Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2016-06-06T16:07:15Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1826443 bytes, checksum: d5304a575fc041fa7cd7350206cd3bad (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-06T16:07:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1826443 bytes, checksum: d5304a575fc041fa7cd7350206cd3bad (MD5) Previous issue date: 2016-02-26 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Plantas são organismos paleopoliplóides que sobreviveram ao deletério processo de duplicação do genoma. Após a duplicação, cópias de um mesmo gene (parálogos) evoluem de forma divergente devido ao relaxamento da seleção purificadora, tornando os genes duplicados fonte de diversificação evolutiva. No entanto, nem todas as categorias de genes são retidas nos genomas, ou perdidas, de forma aleatória. Vários modelos evolutivos têm sido propostos para explicar o destino evolutivo e retenção tendenciosa de genes duplicados, para consequentemente entender melhor a poliploidia. Entretanto, a aplicabilidade destes modelos têm sido pouco investigadas. Usamos abordagens de genômica comparativa e de filogenia molecular para investigar o destino evolutivo de genes duplicados em plantas. Inicialmente, inferimos sobre a ancestralidade de duas pequenas famílias de genes duplicados — metionina sintase e oligossacarídeos de rafinose — em genomas de nove espécies de plantas superiores para, então, caracterizar as forças evolutivas que moldaram os destinos evolutivos dos parálogos, usando dados de resequenciamento de 31 genomas de soja. Posteriormente, usamos dados genômicos de 25 espécies de plantas taxonomicamente divergentes para associar mecanismos de duplicação, categoria funcional do gene e idade de duplicação na retenção tendenciosa de genes duplicados. Nas duas famílias gênicas, cada parálogo evoluiu de forma divergente devido ao relaxamento da seleção purificadora, o que permitiu que mutações aleatórias com valor adaptativo fossem eventualmente fixadas por seleção positiva. No entanto, a seleção purificadora parece ter sido mais restritiva em ao menos um dos parálogos de cada família gênica, preservando função ancestral. Tanto a idade quanto o mecanismo de duplicação contribuíram para variação nos padrões de retenção de genes duplicados nos 25 genomas alvos deste estudo. O destino evolutivo e a retenção de genes duplicados nos genomas parecem ser moldados por peculiaridades inerentes a cada organismo poliplóide. / Plants are paleopolyploid organisms that survived the deleterious process of genome duplication. After duplication, copies of the same gene (paralogs) evolve in different ways due to the relaxation of purifying selection, making the duplicated genes the greatest source of evolutionary diversification. However, not all categories of genes are retained in the genomes, or lost, randomly. Several evolutionary models have been proposed to explain the evolutionary fate and biased retention of duplicate genes, to thereby better understand polyploidy. However, the applicability of these models has been ill defined. We used approaches of comparative genomics and molecular phylogeny to investigate the fate of duplicated genes in plants. Initially, we inferred about the ancestry of two small families of duplicated genes — methionine synthase and raffinose oligosaccharides — in the genomes of nine species of plants to then characterize the evolutionary forces that have shaped the evolutionary fate of paralogs, using resequencing data from 31 soybean genomes. Later, we used genomic data from 25 taxonomically different plant species to associate mechanisms of duplication, functional gene category and age of duplication to the biased retention of duplicate genes. In each of the two gene families, paralog evolved in different ways due to the relaxation of purifying selection, which allowed random mutations with adaptive value be fixed by positive selection. However, purifying selection seems to be more restrictive in at least one of paralogs of each gene family, preserving the ancestral function. Both the age and the mechanism of duplication contributed to variation in duplicate genes retention patterns in the 25 target genomes in this study. The fate and retention of duplicate genes in the genomes is apparently shaped by peculiarities inherent to each polyploid organism.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2016-06-07T10:17:56Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 6010143 bytes, checksum: 17ea0355849d60b92bc6d90854eac3ef (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-07T10:17:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 6010143 bytes, checksum: 17ea0355849d60b92bc6d90854eac3ef (MD5) Previous issue date: 2016-02-29 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / As leishmanioses compreendem um amplo espectro de doenças parasitárias causadas por protozoários do gênero Leishmania. No hospedeiro vertebrado estes parasitos infectam principalmente os macrófagos, onde conseguem escapar dos mecanismos de defesa e se proliferam. Muitos trabalhos relatam que a sinalização purinérgica é modulada durante o desenvolvimento e ativação das células do sistema imune. Para obterem sucesso na infecção, vários patógenos conseguem subverter a resposta imune através da modulação da sinalização purinérgica, promovendo uma diminuição dos níveis de