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Molecular phylogenetics of Crossodactylus Duméril & Bibron, 1841: (Anura: Hylodidae)Fabri, Danielle Angelini January 2013 (has links)
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Previous issue date: 2013 / Hylodidae is an anuran family composed of genera Crossodactylus, Hylodes, and Megaelosia, commonly known as “torrent frogs”, and known to range from northeastern Brazil through southern Paraguay and northern Argentina. Crossodactylus, previously referred to as the most taxonomic problematic of the three, is comprised of 11 small-sized (but for C. grandis) species, currently divided among three species groups: the C. gaudichaudii, C. trachystomus, and C. schmidti groups, the first of which contains the majority of recognized species. The relationship between Hylodidae and other anuran families has been extensively discussed, and hypotheses have been varied. Nonetheless, the monophyly of the group seems well corroborated, and has been recovered in several independent phylogenetic studies. However, despite recurrent mentions to the problematic systematics of Crossodactylus, its phylogenetic relationships remain untested. Furthermore, the only proposed synapomorphy for the group is the absence of the quadratojugal bone, a hypothesis which has already been refuted in literature. In view of the problems still revolving around Crossodactylus, this study aimed to test the monophyly of the genus and its species groups, while clarifying relationships among its species, and among itself and the remainder of hylodid genera. For that, a phylogenetic analysis of 3 mitochondrial and 5 nuclear genes of different degrees of variability was performed on software POY 4. 1. 2. 1 under dynamic homology, employing the maximum parsimony optimality criterion. 72 outgroup taxa, and of 88 ingroup terminals were included. Of the outgroup, 21 taxa—comprised of 61 terminals—were sequenced by this study. All ingroup sequences were generated in this study, except for those of C. schmidti, for which sequences were already available on GenBank.A total of 14 equally most parsimonious trees of 25,508 steps were found, the conflicts of which were restricted to relationships between terminals of the ingroup. The monophyly of Hylodidae was corroborated once more. Megaelosia was found to be paraphyletic with respect to Hylodes, which is monophyletic. Crossodactylus was recovered as a monophyletic group, sister to the clade comprising the other two hylodid genera. The species groups as currently defined were found not to reflect the actual relationships among species, with the C. gaudichaudii group being paraphyletic with respect to C. schmidti, and likely to C. trachystomus. Also, several species complexes were found within Crossodactylus, and species believed to be widespread were found to be actually several narrowly distributed species. 14 putative species were discovered in addition to the six recognized species sampled. The placement of the five recognized species not sampled by this study remains unknown and, as most of these were last collected in the 1970–1980s, future studies will require morphological evidence in order to address this question. / Hylodidae é uma família de anuros composta dos gêneros Crossodactylus, Hylodes e Megaelosia, conhecidos popularmente como “rãzinhas-do-riacho”, e cuja área de distribuição conhecida vai do nordeste do Brasil até o norte da Argentina, através do sul do Paraguai. Crossodactylus, conhecido como o gênero de taxonomia mais problemática dos três, é composto de 11 espécies de pequeno tamanho (exceto por C. grandis), atualmente divididas entre três grupos de espécies: os grupos C. gaudichaudii, C. trachystomus e C. schmidti, o primeiro dos quais contém a maioria das espécies reconhecidas. O relacionamento entre Hylodidae e outras famílias de anuros tem sido extensamente discutido, com hipóteses variadas. Ainda assim, a monofilia do grupo parece bem corroborada e tem sido recuperada em diversos estudos filogenéticos independentes. Contudo, apesar das recorrentes menções à sistemática problemática de Crossodactylus, suas relações filogenéticas permanecem não testadas. Além disso, a única sinapomorfia proposta para o grupo é a ausência do osso quadradojugal, hipótese já refutada na literatura. Tendo em vista os problemas ainda presentes em torno de Crossodactylus, o presente estudo objetivou testar a monofilia do gênero e seus grupos de espécies, ao mesmo tempo buscando esclarecer os relacionamentos entre espécies do gênero e entre esse e os demais gêneros de Hylodidae. Para tanto, uma análise filogenética de três genes mitocondriais e cinco genes nucleares de diferentes graus de variabilidade foi realizada através do software POY 4. 1. 2. 1, sob a implementação de homologia dinâmica, empregando o critério de otimalidade de máxima parcimônia. 72 táxons do grupo externo e 88 terminais do grupo interno foram incluídos. Do grupo externo, 21 táxons — compostos de 61 terminais — foram sequenciados nesse estudo. Todas as sequências do grupo interno foram geradas nesse estudo, exceto por aquelas de C. schmidti, para o qual sequências já estavam disponíveis no GenBank. Um total de 14 árvores igualmente maximamente parcimoniosas de 25. 508 passos foi encontrado, os conflitos das quais se restringiam a relações entre terminais do grupo interno. A monofilia de Hylodidae mais uma vez foi corroborada. O gênero Megaelosia foi encontrado como parafilético em relação a Hylodes, o qual é monofilético. Crossodactylus foi recuperado como um grupo monofilético, irmão do clado composto pelos dois outros gêneros. Descobriu-se que os grupos de espécies como definidos atualmente não refletem os relacionamentos entre espécies, com o grupo C. gaudichaudii sendo parafilético com respeito ao grupo C. schmidti — e, provavelmente, ao grupo C. trachystomus. Além disso, diversos complexos de espécies foram encontrados em Crossodactylus e descobriu-se que espécies cuja distribuição acreditava-se ser extensa são na verdade compostas de várias espécies de distribuição restrita. 14 espécies putativas foram descobertas em adição às seis espécies reconhecidas amostradas. O posicionamento das cinco espécies reconhecidas não amostradas nesse estudo permanece desconhecido e, como a maioria destas não é coletada desde os anos 1970– 1980, estudos futuros necessitarão de evidência morfológica de modo a endereçar essa questão.
