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Variabilidade genética e fitoquímica de Casearia sylvestris em populações do cerrado e Mata Atlântica do Estado de São Paulo /Silva, Magnólia Aparecida Silva da, 1966- January 2003 (has links)
Resumo: Na espécie Casearia sylvestris Sw. (Flacourtiaceae) são consideradas duas variedades botânicas: C. sylvestris var. língua, com característica arbustiva e ocorrência em savanas arbustivas e C. sylvestris var. sylvestris, de caráter arbóreo em vegetação florestal ou arbustiva. A literatura afirma ser bastante problemático definir os limites destas variedades através de parâmetros morfológicos sendo portanto, importante identificar diferenças genéticas e fitoquímicas entre estas. Este trabalho teve como objetivo identificar em seis populações naturais de Casearia sylvestris de ocorrência no Cerrado e Mata Atlântica do estado de São Paulo diferenças genéticas e químicas entre as variedades lingua e sylvestris, realizando estudo da variabilidade genética da espécie, por meio de marcador molecular do tipo RAPD. Foram coletados dados de localização geográfica (altitude, latitude e longitude). As extrações de DNA foram feitas a partir de 100 mg de folhas utilizando o método de extração CTAB. Nove primers foram utilizados para aplicação da técnica. A partir de matriz binária de similaridade gerou-se o dendrograma pelo índice de Jacard, utilizando o método de agrupamento UPGMA. A correlação das distâncias geográficas com distâncias genéticas foi obtida pelo teste de Mantel, enquanto que a análise de variância molecular (AMOVA) e o índice de Shannon foram utilizados para verificar as diferenças entre e dentro das populações. Folhas da espécie foram submetidas à extração em metanol, e a quantificação de rutina foi realizada utilizando um cromatográfo líquido de alta eficiência. Praticamente toda variabilidade da espécie é representada pela variabilidade intrapopulacional e a análise de agrupamento mostrou maior similaridade entre as populações de um mesmo bioma, revelando uma diferença genética entre as duas variedades botânicas... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo). / Abstract: Two botanical varieties have been considered in Casearia sylvestris species: C. sylvestris, lingua variety with a shrubby characteristic, occurring in bushy savannah and C. sylvestris, sylvestris variety with an arboreous type in forest or shrubby vegetation. The limits of these varieties based on morphological parameters are vey tenuos, making molecular and phytochemical markers very important to identify. This work aimed to identify genetic and chemical diffrences between lingua and sylvestris varieties in six natural populations of Casearia sylvestris from Cerrado and the Atlantic Forest in São Paulo state, using (RAPD) molecular marker and chemical markers. Samples have been collected in order to analyze geographic location data (altitude, latitude and longitude). DNA extraction was performed using 100 mg of leaves through the CTAB procedure. Nine primers were used for the technique application. The dendrogram was obtained from the matrix of pairwise distances through the Jaccard's similarity index using the UPGMA grouping method. A Mantel test was used to analyze correlations between genetic and geographical distances, while the molecular variance analysis and the Shannon index were used to determine the intra- and interpopulation divergences. For the phytochemical study leaves of the species were submitted to extraction in methanol and rutin quantification was carried out using a high-performance liquid chromatographer. Practically all species variability are represented by the intrapopulation variability and the grouping analysis showed higher similarity among populations of the same biome, revealing a genetic diversity between the two botanical varieties. The majority of soils where was collected"guaçatonga" is present is of high acidity and predominantly of medium texture. Nevertheless, most soil indicator values showed diversity among populations of savannah and forest... (Complete abstract, click electronic address below). / Orientador: Lin Chau Ming / Coorientador: Ana Maria Soares Pereira / Doutor
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Modelo vibro-rotacional para a molécula de DNA /Silva, Ricardo Alexandre dos Santos. January 2008 (has links)
Orientador: Elso Drigo Filho / Banca: Makoto Yoshida / Banca: Gerald Weber / Banca: Jorge Chahine / Banca: João Ruggiero Neto / Resumo: O objetivo deste trabalho é investigar um modelo mecânico para a molécula de DNA. O modelo consiste de duas cadeias de osciladores harmônicos representando as tas do DNA. Esses osciladores são ligados por um potencial de Morse que simula as interações tipo pontes de hidrogênio, como no modelo original de Peyrard e Bishop. Entretanto, neste trabalho, os movimentos de rotação e de vibração de cada par de base podem ocorrer ao mesmo tempo. Neste contexto, propriedades estruturais e termodinâmicas são discutidas. / Abstract: The objective of this work is to investigate a mechanical model for the DNA molecule. The model consist in two chains of harmonic oscillators representing the ribbons of DNA linked by a Morse potential which represents the hydrogen bonds as in the Peyrard-Bishop's model. However, in this work, the rotation and vibration motion of each base pairs can be occur at the same time. In this context, thermodynamic and structural properties are discussed. / Doutor
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Análise estrutural e funcional de hemoglobinas de ofídios /Lombardi, Fábio Renato. January 2005 (has links)