ATP (molécula pró-inflamatória) e levando a um aumento dos níveis de adenosina (molécula imunossupressora). Este desfecho resulta da atividade conjunta de algumas ecto- nucleotidases, das E-NTPDases e da 5’-ecto-nucleotidase, tema que é abordado no segundo capítulo desta tese. Em Leishmania, as E-NTPDases são consideradas importantes porque participam da via de salvação de purinas, além de serem citadas em diversos artigos como responsáveis por aumento de virulência e infectividade em diferentes espécies. Em trabalhos desenvolvidos por nosso grupo de pesquisa, as E- NTPDases 1 e 2 de L. infantum foram caracterizadas em sistema bacteriano, demonstrando resultados promissores. A possibilidade de expressar essas proteínas em sistema de expressão Leishmania (Leishmania Expression System – LEXSY – Jena Bioscience) nos impulsionou a desenvolver o presente projeto, com o intuito de caracterizar essas enzimas em um organismo bem mais próximo ao original e avaliar o seu potencial uso como vacina viva. Portanto, a clonagem das Lic-E-NTPDases sistema LEXSY é o tema abordado no primeiro capítulo desta tese. / Leishmaniasis comprises a broad spectrum of parasitic diseases caused by protozoa of the genus Leishmania. In vertebrate host, these parasites mainly infect macrophages, where they can escape of defense mechanisms and proliferate. Several works have reported that the purinergic signaling is modulated during development and activation of immune cells. To achieve successful infection, many pathogens can subvert the immune response through modulation of purinergic signaling by promoting a reduction in ATP levels (pro- inflammatory molecule) and leading to increased adenosine levels (immunosuppressive molecule). This outcome results from the joint activity of some ecto-nucleotidases, the E- NTPDase and 5'-ecto-nucleotidase, a topic that is discussed in the second chapter of this thesis. In Leishmania, the E-NTPDases are considered important because they participate in purine salvage pathway, and are cited in various articles to be responsible for increased infectivity and virulence in different species. In work carried out by our research group, the E-NTPDase 1 and 2 of L. infantum were characterized in bacterial system, demonstrating promising results. The ability to express these proteins in Leishmania expression system (Leishmania Expression System - LEXSY - Jena Bioscience) prompted us to develop this project, in order to characterize these enzymes in an organism similar to the original and evaluate its potential use as a live vaccine. Therefore, the cloning of Lic-E-NTPDases in LEXSY system is the subject discussed in the first chapter of this thesis.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-09-02T14:21:12Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1022906 bytes, checksum: c47346c47be766e5f1d01bcccc41b237 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-02T14:21:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1022906 bytes, checksum: c47346c47be766e5f1d01bcccc41b237 (MD5) Previous issue date: 2015-03-19 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Vírus que possuem genoma constituído por DNA fita simples (ssDNA) estão amplamente distribuídos na natureza. As constantes descobertas aliadas à grande diversidade genética desses vírus têm ampliado a compreensão sobre a trajetória evolutiva desse grupo. No Brasil, os vírus DNA fita simples circular causam grandes perdas nas culturas de importância agrícola. Um dos fatores que contribuiu fortemente para o desastre econômico é a transmissão de vírus, onde o maior hospedeiro deles são as plantas não cultivadas. Desde então, diversos trabalhos têm sido publicados tratando de assuntos como diversidade, caracterização, determinação da gama de hospedeiros, interações entre planta e patógeno assim como patógeno e vetor, evolução, predominância, epidemiologia, dentre outros. O presente trabalho teve como objetivo isolar, identificar e caracteriza um novo vírus de ssDNA associado a Melão de São Caetano (Momordica charantia), uma cucurbitácea não cultivada e potencialmente invasiva em cultivos agrícolas no Brasil. A amostra foi coletada em Coimbra, MG- Brasil, com suspeita de ter um vírus da família Geminiviridae por apresentar sintomas de mosaico amarelo. O DNA vegetal foi extraído e analisado através da técnica de amplificação por círculo rolante, os produtos da clivagem com enzimas de restrição foram clonados e completamente sequênciados. A análise das sequências indicou que o vírus tinha um tamanho de 2195 pares de bases e uma organização genômica que apresentava três proteínas: uma codificando o capsídeo do vírus (CP) e duas relac ionada com a replicação (Rep) separadas por um íntron, que a ser removido por inspeção manual codifica a proteína completa. Essa organização em conjunto com as análises do genoma completo mostraram uma identidade com vários isolados do gênero Gemycircularvirus, sendo proposto para esse novo vírus o nome de Momordica charantia associated circular DNA virus (MCasCV). Interessantemente, MCasCV tem uma característica única dentro dos novos ssDNA: um nonanucleotídeo (5'- TAATGTTAT-3') similar ao Hypericum japonicum associated circular DNA virus (HJasCV), com uma formação de um grampo ou “stem- loop” atípico pela ligação de três pares de base encontradas na estrutura. Com o objetivo de caracterizar a biologia do