely distributed intracellularly, with very high concentrations in the placenta and lower concentrations in endothelial cells, kidneys, myocardium, skeletal muscle, skin, red cells, platelets and monocytes. Annexin V binds preferably to phosphatidylserine, a phospholipid commonly present on inner leaflet of lipid bilayer, which during cell apoptosis is translocated to outer leaflet of cell membrane. Despite of Annexin V is a relatively large protein, it was shown early on that the protein can be internalized at sites of ischemic injury both in the heart and in the brain and cross the intact blood-brain barrier, being increasingly used as a tool to detect apoptosis in several diseases such as Alzheimer and Ischemia and in drug. Therefore, production of recombinant human Annexin V using recombinant DNA technique along with High Cell Density Culture and protein purification becomes applicable to commercialize it in Brazil, increasing and facilitating the access of pharmaceutical industries and research laboratories in purchase product. We developed a protocol to produce recombinant human annexin V in large scale, in which approximately 20 mg of recombinant protein was yielded from 3 g of E. coliBL21(DE3) wet cells. N-terminal amino acid sequencing and massspectrometry analysis provided evidence for the identity and purity of therecombinant protein, as well as an apoptosis/necrosis in vitro detectionkit produced performed similarities with an imported commercialized kit in Brazil. / A Anexina V ? uma prote?na humana end?gena dependente de Ca+2, com peso molecular de 35,8 kDa, amplamente distribu?da intracelularmente em altas concentra??es na placenta e em concentra??es mais baixas nas c?lulas endoteliais, renais, mioc?rdicas, epiteliais, esquel?ticas musculares, eritr?citos, plaquetas e mon?citos. Apresenta como principal caracter?stica a capacidade de se ligar ? fosfatidilserina, um fosfolip?deo presente na camada interna da bicamada lip?dica, que durante a apoptose celular ? translocada para a camada externa da membrana celular. Apesar de ser uma prote?na de tamanho relativamente grande, a Anexina V apresentou a capacidade de penetrar em s?tios de inj?ria isqu?mica tanto mioc?rdica quanto cerebral, atravessando a Barreira Hemato-Encef?lica, sendo cada vez mais utilizada para dete??o de apoptose em diversas doen?as como Alzheimer e Isquemia e em monitoramento de drogas antic?ncer. Por esses motivos, se torna relevante a produ??o da prote?na Anexina V humana atrav?s da t?cnica do DNA recombinante em larga escala para que possa ser comercializada no Brasil, aumentando e facilitando o acesso de laborat?rios de pesquisa e ind?strias farmac?uticas na aquisi??o deste produto. Desenvolvemos um protocolo para cultivoem biorreator de grandes quantidades de Anexina V recombinante, no qual aproximadamente 20 mg de prote?na recombinante podem ser obtidos a partir de 3 g de c?lula ?mida de E. coli BL21(DE3). As an?lises porsequenciamento N-terminal de amino?cidos e espectrometria de massas proveram evid?ncias para a identidade e pureza da prote?na recombinante, assim como um desenvolvimento de um kit para marca??o de apoptose in vitro apresentou muita semelhan?a com outro kit importado j? comercializado no Brasil.