Orientador: Gustavo Orlando Bonilla Rodriguez / Banca: Flávio Augusto Vicente Seixas / Banca: Marcos Roberto de Mattos Fontes / Banca: Mário Sérgio Palma / Banca: Arno Rudi Schwantes / Doutor
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Análise molecular e morfológica de exemplares de Trichomycterus valenciennes, 1832 da Chapada dos Guimarães (Bacia do Paraguai) e ensaio sobre o complexo de espécies Trichomycterus brasiliensis Lutken, 1874 /Mehanna, Mahmoud Nagib. January 2010 (has links)
Resumo: O objetivo deste trabalho é analisar as espécies do gênero Trichomycterus presentes na sub bacia do rio Cuiabá, drenagem do rio Paraguai, através de analises morfológicas e moleculares, e um breve ensaio sobre o complexo de espécies T. brasi/iensis através de análises moleculares. Os resultados obtidos foram divididos em duas partes: na primeira parte são apresentados os resultados das análises morfológicas e moleculares dos exemplares de Trichomycterus, e uma análise da morfologia externa de T. johnsoni; e na segunda parte são apresentadas as análises moleculares de alguns espécimes que pertencem ao complexo de espécies T. brasi/iensis. Foram identificadas quatro novas espécies, T. sp. n1, T. sp. n2, T. sp. n3, T. sp. n4 que divergem entre elas pelo seguintes conjuntos de caracteres, respectivamente: Número de odontóideos na placa pré-opercular (9 versus 20-22 versus 17-18 versus 14); número de odontóideos na placa inter-opercular (16-17 versus 27-31 versus 21-25 versus 22-25); T. sp. n1 diverge de seus congêneres pelo número de raios na nadadeira peitoral (i+6 versus i+5). O número de raios da nadadeira anal permite diferenciar T. sp. n1 (ii+4) de T. sp. n2 (ii+5) e T. sp. n3 (ii+5) e T. sp. n4 (ii+6), sendo essa caráter compartilhado entre T. sp. n2 e T. sp. n3. As espécies compartilham o número de raios da nadadeira dorsal (ii+7), o número de raios da nadadeira caudal (i+11 +i), e o número de raios na nadadeira pélvica. Com relação aos canais laterosensorias, T. sp. n1 e T. sp. n3 apresentaram a ausência do canal infra-orbital i1 e i3. Nas análises osteológicas, a única variação encontrada entre as espécies citadas (com exceção de T. sp. n4) foi a formação da nadadeira pélvica, em relação a estruturas dos ossos pélvicos e do processo mesial. Nas análises moleculares foi amplificado e sequenciado parte do gene mitocondrial Citocromo... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The objective of this work is analyze the Trichomycterus species presents in the Cuiabá river sub basin, Paraguay river drainage, through morphologic and molecular analyze, and make a briefing essay species complex of T. brasi/iensis with molecular analyses. The results had been divided in two parts: in the first part are presented the results of the morphologic and molecular analyses of Trichomycterus, and an analysis of the external morphology of T. johnsoni; e in the second part is presented the molecular analyses of some specimens that comprise to the species complex of T. brasiliensis. The species had been identified to four new species, T. sp. n1, T. sp. n2, T. sp. n3 and T. sp. n4, that they diverge between them for the following characters: Number of odontodes in the opercular plate (9 versus 20-22 versus 17-18 versus 14); number of odontodes in the Interopercular plate (16-17 versus 27-31 versus 21-25 versus 22-25); T. sp. n1 diverge of ali species for the number of rays in the pectoral fins (i+6 versus i+5). The number of rays of the anal fins allows differente in T. sp. n1 (ii+4) of T. sp. n2 (ii+5) and T. sp. n3 (ii+5) and T. sp. n4 (ii+6), being this character shared between T. sp. n2 and T. sp. n3. Ali species share the number of rays of the dorsal fins (ii+ 7), the number of caudal fins rays (i+11 +i), and the number of the pelvic fins rays. With regard to the laterosensory canais, T. sp. n1 and T. sp. n3 had presented the absence of the infra-orbital canais i1 and i3. In the osteology analyses, the only variation of ali species cited (with exception of T. sp. n4) was the pelvic fins, where the variation of the pelvic bones structures and the mesial process diverge between them. In the molecular analyses it was amplified and sequence part of the mitochondrial gene Citocromo Oxidase I sub-unit, and was elaborated a matrix with 634 pb. The dendogram with method UPGMA with... (Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Claudio de Oliveira / Coorientador: Flávio Alicino Bockmann / Banca: Francisco Langeani Neto / Banca: Ricardo Cardoso Benine / Banca: Edmir Daniel Carvalho / Banca: Fausto Foresti / Mestre
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Identificação de fatores de transcrição de Neurospora crassa envolvidos na regulação do metabolismo de glicogênio /Gonçalves, Rodrigo Duarte. January 2008 (has links)
Orientador: Maria Célia Bertolini / Banca: Marcos Roberto de Mattos Fontes / Banca: Dulce Helena Ferreira de Souza / Resumo: Este trabalho teve como objetivo identificar fatores de transcrição envolvidos na via metabólica do glicogênio no fungo Neurospora crassa durante o crescimento vegetativo e na condição de choque térmico. Para isso foi utilizado uma coleção de 139 linhagens mutantes do fungo, as quais possuem genes codificadores de fatores de transcrição individualmente nocauteados. O conteúdo de glicogênio de todas as linhagens foi determinado tanto a 30ºC, temperatura fisiológica de crescimento, quanto a 45ºC, situação de choque térmico. Do total das linhagens analisadas, 10 apresentaram um perfil distinto daquele observado na selvagem. Com o objetivo de verificar o envolvimento dos fatores de transcrição identificados na expressão do gene que codifica a enzima glicogênio sintase (gsn), experimentos de Northern blot foram realizados e revelaram que do total de linhagens analisadas, 3 apresentaram diferenças