Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2010. / Submitted by Washington da Silva Chagas (washington@bce.unb.br) on 2011-03-18T17:59:44Z No. of bitstreams: 1 2010_NataliavonGalMilanezi.pdf: 2529712 bytes, checksum: ea3fce7f0a6357dbc0a6e13f6705d142 (MD5) / Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2011-03-19T01:01:37Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_NataliavonGalMilanezi.pdf: 2529712 bytes, checksum: ea3fce7f0a6357dbc0a6e13f6705d142 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-03-19T01:01:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_NataliavonGalMilanezi.pdf: 2529712 bytes, checksum: ea3fce7f0a6357dbc0a6e13f6705d142 (MD5) / A holocelulose é o componente mais abundante da biomassa vegetal e é composto principalmente por celulose, hemicelulose e pectina. O bagaço de cana é o maior resíduo da agroindústria brasileira e é uma fonte de carbono economicamente viável para microrganismos produzirem enzimas holocelulolíticas de aplicação industrial. Os fungos filamentosos são eficientes produtores de xilanases, e suas enzimas têm sido utilizadas em todo o mundo em processos industriais. No presente estudo, uma xilanase (Xyl) do fungo Aspergillus niger crescido sobre bagaço de cana foi purificada e caracterizada visando a sua aplicação industrial. A curva de indução enzimática do fungo indicou alta atividade xilanolítica a partir do segundo dia, mantendo-se constante ao longo de 50 dias. A enzima teve sua maior atividade a 50°C e pH 4,5. A meia-vida aumentou 2,3 vezes quando Xyl foi incubada com tampão acetato de sódio pH 4,5. Estes resultados apontam para a possibilidade de aproveitamento desta xilanase na indústria têxtil, na panificação e em biorefinarias. Diversos íons foram testados, mas nenhum foi capaz de estimular a atividade de Xyl. Dentre os modificadores químicos de aminoácidos, o NBS foi o maior inibidor da atividade de Xyl, sugerindo o envolvimento de L-triptofano na ligação ao substrato ou na catálise. O ?- mercaptoetanol e o L-triptofano foram os maiores ativadores da enzima. Os valores de KM e Vmax encontrados foram de 47,08 mg/mL e 3,02 UI/mL, respectivamente, e há indícios de que Xyl dependa das ramificações da xilana para se ancorar ao substrato. A massa molecular estimada foi de cerca de 33 kDa, e o perfil bidimensional revelou a presença de isoformas ou enzimas múltiplas na amostra. Os resultados da espectrometria de massa sugerem que as xilanases são conservadas entre as espécies do gênero Aspergillus. As imagens de microscopia eletrônica de varredura mostram a degradação do bagaço de cana por enzimas de A. niger. As imagens de microscopia de força atômica sugerem que Xyl pertença à família GH10, mas sua atividade holocelulolítica residual a classificam com GH11. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Holocelulose is the most abundant component of biomass and it is basically composed of cellulose, hemicellulose and pectin. Sugar cane bagasse is the major waste of brazilian agroindustry and it is a cheap carbon source for microorganisms to produce holocellulolytic enzymes of industrial application. Filamentous fungi are good xylanase producers and their enzymes have been used in industrial processes all over the world. In this study a xylanase (Xyl) produced by the fungus Aspergillus niger over sugar cane bagasse was purified and characterized aiming its biotechnological application. The fungus produces higher amounts of xylanolytic activity from the second day on, and this activity remains relatively constant up to the 50th day. The enzyme presented the best activity at 50°C and pH 4,5. The half-life increased 2,3 times when Xyl was incubated with sodium acetate buffer pH 4,5. The results point out to the application of this enzyme in the textile industry, bakery and biorefineries. None of the tested ions was capable of increasing Xyl activity. NBS was Xyl major inhibitor, suggesting that Ltryptophan is involved in the substrate linkage or catalysis. β- mercaptoethanol and L-tryptophan were the best enzyme activators. The KM and Vmax values were 47,08 mg/mL and 3,02 UI/mL, respectively, and it is possible that Xyl depends on xylan side chains to stabilize over the substrate structure. The estimated molecular mass was about 33 kDa, and the 2Delectrophoresis analysis suggested the existence of multiple forms of xylanases. The mass spectrometry results suggest that the xylanases are conserved among the Aspergillus species. The electron scanning microscopy images show the degradation of sugar cane bagasse by A. niger enzymes. The atomic force microscopy images suggest that Xyl belongs to GH10, but its residual holocelulolytic activity classifies Xyl as a member of GH11 family.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2010. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2011-04-17T15:17:05Z No. of bitstreams: 2 2010_NazleMendoncaCollacoVerasSegundaParte.pdf: 17461857 bytes, checksum: 92c83ffee5e8c3178065ee8b9fcc135d (MD5) 2010_NazleMendoncaCollacoVerasParte1.pdf: 22584531 bytes, checksum: 28669e38ce266f342b24224d209a8f43 (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2011-04-17T15:39:57Z (GMT) No. of bitstreams: 2 2010_NazleMendoncaCollacoVerasSegundaParte.pdf: 17461857 bytes, checksum: 92c83ffee5e8c3178065ee8b9fcc135d (MD5) 2010_NazleMendoncaCollacoVerasParte1.pdf: 22584531 bytes, checksum: 28669e38ce266f342b24224d209a8f43 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-04-17T15:39:57Z (GMT). No. of bitstreams: 2 2010_NazleMendoncaCollacoVerasSegundaParte.pdf: 17461857 bytes, checksum: 92c83ffee5e8c3178065ee8b9fcc135d (MD5) 2010_NazleMendoncaCollacoVerasParte1.pdf: 22584531 bytes, checksum: 28669e38ce266f342b24224d209a8f43 (MD5) / A caracterização dos diferentes subtipos do HIV-1 prevalentes em uma região geográfica, assim como a compreensão da origem e disseminação desses subtipos, é essencial para definir estratégias de prevenção e intervenção nas