As espécies reativas de oxigênio geradas in vivo têm sido implicadas em vários mecanismos como apoptose, crescimento e diferenciação celular, câncer e inflamação. O estresse oxidativo é o produto do desbalanço entre os agentes prooxidantes e antioxidantes celulares, causando danos por meio da peroxidação lipídica, oxidação de proteínas e de DNA. Neste trabalho avaliou-se o efeito do estresse oxidativo em glândulas submandibulares de rato e em células acinares dispersas tratadas com isoproterenol (ISO), cicloheximida (CHX), carbacol (CA) e propanolol (PROP). Observou-se aumento dos níveis de MDA em homogenados de glândulas de ratos tratados com ISO e CHX e em células acinares dispersas incubadas com ISO e CHX. Tratamentos semelhantes causaram aumento na oxidação protéica em cultura de células, mas o mesmo aumento não ocorreu in vivo. Em relação aos agentes antioxidantes, observou-se um aumento no poder redutor (conteúdo de GSH) em homogenados de glândulas submandibulares tratadas com ISO e em células dispersas incubadas com ISO. A atividade de superóxido dismutase (SOD) também aumentou em tratamentos com ISO in vivo e os \"Western Blots\" mostraram uma variação acentuada nos níveis protéicos da isoforma MnSOD. A atividade de SOD, induzida por ISO em células dispersas, não ocorre quando as células foram pré-incubadas com PROP, o que sugere a ativação da atividade de SOD via receptores β-adrenérgicos. / Reactive oxygen species (ROS) have been implicated in many mechanisms as apoptosis, cell growth and differentiation, cancer and inflammation. Oxidative stress is the product of the imbalance of the prooxidants and antioxidants agents within the cell and it has been shown to cause damage by producing peroxidation of fatty acid and oxidation of proteins and DNA. In this work the oxidative stress was evaluated on rat submandibular glands and on dispersed acinar cells treated with isoproterenol (ISO), cycloheximide (CHX), carbachol (CA) and propanolol (PROP). The level of lipid peroxidation on rats submandibular glands and on dispersed acinar cells were increased by ISO and CHX treatment. Protein oxidation level was increased on cell culture treated with ISO, but the same results was not found in vivo treatments. Regards the antioxidant agents, the GSH content was found to increase on both in vivo and on cell culture by ISO treatment. The superoxide dismutase (SOD) activity in vivo increased and the Western Blots showed a significant MnSOD variation level. The SOD was induced by ISO treatment on cell culture, but the same increasing was not found with previous cells treatment with PROP. This result suggest the involvement of a β-adrenergic receptor on SOD activity.

Orientador: Marinônio Lopes Cornélio / Banca: Hamilton Cabral / Banca: Marcelo Andrés Fossey / Resumo: Os flavonóides são uma grande classe de polifenóis ocorrendo de forma natural amplamente distribuídos nas plantas, essas moléculas exibem algumas atividades farmacológicas importantes como anti-inflamatória, antioxidante, anticancerígena e antibacteriana. A interação entre os flavonóides Rutina (Ru) e Guaijaverina (Gua) e a Albumina do Soro Humano (HSA) em pH 7,0 fisiológico foi investigado usando a técnica de espectroscopia de fluorescência de estado estacionário, cálculo ab initio e de modelagem molecular. A partir da supressão de fluorescência da HSA pelos flavonóides, a constante de supressão de Stern-Volmer ( SVK ) e sua forma modificada ( aK ) foram calculadas em 298, 303 e 308 K, como também os parâmetros termodinâmicos correspondentes H, G e S, para cada flavonóide. A análise do equilíbrio de ligação foi utilizada para determinar os valores do número de sítios de ligação ( n ) e a constante de ligação ( bK ) para a Rutina e a Guaijaverina em 298, 303 e 308 K. A distância média entre o doador (HSA-214Trp ) e o aceitador (Ru e Gua) foi estimada de acordo com a teoria de transferência de energia ressonante fluorescente. A otimização geométrica dos flavonóides Rutina e Guaijaverina foi realizada nos seus estados fundamentais usando o funcional DFT/B3LYP ab initio com um conjunto de bases 6-31G(d,p) utilizado nos cálculos. O cálculo de modelagem molecular indica que os flavonóides se localizam no sítio I da HSA, dentro do bolso hidrofóbico do subdomínio IIA. Os resultados teóricos obtidos pela modelagem molecular corroboram com os dados de espectroscopia de fluorescência / Abstract: Flavonoids