Orientadora : Profª. Drª. Andrea Senff Ribeiro / Coorientador : Prof. Dr. Silvio Sanches Veiga / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 27/02/2017 / Inclui referências : f. 73-83 / Resumo: O tumor do tipo melanoma da pele apresenta baixa incidência contudo, sua letalidade é extremamente elevada. As linhagens B16 constituem um modelo de melanoma murino muito útil na oncologia experimental. A linhagem B16F10 apresenta alta capacidade de invasão e metastização enquanto que a linhagem B16-F1 apresenta menor motilidade in vitro e, portanto, baixo potencial metastático. A TCTP (Translationally Controlled Tumor Protein) é expressa em diversos organismos e tecidos, o que aponta um papel biológico fundamental. Diferentes estudos já estabeleceram seu envolvimento na regulação do ciclo e proliferação celular, bem como na malignidade e como fator protetor contra estresse e apoptose. Dessa forma, o objetivo desse trabalho foi avaliar o papel da TCTP em melanoma murino (B16F1 e B16F10). O perfil proteico bidimensional apresentado pelas linhagens foi diferente: a linhagem B16-F10 apresentou 201 spots e a linhagem B16-F1 126 spots. Essa diferença pode estar relacionada à complexidade celular da B16-F10, mais maligna e metastática. Em ambos os extratos foi identificada uma proteína com mobilidade eletroforética de 20 kDa e pI de 4,8 (valores esperados para TCTP). Além disso, a TCTP foi imunodetectada por western blotting. A linhagem B16- F1 apresentou um menor sinal de detecção quando comparada à B16-F10., Essa diferença poderia estar associada a uma maior expressão de TCTP em células tumorais mais metastáticas e invasivas e, consequentemente, a B16F10 apresentaria níveis superiores de TCTP. Esta hipótese foi confirmada por PCR em tempo real: B16-F10 apresentou níveis de RNAm para TCTP superiores aos encontrados para B16-F1. Esses dados corroboram com os resultados do western blotting e com dados da literatura que relacionam a TCTP à linhagens malignas, devido ao seu papel anti-apoptótico e seu antagonismo com a p53. A fim de avaliar o papel biológico da TCTP no melanoma, esta foi silenciada na linhagem B16-F10, utilizando a técnica de RNAi. O silenciamento diminuiu os níveis de TCTP em 50 a 70% quando utilizado 50 nM e 60 a 80% quando utilizado 100 nM do duplex após 24, 48 e 72 horas de transfecção. As linhagens transfectadas com RNAi para TCTP apresentaram menor proliferação, menor migração e maior adesão celular às moléculas da matriz extracelular quando comparadas às linhagens transfectadas com o controle negativo. Porém, não houve qualquer alteração significativa da viabilidade celular. O aumento da proliferação celular e do potencial migratório são dois eventos muito importantes para a tumorigênese, e estão intimamente relacionados à malignidade. Portanto, o silenciamento foi capaz de regredir o fenótipo de malignidade da linhagem B16-F10, deixando esse mais próximo da B16-F1. Dessa forma, nosso estudo caracterizou os perfis celulares das duas linhagens e demonstrou uma diferença no número de proteínas e parceiros moleculares entre ambas linhagens. Além disso, nossos dados sugerem que o silenciamento da TCTP tornou a linhagem B16-F10 menos metastática e maligna, com um fenótipo mais próximo ao de uma célula normal. Mais estudos são necessários com o intuito de identificar possíveis parceiros e melhor entender o papel dessa proteína multifuncional no melanoma murino. Palavras-chave: TCTP, melanoma, B16-10, B16-F1, câncer / Abstract: Skin melanoma tumor displays low incidence, however, its lethality is extremely high. B16 cell lines typify a murine melanoma model very useful on the experimental oncology field. B16-F10 cell line exhibits high invasion and metastization capacities while B16-F1 cell line depicts lower in vitro motility and, therefore, low metastasis potential. TCTP (translationally controlled tumor protein) is expressed in several organisms and tissues, which suggests a fundamental biological role. Different studies have already settled its participation in cell cycle regulation and cell proliferation, as well as in malignancy and as a protective factor against stress and apoptosis. Thus, this study aimed to assess the TCTP role in in murine melanoma (B16-F1 and B16- F10). Two-dimensional electrophoresis profiles of proteins from the two cell lines were different: B16-F10 cells presented 201 electrophoresis spots while B16-F1 originated 126 spots. This difference may be related to the B16-F10 cell complexity, since this cell line is more malignant and metastatic. In both cell extracts was identified