epidemias locais de HIV/AIDS. O presente trabalho analisou 895 seqüências de pol disponíveis no GenBank, visando descrever os principais subtipos do HIV-1 prevalentes no Brasil, o perfil de resistência de linhagens não expostas a anti-retrovirais, a prevalência de assinaturas e epitopos na protease e transcripatse reversa (RT) e reconstruir a origem e os principais padrões de disseminação dos subtipos B e C do HIV-1 no Brasil. O subtipo B (65,6%) foi o mais prevalente, seguido dos subtipos C (14,1%) e F (6,1%). As formas recombinantes representaram 14,1% das seqüências analisadas. Foram encontradas oito mutações primárias na protease que diminuem a susceptibilidade aos inibidores de protease (PI): L24I, D30N, M46I/L, I54L/V, V82L e I84V. Na RT, foram identificadas 16 mutações associada a resistência aos inibidores de transcriptase reversa análogos de nucleosídeos (NRTI), A62V, D67N/G, T69E/N/S/d, K70R, V75I/L/M, F77L, V118I, Q151M e M184V, e 18 que conferem resistência aos inibidores de transcriptase reversa não-análogos de nucleosídeos (NNRTI), V90I, A98G, L100I, K101E/N/Q, K103N/R, V106I/L, V108I, E138A/G/K, V179D/T, Y181C e G190A. A transmissão de linhagens resistentes aos PI, NRTI e NNRTI foi de 1,2%, 1,8% e 2,1%, respectivamente. Quanto à variabilidade genética de pol, foram identificadas duas possíveis assinaturas, N37K e R41N, na protease de linhagens do subtipo C do HIV-1, dois epitopos reconhecidos por células T CD4+ na protease e 18 por células T CD8+, sendo cinco na protease e 13 na RT. Desses últimos, KLVDFRELNK, GIPHPAGLK, TVLDVGDAY, NETPGIRYQY, IRYQYNVL e VIYQYMDDL, são altamente recomendados para a produção de protótipos vacinais a serem aplicados no Brasil. A entrada do subtipo B do HIV-1 no Brasil ocorreu no início da década de 70, pelo Rio de Janeiro e Rio Grande do Sul, a partir dos quais as linhagens se dispersaram exponencialmente em direção a outros estados do Nordeste e Centro-Oeste do país. O subtipo C, por sua vez, entrou no Paraná, em meado da década de 70, e, logo após sua introdução, disseminou exponencialmente no Sul do país. A aplicação de análises fillogenéticas de alta resolução, análises de coalescência e filogeografia permitiu a caracterização da epidemia do HIV-1 no Brasil, a re-avaliação de hipóteses e a formulação de novas teorias sobre a origem e disseminação dos subtipos B e C no país. ________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Characterizing the different HIV-1 subtypes prevalent in a geographic region as well as understanding the origin and dissemination of these subtypes are essential to define prevention and intervention strategies targeting local HIV/AIDS epidemics. The present study analyzed 895 pol sequences, available at GenBank, aiming to describe the main HIV-1 subtypes prevalent in Brazil, the resistance profile of naïve lineages, the prevalence of signatures and epitopes in protease and reverse transcriptase (RT), and reconstruct the origin and the main dissemination patterns of HIV-1 subtypes B and C in Brazil. The subtype B (65.6%) was the most prevalent followed by subtypes C (14.1%) and F (6.1%). The recombinant forms represented 14.1% of the analyzed sequences. At protease, eight major mutations which reduce the susceptibility to protease inhibitors (PIs) were found: L24I, D30N, M46I/L, I54L/V, V82L and I84V. At RT, 16 mutations associated to nucleoside reverse transcriptase inhibitors (NRTIs) resistance, A62V, D67N/G, T69E/N/S/d, K70R, V75I/L/M, F77L, V118I, Q151M and M184V, and 18 mutations that confer resistance to the non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors (NNRTIs), V90I, A98G, L100I, K101E/N/Q, K103N/R, V106I/L, V108I, E138A/G/K, V179D/T, Y181C and G190A, were identified. The transmission of lineages resistant to PIs, NRTIs and NNRTIs were 1.2%, 1.8% and 2.1%, respectively. Regarding pol genetic variability, we identified two possible signatures, N37K e R41N, at HIV-1 subtype C protease, two T CD4+ epitopes and 18 T CD8+ epitopes, of which five were at protease and 13 at RT. Concerning these last ones, KLVDFRELNK, GIPHPAGLK, TVLDVGDAY, NETPGIRYQY, IRYQYNVL and VIYQYMDDL are highly recommended to the production of vaccine prototypes to be applied in Brazil. The HIV- 1 subtype B introduction in Brazil occurred in the beginning of 1970s, through Rio de Janeiro and Rio Grande do Sul, from where the lineages exponentially spread to Northeastern and Central Brazil. The subtype C, in turn, entered in Paraná, during mid- 1970s, and, briefly after its introduction, started to spread exponentially in the South region. The application of high-resolution phylogenetics, coalescent analysis and phylogeography, allowed an in-depth characterization of the HIV-1 epidemic in Brazil, the reevaluation of hypothesis and the formulation of new insights about the origin and dissemination of subtypes B and C in the country.

Dissertação (mestrado)-Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, 2006. / Submitted by Patrícia Nunes da Silva (patricia@bce.unb.br) on 2011-06-13T21:06:13Z No. of bitstreams: 1 2006_Caroline Rodrigues Alves Valois.pdf: 4050500 bytes, checksum: e24587952fb64433bb9c2f5df84921d0 (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2011-06-13T21:06:33Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2006_Caroline Rodrigues Alves Valois.pdf: 4050500 bytes, checksum: e24587952fb64433bb9c2f5df84921d0 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-06-13T21:06:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2006_Caroline Rodrigues Alves Valois.pdf: 4050500 bytes, checksum: e24587952fb64433bb9c2f5df84921d0 (MD5) / O presente estudo avaliou a expressão das moléculas de adesão celular (CAMs): L-selectina, P-selectina, E-selectina, integrina-ß2, Mac-1, LFA-1, integrina-ß1, VLA-4 e VCAM-1 durante a migração transendotelial dos leucócitos no pulmão. Para isto, utilizou-se um modelo animal de inflamação pulmonar induzida por fluido magnético contendo