are a large class of naturally occurring polyphenols widely distributed in plants, these molecules exhibit some important pharmacological activities like anti-inflammatory, antioxidant, anticancer, and antibacterial. The interaction between Rutina and Guaijaverin flavonoids and Human Serum Albumin (HSA) at physiological pH 7.0 was investigated by using the technique of fluorescence spectroscopy, ab initio and molecular modeling calculation. From the fluorescence quenching of the HSA by flavonoids, the Stern-Volmer quenching constant ( SVK ) and its modified form ( aK ) were calculated at 298, 303 and K308, as well as the corresponding thermodynamic parameters H, G and S, for each flavonoid. Analysis of binding equilibria was utilized to determine the number of binding sites ( n ) and binding constants ( bK ) values for Rutin and Guaijaverin at 298, 303 and K308 . The average distance between donor (HSA-214Trp ) e acceptor (Ru and Gua) was estimated according to the theory of fluorescence resonance energy transfer. The geometry optimization of Rutin and Guaijaverin flavonoids was performed in its ground state by using ab initio DFT/B3LYP functional with a 6-31G(d,p) basis set applied in calculations. Molecular modeling calculation indicated that the flavonoids are located in site I of HSA, within the hydrophobic pocket of the subdomain IIA. The theoretical results obtained by molecular modeling are corroborated by the fluorescence spectroscopy data / Mestre

Orientador: José Roberto Ruggiero / Coorientador: Jorge Chahine / Banca: Manoel de Arcísio Miranda Filho / Banca: Pedro Pascutti / Banca: Ronaldo Junio de Oliveira / Banca: Alexandre Sumán de Araújo / Resumo: A anandamida é uma molécula anfipática que tem papel fundamental nas funções neurofisiológicas, sendo o agonista endógeno dos receptores canabinóides conhecidos como CB1 e CB2, os mesmos receptores dos compostos psicoativos da Cannabis sativa. Estudos mostram que a anandamida é capaz de realizar suas funções neurofisiológicas mesmo com seus receptores inativos, sugerindo uma atuação independente de receptores. Essa hipótese aliada com a teoria dos lipídios sugere que a anandamida interaja com os fosfolipídios alterando suas propriedades elásticas que levam a uma abertura ou fechamento das proteínas de membrana que são responsáveis por seu efeito biológico. As propriedades elásticas de uma bicamada lipídica podem ser associadas com seu perfil de pressão lateral, dessa forma, para obtermos informações a respeito do modo de ação independente de receptor investigamos como a anandamida particiona em uma bicamada de DOPC e quais propriedades estruturais e elásticas são alteradas por ela. Os resultados mostraram que a preferência do AEA é particionar na bicamada com seus grupos hidrofílicos voltados para a fase aquosa, na posição próxima ao grupo fosfato e éster e mantendo uma estrutura preferencial estendida, onde sua cauda acílica fica protegida das moléculas de água no núcleo hidrofóbico da bicamada. A crescente concentração de AEA não é capaz de alterar significantemente propriedades da membrana como, espessura, área por lipídio e parâmetro de ordem, porém altera... / Abstract: Anandamide is an amphipathic molecule that plays a fundamental role in neurophysiological functions, being the endogenous agonist of the cannabinoid receptors known as CB1 and CB2, the same receptors of the psychoactive compounds of Cannabis sativa. Studies show that anandamide is able to perform its neurophysiological functions even with its inactive receptors, suggesting an independent performance of receptors. This hypothesis allied with the lipid theory suggests that anandamide interacts with the phospholipids by altering its elastic properties that lead to an opening or closing of the membrane proteins that are responsible for its biological effect. The elastic properties of a lipid bilayer can be associated with its lateral pressure profile, so, to obtain information about the receptor-independent mode of action, we investigated how anandamide partitions in a DOPC bilayer and which structural and elastic properties are altered for her. The results showed that the AEA preference is to partition the bilayer with its hydrophilic groups facing the aqueous phase, in the position close to the phosphate and ester group and maintaining an extended preferred structure, where its acrylic tail is protected from the water molecules in the hydrophobic core of the bilayer. The increasing concentration of AEA is not capable of significantly changing membrane properties such as thickness, area by lipid and order parameter, but it significantly alters the lateral pressure profile and ... / Doutor