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 451788.pdf: 1287455 bytes, checksum: d1990d71c198ca3db981a675db0e192b (MD5) Previous issue date: 2013-03-27 / The granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) is a major hematopoietic cytokine involved in the immune defense against infectious agents, stimulating and regulating the proliferation, survival and differentiation of neutrophils precursor cells in the bone marrow. The G-CSF molecule has a 174 amino acids sequence, with a molecular weight of approximately 18.8 kDa. As a strategy for neutropenia prevention, G-CSF (or filgrastim) has been successfully used in cancer patients whose treatment requires high doses of chemotherapy, in both adults and children. Moreover, this biopharmaceutical may be used to strengthen the immune system in patients with HIV, pneumonia, infections resulting from diabetes, leukemia and febrile neutropenia. Currently, filgrastim is not produced in Brazil, which obligates the government to import this medicine. Due to its wide clinical application, the large scale production of G-CSF is required to supply the demand of national market. In this work, a protocol to obtain this protein was developed using overexpression and cultivation in a bioreactor, solubilization and purification of recombinant G-CSF. The protein was expressed in Escherichia coli host cells C41(DE3) cultures grown in bioreactor using a fed-batch strategy. The expression of the recombinant protein was induced by IPTG. A linear ascending feeding strategy permitted high plasmid stability, low accumulation of acetate in the culture medium, a biomass of approximately 31 g/ L and high expression levels of the protein in the form of inclusion bodies which were solubilized using 2 M urea and alkaline pH. The recombinant protein was purified and yielded approximately 1.22 mg of homogeneous recombinant protein per gram of wet cells, corresponding to a volumetric yield of 151.5 mg of rhG-CSF per liter of culture medium. A mass spectrometry analysis was performed, confirming the identity of the recombinant protein. Our work shows a simple and effective strategy to obtain recombinant hG-CSF, stimulating and encouraging a future production of a national biosimilar. / O fator estimulador de col?nias de granul?citos (G-CSF) ? uma das principais citocinas hematopoi?ticas envolvidas na defesa do sistema imune contra agentes infecciosos, estimulando e regulando a prolifera??o, sobreviv?ncia e diferencia??o das c?lulas precursoras de neutr?filos na medula ?ssea. ? uma mol?cula que possui uma sequ?ncia de 174 amino?cidos, com peso molecular de aproximadamente 18,8 kDa. Como estrat?gia de preven??o da neutropenia, o G-CSF (ou filgrastima) ? utilizado clinicamente com sucesso em pacientes com c?ncer, cujo tratamento requer altas doses de quimioterapia, tanto em adultos como em crian?as. Al?m disso, o G-CSF pode ser utilizado para refor?ar o sistema imunol?gico em pacientes com HIV, pneumonia, infec??es decorrentes da diabetes, leucemia e neutropenia febril. Atualmente, a filgrastima n?o ? produzida no Brasil, consequentemente, todo medicamento adquirido pelo governo ? importado. Tendo em vista sua ampla aplica??o cl?nica, a produ??o em larga escala do G-CSF se faz necess?ria para suprir a demanda do mercado nacional e diminuir os custos com importa??o desse biof?rmaco. Neste trabalho um protocolo para a produ??o desta prote?na foi desenvolvido, utilizando t?cnicas de DNA recombinante por meio de experimentos de superexpress?o e cultivo em biorreator, solubiliza??o e purifica??o da G-CSF recombinante. A prote?na foi expressa em c?lulas Escherichia coli C41(DE3) em cultivos de batelada alimentada em biorreactor, utilizando indu??o com IPTG e uma estrat?gia de alimenta??o linear ascendente, que nos permitiu obter um alto percentual de estabilidade plasmidial, baixo ac?mulo de acetato no meio de cultivo, uma biomassa de aproximadamente 31 g/ L e elevados n?veis de express?o da prote?na em forma de corpos de inclus?o, que foram solubilizados utilizando ureia 2 M e pH alcalino. A prote?na recombinante foi purificada obtendo-se aproximadamente 1,22 mg de prote?na recombinante homog?nea por grama de c?lulas ?mida, correspondendo a um rendimento volum?trico de 151,5 mg de rhG-CSF por litro de meio de cultura. Uma an?lise por espectrometria de massa tamb?m foi realizada, confirmando a identidade da prote?na recombinante. Nosso trabalho mostra uma estrat?gia simples e eficaz para obter hG-CSF recombinante, contribuindo e estimulando a futura produ??o de um biossimilar nacional.

