Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000400977-Texto+Completo-0.pdf: 4539357 bytes, checksum: a454d83262e33e9f70ab585e6cbbdd44 (MD5) Previous issue date: 2008 / The reemergence of tuberculosis is a current public health problem. The World Health Organization (WHO) reported in 2006 that 2 billion people, or one-third of the world’s total population, are infected with the bacilli Mycobacterium tuberculosis (MTB), and in 2007 reported that 1. 6 million people died from TB in 2005. Multidrug-resistant TB (MDR-TB) and extensively drug-resistant TB (XDR-TB) are forms of TB that does not respond to the standard drug treatment. Isoniazid (INH, isonicotinic acid hydrazide) is one of oldest synthetic antitubercular drugs. The mechanism of action of INH is complex, as mutations in at least five different genes (katG, inhA, ahpC, kasA, and ndh) have been found to correlate with INH resistance. Pentacyano(isoniazid)ferrate II (PIF) is a rational drug design effort to find alternative drugs capable of inhibiting InhA. It was found that PIF inhibit both wild type and isoniazid-resistant I21V mutants of InhA and this inactivation does not require activation by KatG. In this work we report the results of two molecular dynamics simulations of PIF-InhA interaction considering all atoms of this complex in aqueous solution. The results demonstrated that PIF strongly interacts with InhA and these interactions cause macromolecular instabilities due to substrate binding site perturbation. These instabilities are reflected in the long time necessary for trajectory convergence. Besides this, we observed that the residues Gly14, Ile15, Ile16, Ser20, Gly40, Phe41, Ile47, Ser94 and Thr196 of InhA are responsible for the PIF-InhA association. So, we conclude that PIF competes directly for the NADH binding site and indirectly with the substrate binding site. / A re-emergência da tuberculose é um problema de saúde pública mundial. A Organização Mundial da Saúde (OMS) estima que, em 2006, cerca de 2 bilhões de pessoas, ou um terço da população mundial, foram infectadas com o bacilo Mycobacterium tuberculosis (MTB), e em 2007 relata que 1,6 milhões de pessoas morreram de tuberculose (TB) no ano de 2005. O surgimento das formas de TB resistente a múltiplas drogas (MDR-TB) e extensivamente resistente a drogas (XDR-TB), as quais não respondem ao tratamento convencional, colaboram para este crescimento. A Isoniazida (INH, hidrazida do ácido isonicotínico) é uma das drogas sintéticas mais antigas, e seu mecanismo de ação é complexo. Mutações em pelo menos cinco genes diferentes (katG, inhA, ahpC, kasA, e ndh) foram correlacionadas com a resistência a INH. O complexo inorgânico Isoniazida-pentacianoferrato (IPF) é o resultado do desenho racional de drogas na tentativa de achar uma alternativa capaz de inibir a InhA. O IPF é capaz de inibir os tipos selvagem e o mutante I21V da InhA, resistente à INH, e esta inativação não requer ativação por KatG. Neste trabalho, realizamos duas simulações por dinâmica molecular do complexo IPF-InhA, utilizando todos os átomos em solução aquosa, com o objetivo de investigar os eventos moleculares relacionados ao modo de interação droga-alvo e suas afinidades. Observamos que o IPF interage fortemente com a InhA e estas interações causam instabilidades na macromolécula devido a perturbação no sítio de ligação do substrato. Estas instabilidades se refletem no longo tempo necessário para a convergência da trajetória. Observamos também que os resíduos Gly14, Ile15, Ile16, Ser20, Gly40, Phe41, Ile47, Ser94 e Thr196 são os responsáveis por intermediar a associação IPF-InhA. Concluímos então que o IPF compete diretamente com o NADH pelo seu sítio de ligação e indiretamente com o substrato através da desestabilização do seu sítio de ligação.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000422143-Texto+Completo-0.pdf: 659009 bytes, checksum: 4a462f7c36025ba4acbf746909b37608 (MD5) Previous issue date: 2009 / The purpose of this study was to evaluate the anti-inflammatory, immunomodulatory and cytotoxic effect of the compound derivative of 4-tioxopirimidinas denominated RDV 8. In order to investigate RDV 8 anti-inflammatory effect, the model used was pleurisy induced by carrageenan in rats, where the parameters of the acute phase of inflammation were evaluated. In the in vitro model, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs from humans ) culture was used to investigate both the cytotoxic action and the immunomodulatory effect of RDV 8. In the in vivo model, 30 female Wistar rats were used divided in control and experimental groups. Half hour (30min) after the intraperitoneal injection of RDV 8, 3. 0 mg/Kg, carrageenan (0. 