a protein with electrophoretic mobility about 20 kDa and deduced pI of 4.8 (expected parameters for TCTP). Furthermore, TCTP was immunodetected by western blotting analysis. B16-F1 cells produced low detection signals when compared to the B16-F10 cells. This difference may be associated to the higher TCTP expression in more metastatic and invasive tumoral cells and, consequently, B16-F10 would present higher TCTP levels. This hypothesis was confirmed by Real-Time PCR, since B16-F10 revealed RNAm levels for TCTP higher than the B16-F1. These data corroborate with western blotting results and the specific literature, which connect TCTP and malignant cell lines due to the anti-apoptotic function and its p53 antagonism. In order to evaluate the biological role of TCTP in melanoma, it was performed the TCTP silencing in B16-F10 cell line by using RNA interference (RNAi) method. The gene silencing reduced TCTP levels in 50% to 70% when used 50 nM and 60% to 80% when used 100 nm of the duplex after 24, 48 and 72 hours of transfection. The transfected cell lines with RNAi for TCTP presented lower proliferation, lower migration and higher cell adhesion to extracellular matrix molecules when compared to the cell lines transfected with negative control. However, there was no significant change in cell viability. Increasing cell proliferation and migration potential are two events very important for the tumorigenesis process and they are closely related to the malignancy. Therefore, gene silencing was able to recede the malignant phenotype of B16- F10 cell line, resulting in a similar aspect to the B16-F1 cells. Thus, this study characterized the profile of two cell lines and it demonstrated differences in protein number and molecular partners between these two cell lines. Moreover, the generated data suggest that TCTP gene silencing became B16-F10 cells less metastatic and malignant, resembling the normal cell phenotype. Further studies are necessary in order to identify possible partners and to better understand the TCTP role in the murine melanoma. Key-words: TCTP, melanoma, B16-10, B16-F1, cancer.

Made available in DSpace on 2015-08-20T17:09:17Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2003. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-20T17:27:23Z : No. of bitstreams: 1 000199389.pdf: 584941 bytes, checksum: 5a9337c1a6d76389fabc4039dfce878f (MD5) / A bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri é um fitopatógeno causador do cancro cítrico que compromete parte da produção de laranjas do Estado de São Paulo, com reflexos negativos para a economia do Estado e do País. Para que haja um controle futuro do cancro cítrico, vários pesquisadores se empenharam no Projeto Genoma-Xanthomonas visando desvendar o conjunto gênico desta bactéria e fornecer subsídios para a identificação dos genes envolvidos com a sua patogenicidade. Neste sentido, o atual trabalho visa o monitoramento da expressão gênica do patógeno quando submetido a diferentes condições ambientais, tais como variações no pH extracelular e antibacterianos utilizando o Differential Display RT - PCR. Deste modo, obtivemos a expressão de genes importantes quando o microrganismo foi submetido ao pH 8.0 tais como: um gene relacionado a um transportador MFS, valina - piruvato aminotransferase, glucano 1,4--glucosidase e uma proteína hipotética conservada. Quando submetida à agentes inibidores como a ampicilina, a Xanthomonas expressou proteínas como a integrase, proteína de virulência e uma fosforibosilformilglicinamida ciclo ligase. Quando em meio de cultura contendo penicilina, a bactéria expressou o gene da tirosil t-RNA sintetase. Há um grande interesse em desvendar os mecanismos de ataque da Xanthomonas axonopodis pv. citri, na sua interação com o vegetal e também suas estratégias para inibir o sistema de defesa do hospedeiro, promovendo o surgimento da doença. Neste sentido, espera-se que estes resultados, adicionados a outros projetos funcionais, possam fornecer informações quanto ao mecanismo de defesa da Xanthomonas, bem como da interação planta-bactéria e conseqüentemente auxiliar no controle do cancro cítrico. / The bacterium Xanthomonas axonopodis pv. citri is a pathogen causing citric canker that compromises part of the orange production in the State of São Paulo, with negative consequences for the economy of the State and the Country. For the future control of citric canker, several investigators participated in the Xanthomonas Genome Project in order to determine the gene set of this bacterium and to contribute to the