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 451789.pdf: 1080623 bytes, checksum: 53f3af2f0b9cc2bca520b792d55bcc75 (MD5) Previous issue date: 2013-03-27 / Somatotrophin or growth hormone (GH) is a hormone synthesized and secreted by the anterior pituitary gland in all animals and their secretion is controlled by two neuropeptides: the growth hormone releasing factor (GRF), which increases GH synthesis and secretion and somatostatin (SRIF), which inhibits GH secretion. bGH has galactopoietic effect, which is known since the thirties. The mechanism of action of bGH involves a series of orchestrated changes in the metabolism of body tissues so that more nutrients can be used for milk synthesis and these changes allow the animal to achieve an increased milk yield while remaining healthy. Long term studies (10 12 weeks) demonstrated increase in milk yield up to 40% with no adverse effects in the treated cows. E. coli is currently the largest platform for expression of heterologous proteins and high cell-density culture techniques for culturing E. coli are designed to increase productivity of proteins. This system is widely used for production of various recombinant proteins available in the market. In this work were performed bioreactor cultivations using fed batch techniques, testing different feeding strategies and different IPTG induction times. At the end of the experiments the biomass obtained was 32.4 g/L using a linear feeding strategy. Approximately 2.5 mg of bGH were obtained from 1 g of wet cell using a purification protocol with only one chromatographic column. / Somatotropina ou horm?nio de crescimento trata-se de um horm?nio natural secretado pela gl?ndula pituit?ria. Sua secre??o ? controlada por dois neuropept?deos secretados pelo hipot?lamo, o fator liberador de somatotropina, que aumenta a secre??o de horm?nio de crescimento e a somatostatina que inibe a sua secre??o. O horm?nio de crescimento bovino possui efeito galactopoi?tico, o que ? conhecido desde a d?cada de 30. Seu mecanismo de a??o envolve uma s?rie de mudan?as no metabolismo, direcionando mais nutrientes para a s?ntese de leite, sendo que o aumento na produ??o de leite ? alcan?ado sem prejudicar a sa?de do animal. Resultados de pesquisa demonstram que o horm?nio de crescimento bovino pode aumentar a produ??o de leite de 6% a 40% e a efici?ncia de utiliza??o de alimentos em bovinos. A produ??o de leite no Brasil aumentou cerca de 5 vezes desde 1975 at? 2011, e estima-se que existam 23 mil vacas leiteiras no pa?s, demonstrando o potencial mercado para o uso da somatrotopina bovina. E. coli ? atualmente a maior plataforma para express?o simples de prote?nas heter?logas, principalmente por ser um sistema bem caracterizado. Cultivos de alta densidade s?o desenvolvidos para aumentar a produtividade de prote?nas, sendo amplamente utilizados para produ??o de diversas prote?nas recombinantes dispon?veis no mercado. Neste trabalho foram realizados cultivos de E. coli em biorreator por meio de t?cnicas de batelada alimentada, testando diferentes estrat?gias de alimenta??o e tempos de indu??o com IPTG. Ao final dos experimentos a biomassa obtida foi de 32,4 g/L usando uma estrat?gia de alimenta??o linear. Aproximadamente 2,5 mg de bGH foram obtidas a partir de 1 g de c?lula ?mida usando um protocolo de purifica??o com apenas uma coluna cromatogr?fica.

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 459166.pdf: 2547388 bytes, checksum: 27814fb2b5f7b670424cdc2d80523d6f (MD5) Previous issue date: 2014-03-06 / Disturbances in glutamatergic signaling have been proposed as the cause of many diseases of the nervous system. The zebrafish has been considered as an efficient model in the investigation of the neurochemical basis of various disorders, such as schizophrenia and epilepsy. Several neurotransmitter systems have been characterized in zebrafish, including the glutamatergic system. Moreover, a vast repertoire of behavioral responses to drugs has been characterized in particular in adults. However, little information is available about the ability to generate response to classic drugs of glutamatergic action in the early stages of development in zebrafish. Throughout development, ionotropic glutamate receptors have an orderly variability