2mL, 1%) was injected in the pleural cavity to cause inflammation. After 4 hours the pleural liquid was aspirated and the volume of exudate, total and differential leukocytes were counted and protein concentration and nitric oxide (NO) were measured. In the cell culture model of mononuclear cells, we used blood samples from 6 healthy individuals, between 17 and 40 years olds. These cells were distributed in 11 groups, 5 for cytotoxic assessment and 6 for immunomodulatory research. After 96 hours (4 days) the cells were counted and their supernatants were withdrawn, in order to assess concentrations of interleukin (IL) 1 and 6 and the monocyte chemotactic protein 1 (MCP-1 or CCL2). In the pleurisy model, RDV 8 significantly reduced (P<0. 05) all variables except the number of polymorphonuclear cell (PMNs). The cytotoxic tests presented no significant change in the concentrations used, but there was a significant immunosuppressant effect (P<0. 05) in immunomodulatory tests. There was a decrease in MCP-1 and a increase in IL-6 in the RDV 8 concentration of 0. 1μg/ml. These results indicate a high immunomodulatory and anti-inflammatory action of RDV 8 without any cytotoxic action on the concentrations used in these experiments. / A proposta deste estudo foi avaliar o efeito antiinflamatório, imunomodulador e citotóxico do composto derivado de 4-tioxopirimidinas denominado RDV 8. Para investigar o efeito antiinflamatório usou-se o modelo de pleurisia induzida por carragenina em ratos, onde foram avaliados os parâmetros da fase aguda da inflamação. No modelo in vitro foi utilizado o método de cultura de células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) humano, tanto para investigar a ação citotóxica quanto o efeito imunomodulador do RDV 8. No modelo in vivo foram utilizadas 30 ratas Wistar divididas em grupos controle e experimental. Meia hora (30min) após a injeção intraperitonial de RDV 8 (3,0 mg/kg) a carragenina (0. 2mL) foi injetada na cavidade pleural para causar inflamação. Após 4 horas o volume de exudato, leucócitos totais e contagem diferencial, concentração de proteínas e óxido nítrico (NO) foram mensurados no liquido pleural aspirado. No modelo de cultura de células foram utilizadas células mononucleares de 6 indivíduos saudáveis, na faixa entre 17 e 40 anos. Estas células foram distribuídas em 11 grupos, 5 para avaliação citotóxica e 6 para investigação imunomoduladora. Após 96 horas (4 dias) as células foram contadas e retirados seus sobrenadantes, a fim de avaliar as concentrações de interleucinas-1 (IL-1) e (IL-6) e a proteína-1 quimioatraente de monócitos (MCP-1 ou CCL2). Na pleurisia o RDV 8 reduziu significativamente (P<0,05) todas as variáveis inflamatórias exceto o numero de células polimorfonucleares (PMNs). Em nenhum dos testes de citotoxicidade ocorreu morte celularsignificativa nas concentrações utilizadas, mas nos testes de imunossupressão houve uma significante (P<0,05) imunossupressão (antilinfoproliferação), diminuição de MCP-1 e aumento da IL-6 na concentração de 0,1μg/mL. Esses resultados indicam uma ação antiinflamatória e imunomoduladora do RDV 8, não apresentando ação citotóxica nas concentrações utilizadas nos experimentos.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000439240-Texto+Completo-0.pdf: 319940 bytes, checksum: 78e312c8115e9e5356969e795047faba (MD5) Previous issue date: 2012 / Although Parkinson’s Disease (PD) is predominantly a movement disorder, the presence of cognitive problems related to frontal function, even in the earliest stages has been observed. These problems include attentional, executive and memory deficits. A study using an experimental paradigm developed to investigate the effects of different encoding instructions on contextual memory showed that, unlike healthy controls, PD patients could not reverse their contextual memory deficits and take any advantage of encoding instructions. However, it is unclear whether they have a memory deficit or executive dysfunction would be accountable for results. Attentional and executive deficits observed in PD patients have important implications for daily activities, mainly when patient perform concomitant cognitive and motor activities that are attention demanding. Catechol- O-methyltransferase (COMT) is an enzyme that degrades cortical dopamine. Some studies have examined the relationship between the COMT val158met polymorphism and executive function in PD patients and have found low enzyme activity, associated to met/met polymorphism- implying higher prefrontal dopamine levels- is related to worse performance. However, a recent study did not demonstrate a direct effect of COMT genotype on the executive performance. The present study aimed to characterize different cognitive parameters of patients with PD and to assess their relationship with the COMT polymorphism. In this study participated 18 patients with early disease stage PD and 18 healthy adults matched for age, gender and education. Patients were selected from a data bank of patients genotyped for COMT polymorphism. All participants