na transcrição de gsn, sugerindo que os fatores de transcrição nocauteados nestas linhagens atuam diretamente na regulação da transcrição do gene. As linhagens mutantes selecionadas foram avaliadas quanto ao crescimento e comparadas à linhagem selvagem. Todas as linhagens selecionadas apresentaram uma taxa de crescimento bastante semelhante à linhagem selvagem, exceto a linhagem FGSC011062 (ORF NCU09739), a qual apresentou uma taxa de crescimento muito reduzida. Ferramentas de bioinformática disponíveis na internet foram utilizadas para a dedução teórica das características bioquímicas, moleculares e estruturais dos fatores de transcrição selecionados, tais como ponto isoelétrico, massa molecular, sinais de localização nuclear clássicos e a presença de domínios conhecidos. A análise por Blastp revelou que apenas 2 das 10 ORFs selecionadas codificam fatores de transcrição com função conhecida e as demais codificam proteínas hipotéticas... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The objective of this work was to identify transcription factors involved in the glycogen metabolic pathway of the fungus Neurospora crassa. We used a collection of 139 mutant strains, in which each strain has a gene codifying for transcription factor individually knockedout. The glycogen content was quantified during the vegetative growth (30ºC), and after a stress condition such as heat shock (transfer for 30ºC to 45ºC). Of all analyzed strains, 10 showed a pattern of glycogen accumulation distinct of the one observed for the wild type strain. To verify the involvement of the transcription factors identified in the expression of the gene encoding glycogen synthase (gsn), Northern blot experiments were performed and revealed that 3 strains showed differences in gene transcription, either before or after heat shock. The results suggested that the transcription factors knocked-out in the strains might act directly in the regulation of the gsn gene transcription. The growth of the selected mutant strains was evaluated and compared to the wild type strain. Most of the selected mutant had a growth rate similar to the wild type strain, except the strain FGSC01162 (ORF NCU09739), which showed a reduced growth rate. Online bioinformatics tools were used to predict the biochemical parameters, such as isoeletric point and molecular weight, as well protein domain, such as classic nuclear localization signal (cNLS). Analysis by Blastp revealed that 2 from 10 selected ORFs codify transcription factors having functional roles in public databases: the ORF NCU08000 codifies the cutinase transcription factor 1α that is involved in the induction of the expression of cutinases genes by fatty acids in ascomycetes, and the ORF NCU06971 codifies the protein XlnR a transcription factor responsible for the transcription activation of genes involved in the xylan degradation. The results described... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre
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Adaptações morfofuncionais e respostas moleculares do músculo esquelético de ratos submetidos ao treinamento aeróbio /Vechetti Júnior, Ivan José. January 2011 (has links)
Orientador: Maeli Dal Pai Silva / Banca: Marcelo Papoli / Banca: Roberto Carlos Burini / Resumo: O músculo esquelético é constituído por tipos de fibras que diferem de acordo com suas propriedades contráteis e metabólicas. Estas fibras possuem uma elevada plasticidade sendo capazes de alterar seu fenótipo em resposta a vários estímulos, como o treinamento físico. Tem sido demonstrado que o treinamento aeróbico frequentemente induz a pequenas alterações na massa muscular, promovendo mudanças no perfil do músculo em direção a um padrão mais eficiente. Vários estudos têm sido realizados para tentar identificar as vias moleculares envolvidas com a adaptação muscular. A maioria destes estudos tem procurado entender os fatores que controlam as alterações no fenótipo muscular, incluindo o fator de crescimento semelhante à insulina-I (IGF-I), a miostatina (MSTN) e a calcineurina (CaN). O objetivo deste estudo foi testar a hipótese de que as alterações que ocorrem em músculos fenotipicamente distintos durante o treinamento aeróbio de longo prazo são regulados por fatores de crescimento miogênicos, como o IGF-I, MSTN e CaN A e B. Ratos Wistar machos (80 dias de idade, 250-300 g) foram divididos em dois grupos: treinado (T; n = 8) e controle (C, n = 8). Os animais do grupo T foram submetidos a um programa de treinamento aeróbio de natação de longo prazo (8 semanas, 5 dias / semana). O volume e intensidade do treino foram progressivos: 10 min, sem sobrecarga (1ª semana), 20 min, com sobrecarga de 1% (2ª semana), 25, 30, 35 e 40 min, 3% de sobrecarga (3ª semana), 45, 50, 55, e 60 min, 5% de sobrecarga (4ª semana) e 60 min, 5% de sobrecarga (5ª a 8 semanas). No final do experimento os animais foram pesados e sacrificados. Os músculos sóleo (SOL) e Plantar (PL) foram retirados e processados para as análises histoquímica, morfométrica, bioquímica e molecular... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The skeletal muscle is constituted by fiber types which differ according to their contractile and metabolic properties. Muscle fibers have a high plasticity and are dynamic structures liable to modify their phenotype in response to several stimuli, such as physical training. It has been shown that aerobic training frequently leads to minor changes in muscle mass, promoting changes in muscle profile toward a more efficient pattern. Several studies have been performed to try to identify the molecular pathways involved in the muscle adaptation. Most of them converge to understand the factors that control the muscle phenotype changes including the insulin-like growth factor-I (IGF-I), Myostatin (MSTN) and Calcineurin (CaN). The purpose of this study was to test the hypothesis that muscle phenotypically distinct changes that occur during long-term aerobic training are regulated by myogenic growth factors including IGF-I, MSTN and CaN A and B. Male Wistar rats (80 days old, 250-300 g) were divided into two groups: trained (T; n=8) and control (C; n=8). T group underwent a swimming aerobic training program for 8 weeks (5 days/week). Training volume and intensity were progressive: 10 min without overloading (1st week), 20 min, 1% overload (2nd week), 25, 30, 35, and 40 min, 3% overload (3rd week), 45, 50, 55, and 60 min, 5% overload (4th week and 60 min, 5% overload (5th to 8th weeks). At the end of the experiment animals were weighed and sacrificed. Soleus (SOL) and Plantaris (PL) muscles were removed and processed for histochemical, morphometrical, biochemical and molecular analyses. No significant difference was observed in the initial body weight among the groups (p >0.05). After aerobic training, a reduction of the final body weight was observed in the trained (p < 0.05) compared with the control groups... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre
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O papel do sistema purinérgico e da via de sinalização TOR em crises convulsivas e estresse oxidativoSiebel, Anna Maria January 2013 (has links)
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Previous issue date: 2013 / Epilepsy, characterized by the occurrence of spontaneous and recurrent seizures, is one of the main chronic neurological diseases, affecting around 1% of the world's population. Adenosine is an endogenous modulator of neuronal excitability and has anticonvulsant properties. Thus, the modulation of adenosinergic signalling pathway may presents important effects on epilepsy. In this study we characterize different aspects of the adenosinergic signaling in a model of seizures induced by pentylenetetrazole (PTZ) in zebrafish. In this study we also analyzed the effect of different modulators of adenosinergic signaling on controlling the development of seizures. Our results showed that the activation of type A1 adenosine receptors has an important role in controlling seizures in zebrafish. Furthermore, we observed that ecto-5´-nucleotidase and ADA enzymes, in addition to nucleoside transporters, are directly involved in controlling extracellular adenosine levels and, consequently, in controlling the development of seizures in this teleost. In addition, we clarified the occurrence of controversial data related to the mTOR signaling pathway in oxidative stress. Previous studies have suggested the activation of this pathway in oxidative stress based on the misinterpretation of the phosphorylation of RSK and MSK proteins through the antibody anti-phospho-Thr389-S6K, in addition to protein S6 phosphorylation, regulated by the MAPK signaling pathway in this case. Therefore, these findings might contribute for a better understanding about the signaling pathways involved in the mechanisms of seizure control and represents na alternative for the development of antiepileptic drugs, increasing the therapeutic options in epilepsia. Our results may also contribute to future studies on the characterization and modulation of TOR signaling pathway in zebrafish. / A epilepsia, caracterizada pela ocorrência de crises convulsivas espontâneas e recorrentes, é umas das principais doenças neurológicas crônicas, afetando em torno de 1% da população mundial. A adenosina é um modulador endógeno da excitabilidade neuronal e apresenta propriedades anticonvulsivantes. Sendo assim, a modulação da via de sinalização adenosinérgica pode apresentar um efeito importante na epilepsia. Neste estudo, nós caracterizamos diferentes aspectos da sinalização adenosinérgica em modelo de crise convulsiva induzida por pentilenotetrazol (PTZ) em peixe-zebra. Nossos resultados demonstram um aumento nas atividades da adenosina desaminase (ADA), responsável pela desaminação de adenosina em inosina, logo após uma crise convulsiva. Além disso, foi observado que os fármacos antiepilépticos gabapentina, fenitoína e ácido valpróico preveniram o efeito estimulatório promovido pelo PTZ sobre as atividades da adenosina desaminase. Neste estudo, também analisamos o efeito de diferentes moduladores da sinalização adenosinérgica no controle do desenvolvimento de convulsões induzidas por PTZ. Nossos resultados demonstraram que a ativação de receptores de adenosina do tipo A1 tem importante participação no controle de crises convulsivas em peixe-zebra. Além disso, observamos que as enzimas ecto-5´-nucleotidase e ADA, além dos transportadores de nucleosídeos estão diretamente envolvidos no controle dos níveis extracelulares de adenosina e, consequentemente, no controle do desenvolvimento de crises convulsivas neste teleósteo. Além disso, esclarecemos a ocorrência de dados controversos relacionados à via de sinalização mTOR em estresse oxidativo. Estudos sugeriram a ativação desta via em estresse oxidativo baseados na interpretação equivocada da fosforilação das proteínas RSK e MSK pelo anticorpo anti-fosfo-Thr389-S6K, além da fosforilação da proteína S6, regulada neste caso pela via de sinalização MAPK. Este estudo pode contribuir para um maior entendimento das vias de sinalização envolvidas nos mecanismos de controle de crises convulsivas e representar uma alternativa para o desenvolvimento de fármacos antiepilépticos, aumentando as opções terapêuticas em epilepsia. Nossos resultados também podem contribuir para futuros estudos referentes à caracterização e modulação da via de sinalização TOR em peixe-zebra.