Orientador: Sandro Roberto Valentini / Banca: Flávio Henrique da Silva / Banca: Nilson Ivo Tonin Zanchin / Banca: Carla Columbano de Oliveira / Banca: Beatriz Amaral de Castilho / Resumo: O Poli ácido glutâmico (PAG) é um poliaminoácido sintético formado por unidades repetitivas de glutamato, que apresentam grupos carboxilas ao longo de sua cadeia principal. A preparação de eletrodos de carbono vítreo modificados com filmes de PAG foi investigada utilizando-se três diferentes procedimentos: eletropolimerização do ácido glutâmico (MONO); deposição direta de poli ácido glutâmico (PAG) e poli ácido glutâmico:glutaraldeído (PAG:GLU) seguida de secagem a temperatura ambiente. Após secagem, o eletrodo modificado foi submetido a ciclos sucessivos entre -0,8 a +2,0 V sob velocidade de varredura de 100 mV s-1. O ácido ascórbico foi usado como composto modelo para os eletrodos modificados, os quais apresentaram um efeito eletrocatalítico na oxidação do mesmo. Os eletrodos modificados foram caracterizados por microscopia de força atômica (AFM) e espectroscopia de impedância eletroquímica (EIS). O recobrimento sobre a superfície pela adição de PAG apresentou a melhor performance exibindo filmes nanoestruturados e uniformes com baixa resistência à transferência de carga. Os eletrodos modificados por filmes PAG foram usados para estudar a oxidação do flavonóide rutina. Os resultados mostraram um par de picos redox em +0,46/+0,43 V, usado para a pré-concentração da rutina. Uma curva analítica foi obtida no intervalo de 0,9 a 9,0 μmol L-1 e o método proposto foi aplicado para análise do antioxidante em formulação farmacêutica. Os eletrodos modificados por filmes PAG foram também usados para determinação de ácido cafêico. Um par de pico redox reversível em +0,42/+0,45 V foi obtido para o ácido cafêico em tampão B-R pH 3,5. O método foi aplicado para a determinação de ácido cafêico em amostra de vinho tinto, detectando nível de concentração de 34,8μg mL-1 sem tratamento prévio da amostra. Os filmes de PAG:GLU foram...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The poly glutamic acid (PAG) is a syntetic poliamonacid composed by repetitive glutamate units that shows carboxylic groups in the long of the principal chain. Films of PAG on the glassy carbon electrode was investigated by three diferents procedures: glutamic acid eletropomelimerization (MONO), direct deposition of the poly glutamic acid (PAG) and poly glutamic acid:glutaraldehyde (PAG:GLU), followed by drying at room temperature. After solvent evaporation, the modified electrode was submitted by cycles sucessives from -0.8 to +2.0 V at scan rate of 100 mV s-1. The ascorbic acid was used as a model compound in the modified electrodes, which presented an electrocatitic effect in the oxidation of the ascorbic acid. The modified electrodes were characterized by atomic force microscopy (AFM) and electrochemistry impedance spectroscopy (EIS). Coantings by poly glutamic acid onto the surface presented best performance by addition of PAG films that exhibits films nanostructured and uniforms with lower resistance to charge transfer. The modified electrode by PAG films were investigated to oxidation of rutin flavonoid. The results showed a redox pair of peaks at +0.46/+0.43 V, and linear analytical curve at 0.9 to 9.0 x 10-6 mol L-1. The method proposed was successful applied for rutin determination in pharmaceutical formulation. The modified electrode by PAG films was also used to determine cafeic acid. A reversible redox peak pair at +0.42/+0.45 V was obtained for cafeic acid at B-R buffer pH 3,5. The method was applied for cafeic acid determination in the red wine, where the concentration of the 34,8 μg mL-1 was obtained, without any pre-treatment of the sample. The PAG:GLU films onto the glass carbon electrode were also efficient to pre-concetrate and to determine amoxycilin (AMX) and doxorubicin (DXR) in human urine sample. Linear calibration graphs were obtained from 2,0 a 25,0 x 10-6 mol L-1...(Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Eloi da Silva Feitosa / Banca: Rosângela Itri / Banca: Eneida de Paula / Banca: Vera Aparecida de Oliveira Tiera / Banca: Jorge Chahine / Resumo: A utilização de carreadores não virais de fármacos, de baixo custo comercial, requer estudo das propriedades físico-químicas e caracterização desses carreadores. Uma opção para carreador não viral são vesículas de lipídios sintéticos ou naturais, como os catiônicos brometo e cloreto de dioctadecildimetilamônio (DODAB e DODAC) e o zwitterionico dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) respectivamente. O presente estudo apresentam os efeitos dos sais NaCl e NaBr, e da glicose nas propriedades térmicas e estruturais desses lipídios organizados em monocamadas (filmes de Langmuir) ou em bicamadas (vesículas). Foi também investigada ação do copolímero Plurônico F127, como helper, na solubilização da molécula anticancerígena doxorrubicina nas vesículas investigadas, em soro fisiológico, glicosado e caseiro como solvente. A ação desses aditivos nas vesículas e monocamadas é investigada por calorimetria diferencial de varredura, espalhamento dinâmico da luz, espalhamento eletroforético da luz, espectrofotômetro-UV e medidas em cuba de Langmuir. Dentre os resultados obtidos destacam-se a formação e caracterização de vesículas em soro e na presença do copolímero F127 e DOX / Abstract: The use of low cost non-viral carriers of pharmaceutical drugs in medicine requires studies on the physico-chemical properties and characterization of such carriers. An option for non-viral carriers are vesicles formed with synthetic or natural amphiphiles, such as the cationic dioctadecyldimethylammonium bromide and chloride (DODAB and DODAC) and the zwitterionic 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC), respectively. The present study introduces the effect of NaCl, NaBr and glucose on the thermal and structural properties of these lipids organized as monolayers (Langmuir films) or bilayers (vesicles). The action of the micelle-forming triblock copolymer Pluronic F127, as a helper was also investigated, on the solubilization of the anticancer molecule doxorubicin on the vesicles in saline, glucoside and saline/glucoside mixtures. The action of these additives for vesicles and monolayers were investigated by differential scanning calorimetry (DSC), dynamic light scattering (DLS), dynamic electrophoretic light scattering (DELS), UV-Vis spectrophotometry, and Lagmuir Films techniques. Among the results obtained, it is highlighted the formation and characterization of vesicles and monolayers under physiological conditions of the solvent, and in presence of F127 and DOX / Doutor

Orientador: Ana Maria Centola Vidal / Banca: Karina Paes Bürger / Banca: Mirele Daiana Poleti / Resumo: Bacillus cereus sensu stricto (s.s.) tem o potencial de produzir toxinas gastrointestinais, resistir a condições adversas, como tratamentos térmicos e pasteurização; produzir enzimas e formar biofilmes, causando diversos surtos ao redor do mundo relacionados com a sua presença em alimentos contaminados. Entretanto, não é bem elucidado o dano que o tratamento térmico causa à esta bactéria e à sua expressão gênica. Assim, o objetivo deste estudo foi verificar se a pasteurização e o armazenamento em refrigeração ao longo da shelf-life seriam capazes de influenciar a expressão dos genes relacionados com a produção de toxinas diarreicas, proteases e à formação de biofilmes em leite experimentalmente contaminado com B. cereus s.s.. Trinta litros de leite cru foram tindalizados e experimentalmente contaminados com aproximadamente 108 UFC.mL-1 de B. cereus s.s. SAMN07414939 (Bio Project PRJNA390851). Uma amostra foi coletada logo após a contaminação (LTC - T0) e então o leite foi pasteurizado e envasado em embalagens de polietileno com 1L de capacidade (LCP - T1, T2 e T3) e mantido em refrigeração até o momento das análises. Posteriormente, a extração de RNA total das amostras foi realizada, seguido pelo cDNA e qPCR utilizando os genes plcr, hblA, hblC, hblD, nheA, nheB, nheC, cytk e npr para avaliação da expressão gênica. A expressão dos genes se manteve ao longo de toda a shelf-life, sem diferença estatística significativa entre os momentos avaliados para os genes plcr, hblA, hblC,... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Bacillus cereus sensu stricto (s.s.) has the potential to produce gastrointestinal toxins, resists to adverse conditions, such as heat-treatment and pasteurization; the ability to form biofilms and produce enzymes, causing several outbreaks worldwide related to its presence in contaminated food. However, it is not well elucidated what damage the pasteurization causes to this bacterium and its gene expression. Thus, the aim of this study was to verify if pasteurization and storage during shelf-life in refrigeration were able to influence the expression of genes related to the production of diarrheal toxins, proteases and biofilm formation in milk experimentally contaminated with B. cereus s.s. Thirty liters of raw milk were sterilized by tyndallization and experimentally contaminated with 108 vegetative cells of B. cereus s.s. SAMN07414939 (Bio Project PRJNA390851). A sample was collected right after contamination (LTC - 0h); then the milk was pasteurized and then packed in 1 L capacity polyethylene bags and samples LCP - T1, T2 and T3 were collected. Posteriorly, the total RNA were extracted from the samples and the cDNA and qPCR were performed using the primers plcr, hblA, hblC, hblD, nheA, nheB, nheC, cytk and npr for gene expression quantification. The gene expression was maintained along the shelf-life, without significant statistical difference between the moments evaluates for the plcr, hblA, hblC, hblD, nheA, nheB, nheC, cytk and npr gene expression, which persisted wi... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Introducció Existeixen diferències de gènere en la capacitat oxidativa mitocondrial del teixit adipós marró (TAM) i del fetge de rata, que s’atribueixen a la presència de mitocondris més diferenciats i funcionals a les femelles que als mascles. Una situació d’excés de nutrients, com és el cas de l’obesitat dietètica, podria desencadenar un estat d’estrès oxidatiu i alterar el funcionament mitocondrial com a conseqüència de canvis en el procés de biogènesi mitocondrial. Encara que els mecanismes pels quals l’obesitat dietètica modifica el funcionament mitocondrial no estan completament establerts, s’ha suggerit una connexió entre la via de senyalització de la insulina i el procés de biogènesi mitocondrial. Contingut de la investigació L’eix central d’aquesta tesi ha estat l’estudi de la influència del gènere en els efectes que té l’obesitat sobre la funció i biogènesi mitocondrials del TAM i del fetge, i establir la relació amb la sensibilitat tissular a la insulina. Per assolir aquest objectiu, en primer lloc, s’han analitzat els efectes que té l’alimentació crònica amb una dieta hiperlipídica sobre els paràmetres de funció i biogènesi mitocondrials, l’estat redox i els elements claus en la via de senyalització de la insulina al TAM i al fetge de rates d’ambdós gèneres. En segon lloc, s’ha usat un model de rates femella ovariectomitzades per aprofundir en el coneixement de la influència de les hormones ovàriques sobre el procés de biogènesi mitocondrial. Els resultats obtinguts han demostrat que les diferències de gènere en el funcionament mitocondrial poden atribuir-se, en part, a les hormones ovàriques i que els efectes de l’obesitat sobre el funcionament mitocondrial i la sensibilitat a la insulina són dependents del gènere. En comparació amb els mascles, l’alimentació amb la dieta hiperlipídica indueix a les rates femella un major guany de pes corporal, una major acumulació de greix al teixit adipós blanc i un augment de la resistència a la insulina, tant a nivell circulant com en el TAM i del fetge. Per una banda, la pèrdua de sensibilitat a la insulina del TAM de les rates femella pot estar relacionada amb la disminució de la capacitat oxidativa mitocondrial del teixit i amb l’augment del dany oxidatiu. Per altra banda, la incrementada resistència a la insulina en el fetge de les rates femella, i el manteniment d’una major capacitat oxidativa mitocondrial, en comparació als mascles, es poden considerar mecanismes de protecció enfront de la lipotoxicitat hepàtica induïda per la dieta. Conclusió En el seu conjunt, els resultats obtinguts en aquesta tesi demostren que els efectes de l’obesitat sobre el funcionament mitocondrial també depenen del teixit. Mentre que al fetge de les rates d’ambdós gèneres es posen en marxa mecanismes per fer front a l’excés de nutrients que permeten assolir una nova situació d’equilibri i evitar el dany oxidatiu, al TAM només s’observa una resposta compensatòria en els mascles, el que estaria relacionat amb les diferències de gènere observades en el guany de pes corporal.