completed the Wisconsin Card Sorting Test (WCST), the Stroop Color and Word Test, and dual tasking paradigm. In addition, patients completed a contextual memory paradigm. No effect of COMT val158met genotype on frontal function in patients with PD (executive function and contextual memory) was observed. A decrease in cognitive task performance under dual-tasking was observed in PD patients, by contrast to healthy controls. Relative dual-task cognitive cost was significantly greater for PD patients compared to controls in the arithmetic-walking condition. In conclusion, difficulties in performing a cognitive task while walking can be influenced by the executive/attentional load of the task. / Embora a Doença de Parkinson (DP) seja predominantemente um distúrbio do movimento, a presença de alterações cognitivas relacionadas à função frontal tem sido observada mesmo nos estágios iniciais da doença. Estas alterações incluem déficits atencionais, executivos e de memória. Um estudo usando um paradigma experimental desenvolvido para investigar os efeitos de diferentes instruções codificadoras na memória contextual mostrou que, ao contrário dos idosos, pacientes com DP não são capazes de reverter seus déficits de memória e não tiram nenhuma vantagem das instruções codificadoras. Entretanto, ainda não está claro se estes pacientes têm um déficit de memória ou se as disfunções executivas seriam as responsáveis pelos resultados observados. Déficits atencionais e executivos observados em pacientes com DP têm implicações importantes nas atividades diárias, principalmente quando o paciente desempenha atividades concomitantes cognitivas e motoras que requerem atenção. A catecol- O-metiltransferase (COMT) é uma enzima que degrada a dopamina cortical. Alguns estudos têm examinado a relação entre o polimorfismo val158met da COMT e função executiva em pacientes com DP e têm observado que a atividade reduzida da enzima, relacionada ao polimorfismo, que implica em maiores níveis de dopamina no córtex pré-frontal, está associada a uma pior performance. Entretanto, um estudo recente não demonstrou um efeito direto do genótipo da COMT no desempenho executivo. O presente estudo teve por objetivo caracterizar diferentes parâmetros cognitivos de pacientes com DP e verificar sua relação com o polimorfismo da COMT. Neste estudo participaram 18 pacientes em estágios iniciais da DP e 18 adultos saudáveis, pareados por idade, gênero e nível educacional. Os pacientes foram selecionados de um banco de pacientes genotipados para o polimorfismo da COMT. Todos os participantes completaram o Teste de Classificação de Cartas de Wisconsin, o Teste de Stroop e o paradigma para avaliação da realização de tarefas simultâneas. Adicionalmente, os pacientes com DP completaram o paradigma de memória contextual. Não foi observado efeito do polimorfismo val158met da COMT sobre a função frontal (função executiva e memória contextual) dos pacientes com DP. Os pacientes apresentaram um declínio cognitivo na realização das atividades simultâneas, ao contrário dos controles. O custo cognitivo associado à realização da tarefa aritmética juntamente à caminhada foi significativamente maior para os pacientes com DP, em relação aos controles. Em conclusão, as dificuldades em realizar uma atividade cognitiva e motora simultaneamente podem ser influenciadas pela carga executiva/atencional da atividade.

Em todo o mundo, menos de 5% dos doentes com tuberculose (TB), sejam casos novos ou previamente tratados, tem a avaliação dos isolados quanto ao perfil de sensibilidade aos antibioticos. No Rio Grande do Sul, estado localizado no sul do Brasil, cerca de 4700 casos novos de TB são registrados a cada ano, com uma taxa de cura de 68,9%, e uma taxa de abandono de 7,5%. A identificação rápida da resistência às drogas, em isolados clínicos de M. tuberculosis é importante para o estabelecimento de uma quimioterapia eficaz bem como para evitar a propagação de cepas resistentes. Os objetivos deste estudo foram caracterizar os pacientes de TB com maior risco de possuir TB-­‐MDR, analisando o perfil de resistência às drogas dos isolados e o perfil epidemiológico desses pacientes. Além disso utilizou-­‐se as amostras clínicas para avaliar o teste comercial (GenoType® MTBDRplus) e para desenvolver e padronizar um novo teste (Detect-­‐TBMR) para detectar as mutações mais frequentes associadas a resistência à INH e RIF. Uma proporção significativamente maior (75% versus 20%, p = 0,009) de pacientes do gênero masculino foi encontrada entre os casos resistentes às drogas do que entre os casos suscetíveis. 