identification of the genes involved in its pathogenicity. In this respect, the objective of the current study was to monitor the gene expression of the pathogen when submitted to different environmental conditions such as variation in extracellular pH, and to different antibacterial agents using Differential Display RT-PCR. Using this method we obtained the expression of important genes when the bacteria were submitted to pH 8.0, such as a gene related to an MFS transporter, valine-pyruvate aminotransferase, glucan 1,4--glucosidase and a conserved hypothetical protein. When submitted to the action of inhibitory agents such as ampicillin, Xanthomonas expressed various proteins, i.e., integrase, virulence protein and a phosphoribosylformylglycinamide cycloligase. In a culture containing penicillin, the bacteria expressed the gene of tyrosyl t-RNA synthetase. There is great interest in determining the mechanisms of attack of Xanthomonas axonopodis pv. citri, its interaction with plants and also the strategies it uses to inhibit the defense system of the host, promoting the onset of the disease. In this respect, the present results, added to those obtained in other functional projects, are expected to provide information about the defense mechanism of Xanthomonas and about the plant-bacterium interaction in order to contribute to the control of citric canker

Made available in DSpace on 2015-09-17T15:24:35Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-11-27. Added 1 bitstream(s) on 2015-09-17T15:47:35Z : No. of bitstreams: 1 000843902.pdf: 526265 bytes, checksum: 54002f2d209b43c762ae304c70ae8e85 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / No presente trabalho estudamos a energia eletrônica e a polarizabilidade da molécula de hidrogênio ionizada confinada em cavidades de diferentes volumes. Usamos o Método Variacional para realizar os cálculos de energia. O objetivo principal deste trabalho é ampliar o tratamento matemático já existente na literatura. Introduzimos uma função de onda molecular alternativa, que faz uso de apenas um parâmetro variacional para resolver o problema da molécula de hidrogênio ionizada confinada numa cavidade elíptica / In this work, we study the electronic energy and the polarizability of ion hydrogen molecule under confinement in different volumes of cavities. We use the Variational Method for estimate the energy. The aim of this work is to extend the mathematical treatment reported in the existing literature. We introduce an alternative molecular wave function, this wave function has only a variational parameter to solve the problem of ion hydrogen molecule under confinement in an elliptical cavity

Made available in DSpace on 2014-11-10T11:09:39Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-09-13Bitstream added on 2014-11-10T11:58:07Z : No. of bitstreams: 1 000787009.pdf: 13171623 bytes, checksum: 94a6d017db7ac782d82e93870a530bee (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O comportamento dinâmico do DNA apresenta movimentos de grande amplitude e localizados ao longo da cadeia, contendo inclusive aberturas locais de pares de bases. Esse comportamento est a relacionado com aspectos funcionais da mol ecula, como por exemplo a transcri ção e a replicação. Neste trabalho, procuramos compreender essa dinâmica através da criação e estabilidade de breathers no modelo de Peyrard-Bishop. Estudamos a inuência da variação de energia em uma estrutura de breather estável e por meio da dinâmica do modelo, inferimos a densidade de energia necess aria para que ocorra a transição de fase do sistema, ou seja, a desnaturação do DNA de forma minimalista. Na sequência do trabalho, utilizamos de dinâmica molecular no nível de representação atômica para relacionar o modelo mecânico com a dinâmica in silico do sistema. Por fim, verificamos a instabilidade da dupla hélice do DNA, quando a molécula e submetida a um estresse torcional / The dynamic behavior of the DNA shows motions of great amplitude and localized by the chain. The motions are even capable to open a single base pair on its biological temperature. This behavior is related to functional aspects of the molecule, like transcription and replication. In this work, we aim to understand this dynamic through the creation of breathers and its stability in the Peyrard-Bishop model. We study the in uence of the energy change in a stable breather solution. By the dynamic of the model, we infer the energy density that is needed to happen the phase transition in the system, that is, the DNA denaturation in a minimalistic view. In the sequence, we use atomistic molecular dynamics to relate the mechanical model with the in silico dynamic of the system. In the end, we verify the DNA double helix instability through induced torsional stress