vírus MCasCV foram infectadas plantas de M. charantia e o fungo Sclerotinia sclerotiorum. Para isso, plantas foram bombardeadas com partículas do clone infeccioso de MCasCV e se observou após 21 dias que não apresentaram sintomas visíveis. A confirmação da presença viral foi realizada pelas técnicas de RCA e PCR obtendo um resultado negativo. Para inoculação do vírus em Sclerotinia sclerotiorum, foram transfectados protoplastos desse fungo junto ao clone infeccioso, após o crescimento foi realizada uma extração de DNA total, seguida da confirmação por PCR e RCA, que ao igual da planta os resultados foram negativos. Fatos que podem explicar esse resultado é a ocorrência de falhas no processo de transfecção, ou a não capacidade do vírus de replicar no interior do fungo utilizado. Novas análises de infectividade d everão ser realizadas para a confirmação do hospedeiro do vírus MCasCV. / Viruses that have genomes composed of single-stranded DNA (ssDNA) have been widespread in nature. Continuous discoveries combined with the high genetic diversity of these viruses have leaded our understanding of the historical evolution of this group. In Brazil, the circular single-stranded DNA viruses have caused enormous agricultural losses in staple crops. One factor that strongly contributed to the financial disaster is the transmission of the virus, where the most of the hosts are non-cultivated plants. Since then, several studies have been published, addressing issues such as diversity, characterization, determining the host range and inte ractions between plant and pathogen as well as pathogen and vector, evolution, prevalence, epidemiology, among others. This study aimed to isolate, identify and features a new virus ssDNA associated with Melon de São Caetano (Momordica charantia), one cucurbit uncultivated and potentially invasive in agricultural crops in Brazil. The sample was collected in Coimbra, MG, Brazil, suspected of having a virus Geminiviridae family for symptoms of yellow mosaic. The plant DNA was extracted and analyzed by the tec hnique of rolling circle amplification, the products of cleavage with restriction enzymes have been cloned and completely sequenced. Sequence analysis indicated that the virus had a size of 2195 base pairs and a genomic organization that showed three prote ins: one encoding the virus capsid (CP) and two related replication (Rep) separated by an intron, then it was removed by manual inspection to encoding the complete protein. This arrangement in conjunction with the analysis of complete genome showed an identity with several strains of genus Gemycircularvirus, it has been proposed to name this new virus from Momordica charantia associated circular DNA virus (MCasCV). Interestingly, MCasCV has a unique feature within the new ssDNA: A nonanucleotídeo (TAATGTTAT 5'-3 ') similar to the circular DNA Hypericum japonicum associated virus (HJasCV), with a formation of a staple or "stem- loop" atypical for binding three base pairs found in the structure. With the objective of characterizing the biology of the virus MCasCV M. charantia plants were infected and Sclerotinia sclerotiorum. For this, plants were bombarded with particles of the infectious clone MCasCV and were observed during 21 days, after that interval of time no showed visible symptoms. Confirmation of viral presence was made by RCA and PCR getting a negative result. For virus inoculation of Sclerotinia sclerotiorum, this fungus protoplasts were transfected with the infectious clone, after growing a total DNA extraction was performed, followed by PCR and confirmed by RCA, again the results were negative. Facts that can explain this result is the occurrence of failures in the transfection process, or no ability of the virus to replicate inside the fungus used. New analysis of infectivity should be performed to confirm the MCasCV in the virus host.

O tratamento com antimicrobianos é a principal estratégia de controle da tuberculose (TB). Entretanto, o aumento do número de casos de TB com cepas de Mycobacterium tuberculosis resistente aos antimicrobianos cria um cenário que dificulta a cura do paciente e o controle da doença. Embora várias mutações em loci específicos tenham sido identificadas como base de resistência, outros mecanismos, como o sistema de efluxo, podem contribuir para a resistência e o estabelecimento dessas mutações. O objetivo deste estudo foi avaliar a contribuição do mecanismo de efluxo em isolados clínicos de M. tuberculosis resistentes aos principais antimicrobianos do esquema básico (isoniazida, INH; e rifampicina, RIF) e de multirresistência (ofloxacina, OFX; e amicacina, AMK). Três clássicos inibidores de bombas de efluxo - EPI - (verapamil, VP; tioridazina, TZ; e clorpromazina, CPZ) foram selecionados para detectar o efluxo. Primeiramente, foram analisadas três cepas MDR, duas pré-XDR e a cepa sensível de referência H37Rv. Foi utilizada a metodologia de checkerboard combinada com o tetrazolium microplate-based assay para analisar a interação entre os EPIs com os fármacos. Foi observado que os EPIs diminuem efetivamente a resistência aos antibióticos utilizados, com reduções de 4 a 64 vezes. Para avaliar a atividade do efluxo em tempo real foi utilizado o método fluorimétrico com o brometo de etídio (BrEt), em presença dos EPIs. Foi demonstrado que todas as cepas apresentaram efluxo intrínseco, porém a