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Análise bioquímica, estrutural e funcional da enzima citidina deaminase (E.C. 3.5.4.5) de Mycobacterium tuberculosis H37RvQuitian, Zilpa Adriana Sánchez January 2014 (has links)
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Previous issue date: 2014 / The causative agent of tuberculosis (TB), Mycobacterium tuberculosis, infects one-third of the world population. The World Health Organization estimates that 8. 6 million new TB cases occurred in 2012, resulting in 1. 3 million deaths worldwide. Thus, there is a continuous need to find promising molecular targets for the development of anti-TB agents and to identify pathogenic determinants associated with M. tuberculosis virulence aiming the development of attenuated mutant strains as new vaccine candidates against TB. Enzymes involved in purine and pyrimidine biosynthesis have important roles in cellular metabolism, as they provide nucleotides that are essential components of a number of essential biomolecules. Cytidine deaminase (CDA) catalyzes the hydrolytic deamination of cytidine to uridine, and belongs to the pyrimidine salvage pathway. The CDA from M. tuberculosis (MtCDA) is a target for the development of attenuated strains of M. tuberculosis because it may be involved in mechanisms of pathogenicity such as latency. This work presents the crystal structures of MtCDA in complex with uridine (2. 4 Å resolution) and deoxyuridine (1. 9 Å resolution).Molecular dynamics (MD) simulation was performed to analyze the physically relevant motions involved in the protein–ligand recognition process, showing that structural flexibility of some residues are important to product binding. In addition, MD simulations allowed the analysis of the stability of tetrameric MtCDA structure. The role of the conserved glutamate-47 (E47) residue was evaluated by construction of five mutant proteins (E47A, E47D, E47L, E47H, and E47Q). Mutants E47A and E47H were expressed in insoluble fraction, whereas E47D, E47L and E47Q were soluble and purified by HPLC. The E47D, E47L and E47Q mutants contained 1 mol of Zn2+ per mol of protein subunit. These mutations had no effect on oligomerization state of MtCDA. Steady-state kinetic results showed that KM values for the E47D and E47Q mutants were not significantly altered, whereas there was a decrease in kcat values of 37-fold for E47D and 19-fold for E47Q mutant. No activity could be detected for E47L mutant. The crystal structure of the E47D mutant was solved by X-rays diffraction, using synchrotron light. An essential role was proposed for the g-carboxyl group of E47, and its involvement in the catalityc process. On the other hand, an important part of drug and vaccine development is the identification of gene products that are critical for bacterial growth and survival. In this way the knockout of the cdd gene was performed in order to evaluate the importance of the cdd gene for mycobacteria growth in vitro and in vivo. Our results suggest that cdd gene is not an essential gene for in vitro growth under the employed experimental conditions. Infection in mice with the knockout strain of cdd gene has shown a significant reduction in the CFU’s in lungs and spleen of the infected animals. Futher experiments are under way to confirm such findings. Finally, results from enzymatic characterization, site directed mutagenesis and gene replacement may be the starting point for a better understanding about the role of cytidine deaminase in M. tuberculosis metabolism and open up the possibility for a rational design of attenuated strain, that may be useful for future development of a new vaccine candidate against human TB. / O agente causador da tuberculose (TB), Mycobacterium tuberculosis, infecta um terço da população mundial. A Organização Mundial da Saúde estima que 8,6 milhões de novos casos de tuberculose ocorreram em 2012, resultando em 1,3 milhões de mortes no mundo. Assim, existe uma necessidade contínua de encontrar alvos moleculares promissores para o desenvolvimento de agentes anti-tuberculose e identificar determinantes de virulência associados com a patogênese de M. tuberculosis, visando a obtenção de cepas mutantes atenuadas como candidatas a novas vacinas contra a tuberculose. As enzimas envolvidas na biosíntese de purina e pirimidina têm papéis importantes no metabolismo celular, uma vez que proporcionam nucleótidos, os quais são componentes essenciais de um grande número de biomoléculas. A enzima Citidina deaminase (CDA) catalisa a desaminação hidrolítica da citidina a uridina, e faz parte da via de salvamento das pirimidinas.A CDA de M. tuberculosis (MtCDA) devido a sua não essencialidade pode ser um alvo interesante para a obtenção de cepas atenuadas para o desenvolvimento de vacinas auxotróficas contra a tuberculose, já que pode estar envolvido nos mecanismos de invasão e latência. No presente trabalho são apresentadas as estruturas cristalográficas da MtCDA em complexo com uridina (2,4 Å de resolução) e deoxiuridina (1,9 Å de resolução). Simulação da Dinâmica Molecular (MD) foi realizada com o propósito de analisar os movimentos fisicamente relevantes envolvidos no processo do reconhecimento proteína-ligante, e mostra que a flexibilidade estrutural de algumas regiões da proteína são importantes para a ligação do produto. Além disso, simulações MD permitiram a análise da estabilidade da estrutura tetramérica da MtCDA. O papel do resíduo conservado glutamato 47 (E47) foi avaliado