between the subunits that compose them, giving them different pharmacokinetic properties and degree of affinity for their ligands. In this way, we analyzed the locomotor/behavioral profile of zebrafish in response to the glutamate receptor antagonist, MK-801, in different doses in 30, 60, 120 days post-fertilization (dpf) and 2 years post-fertilization animals, as well the effect of caffeine pre-exposure on MK-801 action. Additionally, we analyzed the expression profile of subunits that comprise the NMDA receptor in whole brain of zebrafish during development. Locomotor/behavioral response to kainic acid (KA) was evaluated in different doses at ages 7, 15 and 30 dpf. Also, the pre-exposure to kainic acid in 24 hours post-fertilization (hpf) and 7 and 15 dpf animals was challenged by a second exposure to kainic acid at 2 months post-fertilization The results demonstrated that zebrafish has an age-dependent response to MK-801 and kainic acid, at least on the locomotor/behavior aspects. The peak of locomotor response to MK-801 occurred at 60-120 days post-fertilization, which was partially prevented by caffeine and able to alter the time on upper zone of aquarium as a measure of anxiety. Analysis of gene expression of NMDA receptor subunits in zebrafish brain demonstrated that NR2C and NR2D subunits have later expression in comparison to subunits NR1, NR2A and NR2B. The animals that were exposed to KA showed alterations in locomotor activity without displaying classic convulsive characteristics. However, pre- exposure to 7dpf KA was able to partially prevent the seizure events in response to KA injection (6 mg / K) at 2 months post- fertilization. / Dist?rbios na sinaliza??o glutamat?rgica s?o propostos como a causa de in?meras patologias do sistema nervoso. O peixe-zebra tem sido considerado um eficiente modelo na investiga??o das bases neuroqu?micas de diversos transtornos, tais como a esquizofrenia e a epilepsia. Diversos sistemas de neurotransmiss?o j? foram caracterizados em peixe-zebra, incluindo o sistema glutamat?rgico. Al?m disto, um vasto repert?rio de respostas comportamentais a f?rmacos j? foram caracterizados em especial em indiv?duos adultos. Entretanto, pouca informa??o ? dispon?vel a cerca da capacidade de gerar resposta a cl?ssicas drogas de a??o glutamat?rgica em fases iniciais do desenvolvimento em peixe-zebra. Ao longo do desenvolvimento, os receptores glutamat?rgicos apresentam uma ordenada variabilidade entre as subunidades que os comp?em, o que lhes confere diferentes propriedades farmacocin?ticas e grau de afinidade por seus ligantes. Desta forma, neste trabalho foi analisado o perfil de resposta locomotora/comportamental do peixe-zebra ao antagonista glutamat?rgico MK-801 em diferentes doses nas idades de 30, 60, 120 dias p?s-fertiliza??o (dpf) e 2 anos p?s-fertiliza??o(apf), bem como o efeito da pr?-exposi??o ? cafe?na sobre os efeitos do MK-801. Adicionalmente, foi analisado o perfil de express?o das subunidades que comp?em o receptor NMDA em c?rebro total de peixe-zebra ao longo do desenvolvimento. A resposta locomotora ao ?cido ca?nico (KA) tamb?m foi avaliada em diferentes doses nas idades de 7, 15 e 30 dpf. A pr?-exposi??o ao ?cido ca?nico em animais de 24 horas p?s-fertiliza??o (hpf) e 7 e 15 dpf foi confrontada pela exposi??o ao ?cido ca?nico aos 2 meses de vida do peixe-zebra. Os resultados encontrados neste trabalho demonstram haver uma resposta idade-dependente na atividade locomotora do peixe-zebra, tanto para MK-801 quanto para ?cido ca?nico. O pico de resposta locomotora ao MK-801 foi entre 60 e 120 dpf, o qual foi parcialmente prevenido pela pr?-exposi??o ? cafe?na e foi capaz de alterar de forma idade-dependente o tempo no topo do aqu?rio, utilizado como uma medida de ansiedade. A an?lise de express?o das subunidades dos receptores NMDA em c?rebro de peixe-zebra demonstrou que as subunidades NR2C e NR2D possuem express?o tardia em rela??o ?s subunidades NR1, NR2A e NR2B. Os animais que foram expostos ao KA apresentaram altera??o na atividade locomotora sem exibir caracter?sticas convulsivas cl?ssicas. Entretanto, a pr?-exposi??o ao KA aos 7dpf foi capaz de prevenir parcialmente os eventos convulsivos em resposta ? inje??o de KA (6 mg/Kg, i.p) aos 2 meses p?s-fertiliza??o.