nanopartículas magnéticas recobertas com ácido meso-2,3-dimercaptosuccínico (FM-DMSA). As análises foram realizadas em camundongos nos períodos de 4 e 12 horas após a administração do FM-DMSA e em animais controles. A atividade migratória induzida experimentalmente foi investigada por meio de lavagem bronco-alveolar. Microscopia de luz foi utilizada para verificar a distribuição de agregados de nanopartículas magnéticas e análise da morfologia do órgão. A expressão das CAMs foi investigada por meio de imunofluorescência indireta em cortes por congelação. De acordo com os resultados obtidos, o FM-DMSA estimula a migração transendotelial dos leucócitos nos períodos de 4 e 12 horas, com o mínimo de dano a esse órgão. L-selectina, P-selectina, integrina-ß2, Mac-1, LFA-1 e VLA-4 participam da migração transendotelial dos leucócitos tanto na presença de um estímulo inflamatório como em condições fisiológicas, enquanto que E-selectina, integrina-ß1 e VCAM-1 são encontradas apenas diante de um estímulo inflamatório. L-selectina, P-selectina, integrina-ß2, Mac-1, LFA-1, integrina-ß1 e VCAM-1 participam da migração transendotelial dos leucócitos em sítios pós-capilares e na microvascularização, enquanto que E-selectina e VLA-4 são encontradas apenas em sítios pós-capilares. E-selectina e LFA-1 têm seus níveis de expressão alterados em função do tempo. As vias de migração transendotelial CD18-dependente (integrina-ß2, Mac-1 e LFA-1) e CD18-independente (integrina-ß1 e VLA-4) podem contribuir mutuamente para a migração dos leucócitos no pulmão.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, 2006. / Submitted by Elna Araújo (elna@bce.unb.br) on 2011-06-22T20:38:21Z No. of bitstreams: 1 2006_CarolineRodriguesAlvesValois.pdf: 4050500 bytes, checksum: e24587952fb64433bb9c2f5df84921d0 (MD5) / Approved for entry into archive by Guilherme Lourenço Machado(gui.admin@gmail.com) on 2011-06-28T13:12:34Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2006_CarolineRodriguesAlvesValois.pdf: 4050500 bytes, checksum: e24587952fb64433bb9c2f5df84921d0 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-06-28T13:12:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2006_CarolineRodriguesAlvesValois.pdf: 4050500 bytes, checksum: e24587952fb64433bb9c2f5df84921d0 (MD5) / O presente estudo avaliou a expressão das moléculas de adesão celular (CAMs): L-selectina, P-selectina, E-selectina, integrina-ß2, Mac-1, LFA-1, integrina-ß1, VLA-4 e VCAM-1 durante a migração transendotelial dos leucócitos no pulmão. Para isto, utilizou-se um modelo animal de inflamação pulmonar induzida por fluido magnético contendo nanopartículas magnéticas recobertas com ácido meso-2,3-dimercaptosuccínico (FM-DMSA). As análises foram realizadas em camundongos nos períodos de 4 e 12 horas após a administração do FM-DMSA e em animais controles. A atividade migratória induzida experimentalmente foi investigada por meio de lavagem bronco-alveolar. Microscopia de luz foi utilizada para verificar a distribuição de agregados de nanopartículas magnéticas e análise da morfologia do órgão. A expressão das CAMs foi investigada por meio de imunofluorescência indireta em cortes por congelação. De acordo com os resultados obtidos, o FM-DMSA estimula a migração transendotelial dos leucócitos nos períodos de 4 e 12 horas, com o mínimo de dano a esse órgão. L-selectina, P-selectina, integrina-ß2, Mac-1, LFA-1 e VLA-4 participam da migração transendotelial dos leucócitos tanto na presença de um estímulo inflamatório como em condições fisiológicas, enquanto que E-selectina, integrina-ß1 e VCAM-1 são encontradas apenas diante de um estímulo inflamatório. L-selectina, P-selectina, integrina-ß2, Mac-1, LFA-1, integrina-ß1 e VCAM-1 participam da migração transendotelial dos leucócitos em sítios pós-capilares e na microvascularização, enquanto que E-selectina e VLA-4 são encontradas apenas em sítios pós-capilares. E-selectina e LFA-1 têm seus níveis de expressão alterados em função do tempo. As vias de migração transendotelial CD18-dependente (integrina-ß2, Mac-1 e LFA-1) e CD18-independente (integrina-ß1 e VLA-4) podem contribuir mutuamente para a migração dos leucócitos no pulmão.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2011. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2011-09-08T11:16:12Z No. of bitstreams: 1 2011_LianaReisBlume.pdf: 943615 bytes, checksum: db4562d40ebfa0b2073bb525dd86fafb (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2011-09-08T11:16:41Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_LianaReisBlume.pdf: 943615 bytes, checksum: db4562d40ebfa0b2073bb525dd86fafb (MD5) / Made available in DSpace on 2011-09-08T11:16:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_LianaReisBlume.pdf: 943615 bytes, checksum: db4562d40ebfa0b2073bb525dd86fafb (MD5) / O uso de biomassa lignocelulósica como matéria-prima para a produção de etanol combustível se inicia pela intensa hidrólise de suas estruturas para a obtenção de açúcares fermentáveis. Neste contexto, o objetivo geral deste trabalho foi avaliar a produção de atividades enzimáticas celulolíticas e hemicelulolíticas de dois isolados da bactéria anaeróbica termófila Clostridium thermocellum (ISO1 e ISO2), quando cultivados em meio de cultura contendo celulose cristalina e bagaço de cana-de-açúcar, assim como, analisar o perfil de proteínas secretadas em cada uma destas condições, visando o mapeamento de proteínas envolvidas na degradação destas biomassas. O pH e temperatura ideais para o cultivo dos isolados são pH 7 e 60°C. Os isolados secretam atividade celulolítica, xilanolítica e pectinolítica quando cultivados em meio de cultura contendo celulose cristalina ou bagaço de cana de açúcar como única fonte de carbono. Estas atividades foram detectadas no sobrenadante do meio de cultura e também associadas ao substrato residual, sendo que o maior valor de atividade 0,478 UI/mL foi detectado para a atividade xilanolítica no sobrenadante