Made available in DSpace on 2015-07-09T02:04:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000471802-Texto+Parcial-0.pdf: 3735530 bytes, checksum: 4d5d2bdf0acc100c891cf110e11d4904 (MD5) Previous issue date: 2015 / Biomolecular recognition processes are intrinsically related to protein flexibility. To understand how ligands interact with its partners, how proteins can cooperate with each other, or why aggregation process occurs, are particularly important, not only to biophysics, but also in the rational drug design process. X-ray crystallography, nuclear magnetic resonance, and molecular dynamics simulations are broadcasted approaches used to try to comprehend flexibility in biological macromolecules, although, this is not an easy task. This Ph. D. thesis will discuss the role of the flexibility using two different systems, (i) Mycobacterium tuberculosis EPSP synthase and (ii) Calmodulin from Mus musculus. Our main goal with this first system was to analyse in detail the structural information of the EPSP synthase, using molecular dynamics simulation. As a result, we have hypothesised how EPSP synthase flexibility could affect its activity, as well as its implications in the process of molecular docking experiments. Calmodulin project was developed during a ten month internship at the University of Cambridge. Our main goal was to study the influence of peptide mutated sequences in the process of molecular recognition, using nuclear magnetic resonance and isothermal titration calorimetry. As a product of this work, we have observed the impact of the linker domain to the peptide recognition, as well as, we have presented the importance of the entropy‐ enthalpy balance in the association with Calmodulin. / O reconhecimento biomolecular está diretamente ligado à capacidade de uma proteína a suportar mudanças conformacionais, ou seja sua plasticidade. Compreender como ocorre a associação de ligantes com seus receptores, como proteínas se interrelacionam, porque ocorrem os processos de agregação, são de extrema importância, não apenas para a área da biofísica, como também para o desenho racional de fármacos. Técnica como cristalografia por difração de raios X, ressonância magnética nuclear e dinâmica molecular, são algumas das principais abordagens para o estudo da flexibilidade em macromoléculas biológicas. No entanto, esta não é uma tarefa simples. Esta tese de doutorado versará sobre o papel da flexibilidade em dois sistemas distintos, (i) a enzima EPSP sintase de Mycobacterium tuberculosis e (ii) a proteína Calmodulina de Mus musculus.A Parte 1 trará como modelo de estudo a enzima EPSP sintase de Mycobacterium tuberculosis. O nosso objetivo com esta parte foi analisar em detalhes as informações estruturais desta enzima, por meio da técnica de dinâmica molecular. Como resultados, propomos como a flexibilidade pode atuar na modulação da atividade enzimática, a hipótese dos cinco mínimos locais de energia, bem como, suas implicações para o processo de docagem molecular a partir de uma estrutura. A Parte 2 foi desenvolvida durante o período de doutorado sanduíche e teve como alvo a proteína Calmodulina de Mus musculus. O objetivo na Parte 2 desta tese foi estudar a influência de mutações no processo de reconhecimento molecular com a Calmodulina, por meio das técnicas de ressonância magnética nuclear e calorimetria por titulação isotérmica. Como resultados, observamos a influência da região de dobradiça para o reconhecimento dos peptídeos avaliados, bem como, um processo de balanço entrópico‐entálpico na associação destas moléculas.