mediante a construção de cinco proteínas mutantes (E47A, E47D, E47L, E47H, e E47Q). Os mutantes E47A e E47H foram expressos na fração insolúvel, enquanto E47D, E47L e E47Q foram expressas na fração solúvel e purificadas por cromatografia líquida de alta performance (HPLC).Os mutantes E47D, E47L e E47Q continham 1 mol de Zn2+ por mol de subunidade de proteína. Estas mutações não tiveram efeito sobre o estado de oligomerização da MtCDA. Resultados cinéticos em estado estacionário mostraram que os valores de KM para os mutantes E47D e E47Q não foram alterados significativamente, enquanto houve uma redução nos valores de kcat de 37 vezes para E47D e 19 vezes para a mutante E47Q. Não foi detectada qualquer atividade para a mutante E47L. A estrutura cristalográfica do mutante E47D foi resolvida por cristalografia de raios-X o que nos permitiu propor um papel catalítico para o grupo g-carboxila do residuo E47, sugerindo o envolvimento de um próton na catálise. Por outro lado, uma parte essencial para o desenvolvimento de novos fármacos e vacinas, é a identificação de produtos de genes que são fundamentais para o crescimento e a sobrevivência bacteriana in vitro e in vivo. Desta forma, foi realizado o nocaute do gene cdd a fim de avaliar a importância deste gene para o crescimento do bacilo em vida livre e em condições de estresse (vida intracelular). Nossos resultados sugerem que o gene cdd não é um gene essencial para o crescimento do bacilo in vitro sob as condições experimentais utilizadas. Experimentos de infecção em camundongos com a cepa nocaute do gene cdd mostraram uma significativa redução nas UFC’s determinadas no pulmão e baço dos animais infectados. Con tudo, experimentos de crescimento in vitro e infecção em camundongos estão sendo realizados a fim de confirmar os resultados obtidos. Os resultados da caracterização enzimática e substituição gênica são o ponto de partida para o melhor entendimento sobre o papel da enzima no metabolismo de nucleotídeos em M. tuberculosis, além de abrirem a possibilidade para o desenho racional de uma cepa atenuada, útil para o futuro desenvolvimento de uma nova candidata a vacina contra a tuberculose humana.
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Estudo de trialelias no marcador forense tpox e caracterização do terceiro aleloPicanço, Juliane Bentes January 2014 (has links)
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Previous issue date: 2014 / Genotyping of polymorphic short tandem repeats (STRs) loci is widely used in forensic DNA analysis. STR loci eventually present tri-allelic pattern as a genotyping irregularity and, in that situation, the doubt about the tri-allele locus calculation can reduce the analysis strength. Alleles at the TPOX STR locus have 6– 14 different numbers of a four-nucleotide (AATG) repeat motif arranged in tandem. Although tri-allelic genotypes are generally rare, the TPOX tri-allelic pattern has a higher frequency, varying widely among populations. Despite this, there are few accurate reports to disclose the nature of the TPOX third allele. In this work we performed two studies: In the first one we present data obtained from 45 individuals belonging to the same pedigree, in which there were cases of tri-allelic TPOX genotypes. The subjects were apparently healthy with a normal biological development. We noticed six tri-allelic cases in this family, and all of them were women. Karyotype analysis showed no occurrence of partial 2p trisomy. All the tri-allelic cases had the genotype 8–10–11, probably due to three copies of the TPOX STR sequence in all cells (Type 2 tri-allelic pattern). Based on previous data we assumed an allele 10 as the TPOX third allele. The pedigree analyses show evidence that the TPOX extra allele was an allele 10, it is placed far from the main TPOX locus, and that there is a potential linkage of the TPOX extra-allele-10 with one marker on Xq. This was the first study that included a large pedigree analysis in order to understand the nature TPOX tri-allelic pattern. In the second study, we investigate whether there is a single third-extra allele in the TPOX tri-allelic pattern, what it is, and where it is. We looked for TPOX tri-allelic subjects in 75,113 Brazilian families. Considering only the parental generation (mother+father) we had 150,226 unrelated subjects evaluated. From this total, we found 88 unrelated subjects with tri-allelic pattern in the TPOX locus (0. 06%; 88/150,226). Seventeen percent of these subjects (15/88) presented heterozygosis with peak imbalance, which we describe as a derived category to Clayton’s Type 2 tri-allelic pattern (a higher peak of double dose homozygote plus a regular sized peak). In this paper we presented detailed data from 66 trios (mother+father+child; with true biological relationships) where the tri-allelic pattern was observed in the mother or in the father. In 39 of these families (39/66; 59%) the third-extra TPOX allele was transmitted either from the mother or from the father to the child. Our evidence indicated an allele 10 as the thirdextra TPOX allele, and it is on the X chromosome. The present data, which support the previous hypothesis, improve the knowledge about tri-allelic pattern of TPOX CODIS' locus allowing the use of TPOX profile in forensic analyses even when with tri-allelic pattern. This evaluation is now available for different forensic applications. / A genotipagem de short tanden repeats ( STRs ) é amplamente utilizada na análise de DNA