43,8% dos pacientes demoraram mais de 30 dias para procurar assistência médica e no grupo TB MDR, 25% dos casos não tinha sido submetido a qualquer tratamento prévio anti-­‐TB. Em nossas amostras, encontramos uma proporção de 48,3% de TB-­‐ MDR. A família T foi a família de spoligotipo mais frequente. Comparado com o método da proporções, a sensibilidade e especificidade do ensaio MTBDRplus foram 82% e 94% para a resistência à RIF, 60% e 94% para resistência à INH. Comparado com sequenciamento, a sensibilidade e especificidade do ensaio MTBDRplus foi 92% e 97% para a resistência à RIF e 100% e 100% para a resistência à INH, respectivamente. Para detectar resistência à RIF e INH, o ensaio Detect-­‐TBMDR mostrou sensibilidade e especificidade de 79,3% e 77,0% e 100% e 65%, respectivamente, em comparação com o método da proporções. Comparado com o sequenciamento, a sensibilidade e especificidade do ensaio Detect-­‐TBMDR foi de 81,2% e 94,7% e 100% e 96,2%, para detectar e resistência à RIF e INH, respectivamente. Ainda existem discordâncias entre o método das proporções e a abordagem molecular, particularmente em relação a resistência à INH. Contudo, estes métodos são muito importantes para o manejo mais rápido e correto dos pacientes, auxiliando na escolha do melhor esquema terapêutico. / In most parts of the world, less than 5% of new and previously treated tuberculosis (TB) patients are tested for multidrug resistance (MDR) TB. In Rio Grande do Sul state, the southern most Brazilian state; approximately 4700 new cases of TB are recorded each year, with a cure rate of 68.9%, and a noncompliance rate of 7.5%. Rapid identification of drug resistance in clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis is important to facilitate rapid and adequate chemotherapy of TB, and to prevent the spread of resistant strains. The aim of this study was to characterize TB patients at higher risk of having MDR-TB, to analyze the drug resistance and epidemiological profile of these patients. Use the clinical samples to assess the commercial test (GenoType® MTBDRplus) and develop and standardize a new test (Detect-MDRTB) for detecting the most frequent mutations associated with resistance to INH and RIF. A significantly higher proportion (75% versus 20%, p = 0.009) of males were found among drug-resistant cases than drug susceptible cases. 43.8% of patients took longer than 30 days to seek medical care and in the MDR group 25% of the cases did not undergo any previous anti-TB treatment. In our samples we found a proportion of 48.3% of MDR-TB. The T family was the most frequent spoligotype family. Compared with the proportion method, the sensitivity and specificity of the MTBDRplus assay were 82% and 94% for RIF-resistance, 60% and 94% for INH resistance. Compared with sequencing, the sensitivity and specificity of the MTBDRplus assay were 92% and 97% for RIF-resistance, 100% and 100% for INHresistance. To detect RIF and INH-resistance, the Detect-TBMDR assay showed a sensitivity and specificity of 79.3% and 77.0%, and 100% and 65%, respectively, compared to proportion method. When compared with sequencing, Detect-TBMDR assay, to detect RIF and INH-resistance, showed a sensitivity and specificity of 81.2% and 94.7% and to 100% and 96.2%, respectively. Discordances still exist between the proportion method and molecular approach, particularly regarding INH-resistance. However, these methods are very important for the management faster and correct patient, helping to choose the best treatment regimen.

O tratamento com antimicrobianos é a principal estratégia de controle da tuberculose (TB). Entretanto, o aumento do número de casos de TB com cepas de Mycobacterium tuberculosis resistente aos antimicrobianos cria um cenário que dificulta a cura do paciente e o controle da doença. Embora várias mutações em loci específicos tenham sido identificadas como base de resistência, outros mecanismos, como o sistema de efluxo, podem contribuir para a resistência e o estabelecimento dessas mutações. O objetivo deste estudo foi avaliar a contribuição do mecanismo de efluxo em isolados clínicos de M. tuberculosis resistentes aos principais antimicrobianos do esquema básico (isoniazida, INH; e rifampicina, RIF) e de multirresistência (ofloxacina, OFX; e amicacina, AMK). Três clássicos inibidores de bombas de efluxo - EPI - (verapamil, VP; tioridazina, TZ; e clorpromazina, CPZ) foram selecionados para detectar o efluxo. Primeiramente, foram analisadas três cepas MDR, duas pré-XDR e a cepa sensível de referência H37Rv. Foi utilizada a metodologia de checkerboard combinada com o tetrazolium microplate-based assay para analisar a interação entre os EPIs com os fármacos. Foi observado que os EPIs diminuem efetivamente a resistência aos antibióticos utilizados, com reduções de 4 a 64 vezes. Para avaliar a atividade do efluxo em tempo real foi utilizado o método fluorimétrico com o brometo de etídio (BrEt), em presença dos EPIs. Foi demonstrado que todas as cepas apresentaram efluxo intrínseco, porém a acumulação e o efluxo do BrEt foi mais evidente na cepa pre-XDR com resistência adicional a AMK. A quantificação transcricional do RNAm dos genes