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METODOLOGIA: Participaram do estudo 50 pacientes de ambos os sexos, submetidos à endoscopia digestiva alta com biópsia. Teste da urease e estudo histológico foram feitos para identificação e confirmação da infecção pela bactéria. Trinta e cinco amostras foram encaminhadas para o laboratório de Imunopatologia do NMT-UFPA para estudo de expressão gênica dos fatores de transcrição dos linfócitos T (ROR- γ, FOXP3 e GATA3) pelo método RT-PCR. RESULTADOS: Obtivemos 48,5% de pacientes H. pylori positivos no teste da urease e 25,7% de H. pylori positivos no estudo histológico. A concordância de positividade para o H. pylori realizada pelos dois testes ocorreu em 11,7%. Relato de infecção prévia pelo Helicobacter pylori foi feito por 22% dos indivíduos da amostra. A idade e gênero dos indivíduos da amostra não influenciaram na expressão gênica dos fatores estudados. Houve maior expressão do gene GATA3 nos indivíduos H. pylori positivos, com relato de infecção prévia e que apresentaram gastrite leve erosiva de corpo classificada pelo Sistema Sydney via endoscopia digestiva alta. O gene ROR- γ apresentou-se com expressão aumentada somente ao compararmos amostras com ou sem positividade pelo H. pylori (estudo histológico), com a topografia do processo inflamatório evidenciado pela endoscopia. As expressões dos fatores em estudo apresentaram-se com maior significância, quando foi usado o gene constitutivo β-actina como padrão quando comparado com o gene GAPDH. CONCLUSÕES: 1- A faixa etária adulta analisada em nossa amostra, não influenciou na expressão gênica dos fatores de transcrição estudados. 2- Não houve diferenças encontradas nas expressões dos genes em estudo com relação ao gênero dos indivíduos participantes da amostra. 3- Houve expressão gênica significante tanto nos pacientes H. pylori positivos (análise histológica), como nos pacientes que relataram infecção prévia em nosso estudo. 4- Ao compararmos os achados endoscópicos da amostra, utilizando o Sistema Sydney, com a expressão gênica dos fatores de transcrição em estudo, obtivemos maior concordância somente em relação ao grau de atividade das gastrites. 5- O fator de transcrição GATA3 (perfil de resposta TH2) foi o gene de maior expressão nas amostras com gastrites endoscópicas e com positividade para o H. pylori. 6- O fator de transcrição ROR-γ (perfil de resposta TH17) apresentou-se com expressão aumentada ao compararmos as amostras com a topografia do processo inflamatório evidenciado pela endoscopia, independente da positividade pelo H. pylori (estudo histológico). 7- O gene da β-actina como gene-padrão constitutivo utilizado em nosso estudo foi o que mais apresentou resultados significativos nas expressões quantificadas, quando comparado com o gene GAPDH. / INTRODUCTION: Helicobacter pylori is known for its adaptability to the host may progress to chronic infection using diverse and effective mechanisms of pathogenicity. It has high worldwide incidence and its direct relationship with peptic ulcer, gastritis, gastric carcinoma and lymphoma occurs in a minority of infected individuals. A better understanding of the genetic regulation of gastric immune response, motivated this investigation. OBJECTIVES: Describe the transcription factors of T lymphocytes positive for ROR-γ, FOXP3 and GATA3, correlating them with the intensity, type and degree of activity of gastritis, caused by H. pylori infection METHODS: The study included 50 patients of both sexes who underwent upper gastrointestinal endoscopy with biopsy. Urease test and histology were made for identification and confirmation of infection by the bacteria. Thirty-five samples were sent to the immunopathology laboratory NMT-UFPA to study gene expression of transcription factors of T lymphocytes (ROR- γ, FOXP3 and GATA3) by RT-PCR method. RESULTS: We obtained 48.5% positive H. pylori urease test in patients and 25.7% positive of H. pylori in the histological study. The confirmation of H. pylori held by these two exams was 11.7%. In this sample, 22% of individuals reported having a previous Helicobacter pylori infection. The age and gender of the individuals did not influence the gene expression of the studied factors. The H. pylori positive individuals showed a higher expression of the GATA3 gene with prior infection report, and mild erosive gastritis body classified by the Sydney system via endoscopy. The ROR-γ gene presented with increased expression only when comparing samples with or without positive for H. pylori (histology), by the topography of the inflammatory process evidenced by endoscopy. The terms of the factors in the study were more significant when we used the β-actin gene as standard when compared to the GAPDH gene. CONCLUSIONS: The adult age group analyzed in our sample did not influence the gene expression of the studied transcription factors. 2- There were not found differences in the genes expressions that were studied, related to gender of the sample. 3- There was a significant gene expression not only in the patients that were H. pylori positive (histology), but also in the ones who reported previous infection in our study. 4-To compare the endoscopic findings of the sample using the Sydney system with the gene expression of transcription factors under study, we obtained better agreement only in the degree of activity of gastritis. 5- The transcription factor GATA3 (TH2 response profile) was the highest gene expression in samples with endoscopic gastritis and tested positive for H. pylori. 6- The transcription factor ROR-γ (TH17 response profile) presented with increased expression when comparing samples with the topography of the inflammatory process evidenced by endoscopy, regardless of positive H. pylori (histology). 7- The gene β-actin gene as a constituent standard used in our study was that showed significant results in quantified terms, when compared to the GAPDH gene.