Made available in DSpace on 2015-07-22T02:04:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000472479-Texto+Completo-0.pdf: 1633754 bytes, checksum: 4a4e4307d99c258ef92fc1b916f00e9e (MD5) Previous issue date: 2015 / Potato is currently the third most consumed food crop after rice and wheat, and it is a valuable resource for alleviating poverty in undeveloped countries. However, potato crop fields are attacked by numerous pests and pathogens, which represent a threat to the global potato production. Unlike animals, plants do not possess an adaptive immune system. Therefore, each individual plant cell needs to be able to perceive the pathogen, release signals to neighbor cells, and produce a defense response. Plant cells recognize the pathogen through Pattern Recognition Receptors (PRRs), triggering a signaling cascade that results in the activation of defense-related genes, which characterize the occurrence of Systemic Acquired Resistance (SAR). Among the factors involved in the regulation of defense-related genes, salicylic acid is widely known as an elicitor of plant defense against biotrophic pathogens. Besides this hormone, it has been demonstrated that a bacterial extract of Xanthomonas axonopodis pv. citri (referred to as XTH) is capable of inducing resistance against pectolytic bacteria via poorly understood mechanisms. Considering the different signaling pathways involved in plant defense, we intended to investigate the occurrence of systemic resistance in Solanum tuberosum plants treated with XTH or salicylic acid, by analyzing the expression of PR-1b, PR-2, ChtA, PAL, Pin2, JAZ1/TIFY10A, and ERF1 genes. Our results suggest that XTH is capable of inducing systemic resistance in potato plants via concomitant activation of the salicylic acid, jasmonic acid, and ethylene signaling pathways. / A batata é atualmente o terceiro alimento mais consumido no mundo, depois do arroz e do trigo, além de ser um recurso importante no combate à fome em países subdesenvolvidos. Entretanto, plantas de batata são atacadas por diversas pragas e patógenos, que representam uma ameaça à produção global de tubérculos. Ao contrário dos animais, as plantas não possuem um sistema imune adaptativo. Dessa forma, as plantas dependem que cada célula, individualmente, tenha a capacidade de perceber o patógeno, sinalizar às células vizinhas e produzir uma resposta de defesa. As células vegetais percebem o contato do patógeno através de Receptores de Reconhecimento de Padrões (PRRs), desencadeando cascatas de sinalização que levam à ativação de genes de defesa, os quais caracterizam a ocorrência de Resistência Sistêmica Adquirida (SAR). Dentre os fatores envolvidos na regulação de genes relacionados à defesa, o ácido salicílico é amplamente conhecido como um eliciador da defesa vegetal contra patógenos biotróficos. Além deste hormônio, foi demonstrado que o extrato bacteriano de Xanthomonas axonopodis pv. citri (denominado de indutor XTH) possui a característica de induzir resistência contra fitobactérias pectolíticas através de mecanismos ainda pouco conhecidos. Considerando as diferentes vias de sinalização envolvidas na defesa vegetal, pretendeu-se investigar a ocorrência de resistência sistêmica em plantas de Solanum tuberosum tratadas com indutor XTH ou ácido salicílico, através da análise transcricional dos genes PR-1b, PR-2, ChtA, PAL, Pin2, JAZ1/TIFY10A e ERF1. Os resultados sugerem que o indutor XTH tem a capacidade de induzir resistência sistêmica em plantas de batata através da ativação concomitante das vias de sinalização do ácido salicílico, jasmonato e etileno.