Tese (doutorado)Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2011. / Submitted by Tania Milca Carvalho Malheiros (tania@bce.unb.br) on 2012-05-14T14:10:56Z No. of bitstreams: 1 2011_JoseDijairAntoninoSouzaJunior_Parcial.pdf: 7235276 bytes, checksum: 6d4a83a25b6b3f969d2db64af5cbfc7f (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2012-05-14T16:45:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_JoseDijairAntoninoSouzaJunior_Parcial.pdf: 7235276 bytes, checksum: 6d4a83a25b6b3f969d2db64af5cbfc7f (MD5) / Made available in DSpace on 2012-05-14T16:45:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_JoseDijairAntoninoSouzaJunior_Parcial.pdf: 7235276 bytes, checksum: 6d4a83a25b6b3f969d2db64af5cbfc7f (MD5) / O nematoide formador de galhas Meloidogyne incognita está presente em quase todos os continentes, causando prejuízos em várias culturas importantes. Proteínas da glândula esofagiana de Meloidogyne spp. podem desenvolver funções importantes no estabelecimento de sítios de alimentação funcionais do nematoide. A função precisa destas proteínas no processo de desenvolvimento do sítio de alimentação é desconhecida. Além disso, estudos sugerem que as proteases do nematoide também estejam envolvidas neste processo de estabelecimento do sítio de alimentação, tornando estas enzimas proteolíticas alvos interessantes para estudos de intervenção de expressão. No primeiro capítulo foi feita a intervenção da expressão das proteínas por intermédio de RNA interferente de três genes (Mi-asp-1, Mi-ser-1 e Mi-cpl-1) de proteases de classes catalíticas diferentes, para entender melhor a função das mesmas na interação do nematoide com o hospedeiro. Observou-se uma diminuição da taxa de fecundidade nos nematoides que infectaram as plantas GM. Além disso, a progênie apresentou menor taxa de eclosão de J2 e de infecção do hospedeiro. No segundo capítulo, a proteína 7E12 de M. incognita, que é produzida na glândula dorsal e secretada dentro da planta durante o parasitismo, foi super expressa em plantas de tabaco para o conhecimento da função desta proteína. A partir dos resultados obtidos foi possível sugerir que a presença da proteína 7E12 na planta de tabaco acelerou a formação das galhas de M. incognita, indicando uma possível função desta proteína na iniciação e/ou na manutenção do sítio de alimentação. O estudo destas moléculas efetoras de parasitismo é um passo chave para compreender melhor as relações entre o hospedeiro e o parasita. A compreensão destas interações possibilitará o desenvolvimento de novas ferramentas para o controle de M. incognita. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The root-knot nematode Meloidogyne incognita is present in almost all continents, causing serious damage in many important crops. Some reports indicate that proteins produced by its dorsal gland perform important roles in the establishment of a functional nematode feeding site. The precise role of these proteins in the development of these feeding sites is still unknown. However, previous studies suggest that nematode proteases are involved in the establishment of feeding sites, turning them into interesting targets for expression intervention studies. In the first chapter, in order to understand the function of these enzymes in the interaction between the nematode and its host, the protein expression of three genes (Mi-asp-1, Mi-ser-1 and Mi-cpl-1) representing different catalytic classes of proteases was reduced by RNA interfering (RNAi). I found that the nematodes that infect GM plants had their fertility rate reduced. In addition, the progeny show reduced hatching rate and host infection. In the second chapter, the protein 7E12 of M. incognita, which is produced in the dorsal gland and secreted into the host during parasitism, was overexpressed in tobacco plants in order to address the function of this protein. The results obtained in this study suggest that the presence of this protein in tobacco plants accelerated the formation of M. incognita galls, indicating a possible function of this protein in the initiation and/or maintenance of feeding sites. The study of these parasitism effector molecules is a key step to better understand the relationship between host and parasite. I envisage that the understanding of these interactions will help the development of new tools for M. incognita control.