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A enzima hidrolase de nucleosídeos purínicos de Mycobacterium tuberculosis H37RV: caracterização bioquímica, termodinâmica e estudos de nocaute gênicoWink, Priscila Lamb January 2013 (has links)
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Previous issue date: 2013 / Human tuberculosis (TB) is a major global health threat. The disease’s increasing prevalence, coupled with the emergence of drug-resistant strains and the devastating effects of co-infection with human immunodeficiency virus (HIV) indicate an urgent need for the development of new and more efficient drugs to combat the disease's causative agent, Mycobacterium tuberculosis. Global health authorities have also begun to recognize the need for drugs that can kill the mycobacteria in its different physiological states including but not limited to latent TB infection. A more comprehensive understanding of the bacilli's nucleotide metabolic pathways, in particular purine and pyrimidine salvage pathways, could aid in the development of new therapeutic strategies to reduce the incidence of TB worldwide. Nucleoside hydrolase catalyzes the irreversible hydrolysis of N-glycosidic bond of ribonucleosides, forming α-D-ribose and the corresponding base. This work describes the amplification, cloning, expression and purification of the iunH-encoding purine nucleoside hydrolase from M. tuberculosis (MtIAGU-NH). Results from steadystate kinetic experiments indicate that MtIAGU-NH has broad substrate specificity, accepting inosine, adenosine, guanosine, and uridine as substrates. Kinetics analysis utilizing fluorescence spectroscopy of ribose binding to MtIAGU-NH suggests that prior to ligand association there are two pre-existing forms of the enzyme. We determined the intracellular concentrations of inosine, uridine, hypoxanthine, and uracil as well as the reaction’s thermodynamic parameters. Thermodynamic activation parameters (Ea, ΔG#, ΔS#, ΔH#) for the MtIAGU-NH-catalyzed chemical reaction, along with results from mass spectrometry, isothermal titration calorimetry (ITC), pH-rate profile experiments, multiple sequence alignment, and molecular docking experiments are also presented. Knockout experiments of the iunH gene indicate that this gene is not essential for the growth of M. tuberculosis H37Rv underutilized experimental conditions. The data presented here contribute to our understanding of MtIAGU-NH, providing a solid basis for the development of efficient prophylactic and therapeutic strategies to reduce the global incidence of TB. / A tuberculose humana (TB) é considerada uma ameaça à saúde global. O aumento na prevalência da doença, a emergência de cepas resistentes e a coinfecção com o vírus da imunodeficiência humana levaram à urgente necessidade do desenvolvimento de novas drogas mais eficientes para o combate do agente causativo da TB, Mycobacterium tuberculosis. Além disso, há a necessidade de novas drogas contra a micobactéria nos seus diferentes estados fisiológicos, incluindo a TB latente. Um maior entendimento sobre as vias metabólicas de nucleotídeos do bacilo da TB, em particular as vias de salvamento de purinas e pirimidinas, levariam ao desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para controlar a incidência global de TB. A hidrolase de nucleosídeos catalisa a hidrólise irreversível da ligação N-glicosídica de ribonucleosídeos, dando origem à α-D-ribose e sua base livre correspondente. Este trabalho descreve a amplificação e clonagem do gene iunH, e a expressão e purificação da enzima recombinante hidrolase de nucleosídeos purínicos de M. tuberculosis (MtIAGU-NH). Os resultados de cinética no estado estacionário mostram que a MtIAGU-NH possui uma ampla especificidade pelos substratos, utilizando inosina, adenosina, guanosina e uridina como substratos. As medidas cinéticas da ligação da ribose à MtIAGU-NH por espectroscopia fluorimétrica sugerem a existência de duas formas da enzima em equilíbrio, relacionadas à associação ao ligante. As concentrações intracelulares de inosina, uridina, hipoxantina e uracil foram determinadas e os parâmetros termodinâmicos, estimados. Os parâmetros termodinâmicos de ativação (Ea, ΔG#, ΔS#, ΔH#) para a reação química catalisada pela MtIAGU-NH, além dos resultados de espectrometria de massa, calorimetria de titulação isotérmica, experimento de perfil de pH, alinhamento de múltiplas sequências e experimentos de docagem molecular também são apresentados neste trabalho. O nocaute do gene iunH mostrou que este não é essencial para o crescimento do bacilo M. tuberculosis H37Rv nas condições experimentais empregadas. Os resultados aqui descritos deverão ser úteis para um melhor entendimento sobre a enzima MtIAGU-NH, fornecendo bases sólidas para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas e preventivas para diminuir a incidência global da TB.