forense, contudo eventuais ocorrências de trialelias podem reduzir o poder da análise. Alelos do lócus de STR TPOX tem de 6-14 números diferentes do motivo de repetição em tandem de quatro nucleotídeos (AATG). Apesar dos genótipos tri-alélicos sejam geralmente raro, o padrão tri-alélico do TPOX tem uma alta freqüência, variando amplamente entre as populações. Apesar disso, há poucos relatos precisos para divulgar a natureza do terceiro alelo do TPOX. Neste trabalho nós realizamos dois estudos: No primeiro, apresentamos os dados obtidos a partir de 45 indivíduos pertencentes à mesma linhagem, em que houve casos de genótipos tri-alélicos do TPOX. Os indivíduos foram aparentemente saudável, com um desenvolvimento biológico normal. Percebemos seis casos tri-alélicos nesta família, e todos eles foram em mulheres. A análise do cariótipo mostrou nenhuma ocorrência de trissomia parcial 2p. Todos os casos trialélicos tinham o genótipo 8-10-11, provavelmente devido a três cópias da seqüência do STR TPOX em todas as células (Padrão tri-alélico tipo 2). Com base nos dados anteriores, assumimos o alelo 10 como sendo o terceiro alelo do TPOX. As análises do pedigree mostraram evidências de que o alelo extra do TPOX foi o alelo 10, é localizado distante do lócus principal do TPOX, e que existe um potencial de ligação entre o alelo- extra-10 do TPOX com um marcador em Xq. Este foi o primeiro estudo que incluiu uma grande análise do pedigree, a fim de compreender a natureza do padrão tri-alélico do TPOX. No segundo estudo, investigamos se há um único terceiro extra-alelo no padrão tri-alélico do TPOX, o que é ele, e onde está. Nós pesquisamos por indivíduos tri-alélicos no lócus TPOX em 75. 113 famílias brasileiras. Considerando apenas a geração parental (mãe + pai) tivemos 150. 226 indivíduos não relacionados avaliados. Desse total, encontramos 88 indivíduos não relacionados com o padrão tri-alélico no lócus TPOX (0,06%, 88/150, 226). Dezessete por cento destes indivíduos (15/88) apresentaram heterozigoses com desbalanço de picos, que descrevemos como uma categoria derivada do padrão tri-alélico de Clayton Tipo 2 (um pico mais alto de homozigoto dose dupla, mais um pico de tamanho regular). Neste trabalho, apresentamos dados detalhados de 66 trios (mãe + pai + filho; com verdadeiras relações biológicas) onde o padrão tri-alélico foi observado na mãe ou no pai. Em 39 destas famílias (39/66; 59%) o terceiro alelo-extra do TPOX foi transmitido tanto a partir da mãe ou do pai para a criança. Nossas evidências indicaram o alelo 10 como sendo o terceiro alelo-extra do TPOX, e ele está no cromossoma X. Os dados apresentados, os quais suportam as hipóteses anteriores, melhoram o entedimento sobre o padrão tri-alélico do lócus TPOX do CODIS permitindo o uso do perfil TPOX em análises forense, mesmo quando com o padrão tri-alélico. Essa avaliação está agora disponível para diferentes aplicações forenses.
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Dados genéticos populacionais e de mutações de novo de 23 Lócus Y-STRS em indivíduos do Rio Grande do SulFré, Nicole Nascimento da January 2014 (has links)
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Previous issue date: 2014 / We evaluated haplotype and allele frequencies, as well as statistical forensic parameters, for 23 Y-chromosome short tandem repeats (STRs) loci of the PowerPlex®Y23 system (DYS19, DYS385a/b, DYS389I/II, DYS390, DYS391, DYS392, DYS393, DYS437, DYS438, DYS439, DYS448, DYS456, DYS458, DYS635, Y-GATA-H4, DYS481, DYS533, DYS549, DYS570, DYS576, DYS643) in a sample of 150 apparently healthy males, resident in south Brazil. A total of 150 different haplotypes were identified. The highest gene diversity was observed for the single locus marker DYS570 (GD = 0. 7888) and for a two-locus system DYS385 (GD = 0. 9009). We also examined 150 father-son pairs by the same system, and observed a total of 13 mutations were identified in the 3,450 father-son allelic transfers, with an overall mutation rate across the 23 loci of 3. 768 x 10-3 (95% CI = 3. 542 x 10-3 to 3. 944 x 10-3). In all cases there was only one locus mutated with gain/loss of repeats in the son (5 one-repeat gains, and 7 one-repeat and 1 two-repeat losses); we observed no instances of mutations involving a non-integral number of repeats. / Foram avaliadas as frequências alélicas e haplotípicas, bem como os parâmetros estatísticos forenses, para 23 lócus Short Tandem Repeat (STRs) de cromossomo Y presentes no kit comercial PowerPlex®Y23 system (DYS19, DYS385a/b, DYS389I/II, DYS390, DYS391, DYS392, DYS393, DYS437, DYS438, DYS439, DYS448, DYS456, DYS458, DYS635, Y-GATA-H4, DYS481, DYS533, DYS549, DYS570, DYS576, DYS643) em uma amostra de 150 homens saudáveis, residentes no sul do Brasil. Um total de 150 haplótipos diferentes foram identificados. A maior diversidade genética foi observada para o marcador de lócus único DYS570 (GD = 0,7888) e para o lócus duplo DYS385 (GD = 0,9009). Também foram analisados 150 de pares de pai-filho pelo mesmo sistema, e um total de 13 mutações foram observadas em 3. 450 transferências alélicas entre pais-filhos, com uma taxa geral de mutação nos 23 lócus de 3. 768 x 10-3 (95% CI = 3. 542 x 10-3 - 3. 944 x 10-3). Em todos os casos foi encontrado apenas um lócus mutado com ganho ou perda de repetições no filho (5 ganhos de repetição única, 7 perdas de repetição única e 1 perda de dupla-repetição). Não foi observado nenhum caso de mutação envolvendo um número não integral de mutações.