acumulação e o efluxo do BrEt foi mais evidente na cepa pre-XDR com resistência adicional a AMK. A quantificação transcricional do RNAm dos genes de bombas de efluxo (mmpl7, mmr, Rv1258, p55, efpA, Rv2459) e do regulador transcricional whib7, quando as cepas foram expostas às concentrações subinibitórias dos antibióticos, foi analisada por RT-qPCR. Houve um aumento do nível transcricional de todos os genes em uma cepa MDR e na cepa Pre-XDR com resistência adicional a OFX, quando expostas a pelo menos um dos fármacos envolvidos na resistência. / Treatment with antimicrobials is the main TB control strategy. However, the increase in the number of TB cases with Mycobacterium tuberculosis strains resistant to antimicrobial creates a scenario that hinders patient's healing and disease control. Although several genetic mutations in specific loci involved in drug resistance have been identified as base of resistance, other mechanisms such as efflux system may contribute to resistance and to the establishment of these mutations. The main goal of this study was to assess the overall contribution of efflux mechanism in M. tuberculosis clinical isolates resistant to the main first line drugs (isoniazid, INH; and rifampicin, RIF) and second line (ofloxacin, OFX; and amikacin, AMK). Three classical inhibitors of efflux pumps -EPI- (verapamil, VP; thioridazine, TZ; and chlorpromazine, CPZ) were selected to detect the efflux. Firstly, we analyzed three MDR strains, two Pre-XDR and an H37Rv reference susceptible strain. We used the checkerboard method combined with the tetrazolium microplate-based assay to analyze the interaction between EPIs and drugs. It was observed that EPIs effectively reduce the MIC of antibiotics, with four-fold to 64-fold reduction. Efflux activity was evaluated in real-time by fluorimetric method with ethidium bromide (EtBr), in the presence of EPIs. All strains showed intrinsic efflux, however the accumulation and efflux of EtBr was evident most in the pre-XDR strain with additional resistance to AMK. The quantification of mRNA transcriptional level of efflux pump genes (mmpl7, mmr, Rv1258, p55, efpA, Rv2459) and the transcriptional regulator, whib7, when strains were exposed to antibiotics subinibitory concentrations was examined by RT-qPCR. There was an increase in the transcriptional level of all genes in a MDR strain and pre-XDR strain with additional OFX resistance, when exposed to at least one of the drugs involved in resistance, INH, RIF or OFX. However, there was no correlation between the reduction of antibiotic resistance levels with the EPI and the expression of genes encoding the pumps. Finally, in order to demonstrate the time to detection (TTD) of the bacterial growth in the antimicrobial environment in presence and absence of EPI, were applied BACTECTM MGITTM system 960 and Epicenter V5.53A equipped with software TB eXiST. Were used the MDR strains, a pre-XDR strain with additional resistance to AMK, and a monorresistant to OFX strain. In general, strains have showed a slower grew in the presence of VP, TZ and/or CPZ when combined with INH or RIF. This suggests that efflux is essential for the strain to grow faster in the presence of certain antibiotics. In addition, the efflux can act synergistically with the presence of mutations in order to reduce the biological cost of the bacteria and promoting growth at high drug concentrations. In conclusion, the described results demonstrated that the efflux system plays an important role in resistance to antibiotics used in the treatment of TB, and that the use of efflux inhibitors may potentiate the antimicrobial activity.

Made available in DSpace on 2013-01-07T15:55:03Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 50.pdf: 360186 bytes, checksum: 4c3e43ee4dcc4e8320bcc05019b95494 (MD5) Previous issue date: 2005 / Durante o ano de 1977, equipes independentes de pesquisa como a do inglês Richard Roberts no Cold Spring Harbor Laboratory , do norte-americano Phillip Sharp no Massachussetts Institute of Technology(MIT), do francês Pierre Chambon no Centre Nacional de la Recherche Scientifique, entre outras, descobrem que ao contrário do que era sabido em bactérias, o gene não era um trecho de DNA ininterruptos pronto para ser traduzido em proteínas. Em organismos eucariontes o RNA mensageiro precisa ser montado para dar origem à proteína final. Todavia, essa montagem do RNA mensageiro pode ocorrer de formas alternativas, gerando mais de uma proteína por gene. Esse fenômeno é chamado de processamento alternativo do RNA mensageiro. A descoberta deste, e de outros processos moleculares são motivo necessário para que certos autores postulem a necessidade de uma mudança conceitual das pesquisas biológicas. Para outros autores, essas descobertas não são anomalias, mas mantém o núcleo de um programa de pesquisa lakatosiano. O “dogma central da biologia molecular”, tratado ou como paradigma kuhniano ou como núcleo lakatosiano é debatido. (AU)