de ISO2 cultivado em bagaço de cana. Além disso, os isolados foram capazes de degradar celulose cristalina com atividades de 0,052UI/mL e 0,040 UI/mL obtidas para as proteínas eluídas do substrato residual celulósico e proteínas secretadas no meio de cultura com bagaço de cana de ISO2, respectivamente. O perfil protéico do sobrenadante e proteínas associadas ao substrato residual foi analisado por eletroforese SDS-PAGE, no qual foi observada a presença de proteínas de 160 e 220kDa, com perfil semelhante ao celulossoma de um isolado de C. thermocellum utilizado como controle (Cth JW). Adicionalmente, os sobrenadantes das culturas foram utilizados como fonte de proteínas para as análises em géis bidimensionais, 2-DE, nos quais foram observadas diferenças no número e volume de spots entre as condições de crescimento, e na comparação dos isolados ISO1 e ISO 2 com o isolado padrão. A espectrometria de massas MALDI-TOF foi utilizada na identificação de proteínas do secretoma do ISO2 cultivado em celulose como fonte de carbono. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The use of lignocellulosic biomass as feedstock for bioethanol production begins with the intense hydrolysis of its structure to obtain fermentable sugars. The present work aims the evaluation of cellulolytic and hemicellulolytic activities production from two strains of the thermophilic anaerobic bacterium Clostridium thermocellum (ISO1 e ISO2), after growth on crystalline cellulose and sugarcane bagasse, also, the protein profile secreted by these isolates was resolved by SDS-PAGE and 2DE electrophoresis aiming the identification of proteins that participate on the cellulosic raw material degradation. The pH and temperature for optimal growth of the isolates are pH 7 and 60 ° C. The bacterium isolates produce cellulolytic, xylanolytic and pectinolytic activities when cultured in liquid medium containing crystalline cellulose or sugar cane bagasse as the sole carbon source. These activities were detected in the supernatant of the culture medium and also associated with the residual substrate, and the highest value was obtained for the xylanolytic activity (0.478 UI/ mL) from the supernatant of ISO2 grown on sugarcane bagasse. Moreover, the isolates were capable to degrade crystalline cellulose, with activities of 0.052 UI/mL and 0.040 UI/mL for the protein sample eluted from the residual substrate and secreted proteins into the culture medium with sugarcane bagasse ISO2, respectively. The protein profile of the supernatant and substrate associated proteins were analyzed by SDS-PAGE, and the presence of 160 e 220kDa proteins with a similar profile to the cellulosome of a C. thermocellum was observed. Additionally, the culture supernatants were used as a source of proteins for the analysis in two-dimensional gels, 2-DE, and there were differences in the number of spots and its volume between the growth conditions, and in comparison of the two strains ISO1 and ISO and the standard isolate CthJW. Mass spectrometry MALDI-TOF was used to the identification of ISO2’s secretome proteins after growth in liquid medium containing cellulose as carbon sources.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2013. / Submitted by Elna Araújo (elna@bce.unb.br) on 2013-11-21T19:07:28Z No. of bitstreams: 1 2013_ClarissaCalaisRomez.pdf: 1504430 bytes, checksum: 4766ff473691c29620666cd2b96ea51b (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-11-25T11:14:33Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_ClarissaCalaisRomez.pdf: 1504430 bytes, checksum: 4766ff473691c29620666cd2b96ea51b (MD5) / Made available in DSpace on 2013-11-25T11:14:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_ClarissaCalaisRomez.pdf: 1504430 bytes, checksum: 4766ff473691c29620666cd2b96ea51b (MD5) / Introdução: A literatura tem demonstrado que células diferenciadas, por exemplo, fibroblastos, podem, por meio de transfecção mediada por retrovírus, adquirir cópias extras de genes cuja expressão está associada à pluripotência e voltarem assim a um estado de indiferenciação, similar ao encontrado em células-tronco embrionárias. Entretanto, a transfecção de genes mediada por retrovírus tem potencial restrito para uso em terapias humanas, pois, além de ser de baixíssima eficiência, pode ocorrer a inserção de genes virais no genoma das células com pluripotência induzida por essa técnica. Nesse sentido, diversos estudos têm sido desenvolvidos de modo a reverter essas células diferenciadas a um estado similar ao embrionário sem utilizar a transfecção de genes. O restabelecimento da pluripotência de células diferenciadas poderia também ser induzido por alterações na expressão de genes envolvidos na pluripotência celular sem afetar a sequência do DNA, ou seja, por mecanismos epigenéticos, como a inibição por algumas substâncias da ação de enzimas que desacetilam histonas ou metilam o DNA. Dentre as substâncias capazes de inibir a ação de enzimas com atividade Histona Desacetilase, ou seja, favorecer a expressão gênica situa-se o butirato de sódio, um ácido graxo de cadeia curta. A inibição da metilação do DNA ocorre por meio da inibição da atividade de enzimas DNA metiltransferases (DNMTs). Uma das drogas que inibe a ação de DNMTs é a hidralazina, um potente vasodilatador arterial. Objetivo: O presente estudo se propôs a avaliar o efeito da hidralazina e do butirato de sódio na desdiferenciação de células de polpa dental hígida e inflamada. Métodos: Células de polpa dental hígida (PN) e inflamada (PI) foram analisadas quanto à sua viabilidade celular, ensaio MTT e coloração por azul de tripano, quanto à sua morfologia, microscopia de luz e citometria de fluxo, e quanto à sua expressão gênica, RT-qPCR, na presença ou não de butirato de sódio ou hidralazina. Resultados: Seis subculturas de polpa dental hígida e inflamada não tiveram sua viabilidade alterada quando tratadas com butirato de sódio (10 mM) e hidralazina (30 μM). O