Made available in DSpace on 2015-09-26T02:05:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000475172-Texto+Completo-0.pdf: 1033533 bytes, checksum: 3695eeb1d157f2c6ed87073d37aa8b1e (MD5) Previous issue date: 2015 / Tuberculosis (TB) caused predominantly by Mycobacterium tuberculosis is an infectious disease responsible for a significantly number of deaths worldwide. The first line TB drugs that are currently used, and others available, present several problems, such as duration and complexity of treatment, and adverse effects, factors that decrease the patient adherence to treatment regimen. These problems increase the number of cases of drug resistant TB. The pentacyano(isoniazid)ferrate(II) (IQG-607) compound is an inorganic complex designed to treat INH-resistant strains of M. tuberculosis containing mutations in catalase-peroxidase gene, katG. The compound appears to be a promising anti-TB drug candidate according to previous studies that demonstrated its effectiveness both in vitro and in vivo. However, the difficulties encountered in the development of an analytical method for detection and quantification of the compound, due to its chemical properties, were impeding further studies, such as the pharmacokinetic studies. In this context, the present study describes two analytical methods for the detection of IQG-607 for the first time. The voltammetric method was shown to be a powerful analytical tool for quantification of IQG-607 and may be used to monitoring the stability and quality control. The proposed method, together with enzymatic inhibition assay, shown that the IQG-607 is stable for at least 1week at 4 ºC. The detection of IQG-607 by high performance liquid chromatography (HPLC) was also described, and we were able to observe the retention of the compound on the stationary phase of a chromatography column for the first time in this work. In addition, the analysis of IQG-607 in mouse plasma by HPLC was also demonstrated. Therefore, this conventional method will be optimized and validated to conduct pharmacokinetics studies. / A tuberculose (TB) causada predominantemente por Mycobacterium tuberculosis é uma doença infecciosa responsável por um número considerável de mortes em todo o mundo. Os medicamentos utilizados no tratamento de primeira linha atual, e os demais disponíveis, apresentam diversos problemas, como a duração, complexidade, e efeitos adversos, dificultando a adesão dos pacientes ao regime terapêutico. Isto favorece o aumento do número de casos de TB resistente a medicamentos. O pentaciano(isoniazida)ferrato(II) (IQG-607) é um composto proposto para agir contra casos de TB resistentes à INH devido a infecção com cepas que possuem mutações no gene katG. O composto demonstrou ser um promissor agente anti-TB em estudos prévios, e a sua eficácia in vitro e in vivo foi comprovada. No entanto, as dificuldades encontradas no desenvolvimento de um método analítico para a detecção e quantificação do composto devido as suas características químicas estavam impedindo a realização de outros estudos, e dentre eles, a determinação de parâmetros farmacocinéticos. Tendo isto em vista, o presente trabalho descreve, pela primeira vez, dois métodos analíticos para detecção de IQG-607. O método voltamétrico mostrou potencialidade na quantificação do composto, podendo ser utilizado para monitorar a estabilidade e em controle de qualidade. Observamos, por meio deste método, juntamente com ensaios de inibição enzimática, que o IQG-607 é estável em solução por até 1 semana se for mantido a 4ºC. A detecção do IQG-607 por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) também foi demonstrada, e, pela primeira vez, observamos a interação do composto em coluna cromatográfica. Ainda, por CLAE, demonstramos a detecção do IQG-607 no plasma de camundongos, e por ser um método convencional, será otimizado e validado para a realização de futuros estudos de farmacocinética.

Made available in DSpace on 2016-06-02T12:30:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000478795-Texto+Completo-0.pdf: 3480923 bytes, checksum: c145d85afafb9cc7cd5782a17ac34cfb (MD5) Previous issue date: 2015 / Angiostrongylus cantonensis is a nematode parasite, main etiologic agent of the eosinophilic meningitis (EM) in humans, a disease endemic in many tropical and sub tropical countries. The diagnosis of EM involves clinical evaluation, eosinophils counting >10% in liquor, and consuming historical of raw mollusks, as they are the intermediate hosts of the Angiostrongylus. Definitive diagnosis through larvae visualization in the liquor is rare. Serological test, mainly involving the 31-kDa component detection, which presents high sensitivity and specificity, has been employed as an alternative way for diagnostic. The 31-kDa antigen is composed for glycoproteins and tentatives in producing it in a recombinant way, using either prokaryotic or eukaryotic models, were inable to mantain immunological recognition, probably due the lack or deficient glycosilation of the molecules. Due the lack