NEPOMUCENO, D. R. Clonagem e expressão de uma lectina de Artocarpus incisa L. (Frutalina) em Escherichia coli. 2008. 81 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2008. / Submitted by Francisco Lacerda (lacerda@ufc.br) on 2014-11-27T19:23:51Z No. of bitstreams: 1 2008_dis_drnepomuceno.pdf: 815376 bytes, checksum: 17de51e5080e91f90b2ad84ac669dbba (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa(jairo@ufc.br) on 2015-02-27T19:42:31Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_dis_drnepomuceno.pdf: 815376 bytes, checksum: 17de51e5080e91f90b2ad84ac669dbba (MD5) / Made available in DSpace on 2015-02-27T19:42:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_dis_drnepomuceno.pdf: 815376 bytes, checksum: 17de51e5080e91f90b2ad84ac669dbba (MD5) Previous issue date: 2008 / The lectins constitute biotechnological tools of fundamental importance in hystochemical and cytochemical studies for the detection of tissue glycoconjugates. Among their applications are the identification of membrane receptors and the detection of neoplastic characteristic structures. Frutalin, an -D-galactose-binding lectin from Artocarpus incise seeds, has already been used in the hystochemical detection of thyreoid and breast neoplasia. In this work was made a study of the cloning and expression of the frutalin gene in Escherichia coli Origami (DE3) cells and was determined the three-dimensional structure of this protein through homology modeling. The frutalin gene cloning was accomplished from the product on RT-PCR with seeds in distinct stages of development of the Artocarpus incisa fruits. Twelve clones were obtained, from which five were sequenced. The frutalin gene was expressed in E. coli using the pET15b expression vector. A recombinant lectin (rFrutalin) was expressed by growing the bacteria in the presence of isopropyl -D-thiogalactopyranoside 1mM. All the recombinant lectin was found in an insoluble aggregated form as inclusion bodies. The recombinant lectin had a higher molecular mass (19,2 kDa) than the native lectin (15 kDa) as estimated by SDS-PAGE and Western blot analyses, showing that the recombinant single chain Frutalin is not processed in E. coli cells. The models generated for the clones obtained indicate that the mutations do not change the molecules active sites. Mutations in the clones obtained suggest the occurrence of isoforms of this protein. / As lectinas constituem ferramentas biotecnológicas de fundamental importância em estudos histoquímicos e citoquímicos para a detecção de glicoconjugados nos tecidos. Entre estas aplicações, destacam-se a identificação de receptores de membrana e a detecção de estruturas características de neoplasias. A Frutalina, uma lectina -D-galactose-ligante encontrada em sementes de Artocarpus incisa, já foi utilizada na detecção histoquímica de lesões malignas de mama e tireóide. No presente trabalho foi realizada a clonagem e expressão do gene da frutalina em células de Escherichia coli Origami (DE3) e foi determinada a estrutura tridimensional dessa proteína através da modelagem por homologia. A clonagem do gene da frutalina foi realizada a partir do produto amplificado da RT-PCR de sementes em diferentes estágios de maturação dos frutos de A. incisa. Foram obtidos 12 clones, dos quais 5 foram seqüenciados. A lectina recombinante foi expressa como cadeia única, formada pela cadeia beta com 20 resíduos, ligada a um peptídeo de ligação com quatro resíduos, e a cadeia alfa com 133 resíduos. A expressão da lectina foi indicada pelo aparecimento de uma banda protéica com massa molecular aparente de 19,2 kDa, superior a da lectina nativa (15 kDa), após a indução com IPTG 1mM. A lectina recombinante foi mantida exclusivamente em corpos de inclusão e foi reconhecida imunologicamente por anticorpos policlonais anti-Frutalina. Os modelos gerados para os clones obtidos indicam que as mutações ocorridas não alteram os sítios de ligação a carboidratos das moléculas. As mutações nos clones obtidos sugerem a ocorrência de isoformas dessa proteína.

MARTINS, Aline Maria Araújo. Proteômica Funcional da Cirrose e do Carcinoma Hepatocelular. 2012. 231 f. : Tese (doutorado) - Universidade Federal do Ceará, Faculdade de Medicina, Departamento de Fisiologia e Farmacologia , Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia - RENORBIO. Fortaleza-CE. 2012. / Submitted by demia Maia (demiamlm@gmail.com) on 2016-05-18T16:48:14Z No. of bitstreams: 1 2012_tese_amamartins.pdf: 7251580 bytes, checksum: 4d2fc400fa8a79065db54dc5369f6fd5 (MD5) / Approved for entry into archive by demia Maia (demiamlm@gmail.com) on 2016-05-18T16:50:52Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_tese_amamartins.pdf: 7251580 bytes, checksum: 4d2fc400fa8a79065db54dc5369f6fd5 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-18T16:50:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_tese_amamartins.pdf: 7251580 bytes, checksum: 4d2fc400fa8a79065db54dc5369f6fd5 (MD5) Previous issue date: 2012 / Introduction. Cancer is the most common given name to a series of molecular and physiological events which result in genetic instability and biochemical imbalance in cells. Among the seven events that drives cell cancer, the role of chronic inflammation and tumor microenvironment in cancer development were highlighted in this work . To experimentally evaluate some of these events was chosen as an experimental model, cirrhosis resulting from chronic hepatitis (viral and alcoholic) as a progressor of hepatocellular carcinoma (HCC), the most common liver cancer. Goals. To identify and correlate proteins/enzymes involved in chronic inflammatory process of cirrhosis and HCC establishment in cancer progress. Patients and Methods. The profile of soluble proteins in inflammatory tissue and in HCC were