tratamento com butirato de sódio (10 mM) induziu alterações discretas na morfologia das células, como o aumento do tamanho e da granulosidade celular. Células tratadas com hidralazina não mostraram alterações quanto a sua morfologia com relação às células não tratadas. O tratamento com butirato de sódio (10 mM) não alterou a expressão relativa dos genes OCT-4 (PN-3; PI-1; PI-2; PI-3); colágeno tipo I (PN-1; PN-3; PI-2; PI-3). O tratamento com butirato de sódio diminuiu a expressão relativa dos genes OCT- 4 (PN-1; PN-2); colágeno tipo III (PN-1; PN-2; PN-3; PI-1; PI-2; PI-3); colágeno tipo I (PI-1) e aumentou a expressão relativa do gene colágeno tipo I (PN-2). O tratamento com hidralazina (30 μM) não alterou a expressão relativa dos genes OCT-4 (PN-2; PN-3; PI-1; PI- 2; PI-3); colágeno tipo I (PN-2; PN-3; PI-1; PI-2; PI-3); colágeno tipo III (PN-1; PN-2; PN-3; PI-1; PI-2; PI-3). O tratamento com hidralazina (30 μM) diminuiu a expressão relativa do gene OCTOCT-4-4 (PN-1); e aumentou a expressão relativa do gene colágeno tipo I (PN-1). Conclusão: O butirato de sódio e a hidralazina não induziram a desdiferenciação celular de células de polpa dental hígida e inflamada. _____________________________________________________________________________ ABSTRACT / Introduction: The literature has demonstrated that differentiated cells, such as fibroblasts, may, by retrovirus-mediated transfection, gain extra copies of genes whose expression is associated with pluripotency and thus return to an undifferentiated state, similar to the state found in embryonic stem cells. However, the transfection of genes mediated by retrovirus has limited potential for use in human therapy, because, besides being very low efficiency, may occur the insert of viral genes into the genome of the cells with induced pluripotent by this technique. In this regard, various studies have been conducted in order to reverse these differentiated cells to an embryonic-like state without using the gene transfection. The restoration of pluripotency could be achived by changes in the expression of genes involved in cell pluripotency without affecting the DNA sequence, in other words, by epigenetic mechanisms, using certain substances that inhibit the action of histone deacetylases enzymes or DNA methyltransferase enzymes. Among the substances capable of inhibiting the action of enzymes with histone deacetylase activity, or promote gene expression is situated sodium butyrate, a fatty acid short-chain. Inhibition of DNA methylation occurs through inhibition of the enzyme DNA methyltransferase (DNMTs). A drug that inhibits the action of DNMTs is hydralazine, a potent arterial vasodilator. Objective: This study aims to analyze the effect of hydralazine and sodium butyrate on cell dedifferentiation of healthy and inflamed dental pulp cells. Methods: Cells from healthy (NP) and inflamed dental pulp (IP) were analyzed for cell viability, MTT assay and trypan blue staining, for cell morphology, light microscopy and flow cytometry, and gene expression, RT-qPCR, in the presence or absence of sodium butyrate or hydralazine. Results: Six subcultures of healthy and inflamed dental pulp did not have their viability altered when treated with sodium butyrate (10 mM) and hydralazine (30 μM). Treatment with sodium butyrate (10 mM) led to subtle changes in cell morphology, such as increased cell size and granularity. hydralazine treated cells showed no change in their morphology as compared to untreated cells. Treatment with sodium butyrate (10 mM) did not alter the relative expression of the genes OCT-4 (NP-3, IP-1, IP-2, IP-3); collagen type I (NP- 1, PN-3; PI-2, PI-3). Treatment with sodium butyrate decreased the relative expression of genes: OCT-4 (NP-1, NP-2), collagen III (NP-1, NP-2, NP-3, IP-1, IP-2, IP-3), collagen type I (IP-1) and increased the relative expression of collagen type I gene (NP-2). Treatment with hydralazine (30 mM) did not alter the relative expression of genes: Oct-4 (NP-2, NP-3, IP-1, IP-2, IP-3); collagen type I (NP-2, NP-3, IP-1, IP-2, IP-3), type III collagen (NP-1, NP-2, NPix 3, IP-1, IP-2, IP-3). Treatment with hydralazine (30 mM) decreased the relative expression of OCT-4 gene (NP-1) and increased the relative expression of type I collagen gene (NP-1). Conclusion: Sodium butyrate and hydralazine did not induce cellular dedifferentiation of cells from inflamed and healthy dental pulp.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Programa de Pós-graduação em Biologia Molecular, 2013. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2014-04-11T15:30:57Z No. of bitstreams: 1 2013_MarxGomesVanderLinden.pdf: 9956920 bytes, checksum: f23ee1a3a019a055fc303b9a6d469e9d (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-04-25T12:05:13Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_MarxGomesVanderLinden.pdf: 9956920 bytes, checksum: f23ee1a3a019a055fc303b9a6d469e9d (MD5) / Made available in DSpace on 2014-04-25T12:05:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_MarxGomesVanderLinden.pdf: 9956920 bytes, checksum: f23ee1a3a019a055fc303b9a6d469e9d (MD5) / Há muito tempo se sabe que estruturas tridimensionais de proteínas são determinadas por suas respectivas sequências de aminoácidos, entretanto as possíveis regras que associam sequências a estruturas continuam em larga medida desconhecidos. A construção de um algoritmo geral para predição ab initio de estruturas proteicas, isto é, uma metodologia que determine computacionalmente a estrutura nativa de qualquer proteína com base em sua sequência de aminoácidos, é possivelmente o maior desafio teórico atual da Biofísica computacional. Esta tese parte da hipótese inovadora de que a única informação dependente de sequência necessária para se determinar a conformação nativa de uma proteína é a distância de cada um de seus átomos até o centro geométrico da estrutura, uma medida que denominamos enterramento atômico. O objetivo