of information about A. cantonensis glycans and the need of producing a standard antigen able to be used worldwide in a diagnostic test, the main goal of this work was to study the A. cantonensis glycan profile and their role on the immune diagnosis of EM. It was used total soluble extract (TE) and excretory-secretory products (ES) as sources of glycans and glycoconjugates. The N-linked glycans and glycoconjugates from A. cantonensis female TE and 31-kDa antigen were analyzed and identified by mass spectrometry (MS) and lectin array, and the immunogenecity of these molecules were characterized by dot blot and Western blots. Furthermore, It was investigated the biosynthesis routes of glycans using in silico analysis of the Angiostrongylus genome and transcriptome dataset. N-glycans containing complex structures, with truncated antennas containing terminal with galactose and N-acetylgalactosamine, and core α1-6 fucosylated were identified. Lectin array analysis could also dentify Gal and GalNAc structures in Angiostrongylus glycoconjugates. Eight genes involved with biosynthesis of N-glycans, among them GCS1; GANAB, MAN1, MGAT2 and FUT8; and three involved with O-glycan biosynthesis, GALNT, C1GALT1 e OFUT1 were found by in silico analysis. Immunogenicity of the 31-kDa antigen is tottaly dependent of N-glycans and not to O-glycans. Modeling of proteins of the 31kDa component showed N-glycosilation sites and predicted structures that were the same identified by MS analysis. Taking together, the data generated in this study shown the glycan importance for angiostrongyliasis diagnosis and also the glycan repertoire that Angiostrongylus produces. This work is an important contribution to the development of a standard diagnosis for EM and also for new perspectives in the study of angiostrongyliasis diagnosis, parasite biology and host-parasite relationship. / Angiostrongylus cantonensis é um nematódeo parasita, principal agente etiológico da meningite eosinofílica (ME) em humanos, doença endêmica em diversos países tropicais e subtropicais. A ME se caracteriza pela eosinofilia >10% no líquor, e histórico de ingestão de moluscos crus, já que estes são hospedeiros intermediários do Angiostrongylus. O diagnóstico definitivo é raramente possível através da visualização da larva no liquor. Testes sorológicos envolvendo principalmente a detecção do componente de 31-kDa, que apresenta alta sensibilidade e especificidade, tem sido empregados como uma alternativa diagnóstica. O antígeno de 31-kDa é composto por glicoproteínas e tentativas em produzi-lo de maneira recombinante, em modelos procarióticos ou eucarióticos, não tiveram sucesso em manter o reconhecimento imunológico, provavelmente pela incorreta ou insuficiente glicosilação das moléculas. Devido à falta de informação sobre glicídios de A. cantonensis e a necessidade de produzir um antígeno padrão capaz de ser usado em um teste de diagnóstico para distribuição mundial, o objetivo principal deste trabalho foi estudar o perfil glicídico de A. cantonensis e o papel dessas moléculas no imunodiagnóstico da ME. Foram utilizados extratos solúveis totais (ET) de vermes adultos machos e fêmeas e produtos de excreção e secreção (ES) como fontes dos glicídios e glicoconjugados estudados. Os N-glicídios e glicoconjugados do ET de verme fêmea de A. cantonensis e o antígeno de 31-kDa foram analisados e identificados por espectrometria de massa (EM) e lectina array, e a importância imunogênica destas moléculas foi caracterizada por tratamento com glicosidases aliado a dot blot ou Western blot. Além disso, foi investigada a presença de enzimas envolvidas na síntese de diferentes glicídios a partir de análises in silico do genoma e transcriptoma do Angiostrongylus. Diversos N-glicídios foram identificados nas amostras analisadas. Estes continham estruturas complexas, com antenas truncadas contendo galactose e N-acetilgalactosamina em posições terminais e núcleo α1-6 fucosilado. As mesmas estruturas terminais foram identificadas pela análise de Lectin Array. Em relação a análise in sílico da biossíntese de glicídios em Angiostrongylus, foram identificados oito genes envolvidos na síntese de N-glicídios, entre eles GCS1; GANAB, MAN1, MGAT2 e FUT8; e pelo menos três genes envolvidos na síntese de O-glicídios, GALNT, C1GALT1 e OFUT1. Os N-glicídios se mostraram essenciais para a imunogenicidade do antígeno de 31-kDa quando soros positivos para A. cantonensis foram testados. Uma modelagem in silico dos componentes de 31-kDa, demonstrou sítios de glicosilação para N-glicídios, e previu as mesmas estruturas que foram identificadas por EM. Em conjunto, os dados gerados neste estudo mostraram a importância de glicídios para o diagnóstico de angiostrongilíases e também o repertório de glicídios que este parasito pode produzir. Este trabalho é uma contribuição importante para o desenvolvimento de um diagnóstico padrão para a ME e também para novas perspectivas no estudo do diagnóstico de angiostrongilíases, biologia do parasito e relação parasito-hospedeiro.