L'apoptosi s'ha considerat un factor important en el control del balanç entre proliferació cel·lular, diferenciació i mort durant el desenvolupament. La regulació de l'apoptosi és un factor clau per aconseguir aquest balanç, eliminant cèl·lules innecessàries o malmeses que, d'altra manera, podrien tenir efectes adversos per l'organisme. Durant la darrera dècada, molts treballs han demostrat que la senyalització per apoptosi té una funció vital per la morfogènesi del cor. Malgrat això, existeix controvèrsia sobre la implicació de les caspases en la mort dels cardiomiòcits en l'individu adult. Així, l'anàlisi de la regulació de l'apoptosi des d'una perspectiva de desenvolupament podria millorar el nostre coneixement sobre la funció de l'apoptosi al cor. Per tant, els nostres principals objectius han estat caracteritzar la regulació de l'expressió dels gens apoptòtics durant el desenvolupament cardíac i la identificació de les vies alternatives implicades al dany del teixit cardíac. Vàrem analitzar l'expressió de proteïnes implicades al control de la via de mort cel·lular dependent de caspases en teixits provinents de rates de diferents edats entre l'embrió i l'estadi adult. Els gens implicats en l'activació de l'apoptosi es troben fortament silenciats al cor adult i, la major part d'ells, també al cervell, però no al fetge. Les excepcions varen ser Caspasa-2, l'expressió de la qual es reprimeix a tots els teixits estudiats durant la fase embrional, i Bax i Bak, que es silencien en tots els teixits durant el període perinatal. L'expressió de la caspasa iniciadora Caspasa-9 i les caspases executores Caspasa-3 i Caspasa-7 es troba reprimida al cor i cervell postnatals. En relació amb els gens anti-apoptòtics, Bcl-2 es silencia al cor i el cervell durant el desenvolupament i no es va detectar al fetge, mentre que Bcl-XL s'expressa a tots els teixits fins l'estadi adult. Mitjançant l'anàlisi per RT-PCR semiquantitativa vàrem poder observar que la reducció en l'abundància de les proteïnes apoptòtiques durant el desenvolupament té lloc de forma paral·lela amb la reducció en els nivells dels seus mRNA. Durant la isquèmia experimental o el tractament amb la droga pro-apoptòtica estaurosporina, l'activació de la caspasa executora Caspasa-3 va observar-se només als cardiomiòcits embrionaris, però no als cardiomiòcits postnatals o adults. A més a més, la isquèmia va induir fragmentació de l'ADN que no es va poder evitar afegint inhibidors de caspases a cardiomiòcits postnatals en cultiu, que ja expressen nivells molt baixos d'aquests gens. Per continuar amb la investigació sobre la mort dels cardiomiòcits postnatals i el canvi d'una via dependent de caspases a una via independent de caspases durant el desenvolupament del cor, vàrem analitzar el possible rol de diverses DNAses que podrien estar implicades al dany a l'ADN durant la isquèmia. La repressió experimental en cultiu del gen Endonucleasa G (EndoG), que codifica per una nucleasa mitocondrial, va bloquejar la degradació de l'ADN durant la isquèmia, demostrant que EndoG té una funció molt important en aquest esdeveniment, de forma independent a les caspases. La sortida d'EndoG del mitocondri és un pas important per a la fragmentació de l'ADN als cardiomiòcits. Hem demostrat que Bcl -XL és capaç de bloquejar i Bnip3 contribueix a l'alliberament d'EndoG del mitocondri i, així, tenen efectes contraposats en la fragmentació de l'ADN durant la isquèmia als cardiomiòcits diferenciats. També vàrem iniciar l'anàlisi dels mecanismes que controlen l'expressió i silenciament dels gens apoptòtics al cor. Vàrem analitzar la contribució de dos candidats, E2F i les proteïnes d'unió a tractes de polipirimidines (PTB). Al cor, l'expressió d'E2F i PTB es redueix durant el desenvolupament, de forma paral·lela als gens