principal do trabalho é avaliar a aplicabilidade dessa hipótese através da construção da primeira versão de um método computacional para predição ab initio que utilize os enterramentos como único intermediário informacional entre sequência e estrutura proteica. Nossa metodologia está dividida em duas partes principais: a primeira descreve a construção de um método computacional capaz de realizar predições de enterramentos atômicos a partir de sequências de aminoácidos; a segunda trata de simulações computacionais do enovelamento que utilizam as predições obtidas na primeira parte para obter estruturas terciárias próximas à nativa para algumas proteínas selecionadas. O método computacional que foi desenvolvido neste trabalho para prever os enterramentos atômicos de proteínas a partir de suas sequências de aminoácidos é um algoritmo de aprendizado supervisionado baseado em um modelo oculto de Markov (Hidden Markov Model - HMM). Análises informacionais realizadas sobre os resultados alcançados pelo HMM implementado revelaram que suas predições são ótimas, no sentido de que elas são capazes de extrair praticamente toda a informação sobre enterramentos disponível na sequência, de acordo com o modelo de dados adotado. Na segunda parte do trabalho, um método de dinâmica molecular com um potencial simplificado, que não inclui nenhuma informação derivada da estrutura nativa e utiliza as predições de enterramentos atômicos como base para o único termo dependente de sequência do potencial, foi aplicado a três proteínas pertencentes a diferentes classes estruturais, selecionadas entre os melhores resultados de predição alcançados na etapa anterior. Nos três casos, o algoritmo foi capaz de obter e distinguir a conformação nativa correta em simulações do enovelamento que partiram de conformações completamente estendidas. Os resultados obtidos demonstram que, ao menos para algumas classes de proteínas, os enterramentos atômicos podem de fato atuar como os únicos intermediários informacionais entre sequência e estrutura, fornecendo um novo arcabouço conceitual que esperamos contribuir para a compreensão dos fundamentos do enovelamento proteico e para a investigação do problema da predição estrutural de proteínas. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / It has been long known that the three-dimensional structures of proteins are determined by their respective amino acid sequences. The possible rules, however, that associate protein sequences to structures remain at large elusive. The development of an ab initio general algorithm for protein structure prediction, that is, a computational methodology that should be able to determine the native structure of any protein from its amino acid sequence, is possibly the greatest theoretical challenge of current computational biophysics. The premise of this work is based on the innovative hypothesis that the only sequence-dependent information needed to determine the native conformation of a protein is the distance of each of its atoms to the geometric center of the structure, a measure we call atomic burial. Our main objective is to evaluate the applicability of this hypothesis through the development of the first version of a computational method for ab initio prediction that employs burials as the only informational intermediate between protein sequence and structure. Out methodology is divided in two main parts: the first part describes the construction of a computational method to produce atomic burial predictions from amino acid sequences; the second part refers to folding simulations that employ the previously obtained predictions to obtain tertiary structures that are close to the native configuration for selected proteins. The computational method that was developed in this work for atomic burial prediction from amino acid sequences is a supervised learning algorithm based in a Hidden Markov Model (HMM). Informational analyses performed on the HMM results revealed that its predictions are optimal, in the sense that they are capable of extracting almost the totality of the information about burials that is available in amino acid sequences, according to the data model that was adopted. In the second part of this work, a molecular dynamics method with a simplified potential, which does not include any information derived from the native structure and employs atomic burial predictions as its only sequence-dependent term, was applied to three proteins belonging to different structural classes, selected among the best prediction results achieved in the previous step. In all three cases, the algorithm was capable of obtaining and distinguishing the native conformation in folding simulations that started from fully extended conformations. The results achieved in this work demonstrate that, at least for some protein classes, atomic burials are in fact able to act as the sole informational intermediates between sequence and structure, providing a new conceptual framework that we expect to be able to contribute for our knowledge of the fundamentals of protein folding and to the problem of protein structure prediction.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2010. / Submitted by Washington da Silva Chagas (washington@bce.unb.br) on 2011-04-19T21:55:21Z No. of bitstreams: 1 2010_AlicedaCunhaMoralesAlvares.pdf: 3239774 bytes, checksum: 1a6bf8a22db3e2e23b2651cbe67dc9f1 (MD5) / Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2011-05-25T01:52:55Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_AlicedaCunhaMoralesAlvares.pdf: 3239774 bytes, checksum: 1a6bf8a22db3e2e23b2651cbe67dc9f1 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-05-25T01:52:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_AlicedaCunhaMoralesAlvares.pdf: 3239774 bytes, checksum: 1a6bf8a22db3e2e23b2651cbe67dc9f1 (MD5) / Neste trabalho apresentamos estudo biofísico e estrutural de uma leucil aminopeptidase (LAP), proteína recombinante expressa em Escherichia coli e presente em Leptospira interrogans sorovar Hardjo (LAPr-Li). Essa proteína está diretamente relacionada com a patogenicidade dessa bactéria e com a doença leptospirose em animais e humanos. A LAPr-Li foi obtida por transformação do vetor pET19b-HapepA em E. coli BL21-DE3, expressa a 20ºC, após indução com IPTG 0,3 mM, e purificada por cromatografia de afinidade e de exclusão molecular. Essa enzima apresenta atividade ótima na forma hexamérica em pH 8,5 e temperatura 50ºC. A LAPr-Li é formada por dímeros de trímeros formando o hexâmero, cuja atividade depende desta estrutura. A estrutura secundária é constituída de 44,7% de ?