analyzed using Functional Proteomics techniques of , such as 2D DIGE, coupled to mass spectrometry. The interaction within the identified proteins signaling pathways´ was performed by using MetaCore® software. Results. In this study, where identified proteins that never been described in the literature, using differential gel electrophoresis within the different biological scenarios analyzed here, such as macrophage metalloelastase - MMP12; Collagenase 3 - MMP13; endoplasmina - HSP90B1; heat shock protein HSP 90β - HSP90AB1; Protein S100 A6; Disintegrin and metalloproteinase with a thrombospondin motifs 9 - ADAMTS9, those playing an important role in carcinogenesis. Discussion Relevant observations due to signaling pathways within the proposed biological scenario were analysed, as well as specific pathways in each etiology. Conclusion. Proteins/enzymes involved in cirrhosis and chronic inflammatory progression and the development of HCC were identified and related by their functionality. The interaction between identified proteins within each biological scenario was evaluated from the perspective of its signaling pathways, and differences between those pathways were demonstrated. Tumor microenvironment plays and undergoes significant influence on the variation of gene expression. / Introdução. O câncer é o nome mais comum dado a uma série de eventos moleculares e fisiológicos que resultam na instabilidade genética e no desequilíbrio bioquímico nas células. Dentro os sete eventos celulares que regem o câncer destaca-se neste trabalho o papel da inflamação crônica e do microambiente tumoral no desenvolvimento dos tumores. Para avaliar experimentalmente alguns destes eventos foi escolhido como modelo experimental, a cirrose resultante da hepatite crônica (viral e alcoólica) como progressora da neoplasia mais comum no fígado, o carcinoma hepatocelular. Objetivo. Identificar e inter-relacionar as proteínas/enzimas envolvidas no processo inflamatório crônico da cirrose e o estabelecimento dos processos neoplásicos no carcinoma hepatocelular. Pacientes e Métodos. Utilizando de técnicas de Proteômica diferencial, 2D DIGE acoplada à espectrometria de massa, foram analisadas, entre vários cenários biológicos, o perfil das proteínas solúveis em tecidos inflamatórios e no próprio carcinoma hepatocelular. Uma abordagem por meio da interação das proteínas anotadas em vias de sinalização foi realizada por meio do programa Metacore®. Resultados. Neste estudo, proteínas que não haviam sido separadas e purificadas por meio de eletroforese em gel diferencial foram anotadas, como Macrófago metaloelastase - MMP12; Colagenase 3 – MMP13; endoplasmina - HSP90B1; Proteína S100 A6; Desintegrina e metaloproteinase com repetição de trombospondina 9 - ADAMTS9, estas desempenhando importante papel na carcinogêneses. Discussão Relevantes observações das vias de sinalização que regem cada cenário biológico proposto, foram realizadas e vias específicas em cada etiologia foram analisadas. Conclusão. As proteínas/enzimas envolvidas no processo inflamatório crônico da cirrose e o surgimento/progressão do carcinoma hepatocelular foram identificadas e caracterizadas quanto à sua funcionalidade e a interação das mesmas, com outras proteínas diferenciais anotadas em cada cenário biológico foi avaliada dentro da perspectiva de suas vias de sinalização correspondentes. O microambiente tumoral exerce e sofre importante influência na variação da expressão gênica.

Made available in DSpace on 2016-08-29T15:34:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_8804_Tese_Alice Laschuk Herlinger.pdf: 1575039 bytes, checksum: fc041b347fbc6e8e6b1698a08137c688 (MD5) Previous issue date: 2015-04-27 / CAPES / Ovarian cancer (OVCA) is the most lethal gynecological cancer, and its dissemination and chemoresistance are major factors determining disease prognosis. Better understanding of mechanisms involved in these processes is crucial to improve OVCA therapy; therefore being the aim of the present study. Firstly, the role of NAC1 and BCL6 regulating transcription in OVCA has been investigated using FOXQ1 as a study model. It has been shown that NAC1 and BCL6 interact through NAC1’s BEN C-terminus domain, forming a complex which binds to three BCL6 binding motives on FOXQ1 promoter, activating its transcription. A positive correlation between NAC1 and BCL6 expression has been shown in OVCA cell lines and tumor specimens. Moreover, BCL6-depending NAC1 binding to BCL6 promoter activating its transcription has been shown. Therefore, a novel mechanism by which a BTB/POZ family member interacts with BCL6 attenuating its auto-repression has been herein described. Finally, cDNA microarray analyzes revealed a plethora of putative NAC1/BCL6 target genes. On the second chapter, the effects of cisplatin on OVCA progression have been analyzed. It has been shown that a five-day treatment with 10-5M cisplatin of A2780 cell increased chemoresistance, cell migration and expression of the cancer-stem cell associated phenotype CD44+CD24-, and a G2/M cell cycle arrest. The secretion of TGF-β1 and CXCL2, both cytokines involved in migration and resistance in cancer, in response to cisplatin, doxorubicin, and paclitaxel, by three cell lines originated from serous (A2780), endometrioid (MDAH-2774), and clear cell (TOV21G) OVCA subtypes has been measured. In response to