apoptòtics. Malgrat això, l'anàlisi de l'expressió de gens apoptòtics a ratolins deficients per E2F1, E2F2 o tots dos gens no va mostrar cap canvi en relació amb els nivells d'expressió als seus respectius animals control ni durant l'estadi embrional ni durant el desenvolupament postnatal. Aquests resultats varen descartar que E2F tinguin una funció rellevant en el control de l'expressió dels gens apoptòtics al cor, a diferència del que s'ha observat en línies cel·lulars tumorals. D'altra banda, vàrem trobar que, en cardiomiòcits neonatals, que expressen nivells molt baixos de PTB, la sobrexpressió de PTB1 o PTB4 va induir la reexpressió de molts gens apoptòtics, incloent Apaf-1, les caspases-9 i -3, i Bid. A més a més, els cardiomiòcits sobre-expressors de PTB varen patir major dany a l'ADN durant la isquèmia que els cardiomiòcits control i aquest increment podia ser inhibit mitjançant inhibidors de caspases fins a nivells similars als de cèl·lules no sobreexpressores. Això suggereix que la recuperació de l'expressió de PTB, probablement implicant l'increment de l'expressió de gens apoptòtics, va induir un canvi a un mecanisme implicant les caspases. La re-expressió de PTB va induir un increment en la quantitat de proteïnes apoptòtiques sense afectar els nivells dels seus respectius mRNA. Els assaigs luciferasa (Luc) en cardiomiòcits normals i sobre-expressors de PTB, utilitzant plàsmids bicistrònics en els quals es va integrar la regió 5'-no codificant (5'-UTR) dels transcrits d'Apaf-1 o Caspasa-3 entre LucRenilla i LucFirefly, varen demostrar un increment en l'activitat LucFirefly quan qualsevol de les dues 5'-UTR es trobava present, comparat amb els nivells control. Aquests resultats suggereixen que PTB indueixen traducció per la via Internal Ribosolmal Entry Site (IRES), que requereix certes seqüències a les regions 5'-UTR dels gens implicats.

Las neuropatías periféricas representan una de las mayores complicaciones del SNP. Pocos son los fármacos efectivos para su tratamiento y la mayoría se basan en el tratamiento del dolor. Núcleo CMP Forte® es un fármaco compuesto por los nucleótidos (UMP, UDP, UTP y CMP) que se prescribe a pacientes con neuropatías periféricas de diverso origen; sin embargo, se desconoce cuál es su mecanismo de acción. Los resultados de la presente tesis demuestran que la presencia de nucleótidos extracelulares en las células de Schwann provocan una reestructuración del citoesqueleto de actina y aumentos en la adhesión (N cadherina) de forma dependiente a la activación de P2YR y de tres MAPK (JNK, P38 Y ERK1/2). Como conclusión podemos decir que los efectos a través de nuc!eótidos extracelulares podrían beneficiar los procesos de migración y de adhesión en presencia de daño axonal, favoreciendo los primeros contactos intercelulares entre células de Schwann y axones antes de remielinizar y regenerar el daño provocado en el SNP. / Peripheral neuropathies represent one of the most common pathology in the PNS. Currently, there are no efficient treatments for peripheral neuropathies, and the drugs administrated are based in pain treatment. Núcleo CMP Forte® is a drug composed by the nucleotides (UMP, UDP, UTP y CMP) and is prescribed to patients with PNS neuropathies. Despite Núcleo CMP Forte® administration leads to improvement in the patients there is no information about its mechanism of action. Our results demonstrated that extracellular nucleotides change actin organization and cellular adhesion (N cadherin) in Schwann cells. They depend on UTP-induced P2YR and MAPK (ERK1/2, JNK and P38) activation. To sum up, extracellular nucleotides effects could be beneficial in migration and adhesion processes promoting the first contacts between axons and Schwann cells and improving the regeneration in the presence oxonal damage in PNS.