-hélice e 11,6% por folhas-?. A forma hexamérica, de diâmetro 15,2 nm e massa molecular 320 kDa, foi confirmada por ensaios de oligomerização dependentes da temperatura, por espalhamento de luz dinâmico. Estudos de atenuação de fluorescência, utilizando atenuadores carregados e neutros e ajustes de Stern-Volmer, revelaram que a proteína apresenta duas populações de triptofanos. A caracterização dos microambientes foi baseada nas constantes de Stern-Volmer (KSV) obtidas para atenuação com cloreto de césio, apresentou maior acesso aos resíduos de triptofanos, quando comparado ao iodeto de potássio, carregado negativamente. As constantes de atenuação de fluorescência para o césio foram KSV1= 38,6 M-1 e KSV2= 6,4 M-1 e para iodeto KSV1= 4,4 M-1 e KSV2= 0,4M-1. A estabilidade estrutural da LAPr-Li foi analisada a partir de curvas de desnaturação térmica e química obtidas por dicroísmo circular. A elevação da temperatura para 50ºC em pH 8,5 induziu modificações na estrutura secundária e, consequentemente, na conformação da proteína. As curvas de desnaturação térmica (25-95ºC) indicaram maior estabilidade estrutural da LAPr-Li nos pHs 3,0 e 5,0, onde nenhuma alteração estrutural e desnaturação foi observada. Em região alcalina (8,0, 8,5 e 9,0) a LAPr-Li não é desnaturada completamente, resultando, portanto, em valores de ?G25 mais baixos (~2,0 kcal.mol-1) comparados àqueles obtidos nos pHs 6,0 (3,52 kcal.mol-1) e 7,0 (6,63 kcal.mol-1), onde a proteína se desnaturou completamente. Esse último resultado foi confirmado com a curva de desnaturação, utilizando cloridrato de guanidina em água, onde a desnaturação completa da LAPr-Li resultou no valor de ?GH2O de 6,32 kcal. mol-1. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / In this work we present the biophysical studies of the leucine aminopeptidase (LAP), a recombinant protein expressed in Escherichia coli and present in Leptospira interrogans serovar Hardjo (LAPr-Li). This protein is related to pathogenicity of the bacteria and the leptospirosis disease in animals and humans. The LAPr-Li was obtained by transformation of the vector pET19b-HapepA in E. coli BL21-DE3, expressed at 20°C after induction with 0.3 mM IPTG, and purified by affinity and size exclusion chromatography. The enzyme presents optimal activity as hexamer at pH 8.5 and 50°C. LAPr-Li is self assembled as hexamer from trimers of dimmers and its secondary structure consists of 44.7% α-helix and 11.6% for β-sheets. The hexamer with diameter of 15.2 nm and molecular weight 320 kDa was confirmed by dynamic light scattering oligomerization assays. Fluorescence decay studies using charged and neutral quenchers and Stern-Volmer fitting revealed two different populations of tryptophan (exposed and buried) in negatively charged microenvironment. The cesium chloride had greater access to tryptophan residues, when compared to potassium iodide, negatively charged. The constants of fluorescence decay for cesium was KSV1 = 38.6 M-1 and KSV2 = 6.2 M-1 and iodide KSV1 = 4.4 M-1 and KSV2 = 0.4 M-1. The structural stability of LAPr-Li was analyzed from thermal and chemical denaturation curves by circular dichroism spectroscopy. The increase of temperature to 50ºC at pH 8.5 induced secondary structure and conformational changes of the protein. It promotes flexibility of the enzyme that appears to be essential for enzymatic activity. The thermal denaturation curves (25-95ºC) indicated higher structural stability of LAPr-Li at pH 3.0 and 5.0 in which no denaturation profile was observed. At pH 8.0, 8.5 and 9.0 LAPr-Li was partially denatured resulting in lower values of G25 (~ 2.0 kcal.mol-1) compared to those obtained at pH 6.0 (3.52 kcal.mol-1) and 7.0 (6.63 kcal.mol-1), where the protein was completely denatured. The latter result was confirmed by denaturation using aqueous solution of guanidine hydrochloride, where the complete denaturation of LAPr-Li resulted in GH2O value of 6.32 kcal.mol-1.

A caracterização molecular e morfofisiológica de 28 isolados de Metarhizium ssp. foi avaliada por análises de seqüências do espaçador transcrito interno (ITS1 e ITS2), presença de elementos dsRNA e taxa de crescimento e esporulação em diferentes temperaturas e pH. A patogenicidade de 19 isolados do fungo entomopatogênico Metarhizium ssp. foi avaliada para fêmeas ingurgitadas do carrapato Boophilus microplus. As alterações cronológicas durante o processo de infecção Metarhizium anisopliae isolado E6 em B. microplus foi avaliada em detalhe por microscopia óptica e eletrônica de varredura e transmissão. O seqüenciamento do espaçador transcrito interno confirmou a identidade taxonômica dos isolados avaliados como M. anisopliae var. anisopliae ou M. anisopliae var. majus e mostrou que dois isolados (CG291 e CG423), previamente classificados como Metarhizium flavoviride, são pertencentes a M. anisopliae var. anisopliae. Os testes sobre a influência da temperatura e pH no desenvolvimento e esporulação dos isolados evidenciaram que a melhor temperatura de crescimento para a maioria desses foi 28oC e que o crescimento foi ótimo na faixa de pH entre 4 a 9. Os bioensaios mostraram que três isolados (C14, CG47 e CG97) foram altamente patogênicos para fêmeas ingurgitadas de B. microplus sendo tão virulentos quanto o isolado E6, previamente