Made available in DSpace on 2016-06-02T12:30:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000478692-Texto+Completo-0.pdf: 1934289 bytes, checksum: ad294c842ebebac268c4523f0b1f9420 (MD5) Previous issue date: 2016 / Tuberculosis is the infectious disease that causes more deaths worldwide, along with acquired immunodeficiency syndrome (AIDS). Great efforts have been exerted in recent years to the search for new anti-tuberculosis drugs without success. Drug development platforms fail at different stages of the research and development process and one aspect that contributes to this is the lack of knowledge of the potential molecular drug targets. Both the elucidation of the bioactive compounds mechanism of action and the identification of their cellular targets are important for the development of new drugs. As an experimental alternative to the identification of molecular targets is pulse proteolysis technique, which determines the fraction of proteins differentially degraded after a brief incubation with proteases when comparing samples treated and untreated with a ligand. In this work, we developed the PePTID method: a new method for identification of molecular targets using pulse proteolysis and mass spectrometry analysis. The application of PePTID resulted in a reproducible procedure that minimizes the required amount of sample and provides a more robust analysis method compared to other approaches that use pulse proteolysis. / A tuberculose é, junto com a Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (SIDA), a doença infecciosa que mais causa mortes no mundo. Grandes esforços foram exercidos nos últimos anos para a busca de novos fármacos antituberculose, porém sem muito sucesso. As plataformas de desenvolvimento de fármacos falham em diferentes etapas do processo de pesquisa e desenvolvimento e um dos aspectos que contribui para isso é a falta de conhecimento dos alvos moleculares de potenciais fármacos. Tanto a elucidação do mecanismo de ação de compostos bioativos quanto a identificação de seus alvos celulares são importantes para o desenvolvimento de novos fármacos. Como alternativa experimental para a identificação de alvos moleculares está a técnica de proteólise pulsada, a qual determina a fração de proteínas diferencialmente degradadas após breve incubação com proteases quando comparadas as amostras tratadas e não tratadas com um ligante. Nesse trabalho, desenvolvemos o método PePTID: um novo método para identificação de alvos moleculares usando a proteólise pulsada e análise por espectrometria de massa. A aplicação do método PePTID resultou em um procedimento reprodutível que minimiza a quantidade necessária de amostra e que apresenta uma metodologia de análise mais robusta em relação a outras abordagens que utilizam a proteólise pulsada.