de bombas de efluxo (mmpl7, mmr, Rv1258, p55, efpA, Rv2459) e do regulador transcricional whib7, quando as cepas foram expostas às concentrações subinibitórias dos antibióticos, foi analisada por RT-qPCR. Houve um aumento do nível transcricional de todos os genes em uma cepa MDR e na cepa Pre-XDR com resistência adicional a OFX, quando expostas a pelo menos um dos fármacos envolvidos na resistência. / Treatment with antimicrobials is the main TB control strategy. However, the increase in the number of TB cases with Mycobacterium tuberculosis strains resistant to antimicrobial creates a scenario that hinders patient's healing and disease control. Although several genetic mutations in specific loci involved in drug resistance have been identified as base of resistance, other mechanisms such as efflux system may contribute to resistance and to the establishment of these mutations. The main goal of this study was to assess the overall contribution of efflux mechanism in M. tuberculosis clinical isolates resistant to the main first line drugs (isoniazid, INH; and rifampicin, RIF) and second line (ofloxacin, OFX; and amikacin, AMK). Three classical inhibitors of efflux pumps -EPI- (verapamil, VP; thioridazine, TZ; and chlorpromazine, CPZ) were selected to detect the efflux. Firstly, we analyzed three MDR strains, two Pre-XDR and an H37Rv reference susceptible strain. We used the checkerboard method combined with the tetrazolium microplate-based assay to analyze the interaction between EPIs and drugs. It was observed that EPIs effectively reduce the MIC of antibiotics, with four-fold to 64-fold reduction. Efflux activity was evaluated in real-time by fluorimetric method with ethidium bromide (EtBr), in the presence of EPIs. All strains showed intrinsic efflux, however the accumulation and efflux of EtBr was evident most in the pre-XDR strain with additional resistance to AMK. The quantification of mRNA transcriptional level of efflux pump genes (mmpl7, mmr, Rv1258, p55, efpA, Rv2459) and the transcriptional regulator, whib7, when strains were exposed to antibiotics subinibitory concentrations was examined by RT-qPCR. There was an increase in the transcriptional level of all genes in a MDR strain and pre-XDR strain with additional OFX resistance, when exposed to at least one of the drugs involved in resistance, INH, RIF or OFX. However, there was no correlation between the reduction of antibiotic resistance levels with the EPI and the expression of genes encoding the pumps. Finally, in order to demonstrate the time to detection (TTD) of the bacterial growth in the antimicrobial environment in presence and absence of EPI, were applied BACTECTM MGITTM system 960 and Epicenter V5.53A equipped with software TB eXiST. Were used the MDR strains, a pre-XDR strain with additional resistance to AMK, and a monorresistant to OFX strain. In general, strains have showed a slower grew in the presence of VP, TZ and/or CPZ when combined with INH or RIF. This suggests that efflux is essential for the strain to grow faster in the presence of certain antibiotics. In addition, the efflux can act synergistically with the presence of mutations in order to reduce the biological cost of the bacteria and promoting growth at high drug concentrations. In conclusion, the described results demonstrated that the efflux system plays an important role in resistance to antibiotics used in the treatment of TB, and that the use of efflux inhibitors may potentiate the antimicrobial activity.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, 2014. / Submitted by Josina da Silva Vieira (josinasv1990@gmail.com) on 2014-07-17T14:56:19Z No. of bitstreams: 3 2014_Guilherme Menegói Ribeiro.pdf: 8299224 bytes, checksum: e7fc821d4f808367de0b3df8039d1138 (MD5) 2014_Guilherme Menegói Ribeiro.pdf: 8299224 bytes, checksum: e7fc821d4f808367de0b3df8039d1138 (MD5) 2014_Guilherme Menegói Ribeiro.pdf: 8299224 bytes, checksum: e7fc821d4f808367de0b3df8039d1138 (MD5) / Rejected by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br), reason: Josina, Por favor, excluir os arquivos duplicados. Obrigada! Jacqueline on 2014-07-18T14:39:10Z (GMT) / Submitted by Josina da Silva Vieira (josinasv1990@gmail.com) on 2014-07-18T14:44:07Z No. of bitstreams: 1 2014_Guilherme Menegói Ribeiro.pdf: 8403115 bytes, checksum: 8a074a463a04e8f0e656e5023f02c793 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-07-18T15:43:11Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_Guilherme Menegói Ribeiro.pdf: 8403115 bytes, checksum: 8a074a463a04e8f0e656e5023f02c793 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-07-18T15:43:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_Guilherme Menegói Ribeiro.pdf: 8403115 bytes, checksum: 8a074a463a04e8f0e656e5023f02c793 (MD5) / As microbactérias de crescimento rápido (RGM) têm implicações importantes em patologias humanas, sendo relacionadas à