analisado, causando cerca de 90-100% de mortalidade ao 4o dia de infecção. Outros isolados foram menos virulentos ou não mostraram virulência para o carrapato. A presença de dsRNA foi avaliada em 28 isolados e detectada em 21 isolados. Vários padrões de dsRNA foram observados baseados no tamanho molecular analisado por eletroforese em gel de agarose. Nenhuma correlação foi observada entre a presença de dsRNA e a virulência do fungo. As observações microscópicas evidenciaram que o fungo M. anisopliae isolado E6 invade seu hospedeiro por penetração direta da cutícula, sendo que este processo envolveu as etapas de adesão e germinação dos conídios, formação do apressório e penetração do fungo na cutícula do hospedeiro. A adesão e germinação dos conídios na superfície da cutícula se iniciou após 24 h de infecção. Neste mesmo tempo, ocorreu diferenciação do apressório, estrutura que exerce a pressão mecânica durante o processo de penetração, sendo que este processo é facilitado pela ação de enzimas hidrolíticas secretadas pelo fungo. A penetração de algumas hifas ocorreu até 24 h após a infecção do fungo, embora, neste mesmo tempo de infecção, a maioria dos conídios ainda estivesse em processo de germinação. A penetração em massa do fungo foi observada 72 h após a infecção e, após 96 h, as hifas emergiram na superfície da cutícula para originarem novos conídios e assegurarem a perpetuação do fungo. A intensa invasão das hifas nos tecidos adjacentes confirmou a eficácia do isolado E6 na infecção do carrapato B. microplus.

O aumento na prevalência da tuberculose (TB), a emergência de cepas resistentes a múltiplas drogas de Mycobacterium tuberculosis, o agente etiológico da TB, e o efeito devastador da coinfecção pelo HIV têm enfatizado a urgente necessidade no desenvolvimento de novos agentes antimicobacterianos. A análise completa da seqüência genômica do M. tuberculosis H37Rv mostrou a existência de genes envolvidos na via de biossíntese de aminoácidos aromáticos, a via do chiquimato, e evidências experimentais indicam que esta via é essencial para o M. tuberculosis e apresenta-se ausente no homem. Os produtos dos genes que são essenciais para o crescimento dos microrganismos fazem deles alvos atrativos para a ação de drogas, pois a inibição de sua função pode matar o bacilo. Previamente, nosso grupo relatou a clonagem do gene aroE de M. tuberculosis e a expressão do seu produto na forma solúvel, a enzima chiquimato desidrogenase (MtbSD), que catalisa o quarto passo na via do chiquimato. Neste trabalho apresentamos, no primeiro artigo, intitulado “Functional shikimate dehydrogenase from Mycobacterium tuberculosis H37Rv: purification and characterization”, a purificação da MtbSD solúvel e ativa por cromatografia líquida, o seqüenciamento do Nterminal, a espectrometria de massas, a determinação do estado oligomérico por cromatografia em gel filtração, a estabilidade térmica, a determinação de parâmetros cinéticos aparentes em estado estacionário para as reações direta e reversa, a constante de equilíbrio aparente e energia de ativação para a reação química catalisada pela MtbSD. No segundo artigo, intitulado “Shikimate Dehydrogenase from Mycobacterium tuberculosis H37Rv: Kinetic and Chemical Mechanisms”, descrevemos os parâmetros de velocidade inicial na reação direta, os estudos de inibição pelos produtos, os efeitos isotópicos cinéticos primários do deutério, os efeitos isotópicos cinéticos do solvente, os efeitos isotópicos cinéticos múltiplos, proton inventory, o efeito de pH na química ácido/base para a ligação e catálise dos substratos, e a estrutura 3D da MtbSD obtida in silicon pela modelagem por homologia. Esses resultados servem como base para os estudos cinéticos e estruturais que podem auxiliar no desenho racional de inibidores a serem testados como agentes antimicobacterianos. / The increasing prevalence of tuberculosis (TB), the emergence of multidrug-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of TB, and the devastating effect of coinfection with HIV have highlighted the urgent need for the development of new antimycobacterial agents. Analysis of the complete genome sequence of M. tuberculosis H37Rv shows the presence of genes involved in the aromatic amino acid biosynthetic pathway, the shikimate pathway, and experimental evidence showed that this pathway is essential for M. tuberculosis and it is absent in humans. The gene products that are essential for the growth of the microorganisms make them attractive drug targets since inhibiting their function may kill the bacilli. Our group has previously reported the cloning of M. tuberculosis aroE gene and the expression of the product in the soluble form, the shikimate dehydrogenase (MtbSD) enzyme, that catalysis the fourth reaction in the shikimate pathway. Currently, in the first manuscript “Functional shikimate dehydrogenase from Mycobacterium tuberculosis H37Rv: purification and characterization”, we present the purification of soluble and active MtbSD, N-terminal sequencing, mass spectrometry, assessment of the oligomeric state by gel filtration chromatography, thermal stability, determination of apparent steady-state kinetic parameters for both forward and reverse directions, apparent equilibrium constant, and energy of activation for the enzyme-catalyzed chemical reaction. In the second manuscript “Shikimate Dehydrogenase from Mycobacterium tuberculosis H37Rv: Kinetic and Chemical Mechanisms”, we describe the kinetic mechanism, initial velocity patterns in the forward direction, product inhibition studies, primary deuterium kinetic isotope effects, solvent kinetic isotope effects, multiple isotope effects, proton inventory, pH rate profile and the MtbSD 3D structure obtained in silicon by homology modeling. These results should be useful as a solid base for structural and kinetic studies, which can aid in the rational design of inhibitors to be tested as antimycobacterial agents.