Made available in DSpace on 2018-05-08T12:03:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000488668-Texto+Confidencial-0.pdf: 680944 bytes, checksum: 8977a7ea03100f9505fb671a85a71feb (MD5) Previous issue date: 2017

Orientador: José Roberto Ruggiero / Coorientador: Elso Drigo Filho / Banca: Gerald Weber / Banca: Antonio Caliri / Banca: Edson Denis Leonel / Banca: Jorge Chahine / Resumo: O comportamento dinâmico do DNA apresenta movimentos de grande amplitude e localizados ao longo da cadeia, contendo inclusive aberturas locais de pares de bases. Esse comportamento est a relacionado com aspectos funcionais da mol ecula, como por exemplo a transcri ção e a replicação. Neste trabalho, procuramos compreender essa dinâmica através da criação e estabilidade de breathers no modelo de Peyrard-Bishop. Estudamos a inuência da variação de energia em uma estrutura de breather estável e por meio da dinâmica do modelo, inferimos a densidade de energia necess aria para que ocorra a transição de fase do sistema, ou seja, a desnaturação do DNA de forma minimalista. Na sequência do trabalho, utilizamos de dinâmica molecular no nível de representação atômica para relacionar o modelo mecânico com a dinâmica in silico do sistema. Por fim, verificamos a instabilidade da dupla hélice do DNA, quando a molécula e submetida a um estresse torcional / Abstract: The dynamic behavior of the DNA shows motions of great amplitude and localized by the chain. The motions are even capable to open a single base pair on its biological temperature. This behavior is related to functional aspects of the molecule, like transcription and replication. In this work, we aim to understand this dynamic through the creation of breathers and its stability in the Peyrard-Bishop model. We study the in uence of the energy change in a stable breather solution. By the dynamic of the model, we infer the energy density that is needed to happen the phase transition in the system, that is, the DNA denaturation in a minimalistic view. In the sequence, we use atomistic molecular dynamics to relate the mechanical model with the in silico dynamic of the system. In the end, we verify the DNA double helix instability through induced torsional stress / Doutor

Resumo: Mastoparanos são uma família de peptídeos líticos, extraídos do saco de veneno de vespas sociais, que apresentam moderada a intensa atividade antimicrobiana e alguns são hemolíticos e citotóxicos. Embora o mecanismo de ação destes peptídeos não seja bem compreendido ainda, aceita-se que envolva desestabilização da fase lipídica da membrana celular. Acredita-se que a carga líquida do peptídeo e sua hidrofobicidade média contribuam na modulação da atividade lítica e na seletividade. Nesta dissertação apresentamos um estudo de quatro peptídeos mastoparanos que possuem resíduos ácidos e básicos resultando em uma carga elétrica líquida variando de +1 a +4. Este estudo envolve a análise conformacional destes peptídeos em vesículas zwitteriônicas e aniônicas por dicroísmo circular. Suas atividades líticas foram avaliadas usando espectroscopia de fluorescência monitorando a recuperação da intensidade de fluorescência devido à liberação de marcador fluorescente encapsulado em vesículas. As constantes de partição destes peptídeos em vesículas zwitteriônicas foram também determinadas por espectroscopia de fluorescência usando um método de análise que é independente de modelo. Com o objetivo de entender a influência de resíduos ácidos e a carga líquida dos peptídeos e sua hidrofobicidade na interação peptídeo-lipídio, foram estimadas as contribuições energéticas eletrostáticas e não eletrostática. Para alcançar este objetivo, os resultados obtidos nas isotermas de ligação por fluorescência foram associados com medidas de potencial zeta. Foi observado que a afinidade destes peptídeos em vesículas zwitteriônicas decresce com a carga líquida do peptídeo e as curvas de dose-resposta são mais cooperativas para os dois peptídeos com as cargas mais baixas. Os peptídeos com maior carga apresentaram uma maior afinidade... (Resumo completo clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Mastoparans are a family of lytic peptides extracted from the venom sac of wasps which present moderate to intense antimicrobial activity and some of them are hemolytic and cytotoxic. Although the mechanism of action of these peptides are still not completely understood, it is accepted that it involves the destabilization of the lipidic phase of the cell membrane. It is believed that both the peptide net electrical charge