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Caracterização da resistência a antimicrobianos em isolados de Salmonella enterica provenientes de materiais de origem avícolaMattiello, Samara Paula January 2013 (has links)
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Previous issue date: 2013 / Salmonella enterica is an important pathogen that causes gastroenteritis, and is transmitted to human through the consumption of contaminated food, especially from animal origin. The use of antimicrobials for therapeutic purposes in veterinary medicine and as growth promoters in animals used for food production has been considered one of the causes of emergence and spread of multi-drug resistant (MDR) S. enterica, representing a major risk to public health. Thus, the aim of this study was to determine antimicrobial resistance profiles as well as to characterize the main determinants involved on phenotypes of resistance in S. enterica isolates from poultry by-product meal and from other samples derived of poultry production chain, especially from environment of broiler houses. A total of 203 S. enterica isolates was analyzed, being 106 from poultry by-product meal and 97 isolated mainly from drag swabs. Higher percentages of resistance were detected in S. enterica isolated from drag swab when compared with isolates from poultry by-product meal. The highest percentages of resistance were found to sulfonamides followed by tetracycline, trimethoprim-sulfamethoxazole, nalidixic acid, streptomycin and spectinomycin. The majority of isolates was sensitive to ciprofloxacin and enrofloxacin. MDR phenotypes were detected in 37 (18. 2%) isolates and the profile penta-resistant (ampicillin, chloramphenicol, streptomycin, tetracycline and sulphamethoxazole) was detected in S. Heidelberg, S. Cerro and two S. Senftenberg. Class 1 integrons was found in 26 isolates (12. 7 %), and did not detect the presence of class 2 integron. A S. Senftenberg isolated from environment was found to harbor two class 1 integrons: one integron with a typical 3’CS, and the other with an atypical 3′CS linked to the qacH–sul3. The sul1, sul2 and sul3 genes were detected in 18. 7%, 32. 5% and 31. 2% S. enterica phenotypically resistant to sulfonamide, respectively. blaCMY, blaCTX-M and blaTEM genes were detected in 23. 8%, 9. 5% and 85. 7% of isolates resistant to β -lactams, respectively. Resistance determinants tetA, tetB and tetC were observed in 70%, 10% and 10% of isolates resistant to tetracycline, respectively. aadA and aadB genes were detected in 26. 1% and 32. 1% of isolates resistant to aminoglycosides, as well as the presence of strA and strB genes in 44. 4% and 34. 9% of S. enterica isolates phenotypically resistant to streptomycin. The presence of a heterogeneous profile of antimicrobial determinants and mobile genetic elements in the isolates analyzed indicates the potential risk that these bacteria represent to human health. / A Salmonella enterica é um importante patógeno causador de gastrenterite transmitido para humanos através do consumo de alimentos contaminados, principalmente os de origem animal. O uso de antimicrobianos para fins terapêuticos na medicina veterinária e como promotores de crescimento em animais destinados à produção de alimentos tem sido apontado como uma das causas do surgimento e disseminação de S. enterica multi-resistentes (MDR), constituindo um grande risco para a saúde publica. Dessa forma, o objetivo do presente trabalho foi determinar o perfil de resistência a antimicrobianos, bem como caracterizar os principais determinantes envolvidos nos fenótipos de resistência em isolados de S. enterica provenientes de farinhas de aves e de outras amostras oriundas da cadeia produtiva do frango, especialmente do ambiente de criação. Um total de 203 isolados de S. enterica foi analisado, sendo 106 oriundos de farinhas de aves e 97 provenientes, principalmente, de suabes de arrasto. Percentuais mais elevados de resistência foram detectados em S. enterica isoladas de suabe de arrasto, quando comparadas com isolados de farinhas de aves. Os maiores percentuais de resistência foram encontrados para sulfonamida, seguida por tetraciclina, trimetoprim-sulfametoxazol, ácido nalidíxico, estreptomicina e espectinomicina.A maioria dos isolados foi sensível à ciprofloxacina e à enrofloxacina. Fenótipos de MDR foram observados em 37 (18,2%) isolados, sendo que o perfil penta-resistente (ampicilina, cloranfenicol, estreptomicina, sulfametoxazol e tetraciclina) foi detectado em S. Heidelberg, S. Cerro e em duas S. Senftenberg. Integrons de classe 1 foram detectados em 26 isolados (12,7%), e não foi observada a presença de integron de classe 2. Uma S. Senftenberg isolada a partir do ambiente apresentou dois integrons de classe 1: um com um 3’CS típico e outro com 3′CS atípico ligado a qacH–sul3. Os genes sul1, sul2 e sul3 foram detectados, respectivamente, em 18,7%, 32,5% e 31,2% dos isolados de S. enterica fenotipicamente resistentes à sulfonamida. Os genes blaCMY, blaCTX-M e blaTEM foram detectados 23,8%, 9,5% e 85,7% dos isolados resistentes aos β-lactâmicos, respectivamente. Os determinantes de resistência tetA, tetB e tetC foram observados em 70%, 10% e 10% dos isolados resistentes à tetraciclina, respectivamente. Os genes aadA e aadB foram encontrados em 26,1% e 32,1 % dos isolados resistentes aos aminoglicosídeos, assim como a presença dos genes strA e strB foi detectada em 44,4% e 34,9% dos isolados de S. enterica fenotipicamente resistentes à estreptomicina. A presença de um perfil heterogêneo de determinantes de resistência e de elementos genéticos móveis nos isolados analisados indica o potencial risco que estas bactérias representam para a saúde humana.