Els nutrients són els factors tràfics més importants per al llevat, i la sevalimitació provoca una aturada del cicle en la fase G1. Aquesta resposta d'adaptació alscanvis nutricionals del medi assegura la màxima viabilitat de la cèl·lula, i permet l'inicide diferents processos de diferenciació segons les condicions nutricionals.El cicle cel·lular de Saccharomyces cerevisiae està regulat en diferents puntsper mecanismes de control intern que asseguren la proliferació sense cap anomalia enels diferents processos cel·lulars. Al final de fa fase G1, si les condicions nutricionalssón òptimes, es dóna el compromís de continuar el cicle fins a la propera fase G1. Lavia de senyalització de la limitació de nutrients essencials com la font de nitrogenencara no havia estat determinada. Hem estudiat la regulació de les ciclines de faseG1 en el model de limitació de font de nitrogen, i hem demostrat que la proteïna Cln3està regulada post-transcripcionalment de dues formes diferents: una majorinestabilitat que depèn de la via de la ubiquitina, i una inhibició traduccional queprovoca la total desaparició de Cln3, causant així la repressió de gens dependents deSBF i MBF en la següent fase G1. La presència de Sic1, l'inhibidor de complexesClb/Cdc28, permet explicar en termes moleculars l'aturada en G1.En condicions de limitació nutricional les cèl·lules diploides també s'aturen enG1, però inicien un procés diferenciador anomenat meiosi, que implica la replicado delDNA, dues divisions meiòtiques i la formació d'espores com a unitats de resistència acondicions adverses. La proteïna Ime1 és la principal inductora de tots els processosde meiosi i activa l'expressió del primer grup de gens que participen en la replicadopremeiòtica del DNA. En aquest treball mostrem que, en les condicions nutricionals enque es dóna la meiosi, les ciclines G1 desapareixen ràpidament, però d'altra banda esprodueix una alta expressió de CLB5 que depèn d'Imel. Els nivells de Sic1disminueixen, de manera també dependent d'Imel, el que indica un mecanisme deregulació d'entrada en la fase S premeiòtica molt semblant al cicle mitòtic, però induitper Ime1 enlloc de Cdc28/Cln3. En mutants cln la meiosi pot iniciar-se en medi ric, elque implica a les ciclines G1 com a mediadores d'un senyal nutricional sobre l'inici dela meiosi. Les ciclines G1 inhibeixen la via Ime1 mitjançant dos controls negatius:repressió transcripcional d'IMEI, i inhibició de l'acumulació en el nucli d'Imel,reprimint així l'expressió del gens meiòtics. Aquests resultats demostren l'existènciad'un control negatiu dels activadors clau de la mitosi sobre els de la meiosi, fent queaquestes dues opcions del cicle cel·lular siguin incompatibles.

El present estudi s'ha plantejat per aprofundir en la influència de l'equilibri redox en aspectes de la biologia tumoral com són el metabolisme oxidatiu i el creixement cel·lular; a més a més, d'avaluar la importància de les espècies reactives d'oxigen en l'eficàcia de la quimioteràpia i establir la rellevància de la intensitat de l'estrès oxidatiu en la superació de la quimioresistència a fàrmacs convencionals. Els nostres resultats mostren que les diferències en l'estrès oxidatiu s'expressen segons el grau de diferenciació cel·lular i entre regions d'un mateix tumor. L'estat redox cel·lular, així com la resposta immediata al desequilibri oxidatiu generat, són factors determinants tant del creixement de la cèl·lula cancerosa com de l'eficàcia d'alguns agents antitumorals.En conclusió, els moduladors redox capaços de potenciar l'acció pro-oxidant de fàrmacs anticancerosos podrien tenir un potencial benefici per controlar el creixement de les cèl·lules canceroses i sensibilitzar-les novament a l'acció d'agents antitumorals clàssics