and its mean hydrophobicity contribute to modulate their lytic activity and selectivity. In this dissertation we present a study of four mastoparan peptides which have acidic and basic residues resulting in net electrical charges ranging from +1 to +4. This study involves the conformational analysis of these peptides in zwitterionic and anionic lipid vesicles by circular dichroism. Their lytic activities were evaluated using fluorescence spectroscopy by the release of fluorescent dye entrapped in these two types of vesicles. The partition constants of these peptides to zwitterionic vesicles were also determined by fluorescence spectroscopy using a method of analysis which is model independent. Aiming to understand the influence of acidic residues and of the peptides net charge and hydrophobocity on the peptide-lipid interaction, the electrostatic and non electrostatic energetic contributions were estimated. To achieve this goal it was used the association of the results of fluorescence binding isotherms and zeta potential measurements. It was observed that the affinity and lytic activity of these peptides in zwitterionic vesicles decrease with the peptides net electrical charges and the dose-response curves are more cooperative for the two peptides with lower net charges. The more charged peptides exhibit higher affinity and lytic activity in anionic vesicles. The most charged peptide displayed the higher selectivity for the vesicles studied. The present work... (Complete abstract click electronic access below) / Orientador: João Ruggiero Neto / Coorientador: Marcia Perez dos Santos Cabrera / Banca: Bibiana Monson de Souza / Banca: Marcelo Andrés Fossey / Mestre

Orientador: Rejane Maria Tommasini Grotto / Banca: Dennis Armando Bertolini / Banca: Giovanni Faria Silva / Resumo: O vírus da Hepatite C (VHC) é um importante patógeno associado com doença hepática crônica sendo que alguns infectados podem desenvolver cirrose e carcinoma hepatocelular. O tratamento da hepatite C crônica visa a resposta virológica sustentada (RVS), definida como níveis de RNA viral indetectáveis no soro por seis meses depois do término do tratamento. Atualmente, a terapia padrão ouro é a combinação de interferon α peguilado e ribavirina, porém esse esquema terapêutico vem se mostrando eficaz em, apenas, 50% dos pacientes infectados com o genótipo 1, o mais prevalente no Brasil. Portanto, novas drogas mais eficazes e menos tóxicas estão sendo desenvolvidas para melhorar a assistência aos pacientes infectados pelo VHC, entre as quais merecem destaque os inibidores da serina protease NS3, a qual é uma enzima essencial para a replicação do VHC e assim um potencial alvo para novas terapias antivirais. Entretanto, a emergência de variantes resistentes é o maior obstáculo para o sucesso da terapêutica. Variantes resistentes já foram isoladas em pacientes tratados com os inibidores de protease e, estão associadas com a falência terapêutica. Porém o impacto dessas variantes resistentes em pacientes virgens de tratamento ainda não foi esclarecido e, esse tipo de informação pode avaliar o impacto dos inibidores de protease na terapia antiviral. O objetivo deste estudo foi avaliar a presença de mutações de resistência e polimorfismos genéticos na região genômica NS3 do VHC em 37 pacientes virgens de tratamento com inibidores de protease infectados com genótipo 1. RNA viral sérico foi utilizado como fonte para amplificação e seqüenciamento da região NS3 do VHC e, avaliar a presença de mutações de... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The Hepatitis C Virus (HCV) is an important pathogen associated with chronic hepatic disease and some infected patients can develop cirrhosis and hepatocellular carcinoma. The treatment of chronic hepatitis C aimed the sustained virological response (SVR), defined as having undetectable serum HCV RNA at the end of therapy for at least 6 months. Currently, the gold standard therapy is a combination of pegylated interferon-α and the ribavirin, however this treatment present efficacy in only 50% of patients infected with genotypes 1, the most prevalent in Brazil. Then, new drugs more effective and less toxic have been developed to improve the attendance of the HCV infected patients as the serine protease NS3 inhibitors, which is an enzyme essential to HCV replication and main target of new antiviral therapies. However, the emergence of drug resistant variants has been the major obstacle to therapeutic successful. Resistant variants have already been isolated in patients treated with protease