Made available in DSpace on 2015-03-04T18:58:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO_PAULO_WERDT.pdf: 21786566 bytes, checksum: 03a53ac9704356741edfa085dc1c0f81 (MD5) Previous issue date: 2014-04-28 / The prediction of the three-dimensional structure of proteins (PSP) has been one of the most challenging fields of computational biology, both for its applicability in the field of medicine and drug design, as for its high complexity and computational cost. The main objective of this work was to implement and investigate the predictive potential in the context of the program GAPF (Genetic Algorithm for Protein Folding), the use of a Coarse Grained (CG) model, coupled with a genetic algorithm of multiple minimum, designed specifically to predict protein structures, using restraints of distance and angles obtained from experiments of Nuclear Magnetic Resonance (NMR). A second objective was, using structures determined by NMR and deposited in the Protein Data Bank (PDB), to identify, classify and generate statistics of those NMR restraints that might be more relevant in a process of predicting protein structures. In this sense, programs were developed, in C++ language, to read, interpret, analyze and engage the NMR information contained in the PDB files, making it possible to use the restraints contained in these files, by the program GAPF. A visualization program was also developed, using the OpenGL library, which allows the observation of protein structures with their respective NMR restraints. Simulations were performed on a test group of ten proteins with known structure, and the results were compared with those obtained using an all atom model. The results obtained with the use of the CG model were equivalent or, in most cases, exceeded the results achieved with the all atom force field. Besides allowing a significant reduction in computational cost, the use of the CG model enabled a significant reduction of the number of NMR restraints necessary for the prediction of a structure with a folding considered correct or satisfactory. / A predição da estrutura tridimensional de proteínas (PSP) tem se mostrado um dos campos mais desafiadores da biologia computacional, tanto pela sua aplicabilidade no campo da medicina e no desenho de fármacos, quanto pela sua alta complexidade e custo computacionais. O objetivo principal deste trabalho foi implementar e investigar o potencial preditivo, no contexto do programa GAPF (Genetic Algorithm for Protein Folding), do uso de um modelo Coarse Grained (CG) acoplado com um algoritmo genético de múltiplos mínimos desenvolvido especificamente para predizer estruturas de proteínas, utilizando restrições de distância e de ângulos advindas de experimentos de Ressonância Magnética Nuclear (RMN). Um segundo objetivo foi, utilizando estruturas determinadas por RMN depositadas no Protein Data Bank (PDB), identificar, classificar e gerar estatísticas sobre as restrições de RMN que possam ser mais relevantes em um processo de predição de estruturas de proteínas. Neste sentido, foram desenvolvidos programas, na linguagem C++, para ler, interpretar, analisar e acoplar as informações de RMN contidas nos arquivos do PDB, tornando possível a utilização das restrições, contidas nestes arquivos, pelo programa GAPF. Também foi desenvolvido um programa de visualização que, utilizando a biblioteca OpenGL, permite a observação das estruturas de proteínas com as suas respectivas restrições de RMN. Foram realizadas simulações em um grupo teste de dez proteínas, de estrutura já conhecida, e os resultados foram comparados com aqueles obtidos com o uso do modelo all-atom. Os resultados obtidos com o uso do modelo CG conseguiram ser equivalentes ou, na maioria dos casos, superar os resultados obtidos com o modelo all-atom. Além de permitir uma redução significativa no custo computacional, o uso do modelo CG possibilitou uma redução significativa do número de restrições de RMN necessárias para a predição de uma estrutura com um enovelamento considerado correto ou satisfatório.