As fosfodiesterases do tipo 2A (PDE2A) hidrolisam os nucleotídeos cíclicos cAMP e cGMP e por isso desempenham papel importante na sinalização intracelular. PDE2A é composta por uma região N-terminal, que ao contrário de outras famílias de PDEs, não possui função conhecida, dois domínios regulatórios, GAF A e GAF B, e um domínio catalítico localizado na porção C-terminal. Sabe-se que a hidrólise dos nucleotídeos cíclicos, pela PDE2A, é ativada pela ligação de cGMP ao domínio regulatório GAF B. Em uma triagem dois híbridos, identificamos XAP2 como a principal proteína interatora de PDE2A. XAP2 é um componente crucial do complexo multiprotéico do receptor Aril hidrocarboneto (Ahr), o principal fator de transcrição que controla a expressão de múltiplos genes envolvidos em detoxificação. Neste trabalho, foi determinado que XAP2 liga o domínio GAF B da enzima PDE2A. Ensaios de atividade fosfodiesterásica, utilizando proteínas purificadas, mostram que a ligação de XAP2 não interfere na atividade enzimática de PDE2A. Para analisar se PDE2A afeta a função de XAP2, foi investigado o deslocamento de Ahr para o núcleo. Sabe-se que a regulação da expressão dos genes alvos de Ah é iniciada pela ligação de tetraclorodibenzodioxina (TCDD) e por uma via, ainda pouco entendida, dependente de cAMP. Verificamos que a ligação de PDE2A à XAP2 inibe o deslocamento de Ahr para o núcleo, induzido por TCDD e por cAMP em células hepáticas Hepa1c1c7 em cultura. Em conclusão, mostramos neste trabalho que XAP2 recruta PDE2A para o complexo Ahr, causando a inibição da mobilidade de Ahr, possivelmente pela redução local da concentração de cAMP. Esses dados suportam o papel de cAMP no controle da função de Ahr. / Phosphodiesterase type 2A (PDE2A) hydrolyzes cyclic nucleotides cAMP and cGMP thus efficiently controlling cNMP-dependent signaling pathways. PDE2A is composed of an N-terminal region, two regulatory GAF domains and a catalytic domain. Cyclic nucleotide hydrolysis is known to be activated by cGMP binding to GAF-B, however, other mechanisms may operate to fine-tune local cyclic nucleotide levels. In a yeast-two-hybrid screening we identified XAP2, a crucial component of the aryl hydrocarbon receptor (AhR) complex, as a major PDE2A-interacting protein. We mapped the XAP2 binding site to the GAF-B domain of PDE2A. PDE assays with purified proteins showed that XAP2 binding does not change the enzymatic activity of PDE2A. To analyze if PDE2A could affect the function of XAP2 we studied nuclear translocation of AhR, i.e. the master transcription factor controlling the expression of multiple detoxification genes. Notably, regulation of AhR target gene expression is initiated by tetrachlorodibenzodioxin (TCDD) binding to AhR and by a poorly understood cAMP-dependent pathway, followed by the translocation of AhR from the cytosol into the nucleus. Binding of PDE2A to XAP2 inhibited TCDD- and cAMP-induced nuclear translocation of AhR in Hepa1c1c7 hepatocytes. We conclude that XAP2 targets PDE2A to the AhR complex thereby restricting AhR mobility, possibly by a local reduction of cAMP levels. Our results provide first insights into the elusive cAMP-dependent regulation of AhR.