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Caracterização cinética e bioquímica da enzima inosina monofosfato desidrogenase (EC 1.1.1.205) de Mycobacterium tuberculosis como alvo para o desenvolvimento de inibidoresRostirolla, Diana Carolina January 2013 (has links)
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Previous issue date: 2013 / Tuberculosis (TB) remains a leading infectious killer and its causative agent, Mycobacterium tuberculosis, infects one third of the world population. Despite 50 years of available drug treatments, TB continues to cause considerable mortality worldwide. The TBHIV co-infection and the emergence of multidrug and extensively-resistant TB have provided a very alarming challenge to global health and led us to focus on the research for new and more effective therapeutics against the disease. Advances in the identification of new TB drug targets have been driven by the availability of the genome sequence of M. tuberculosis H37Rv, and include elucidation of the role played by proteins of essential biochemical pathways for mycobacterial growth. Inosine Monophosphate Dehydrogenase (IMPDH, EC 1. 1. 1. 205) catalyzes the penultimate and rate-limiting step in guanine nucleotide biosynthesis, the oxidation of inosine 5’-monophosphate (IMP) to xanthosine 5’- monophosphate (XMP), with concomitant reduction of nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+) to NADH. This reaction controls the guanine nucleotide pool and IMPDH inhibitors are used as immunosuppresive, anticancer, and antiviral agents. Recently, IMPDH from M. tuberculosis (MtIMPDH) has gained attention as a promising anti-mycobacterial target, associated with a number of distinct inhibitor scaffolds. In the present work, the guaB2- encoded MtIMPDH has been cloned, expressed and purified to homogeneity. The recombinant MtIMPDH has a subunit molecular weight of 54,775 Da and Inductively-Coupled Plasma Optical Emission Spectroscopy (ICP-OES) and Flame Atomic Absorption Spectroscopy (FAAS) identified a K+ ion per subunit. Glutaraldehyde cross-linking analysis suggests that MtIMPDH predominates as a tetramer. Steady-state kinetics showed that MtIMPDH optimal activity is dependent on the presence of a monovalent cation, mainly K+. Initial velocity and product inhibition patterns suggested a steady-state ordered Bi Bi kinetic mechanism in which IMP binds first followed by NAD+, and hydride transfer is not the ratelimiting step in the MtIMPDH catalyzed reaction. In addition, NAD+ substrate inhibition implies that product release is ordered, with NADH released first. The pH-rate profile indicated one deprotonated group essential for catalysis and that groups with pK values of 7. 5 and 9. 0 are important for NAD+ binding. The data presented here are discussed in light of the kinetic and structural information available for IMPDHs investigated to date and should inform us on how to better design inhibitors targeting this enzyme. Additionaly, a vital part of drug development is the identification of gene products that are critical for bacterial growth and survival. In this regard, we have performed site-directed mutagenesis by gene replacement in order to evaluate the importance of the guaB2 gene for mycobacteria growth. Our results suggest that this gene is essential for M. tuberculosis H37Rv in vitro growth, and the confirmation of gene essentiality will point out the guaB2-encoded IMPDH as a potential drug target. Data resulting from enzyme’s characterization and gene replacement were the starting point for MtIMPDH inhibitors planning, selection and testing. A compound was identified as promising lead molecule, with Ki values in nanomolar range and it was characterized as noncompetitive and uncompetitive inhibitor towards MtIMPDH substrates NAD+ and IMP, respectively. MtIMPDH characterization and results on primary inhibitors identification are crucial step towards a potential novel drug development for TB treatment. Altogether, these data may be useful for a better understanding about the biology of M. tuberculosis and as a framework on which to base efforts towards the development of efficient therapeutic strategies, aiming TB control. / A tuberculose (TB) permanece entre as principais causas de morte por doenças infectocontagiosas e estima-se que um terço da população mundial esteja infectada pelo Mycobacterium tuberculosis. Apesar de existirem tratamentos disponíveis há mais de 50 anos, a TB é responsável por causar altas taxas de mortalidade em todo o mundo. A coinfecção com o HIV e a emergência de TB resistente a múltiplas drogas representam um desafio à saúde pública e têm estimulado a pesquisa por novos e mais efetivos agentes terapêuticos contra a doença. Avanços na identificação de novos alvos para drogas contra a TB têm sido possíveis graças ao sequenciamento do genoma do M. tuberculosis H37Rv e incluem a elucidação da função de proteínas envolvidas em rotas bioquímicas essenciais para o crescimento micobacteriano. A enzima Inosina Monofosfato Desidrogenase (IMPDH, EC 1. 1. 1. 