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Avaliação da atividade da frutose-1, 6-bisfosfato no crescimento celular de hepatocarcinoma (HEPG2)Krause, Gabriele Catyana January 2014 (has links)
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Previous issue date: 2014 / Hepatocellular carcinoma (HCC) is the most frequent primary tumor of the liver, and is currently one of the major neoplastic diseases, representing 85% of primary liver tumors and is the third leading cause of cancer-related death. The development of the majority of hepatocellular carcinomas related to the presence of a disease resulting from cirrhosis, such as hepatitis B and C. Its incidence has increased in recent years due to the number of patients with infections caused by hepatitis C. The aim of this study was investigate the in vitro effect of fructose-1,6-bisphosphate (FBP) on the growth of HepG2 cells, used as a model to hepatocellular carcinoma. The results showed that the FBP decreases cell proliferation in a dose-dependent manner, not being caused by cell cycle arrest or apoptosis verified by flow cytometry. It was observed that at 72 h of treatment FBP decreased levels of IL-8, which is closely related to the tumor progression and the generation of reactive oxygen species. Moreover, FBP decreased oxidative stress by increasing the levels of catalase and decrease TBARS, this effect is possibly caused by the result of low IL- 8. These findings demonstrated that the FBP may be a potential anticancer agent for the treatment of HCC. / O hepatocarcinoma (HCC) é o tumor primário de fígado mais frequente, sendo atualmente uma das principais doenças neoplásicas, representando 85% dos tumores hepáticos primários e sendo a terceira maior causa de morte relacionada ao câncer. O desenvolvimento da maioria dos hepatocarcinomas relaciona-se com a presença de alguma doença decorrente do quadro de cirrose, como hepatite B e C. Sua incidência tem aumentado nos últimos anos devido ao número de pacientes com infecções por hepatite C. O objetivo deste estudo foi investigar, in vitro, o efeito da frutose-1,6-bisfosfato (FBP) sobre o crescimento das células HepG2, modelo utilizado como carcinoma hepatocelular. Os resultados demonstraram que a FBP diminui a proliferação celular em uma relação dose-dependente, não sendo essa proliferação ocasionada por parada no ciclo celular ou apoptose verificado pelos testes de citometria. Observou-se que em 72 h de tratamento a FBP diminuiu os níveis de Interleucina 8 (IL-8), sendo esta interleucina relacionada com a progressão tumoral e a geração de espécies reativas de oxigênio. Além disso, a FBP diminuiu o estresse oxidativo, aumentando os níveis de catalase e diminuindoa produção das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico(TBARS), sendo esse efeito antioxidante possivelmente ocasionado por conseqüênte diminuição de IL-8. Estes resultados demonstraram que a FBP pode ser um agente antineoplásico em potencial para o tratamento de hepatocarcinoma.
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9H-fluoren-9-IL(difenilmetil)-piperazinas: síntese, inibição da enzima 2-trans-enoil-ACP (CoA) redutase de mycobacterium tuberculosis e estudos de relação estrutura-atividadeRotta, Mariane January 2014 (has links)
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Previous issue date: 2014 / The Mycobacterium tuberculosis NADH-dependent enoyl-acyl carrier protein reductase (MtInhA) catalyzes hydride transfer to long-chain enoyl thioester substrates. MtInhA is a member of the mycobacterial type II dissociated fatty acid biosynthesis system, and is the bona fide target for isoniazid, the most prescribed drug for tuberculosis treatment. Here, a series of piperazine derivatives was synthesized and screened as MtInhA inhibitors, which resulted in the identification of compounds with IC50 values in the submicromolar range. A structure-activity relationship (SAR) evaluation indicated the importance of the chemical environment surrounding the carbonyl group for inhibition. In addition, the structure of one selected compound was supported by crystallographic studies, and experimental geometrical values were compared with semi-empirical quantum chemical calculations. Furthermore, the mode of inhibition and inhibitory dissociation constants were determined for the nine most active compounds. These findings suggest that these compounds interact with MtInhA at the enoyl thioester (2-trans-dodecenoyl-CoA) substrate binding site. Finally, two 9H-fluoren-9-yl-piperazine-containing compounds exhibited moderate antimycobacterial activity against the M. tuberculosis H37Rv strain. / A enzima 2-trans-enoil-ACP redutase de Mycobacterium tuberculosis (MtInhA) catalisa a etapa enzimática final no ciclo de alongamento da via de biossíntese de ácidos graxos, convertendo 2-trans-enoil-ACP à acil-ACP em um mecanismo dependente de NADH. Essa enzima vem sendo descrita como alvo validado para a descoberta de fármacos. Nesse trabalho uma série de piperazinas foi sintetizada e avaliada quanto ao potencial inibitório da atividade enzimática da MtInhA, resultando em compostos com valores de IC50 na faixa de inibição de nanomolar. Avaliações de relação estrutura-atividade (SAR) indicam a importância do ambiente químico adjacente à carbonila para a inibição. Além disso, a estrutura de um composto foi confirmada por estudos cristalográficos e os valores geométricos experimentais foram comparados com valores obtidos através de cálculos semi-empíricos de obitais moleculares. Experimentos para determinação do modo de inibição e obtenção dos valores das constantes de dissociação foram realizados para os nove compostos mais ativos. Os resultados sugerem que esses compostos interagem com MtInhA no sítio de ligação dos substratos acil-graxos. Finalmente, dois compostos, contendo na sua estrutura 9H-fluoren-9-il-piperazina exibiram moderada atividade antimicrobiana contra a cepa Mycobacterium tuberculosis H37Rv.