Resumo não disponível.

O gênero Drosophila abrange pelo menos 1.149 espécies, subdivididas em oito subgêneros, muitas das quais vêm desempenhando um papel fundamental no desenvolvimento do conhecimento biológico, principalmente nos âmbitos genético e evolutivo. Toda esta diversidade, entretanto, ao mesmo tempo em que gera inúmeras oportunidades de pesquisa, impõe uma série de desafios taxonômicos e filogenéticos. Desta forma, apesar de Drosophila compor um dos organismos experimentais mais bem estudados, muitas questões acerca de sua evolução permanecem irresolvidos ao longo do tempo. A presente tese foi, portanto, desenvolvida com o objetivo de auxiliar na resolução de aspectos particulares relacionados à história evolutiva deste complexo grupo de espécies. Neste sentido, os Capítulos II e III foram designados com o intuito de elucidar as relações filogenéticas entre espécies e grupos tradicionalmente situados no subgênero Drosophila, com ênfase naqueles de distribuição primariamente Neotropical. A inclusão de outros gêneros pertencentes à família Drosophilidae levou, porém, a definições parafiléticas para o gênero e para o subgênero Drosophila. Mesmo assim, níveis adicionais de resolução foram acrescentados à filogenia do subgênero Drosophila, que se apresentou subdividido em duas (Capítulo II) ou três (Capítulo III) grandes radiações. Os Capítulos IV e V, por outro lado, buscaram a inferência de cenários evolutivos mais restritos. No Capítulo IV o foco foi um pequeno grupo de espécies pertencente ao subgênero Drosophila, o grupo mesophragmatica, para o qual se obteve descrições evolutivas confiáveis. No Capítulo V, por outro lado, o grupo willistoni, pertencente ao subgênero Sophophora teve sua complexidade evolutiva mais uma vez reiterada. Em cada um destes casos, entretanto, novos estudos são incentivados para que um dia realmente nos aproximemos da história evolutiva verdadeira do gênero Drosophila. / The genus Drosophila encompasses at least 1.149 species subdivided into eight subgenera, many of which presented a central role in the development of the biological knowledge, mainly in the genetical and evolutionary areas. However, at the same time that this diversity provides numberless opportunities of research, it imposes a set of taxonomic and phylogenetic challenges. Thus, although Drosophila composes one of the best studied experimental organisms, many questions concerning its evolution remain unsolved through time. This thesis was developed with the aim of helping to solve particular questions related to the evolutionary history of this complex group of species. In this sense, Chapters II and III were designed with the aim of elucidating the phylogenetic relationships within and between species groups traditionally placed in the Drosophila subgenus, with an emphasis in those mainly Neotropical in distribution. The inclusion of other Drosophilidae genera, nevertheless, led the Drosophila genus and subgenus entirely paraphyletic. Even so, improved levels of resolution were provided to the subgenus Drosophila phylogeny, which was subdivided into two (Chapter II) or three (Chapter III) major radiations. Chapters IV and V, on the other hand, addressed more restricted evolutionary scenarios. In Chapter IV the focus was a small group of species included in the Drosophila subgenus, the mesophragmatica group, for which a confident evolutionary description was attained. In Chapter V, otherwise, the willistoni group, included in the Sophophora subgenus, had its evolutionary complexity once again reiterated. In each of these cases, nevertheless, new studies are encouraged in order to approach the genus Drosophila real evolutionary history.