205) é uma enzima chave na biossíntese de nucleotídeos de purina, pois participa de uma etapa limitante na síntese de novo de nucleotídeos de guanina, a partir de inosina 5’-monofosfato (IMP). Ela catalisa a oxidação de IMP a xantosina 5’-monofosfato (XMP), com concomitante conversão de nicotinamida adenina dinucleotídeo (NAD+) à sua forma reduzida, NADH. Essa reação controla os níveis de nucleotídeos de guanina e inibidores da IMPDH têm sido utilizados como agentes imunossupressores, anticâncer e antivirais. Recentemente, a IMPDH de M. tuberculosis (MtIMPDH) foi descrita como um alvo antimicobacteriano promissor e inibidores desta enzima têm sido reportados. Neste trabalho, foi realizada a clonagem da região codificante do gene guaB2, a expressão e a purificação da proteína MtIMPDH. A MtIMPDH recombinante apresentou uma massa molecular média de 54. 775 Da e a análise através de Espectroscopia de Absorção Atômica em Chama (FAAS) e Espectroscopia de Emissão Óptica com Plasma Indutivamente Acoplado (ICPOES) identificou um íon K+ por subunidade. Os experimentos de reação cruzada, utilizando glutaraldeído, mostraram que a MtIMPDH pode existir como um tetrâmero em solução. Os estudos de cinética em estado estacionário revelaram que a atividade catalítica da MtIMPDH é dependente de cátions monovalentes, principalmente K+.Os estudos de velocidade inicial e inibição pelos produtos sugeriram que a catálise procede através de um mecanismo cinético sequencial Bi Bi ordenado, no qual o IMP associa-se primeiramente à MtIMPDH, seguido pela ligação do NAD+, e que a transferência do hidreto não é a etapa limitante da reação catalisada pela enzima em estudo. Além disso, a inibição pelo substrato NAD+ indica que a liberação dos produtos é ordenada, onde o NADH é o primeiro produto a ser liberado. Os estudos de perfil de pH indicaram que a desprotonação de um grupamento com valor de pK em torno de 8,2 é essencial para a atividade catalítica da MtIMPDH e, que aminoácidos cujas cadeias laterais possuem valores de pK próximos de 7,5 e 9,0 estão envolvidos na ligação ao NAD+. Os dados aqui apresentados são discutidos com base em estudos cinéticos e estruturais disponíveis de IMPDHs de diferentes organismos e podem auxiliar no desenvolvimento de compostos inibidores para a enzima em estudo. Além disso, a identificação de genes essenciais para o crescimento bacteriano representa uma etapa importante no desenvolvimento de drogas. Assim, foi realizada a mutagênese sítio-dirigida por substituição gênica, a fim de avaliar a importância do gene guaB2 no crescimento do M. tuberculosis H37Rv. Nossos resultados sugerem que este gene é essencial para o crescimento in vitro do M. tuberculosis H37Rv e a confirmação da essencialidade permitirá a validação do produto deste gene como um alvo para inibidores. Os dados obtidos a partir da caracterização cinética da enzima e da substituição gênica representaram o ponto de partida para o planejamento, seleção e testes de possíveis inibidores da MtIMPDH. Entre os compostos químicos sintetizados, um deles apresentou valores de Ki na faixa de nanomolar e apresentou perfis de inibição não-competitivo e incompetitivo em relação aos substratos NAD+ e IMP, respectivamente. A caracterização da MtIMPDH e os resultados preliminares de inibição desta enzima representam passos cruciais no desenvolvimento de novas drogas para o tratamento da TB. Assim, estes dados podem ser úteis para um melhor entendimento sobre o metabolismo do M. tuberculosis e podem servir como base para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas objetivando o controle da TB.
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Desenvolvimento do radiofármaco [18F] flumazenil para realização de exames PET/CTHartmann, Louise Mross January 2013 (has links)
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Previous issue date: 2013 / Molecular Imaging is a technique that allows visualization, characterization and quantification of biochemical processes in a molecular and cellular level, in humans and other live organisms. Among all the technics available, it’s possible to highlight PET (Positron Emission Tomography), which needs the administration of a radiotracer in the organism to be studied. Radiotracers or radiopharmaceuticals are molecules that possess a radioactive element in their composition. Nowadays, the most used PET radiopharmaceutical is fluorodeoxyglucose (18F) or [18F]FDG. This molecule is a glucose analogue that accumulates inside the cell, allowing glucose metabolism visualization. However, considering the use of glucose by the brain as its main energy source, this radiopharmaceutical accumulates in high rates in the normal brain, making difficult to see pathological processes. In order to visualize more specific alterations in the brain, many others radiotracers can be used, for example flumazenil (18F).Flumazenil (FMZ) shows high affinity for the benzodiazepine site in the GABAA receptor, acting as competitive antagonist. It’s already known that GABAA receptors play a key role in neuronal excitability control, and expression deficiencies in these receptors are involved in many neurological and psychiatric disorders, such as epilepsy, anxiety, depression, schizophrenia, etc. Regarding epilepsy, it is believed that in the epileptogenic foci the GABAA receptor expression is reduced, the brain region where seizures start. For this reason, the aim of this work was to study flumazenil (18F) synthesis, as well as its purification and quality control analysis, in order to produce a molecule that can be used to localize the epileptogenic foci. The fluoride ion (18F-) was produced using PET Trace 16 MeV cyclotron from GE Healthcare, through the nuclear reaction 18O(p, n)18F, through the irradiation of enriched 18O