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Investigação de leveduras de ocorrência ambiental com o potencial metabólico de consumo do glicerol bruto derivado da produção de biodiesel e caracterização dos produtos geradosSilva, Anelise Baptista da January 2013 (has links)
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Previous issue date: 2013 / The raw glycerol derived from the biodiesel production is considered an industrial waste that has raised great concerns in the biofuels industry, mainly due to its low commercial value, its reduced assimilation after purification as well as to the high costs associated with its disposal. In this context, the use of microorganisms on biodegradation processes and bioconversion of raw glycerol to molecules with high added-values tends to enhance the biodiesel production chain, and minimize environmental impacts associated with its disposal, often done improperly. Thus, the goal of this work was to investigate and identify, in different environmental samples, the presence of yeasts capable of using raw glycerol as sole carbon source, and investigate in a preliminary manner their eventual metabolic products. Fifty-seven yeasts derived from the regional biodiversity were evaluated and five of them were selected as metabolically able for raw glycerol consumption. The selected isolates were cultured under different conditions of temperature, glycerol concentration and oxygenation in order to establish the best growing conditions. In order to investigate eventual products generated from the raw glycerol assimilation, high-performance liquid chromatography (HPLC) analyses and emulsification assays were performed. As results, this work presents the first report of raw glycerol consumption by Zygowilliopsis californica, Pichia fermentans, Candida melibiosica and by a probable new yeast species of Candida genus (Candida sp. ) isolated in this work. Still, this is the first report of this metabolic feature for a species of Zygowilliopsis genus. Moreover, Z. californica and Candida sp. presented some evidence to bear the metabolic potential to produce molecules of industrial interest from raw glycerol. These data may contribute for future strategies that aim the value increase of the biodiesel production chain. / O glicerol bruto derivado da produção do biodiesel é considerado um rejeito industrial que tem despertado grande preocupação na indústria de biocombustíveis, dentre outros fatores, devido ao seu baixo valor comercial, sua reduzida assimilação após processo de purificação e aos altos custos associados ao seu descarte. Nesse contexto, a aplicação de microrganismos em processos de biodegradação ou bioconversão do glicerol bruto em moléculas de maior valor agregado tende a valorizar a cadeia produtiva do biodiesel, e a minimizar impactos ambientais associados ao seu descarte, muitas vezes feito de forma inadequada. Deste modo, o objetivo desde trabalho foi investigar e identificar, em diferentes amostras ambientais, a presença de leveduras capazes de utilizar, como única fonte de carbono, o glicerol bruto, bem como investigar de maneira preliminar eventuais produtos metabólicos. Cinquenta e sete leveduras oriundas da biodiversidade local foram avaliadas e cinco delas selecionadas por apresentaram o potencial metabólico de interesse. Os isolados selecionados foram cultivados sob diferentes condições de temperatura, concentração de glicerol e oxigenação, com a finalidade de estabelecer as melhores condições para o seu crescimento. Análises de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) e de atividade emulsificante foram realizadas com a finalidade de investigar eventuais produtos gerados a partir do consumo do glicerol bruto. Como resultados, este trabalho traz o primeiro relato do potencial de utilização de glicerol bruto por Zygowilliopsis californica, Pichia fermentans, Candida melibiosica e por uma provável espécie nova do gênero Candida (Candida sp. ) isolada durante este trabalho. Esta é também a primeira descrição desta atividade metabólica para uma espécie do gênero Zygowilliopsis. De forma adicional, Z. californica e Candida sp. apresentaram indícios de capacidade metabólica para bioconversão do glicerol bruto em moléculas de valor industrial. Os dados levantados neste trabalho poderão contribuir para futuras estratégias que visem à valorização da cadeia produtiva do biodiesel.
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Caracterização de resistência a quinolonas em Salmonella enterica isoladas de materiais de origem avícola do sul do BrasilDrescher, Guilherme January 2013 (has links)
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Previous issue date: 2013 / Salmonella enterica is considered an important zoonotic pathogen that can be responsible by losses in animal production, especially in poultry husbandry. Different classes of antimicrobials have been used as a prophylactic and/or therapeutic in poultry production, highlighting the quinolones, which also are indicated for human use. The wide use of these antimicrobials may contribute to the selection of microorganisms resistant to these drugs. Resistance to quinolones has been assigned to mutations in genes encoding DNA gyrase and topoisomerase IV, in addition to being associated with the presence of plasmid-mediated quinolone resistance (PMQR), especially encoded by qnr and aac(6')-Ib-cr genes. Thus, the aim of this study was to evaluate the presence of efflux pump systems involved in the resistance to quinolones using the efflux pump inhibitor carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone (CCCP), and identify the presence of resistance determinants to quinolones in isolates of S. enterica from poultry-related material. For this, 36 S. enterica strains resistant to quinolones were used. The reduction of the activity of efflux pump systems was detected in 66. 7% of isolates tested for nalidixic acid and ciprofloxacin with addition of CCCP. Mutation in DNA gyrase was determined by sequencing and analysis of the gyrA gene, and qnr (A, B, D and S) and aac(6')-Ib-cr genes were detected by PCR. Analysis of the gyrA gene sequences in isolates phenotypically resistant to quinolones identify the presence of mutation leading to the alteration Ser83→Phe and Asp87→Gly, Asn or Tyr in 38,9% and 22,2%, respectively. Plasmid profile analysis showed nine profiles with plasmids that ranged from ~2 kb to ~50 kb, and PMQR genes were found in 22. 