Ureases (EC 3.5.1.5) são metaloenzimas que hidrolisam uréia para produzir amônia e dióxido de carbono. Estas enzimas, que são amplamente encontradas em fungos, bactérias e plantas, compartilham de estruturas similares. A presença de urease em várias bactérias patogênicas (Helicobacter pylori e Proteus mirabilis, p.e) está fortemente correlacionada com a patogênese em doenças humanas. Muitos fungos de importância médica possuem atividade ureásica, entre eles citamos Cryptococcus neoformans, Coccidioides immitis, Histoplasma capsulatum, Sporothrix schenckii, e espécies de Trichosporon e Aspergillus. C. neoformans é uma levedura que produz vários fatores de virulência conhecidos, como presença de cápsula polisacarídica, produção de melanina e capacidade de desenvolvimento a 37ºC. A maioria de isolados clínicos produz grandes quantidades de urease e muitos autores sugerem que a urease de Cryptococcus exerça uma função importante na patogênese, porém com mecanismos ainda não esclarecidos. Cryptococcus gattii – sorotipo B, tipo molecular VGII, linhagem R265, com capacidade de infectar pacientes imunocompetentes, causou uma epidemia na Ilha de Vancouver (Canadá) entre 1999 e 2003. Neste trabalho desenvolvemos um procedimento de purificação e apresentamos a caracterização físico-química e cinética da urease de C. gattii, cepa R265, após ter sido purificada na razão de 539 vezes. A massa molecular estimada foi de 120 kDa, Km 2,0 mM para uréia, pH ótimo 8,0. O ácido acetohidroxâmico demonstrou ser um bom inibidor em concentrações micromolares, enquanto ρ-hidroximercuriobenzoato causou inibição em concentrações mais altas, comparado a outras ureases. Espera-se que estudos adicionais com essa urease purificada permitam investigar propriedades biológicas independentes da atividade ureolítica e estabelecer sua contribuição para a patogênese da criptococose. / Ureases (EC 3.5.1.5) are metalloenzymes that hydrolyze urea to produce ammonia and carbon dioxide. These enzymes, which are found in fungi, bacteria, and plants show very similar structures. The presence of urease in many pathogenic bacteria (Helicobacter pylori and Proteus mirabilis) is strongly correlative with pathogenesis in human diseases. Many medically important fungi have urease activity, among which are Cryptococcus neoformans, Coccidioides immitis, Histoplasma capsulatum, Sporothrix schenckii, and species of Trichosporon and Aspergillus. C. neoformans is a heterothallic yeast with several known virulence factors, including a polysaccharide capsule, melanin production, and the ability to grow at 37°C.The majority of clinical isolates produce large amounts of urease and several authors suggest that Cryptococcal urease play an important role in pathogenesis but with unclear mechanisms but probably by different routes dependent and independent of ureolytic activity, althought many questions are unclear. We wanted to further investigate the role of urease in biological properties by using Cryptococcus gattii as a pathogen model. C. gatti – serotype B, molecular type VGII, R265 strain, which has capacity to infect immunocompetent individuals, caused an outbreak on Vancouver Island in Canada from 1999 to 2003. This work presents the physicochemical characterization of a urease from C. gatti strain R265 after a 539 fold purification. The estimated native molecular mass was 120 kDa, Km 2.0 mM urea, pH optimum 8.0. Aceto hydroxamic acid was a strong inhibitor at low concentration while ρ-hidroxy mercuribenzoate needed higher concentrations for inhibition compared to other ureases.