water with accelerated protons. The flumazenil (18F) synthesis was performed in the automated synthesis module TRACERlab FX F-N from GE Healthcare, by nucleophilic aromatic substitution reaction. The established ideal reaction conditions were 145°C for 15 minutes, and 6,2mg precursor mass. The 18F- incorporation degree in the flumazenil molecule was 72±6% (n = 5), verified by reaction mixture analysis. In the last step flumazenil (18F) was purified through high performance liquid chromatography (HPLC) and reserve-phase tC18 cartridge, obtaining a product with a purity higher than 99%.The radionuclidic purity and identity were analyzed by gamma ray spectroscopy and half-life evaluation. Radiochemical purity was verified using thin layer chromatography (TLC) and HPLC. The chemical purity tested the presence of kryptofix 2. 2. 2, through a colorimetric test, and residual solvents (ethanol and acetonitrile) through gas chromatography (GC). The pH was verified using strips. All the results complied with the pharmacopeia using [18F]FDG as reference. Synthesis time was 80 minutes including purification steps and the overall yield was 9. 3% (decay corrected). The radiopharmaceutical stability was analyzed for 8 hours, and no impurities were detected in this period. The method developed showed to be viable to produce flumazenil (18F), which can be used in pre-clinical and clinical studies in the future. The knowledge acquired with this work will allow the improvement of this technology in the country, and the research of new radiotracers for PET/CT imaging. / A Imagem Molecular é uma técnica que permite a visualização, caracterização e quantificação de processos bioquímicos a nível molecular e celular, em humanos e outros organismos vivos. Dentre as tecnologias disponíveis, destaca-se o PET (Positron Emission Tomography - Tomografia por Emissão de Pósitrons) que necessita da administração do radiotraçador ao organismo a ser estudado. Radiotraçadores ou radiofármacos são moléculas que possuem um elemento radioativo em sua composição. Atualmente, o radiofármaco mais utilizado em PET é o fludesoxiglicose (18F) ou [18F]FDG. Esta molécula é um análogo da glicose, que se acumula no interior da célula, permitindo a visualização do metabolismo da glicose. Entretanto, considerando que o cérebro utiliza basicamente a glicose como fonte de energia, este radiofármaco se acumula em altas taxas no cérebro normal, dificultando a visualização de processos patológicos. A fim de visualizar alterações patológicas mais específicas no cérebro, vários outros radiotraçadores podem ser utilizados, como por exemplo o flumazenil (18F).O flumazenil (FMZ) apresenta alta afinidade pelo local de ligação de benzodiazepínicos do receptor GABAA, atuando como antagonista competitivo. Sabe-se que os receptores GABAA possuem um papel chave no controle da excitabilidade neuronal e que deficiências na expressão destes receptores estão envolvidas em um grande número de patologias neurológicas e psiquiátricas, como epilepsia, ansiedade, depressão, esquizofrenia e etc. Com relação a epilepsia, acredita-se que exista uma diminuição da expressão dos receptores GABAA no foco epileptogênico, região do cérebro geradora das crises epilépticas. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi estudar a síntese do flumazenil (18F), bem como sua purificação e as análises de controle de qualidade, visando produzir uma molécula que auxilie na localização do foco epileptogênico. O íon fluoreto (18F-) foi produzido no cíclotron PET Trace 16 MeV da GE Healthcare, através da reação nuclear 18O(p, n)18F, decorrente da irradiação da água enriquecida com 18O pelos prótons acelerados. A síntese do flumazenil (18F) foi realizada no módulo automatizado TRACERlab FX F-N da GE Helthcare, através de uma reação de substituição nucleofílica aromática. As condições ideais de reação foram estabelecidas em 145°C durante 15 minutos, sendo que a massa do precursor foi de 6,2mg.A taxa de incorporação do 18F- na molécula do flumazenil foi de 72±6% (n = 5), verificado através da análise da mistura de reação. Na fase final o flumazenil (18F) foi purificado através de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) e cartucho de fase-reversa tC18, obtendo-se um produto com grau de pureza superior a 99%. A pureza e identidade radionuclídica foram avaliadas através de espectroscopia de raios gama e do tempo de meia-vida. A pureza radioquímica foi verificada por cromatografia em camada delgada (CCD) e CLAE. Na análise da pureza química verificou-se a presença de kryptofix 2. 2. 2, através de teste colorimétrico, e solventes residuais (etanol e acetonitrila) por cromatografia gasosa (CG). O pH foi analisado utilizando fitas. Os resultados obtidos foram dentro dos limites estabelecidos pela farmacopéia levando em consideração o [18F]FDG. O tempo total de síntese foi de 80 minutos e o rendimento total foi de 9,3% (corrigido pelo decaimento). A estabilidade do radiofármaco foi analisada durante 8 horas, sendo que nenhuma impureza foi detectada neste período. O método desenvolvido mostrou ser viável para produção do flumazenil (18F), podendo este ser futuramente utilizado em estudos pré-clínicos e clínicos. Os conhecimentos adquiridos com este trabalho permitirão o avanço desta tecnologia no país, e a pesquisa de novos radiotraçadores para a realização de exames PET/CT.
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