infecções oportunistas. Desde sua descrição em 2004, os casos clínicos associados a Mycobacterium massiliense, uma espécie representativa do grupo das RGM, tem sido crescentemente reportados. Com o aumento dos surtos causados por essas bactérias, o desenvolvimento de novas técnicas de detecção de espécie e de predição de padrões de susceptibilidade e essencial para o controle e ciente de suas infecções. O objetivo deste trabalho e utilizar a genômica comparativa para traçar umperfil do funcionamento biológico e dos mecanismos de virulência de M. massiliense, facilitandoa descoberta de moléculas de interesse. A estirpe GO 06 de M. massiliensefoi isolada durante o surto ocorrido no período entre 2005 e 2007 em Goiás, na região central do Brasil, e teve seu genoma seqüenciado pela plataforma de seqüenciamento de alto desempenho 454 GS-FLX Titanium (Roche). Foi possível montar o genoma completo da estirpe GO 06, constituído por seu cromossomo e dois plasmídos, bem como anotar a maioria das suas ORFs preditas (3.491 ORFs, representando 84,5% do total identificado), com a identificação de 826 genes relacionados a virulência. Também foi possível identificar 46 tRNAs e um único operon de rRNA. As vias metabólicas relacionadas aos sistemas de secreção bacterianos e a bioissíntese de sideróforos de M. massiliense GO 06, geralmente envolvidas na patogenicidade microbacteriana, foram descritas in silico. 15 genes relacionados ao T7SS também foram identificados no genoma do isolado GO 06, sugerindo a existência dos sistemas ESX-3 e ESX-4. Os dados gerados neste projeto fornecem informações importantes para o desenvolvimento de estratégias de controle de surtos relacionados as RGM, sendo disponibilizados em uma página hospedada no domínio público da Universidade de Brasília. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Rapid growing mycobacteria (RGM) have important implications in human diseases, being often related to opportunistic infections. Since its description in 2004, clinical cases related to Mycobacterium massiliense, a representative species of the RGM group, have been increasingly reported. With the increase of outbreaks related to these bacteria, the development of new species detection and susceptibility pattern prediction techniquesis essential for the efficient control of their infections. The goal of this project is touse comparative genomics to trace the biological functioning and virulence mechanisms pro_les of M. massiliense, facilitating the discovery of molecules of interest. The strain GO 06 of M. massiliense was isolated during the outbreak that occurred between 2005 and 2007 in Goias, in the midwest region of Brazil, and had its entire genome sequence dusing the 454 GS-FLX Titanium (Roche) high-throughput sequencer. It was possibleto construct strain GO 06's entire genome, which was comprised of its chromosome and two plasmids, and annotate the majority of its predicted ORFs (3.491 ORFs, 84,5% of all identified ORFs), with the identication of 826 genes related to virulence. It was also possible to identify 46 tRNAs and a single rRNA operon. M. massiliense GO 06'smetabolic pathways regarding bacterial secretion systems and siderophore biosynthesis,usually involved in mycobacterial pathogenicity, were described in silico. 15 genes related to T7SS were also identied in isolate GO 06's genome, suggesting the existence of ESX-3and ESX-4 systems. The data generated in this project represents useful information inthe development of control strategies of outbreaks related to RGM, being made availablein a webpage hosted in the public domain of University of Brasília.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ceilândia, Programa de Pós-Graduação em Ciências e Tecnologias em Saúde, 2014. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2014-10-14T21:29:48Z No. of bitstreams: 1 2014_AmandaLiraNogueiraBarros.pdf: 3370997 bytes, checksum: 85117556d8ae68f1292b6073cbb5fc91 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-10-15T13:24:45Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_AmandaLiraNogueiraBarros.pdf: 3370997 bytes, checksum: 85117556d8ae68f1292b6073cbb5fc91 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-10-15T13:24:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_AmandaLiraNogueiraBarros.pdf: 3370997 bytes, checksum: 85117556d8ae68f1292b6073cbb5fc91 (MD5) / As proteínas Velvet compreendem quatro membros altamente conservados entre ascomicetos e basidiomicetos, os quais compartilham o domínio Velvet. Eles regulam diferentes vias de sinalização em resposta a estímulos ambientais e também coordenam o metabolismo secundário e diferenciação assexual e sexual em diferentes espécies de fungos. Recentemente, as proteínas Velvet foram implicadas na virulência de alguns agentes patogênicos de plantas. Buscou-se avaliar o papel das proteínas Velvet no fungo patogênico humano Cryptococcus