cisplatin, TGF-β1 secretion by TOV21G cells has increased, as has CXCL2 secretion by TOV21G and A2780. When analyzing the effect of exogenous CXCL2 in drug resistance, this relation could not be demonstrated. However, it could be explained by CXCR2 overexpression in response to cisplatin, which has been herein demonstrated. Therefore, several different mechanisms leading to OVCA progression have been identified / O câncer de ovário (CAOV) é a neoplasia ginecológica mais letal, sendo que a disseminação da doença e a quimiorresistência podem ser considerados fatores determinantes no prognóstico da doença. O entendimento dos mecanismos envolvidos nesses processos é essencial ao aprimoramento da terapêutica do CAOV, sendo assim o alvo de estudo deste trabalho. Primeiramente, investigou-se o papel de NAC1 e BCL6 na regulação da transcrição no CAOV, utilizando-se como modelo FOXQ1. Viu-se que NAC1 e BCL6 interagem através do domínio BEN Cterminal de NAC1, formando um complexo que se liga a motivos de ligação a BCL6 localizados na região promotora de FOXQ1 que, conforme se mostrou, possui três desses motivos. Em seguida, mostrou-se que existe uma correlação positiva entre a expressão de NAC1 e BCL6 em linhagens celulares de CAOV e em tumores. Mostrou-se ainda, que NAC1 liga-se ao promotor de BCL6 de forma dependente da proteína BCL6, ativando a sua transcrição. Dessa forma, descreveu-se de forma inédita um mecanismo através do qual um membro da família BTB/POZ interage com BCL6 atenuando a sua autorregulação negativa. Por fim, através de análise de microarranjo de cDNA identificaram-se possíveis novos alvos de regulação do complexo NAC1/BCL6. Na segunda parte deste trabalho, analisaram-se os efeitos da cisplatina na progressão do CAOV. Mostrou-se que, em resposta ao tratamento por cinco dias com cisplatina 10-5M, células da linhagem A2780 apresentaram aumento de migração, resistência e expressão do fenótipo de células-tronco tumorais CD44+CD24-; além da droga induzir uma parada do ciclo celular em fase G2/M. Também se analisou a secreção de TGF-β1 e CXCL2, citocinas envolvidas com a resistência e metástase no câncer, em resposta à cisplatina, à doxorrubicina e ao paclitaxel, em três linhagens de CAOV derivadas de tumores dos tipos seroso (A2780), endometrioide (MDAH-2774) e de células claras (TOV21G). Mostrou-se que, em resposta à cisplatina, apenas, havia o aumento da secreção de TGF-β1 por células TOV21G e de CXCL2 por células A2780 e TOV21G. Em seguida, buscou-se identificar se CXCL2 exógeno seria capaz de induzir a resistência nas células A2780. Esse efeito não foi observado. Contudo, pode ser explicado pela regulação positiva da expressão de CXCR2 induzida pela cisplatina aqui mostrada. Dessa forma, identificaram-se diferentes mecanismos que podem contribuir para a progressão do CAOV

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2018-04-19T13:52:32Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1721815 bytes, checksum: 43f6125a682c349b31f8f0fb972ad1c3 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-19T13:52:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1721815 bytes, checksum: 43f6125a682c349b31f8f0fb972ad1c3 (MD5) Previous issue date: 2018-02-20 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Em resposta a infecções por patógenos, as plantas modulam vias de sinalização mediada por hormônios, tais como SA, MeJA e auxina. Essas vias podem resultar em alteração da expressão gênica, processo importante para a mitigação dos efeitos da infecção. Essa reprogramação transcricional é regulada através de fatores de transcrição. Os fatores de transcrição da família gênica bZIPs são reguladores importantes em plantas e alguns de seus membros estão envolvidos em respostas de defesa contra patógenos. Neste estudo, descreveu-se a caracterização funcional do fator de transcrição GmbZIP105 e da proteína GmARP15g em resposta a infecção pelo fungo causador da ferrugem asiática da soja. Além disso, potencias grupos da família DRM1/ARP foram identificados por meio de metodologias de agrupamento in silico de sequências. Os perfis de expressão de genes presente nestes grupos foram avaliados em resposta ao tratamento com os hormônios auxina e MeJA e à infecção por patógenos em plantas de soja. As proteínas GmbZIP105 e GmARP15g interagem em ensaios de duplo híbrido de leveduras. Além disso, apresentam o mesmo perfil transcricional em resposta ao tratamento com os hormônios MeJA e auxina. GmbZIP105 induz a expressão de genes relacionados a fotossíntese, enquanto GmARP15g interage com PSBS, uma proteína que compõe o PSII. Esses resultados sugerem uma relação funcional entre estas proteínas e que, provavelmente, GmARP15g modula a localização ou a atividade do fator de transcrição GmbZIP105. / In response to pathogen infections, plants modulate a series of signaling pathways that are mediated by hormones, such as SA, MeJA and auxin. These pathways may result in gene expression alteration that is important for mitigating the effects of infection. This transcriptional reprogramming is regulated by transcription factors. bZIP’s transcriptional factors are important regulators in plants. Some of their members are involved in defense responses against pathogens. This study describes the functional characterization for GMbZIP105 transcriptional factor and GmARP15g protein during response against fungal infection. For