2% of S. enterica isolates. qnrA and qnrB genes were detected in 11. 1% and 5. 5% of isolates, respectively, and qnrS was found in 2. 7%. None qnrD gene was found in the isolates tested. aac(6')-Ib-cr gene was detected in 8. 3% of the isolates. To our knowledge, this study reports for the first time mutations in gyrA in S. Worthington from poultry, as well as this is the first report of the presence of qnrA, qnrS and aac(6')-Ib-cr in S. enterica isolated from samples related to poultry production chain in Brazil. The presence of resistance determinants to quinolones in S. enterica isolates from poultry leads to concern regarding to potential resistance selection due to the use of these antimicrobials in animal production. / A Salmonella enterica é considerada um importante patógeno zoonótico que pode ser responsável por perdas na produção animal, especialmente na criação de aves. Diferentes classes de antimicrobianos têm sido utilizadas de forma profilática e/ou terapêutica na produção avícola, entre elas destacam-se as quinolonas, que também têm indicação para uso humano. A ampla utilização destes antimicrobianos pode contribuir para a seleção de microrganismos resistentes a estes fármacos. A resistência a quinolonas tem sido atribuída a mutações nos genes da DNA girase e da topoisomerase IV, além de estar associada à presença de determinantes de resistência carreados por plasmídeos (PMQR), especialmente aqueles codificados pelos genes qnr e aac(6’)-Ib-cr. Desta forma, o objetivo do presente trabalho foi avaliar a presença de sistemas de bombas de efluxo envolvidos na resistência a quinolonas utilizando o inibidor Cianeto de Carbonila Clorofenilhidrazona (CCCP), bem como identificar determinantes de resistência a quinolonas em isolados de S. enterica de origem avícola. Para tanto, foram utilizados 36 isolados de S. enterica resistentes quinolonas. A redução na atividade dos sistemas de bombas de efluxo foi observada em 66,7% dos isolados testados para o ácido nalidíxico e para a ciprofloxacina com adição do CCCP. Mutações na DNA girase foram determinadas por sequenciamento e análise do gene gyrA, e os genes qnr (A, B, D e S) e aac(6’)-Ib-cr foram detectados através de PCR. A análise das sequências do gene gyrA nos isolados fenotipicamente resistentes a quinolonas identificou a presença de mutação levando à alteração Ser83→Phe e Asp87→Gly, Asn ou Tyr em 38,9% e 22,2%, respectivamente.A análise do perfil plasmidial revelou nove perfis com plasmídeos que variaram de ~2 kb até ~50 kb e os genes PMQR foram encontrados em 22,2% dos isolados de S. enterica. O gene qnrA e o qnrB foram detectados em 11,1% e 5,5% dos isolados, respectivamente, e o gene qnrS em 2,7%. O gene qnrD não foi encontrado em nenhum dos isolados testados. O gene aac(6’)-Ib-cr foi detectado em 8,3% dos isolados. Até onde se sabe, este trabalho relata pela primeira vez mutações no gene gyrA em S. Worthington de origem aviária, bem como, este é o primeiro relato da presença dos genes qnrA, qnrS e aac(6’)-Ib-cr em cepas de S. enterica isoladas de amostras relacionadas com a cadeia produtiva de frangos no Brasil. A presença de determinantes de resistência a quinolonas em isolados de S. enterica de origem aviária alerta para a possível seleção de resistência pelo uso destes antimicrobianos na produção animal.
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Espectrometria de massas combinada a agentes de ligação cruzada para a caracterização estrutural em solução da enzima Enoil-ACP-redutase de Mycobacterium tuberculosisSantos, Anderson Jader Antunes Brizola dos January 2014 (has links)
Made available in DSpace on 2014-11-15T01:01:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1
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Previous issue date: 2014 / Tuberculosis (TB), a disease mainly caused by the bacillus Mycobacterium tuberculosis (MTB), is considered a global public health problem. Infections caused by mycobacteria are generally difficult to treat because of its natural resistance to most antibiotics. This resistance is largely attributed to the formation of the cell wall. The InhA is part of the mycobacterial FAS II system which regulates the elongation of the fatty acid chain, which will compose the cell wall of the bacillus (mycolic acids). As the FAS II system is not present in mammals, this enzyme has been described as an important macromolecular target aiming the development of drugs with selective toxicity. The development of analytical techniques for studying proteins in solution by mass spectrometry combined with cross-linking has permitted access information about the primary, tertiary, and quaternary structure of the proteins. In this work, the technique of cross-linking combined with mass spectrometry was implemented for the characterization of the Mycobacterium tuberculosis enoyl-ACP reductase (InhA) which catalyzes the final essential enzymatic step in fatty acid elongation in the FAS II pathway, converting 2-trans-enoyl-ACP to acyl-ACP via an NADH-dependent reaction. / A tuberculose (TB), doença causada principalmente pelo bacilo Mycobacterium tuberculosis (MTB), é considerada um problema global de saúde pública. As infecções causadas pela micobactéria são, em geral, difíceis de tratar devido principalmente ao surgimento de cepas resistentes á maioria dos fármacos disponíveis e à co-infecção com a síndrome da imunodeficiênciaadquirida (SIDA). Nesse contexto, a caracterização de alvos moleculares para a proposição de novas estruturas químicas candidatas a fármacos anti-TB mostra-se de importância sumária. A enzima enoil-ACP-redutase (InhA) de MTB faz parte do sistema FAS II damicobactéria a qual regula o alongamento da cadeia dos ácidos graxos fornecendo os precursores que irão compor a parede celular do bacilo (ácidos micólicos). Como o sistema FAS II não esta presente em mamíferos esse fato torna essa enzima um importante alvo macromolecular para o desenvolvimento de novos fármacos com toxicidade seletiva. O desenvolvimento de técnicas analíticas para estudar proteínas em solução utilizando a espectrometria de massas combinada com agentes de ligação cruzada vem possibilitandoa caracterização estrutural de proteínas conduzindo a informações sobre suas estruturas primárias, terciárias e quaternárias. No presente trabalho foi implementado a técnica de cross-linking combinada a espectrometria de massas para a caracterização em solução da enzima InhA de MTB.
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