neoformans, causador da criptococose, importante micose sistêmica e a terceira doença mais prevalente em indivíduos portadores do vírus HIV. Entre as micoses sistêmicas, ela é classificada como tendo a maior incidência em pacientes imunocomprometidos. A infecção por C.neoformans ocorre pela inalação de células infecciosas e é considerada uma infecção pulmonar primária, o que pode levar a uma infecção disseminada e meningoencefalite. O objetivo geral do trabalho foi avaliar o papel do gene VELB na patogenidade e morfogênese de C. neoformans. O primeiro passo realizado no estudo foi a deleção do gene VELB em Cryptococcus neoformans. O cassete foi transformado em células leveduriformes haploides de C. neoformans diretamente através de biobalística. Confirmou-se a deleção por PCR e Southern Blot. Após confirmação, os transformantes foram submetidos a diferentes condições de crescimento para determinação de seus fenótipos e virulência. Foram realizados testes de estresse osmótico (NaCl), estresse na parede celular (CongoRed, SDS, cafeína) e estresse oxidativo com peróxido de hidrogênio. Foram avaliados os fatores de virulência de C. neoformans como fosfolipase, urease, melanina e cápsula. Os testes fenotípicos não apresentaram alterações entre a linhagem e mutante indicando que o gene VELB parece não ter nenhum envolvimento em virulência e resposta a agentes estressores. Para avaliação da capacidade de acasalamento foram realizados co-cultivos no escuro em diferentes meios de cultura (Filament, SLAD e MS), além disto foi testada a capacidade de fusão dos mutantes. Estes testes demonstraram que a deleção de VELB bloqueia a produção de hifas no acasalamento entre mutantes e que estes apresentam também defeito no processo de fusão celular. Estes resultados gerados neste trabalho sobre o papel de VELB corroboram os dados anteriormente obtidos pelo nosso grupo de pesquisa de que os membros da família velvet estão diretamente envolvidos na regulação do ciclo sexual de C. neoformans. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The Velvet proteins consist of four highly conserved members in ascomycetes and basidiomycetes, sharing the Velvet domain. They regulate different signaling ways in response to environmental stimulation and also coordinate secondary metabolism and asexual to sexual differentiation in different species of fungi. Recently, Velvet proteins have been implicated in the virulence of some pathogenic agents of plants. It was evaluated the role of Velvet proteins in the human pathogenic fungus Cryptococcus neoformans that causes cryptococcosis, an important systemic mycosis and the third most prevalent disease in HIV positive individuals. Compared to other systemic mycoses, it is classified as having the highest incidence in immunocompromised patients. C.neoformans infection is by inhalation of infectious cells and is considered a primary pulmonary infection, which can lead to widespread infection and meningoencephalitis. The overall objective of this study was to evaluate the role of the VELB gene in morphogenesis and pathogenicity of C. neoformans. The first step was performed at study deletion of the gene VELB in Cryptococcus neoformans. The cassette was transformed into haploid yeast cells of C. neoformans directly through biolistic. The deletion was confirmed by PCR and Southern blot. After confirmation, the transformants were submitted to different growth conditions to determine their phenotypes and virulence. Tests of osmotic stress (KCl, NaCl, sorbitol), stress in the cell wall (Congo Red, Calcofluor, SDS, caffeine) and oxidative stress with hydrogen peroxide were performed. Virulence factors of C. neoformans as phospholipase, urease, melanin and capsule were evaluated. Phenotypic tests showed no change between the strain and mutant indicating that the VELB gene seems to have no involvement in virulence and response to stressors. To evaluate the ability of mating co-cultures were performed in the dark in different culture media (Filament, SLAD and MS), in addition it was tested the ability of fusion of mutants. These tests showed that the deletion of VELB blocks the production of hyphae in mating and that these mutants also exhibit defective cell fusion process. These results generated in this paper about the VELB function corroborate data previously 13 obtained by our research group that the members of the velvet family are directly involved in the regulation of the sexual cycle of C. neoformans.