that, it was used the fungus that causes ASR – Asian soybean rust. In addition, in silico analysis using clustering methodologies were applied to identify potential DRM1 / ARP family groups. The expression profiles of these groups were evaluated in response to treatment with hormones auxin and MeJA and during pathogen infection in soybean. The proteins GmbZIP105 and GmARP15g interact in two-hybrid yeast assays; in addition, they present the same transcriptional profile in response to treatment with hormones MeJA and auxin and are responsive to pathogen. GmbZIP105 induces the expression of genes related to photosynthesis, while GmARP15g interacts with one of the PSII proteins. These results suggest a functional relationship between both proteins in which GmARP15g probably modulates the localization or activity of the transcription factor GmbZIP105.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2018-04-19T15:50:58Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1496637 bytes, checksum: 5fe9118e3af447fde79634e413e36251 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-19T15:50:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1496637 bytes, checksum: 5fe9118e3af447fde79634e413e36251 (MD5) Previous issue date: 2017-06-30 / NIK1 (NSP Interacting kinase I) é um receptor cinase da família das LRRII-RLKs (leucine rich repeat II – receptor like kinase), identificado como alvo de virulência da proteína NSP (Nuclear Shuttle Protein), sendo o principal mediador de uma via de resposta imune contra esse grupo de vírus de DNA. Aufosforilação, de NIK1 em um resíduo de treonina 474 aciona a via de resposta antiviral que culmina com a repressão da expressão de proteínas ribossomais levando à redução da síntese de proteínas da célula vegetal e virais. Apesar de sua atividade antiviral, o transcriptoma de plantas nocautes de nik1 indicam um possível envolvimento de NIK1 como regulador negativo na resposta imune contra bactérias. Com a finalidade de esclarecer o envolvimento de NIK1 na imunidade inata antibacteriana, foram conduzidos ensaios de fosforilação in vitro de NIK1, utilizando os receptores, que intermedeiam PTI (Pamp-triggered immunity), BAK1 ( Brassinosteroid insensitive 1- associated kinase) e FLS2 (Flagellin sensitive – 2). Os resultados de espectrometria de massas demonstraram que BAK1 é um possível regulador da fosforilação de NIK1, uma vez que foi capaz de fosforilar um peptídeo sintético em uma treonina correspondente à posição 474 de NIK1 e de modificar a taxa de autofosforilação desse receptor em um ensaio contendo o domínio cinase intacto de NIK1. Além disso, foi demonstrado por BiFC (complementação de fluorescência bimolecular) que NIK1 e NIK1-T474D interagem tanto com BAK1 quanto com FLS2 na membrana plasmática. Ensaios de co-imunoprecipitação (Co-IP) demonstraram que flagelina promove a dissociação de NIK1 dos receptores para formar o complexo imune ativo BAK1-FLS2. Finalmente, ensaios de Co-IP com linhagens transgênicas de Arabidopsis superexpressando NIK1 e nocautes de nik1 indicaram que NIK1 interfere com a formação do complexo BAK1/FLS2 na resposta antibacteriana, já que a superexpressão de NIK1 diminui a eficiência de formação do complexo imune na presença de flagelina, enquanto que a inativação de NIK1 resulta em efeito oposto. Coletivamente, estes resultados substanciam o argumento de que NIK1 atua regulando negativamente PTI em plantas. / NIK1 (NSP Interacting kinase I), which was first identified as a virulence target of NSP (Nuclear Shuttle Protein), is a receptor-like kinase belonging to the LRRII-RLKs (leucine rich repeat II – receptor like kinase) family and the major mediator of an immune response against this group of DNA virus. NIK1 autophosphorylation at Thr 474 triggers an antiviral response which culminates with the repression of ribosomal protein gene expression leading to suppression of host and viral protein synthesis. Despite its antiviral activity, the transcriptome of nik1 knockouts implicates NIK1 as a possible negative regulator of the immune response against bacteria. To examine the NIK1 involvement in antibacterial innate immunity, in vitro phosphorylation assays were carried out on NIK1, using the PTI (Pamp-triggered immunity)-mediated receptors, BAK1 ( Brassinosteroid insensitive 1- associated kinase) and FLS2 (Flagellin sensitive – 2). The results from mass spectrometry demonstrated that BAK1 may be a regulator of NIK1 phosphorylation, as it was capable of phosphorylating a Thr residue of a synthetic peptide corresponding to the position 474 of NIK1 and modifying the autophosphorylation rate of the NIK1 Kinase domain. Furthermore, BiFC (bimolecular fluorescence complementation) assays demonstrated that NIK1 and NIK1-T474D interact with BAK1 and FLS2 in the plasma membrane. Co-immunoprecipitation (Co-IP) assays showed that flagellin promoted the NIK1 dissociation from BAK1 and FLS2 to form an active BAK1-FLS2 immune complex. Finally, Co-IPs using NIK1- overexpressing transgenic lines and nik1 knockouts indicated that NIK1 interferes with BAK1-FLS2 complex formation in the antibacterial response, as NIK1 overexpression decreased the efficiency of the immune complex formation in the presence of flagellin, whereas NIK1 inactivation resulted in opposing effects. Collectively, these results substantiate the argument that NIK1 regulates negatively plant PTI.