inhibitors and, these resistant variants are associated with non response to treatment. But the impact of the resistant variants in naïve protease inhibitors patients is unclear yet and, this information can evaluate the impact of protease inhibitors in antiviral therapeutic. The goal of this study was evaluate the presence of resistance mutations and genetic polymorphisms in the NS3 genomic region of HCV in 37 protease inhibitors-naive genotype 1 HCV infected patients. Serum viral RNA was used as source to amplification and sequencing of NS3 region of HCV and, evaluates the presence of resistance mutations and polymorphisms in this region. The results showed that only 07 (18.9%) samples presented resistant variants, the mutations... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Mário Tyago Murakami / Coorientador: Camila Ramos dos Santos / Banca: José Ramon Abrego / Banca: Roberto Ruller / Resumo: Esta dissertação aborda o estudo de duas proteínas, uma β-1,3-1,4-glicanase (EC 3.2.1.73) de Bacillus subtilis 168 (liquenase) e outra α-L-arabinofuranosidase (E.C. 3.2.1.55) da família GH51 de Thermotoga petrophila RKU-1, ambas com potenciais aplicações biotecnológicas. A liquenase é responsável pela catálise da clivagem de β-D-glicanas unidas por ligações tipo 1,3 e 1,4, por outro lado a arabinofuranosidase de estudo é responsável pela hidrólise de resíduos α-1,2, α-1,3 e α-1,5-L-arabinofuranosil e age em combinação com outras enzimas para despolimerização de arabinose em polissacarídeos. Neste sentido, este trabalho teve como objetivo realizar estudos estruturais e biofísicos dessas duas proteínas com o intuito de obter informações moleculares importantes que pudessem contribuir para utilização das mesmas em processos biotecnológicos, como o pré-tratamento da biomassa lignocelulósica por exemplo. Desta forma, foi verificado que a liquenase apresenta massa molecular de 28 kDa, mostra um enovelamento típico de membros da família GH16 com estrutura β-jelly e mostrou uma termotolerância reduzida, abaixo de 50°C. Por outro lado, a arabinofuranosidase é uma enzima termofílica com massa molecular de 57 kDa e com a presença de dois domínios: um domínio catalítico com enovelamento barril (α/β) e um domínio C-terminal β-sanduíche, que possui um motivo β-hairpin único para arabinofuranosidases encontradas no gênero Thermotoga. Desta forma, foi possível concluir que a liquenase de estudo é uma enzima monomérica e que sua reduzida termotolerância limita sua aplicação em processos industriais acima de 50°C. Desta forma, esta é uma candidata a estudos de engenharia de proteínas. E com relação a arabinofuranosidase, possui uma estrutura hexamérica, quando em solução, e sua elevada estabilidade térmica sugere que esta é uma forte candidata a futuras aplicações industriais / Abstract: This paper describes two proteins, β-1,3-1,4-glucanase (EC 3.2.1.73) from Bacillus subtilis 168 (lichenase) and α-L-arabinofuranosidase (EC 3.2.1.55) family GH51 from Thermotoga petrophila RKU-1, both with potential biotechnological applications. The lichenase is responsible for cleavage of β-D-glucans joined by linkages type 1.3 and 1.4, on the other hand arabinofuranosidase is responsible for the hydrolysis of α-1.2, α-1.3 and α-1.5-L-arabinofuranosyl radicals and acts synergistically with others enzymes for arabinose depolymerization of polysaccharides. Therefore, this study aimed to perform structural and biophysical studies of these two proteins in order to obtain important molecular information that could help biotechnological processes by application of these enzymes, such as the pretreatment of lignocellulosic biomass. Thus, it was found that the lichenase molecular mass was 28 kDa and showed a typical folding members of the family GH16 with structure β-jelly and showed a reduced thermotolerance, below 50°C. Moreover, arabinofuranosidase, a thermophilic enzyme, showed molecular mass of 57 kDa and displayed two domains: a folding barrel with the catalytic domain (α/β) and a C-terminal domain β-sandwich, which had a motif β-hairpin unique for arabinofuranosidases found in the genus Thermotoga. Therefore, it was concluded that the lichenase is a monomeric enzyme and that its reduced thermotolerance feature limits its application in industrial processes, above 50°C. So, this is a candidate for future studies of protein engineering. Regarding the arabinofuranosidase, revealed a hexameric structure, when in solution, and its high thermal stability suggests that this is a strong candidate for future industrial applications / Mestre