O arroz é umas das mais importantes plantas cultivadas no mundo, sendo constituinte da dieta básica de mais da metade da população humana, inclusive no Brasil. Entretanto, o arroz é um cereal nutricionalmente pobre, apresentando baixas concentrações de metais essenciais, como o ferro e o zinco. Programas de melhoramento e de engenharia genética têm sido empregados na tentativa de melhorar o teor nutritivo dos grãos de arroz. Entretanto, para se alcançar este objetivo é essencial conhecer os mecanismos que envolvem a aquisição de metais, transporte interno e armazenamento nas plantas. A literatura recente tem revelado a existência de diversas famílias de genes candidatos a desempenharem função na homeostase de metais em arroz (genes Yellow Stripe Like, IRT, FRO, MTP, etc). Entre estes, a família Yellow Stripe Like é forte candidata a possuir genes envolvidos na alocação de ferro para o grão, visto que é uma família numerosa (18 genes) de transportadores de ferro, com diferentes isoformas capazes de transportar ferro ligado a fitossideróforos ou a nicotiamina (o principal quelante de ferro intracelular), e com expressão comprovada de pelo menos uma isoforma em células de floema. No entanto, a alocação de minerais para o grão é um processo altamente regulado, que provavelmente requer a atividade de outros genes, com funções ainda desconhecidas. Neste estudo visamos avaliar a contribuição de genes YSL em plantas de arroz e identificar novos genes potencialmente envolvidos com o transporte de metais aos grãos de arroz utilizando diferentes ferramentas: análise de plantas mutantes no gene OsYSL15 por inserção do retroelemento TOS17; avaliação da expressão de genes YSL em folhas bandeira e panículas de arroz em dois estádios de desenvolvimento; construção de uma biblioteca de hibridização subtrativa (SSH) de panículas em dois estádios de desenvolvimento, visando identificar genes com expressão induzida no enchimento dos grãos. Estas diferentes abordagens nos permitiram concluir que: o gene OsYSL15 é fortemente induzido em raízes sob deficiência de ferro, mas não necessário para o desenvolvimento das plantas nas condições estudadas; a função do gene OsYSL15 provavelmente possui sobreposição com as de outros transportadores de ferro, que podem compensar a sua falta; o gene OsYSL18 é um forte candidato a participar dos processos de alocação de minerais para os grãos de arroz. Além disso, foi possível identificar um novo gene, com função ainda desconhecida, com alta expressão em panículas de arroz durante o enchimento do grão. / Rice is one of the most important crops worldwide. Although being a poor source of nutrients, such as iron and zinc, rice is the dietary basis of over half the world's population, including Brazil. Breeding and genetic engineering programs have been employed with the intent to improve the nutritive characteristics in rice grains, including the increase of mineral nutrients, such as iron and zinc. To reach this objective, it is necessary to understand how metal homeostasis occurs in plants, including rhizosphere uptake, internal transport and storage. The recent literature has revealed several families of genes which are candidates to be involved in metal homeostasis in rice (Yellow Stripe Like, IRT, FRO, MTP, etc). Among them, the Yellow Stripe Like family is a strong candidate to contain genes involved with iron allocation to the grain. This is a large family (18 genes) of iron transporters, with different isoforms being able to transport iron chelated to siderophores or to nicotianamine (the main intracellular iron ligand in plants), and with at least one isoform being expressed in phloem cells. However, mineral allocation to the grain is a highly regulated process, which probably requires the activity of other genes, with functions that are still unknown. This study aimed at the evaluation of the contribution of YSL genes and at the identification of new genes potentially involved with metal transport to the rice grain, making use of three different tools: analysis of OsYSL15 mutant plants, containing TOS17 retroelement insertion; gene expression evaluation of YSL genes in rice flag leaves and panicles during two reproductive stages; construction of a panicle subtractive library (SSH) comparing two reproductive stages, in order to identify genes up-regulated during grain filling. These diverse approaches allowed us to reach the following conclusions: the OsYSL15 gene is strongly induced in roots under iron deficiency, but is not necessary for plant development under control conditions; probably there is function overlap between the OsYSL15 gene and other iron transporters, which can compensate for its absence; the OsYSL18 gene is a strong candidate to participate in mineral allocation to the rice grain. Moreover, it was possible to identify a new gene, with still unknown function, which is highly up-regulated in panicles after anthesis.