Tese(doutorado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2011. / Submitted by Sabrina Silva de Macedo (sabrinamacedo@bce.unb.br) on 2012-07-03T15:45:44Z No. of bitstreams: 1 2011_CristianeTeresinhaCitadin.pdf: 2307833 bytes, checksum: 153d8486e61c946638efe8f3e173fc9b (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2012-07-05T18:09:54Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_CristianeTeresinhaCitadin.pdf: 2307833 bytes, checksum: 153d8486e61c946638efe8f3e173fc9b (MD5) / Made available in DSpace on 2012-07-05T18:09:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_CristianeTeresinhaCitadin.pdf: 2307833 bytes, checksum: 153d8486e61c946638efe8f3e173fc9b (MD5) / O feijão-caupi (Vigna unguiculata L. Walp) é uma leguminosa de grande importância na alimentação humana, e tem sido alvo de melhoramento clássico por décadas, no entanto, algumas características, como resistência a estresses bióticos e teores de aminoácidos sulfurados em sementes, ainda não puderam ser incorporados. Nas últimas três décadas, uma série de tentativas foi realizada com intuito de desenvolver protocolos reprodutíveis na geração de feijão-caupi transgênico que permitam a expressão de genes de importância agronômica, especialmente aqueles que não foram incorporados pelo melhoramento clássico. No momento atual, vários pesquisadores têm estabelecido com sucesso procedimentos para transformação genética de feijão-caupi. Neste trabalho é relatada a obtenção de feijão-caupi transgênico resistente ao herbicida Imazapyr. Para isso, foram utilizados vetores contendo um cassete de expressão constitutivo da enzima AtAHAS. Estas plantas foram transformadas pela técnica de biobalística e um total de 16 linhagens transgênicas confirmadas por análises de Southern blot. Bioensaios para determinar a tolerância ao herbicida foram realizados usando diferentes concentrações de imazapyr. Algumas linhagens mostraram alta tolerância, sobrevivendo em até 400g/ha de imazapyr e não apresentando sintomas ao herbicida, demonstrando que o gene Atahas é capaz de gerar tolerância a herbicida a Imazapyr em feijão-caupi. Também é reportado neste trabalho, a introdução do gene de uma δ-zeína do milho (Zea mays) de 18 kDa (dzs18), que é rica em resíduos aminoácidos de metionina. Análises de Southern blot confirmaram a introdução do transgene no genoma da planta em múltiplos loci. No entanto, a segregação na progênie ficou próxima de uma razão de 1:1, sugerindo interferência na produção de gameta. Análises de expressão da proteína em sementes da única planta transgênica segregante foram negativas. Assim sendo, neste trabalho não foi possível analisar aumento dos níveis de metionina na semente. Não é possível concluir ainda o motivo da não expressão da δ-zeína em caupi, necessitando da geração de um número maior de eventos transgênicos segregantes. Dentre as plantas transformadas para expressar o gene dzs18, duas apresentaram fenótipo de esterilidade juntamente com multibrotação, multifloração e escasso número de folhas. Essas observações levaram a questionar se as mutações eram devido ao um efeito do transgene ou de mutagênese insercional, além de questionar que alterações nas flores poderiam estar levando ao fenótipo de esterilidade. Análises de Southern blot mostraram a presença de múltiplas cópias do transgene, aumentando as chances de que o fenótipo observado esteja relacionado com mutagênese insercional. Análise de polens e óvulos mostrou sérias alterações, além de indeiscência das anteras, explicando o fenótipo de esterilidade, concluindo tratar-se de alterações na maturação dos gametas. RT-PCR das folhas confirmou a presença de transcritos do transgene, sugerindo que as alterações podem estar relacionadas também com a expressão da δ-zeína. Os dados gerados não são capazes de confirmar se as mutações se devem ao transgene ou a mutagênese insercional, por isso mais análises precisam ser realizadas, incluindo a geração de mais eventos para esse transgene. Para isso também, bibliotecas de Genome walking foram confeccionadas para futura análise e correlação entre os lócus de inserção do transgene no genoma de feijão-caupi. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The cowpea (Vigna unguiculata L. Walp) is a legume of great importance for human nutrition. Some characteristics, such as resistance to biotic stress and levels of sulfur amino acids in seeds, have not yet been incorporated by the classical breeding. In the last three decades several attempts were made in order to develop reproducible protocols for generation of transgenic cowpea plants, allowing the expression of genes of agronomic importance. At the present, several researchers have successfully established procedures for genetic transformation of cowpea, presenting evidence of stable transgene integration, which segregated in a Mendelian fashion. In this work it is reported the obtaintion of transgenic cowpea lines resistant to the imidazolinone herbicide group. For this, we used vectors containing a cassette for the AtAHAS enzyme constitutive expression. These lines were transformed by the biolistic system and a total of 16 transgenic lines was confirmed by Southern blot analysis. Bioassays to determine the tolerance to herbicide was carried out using different concentrations of imazapyr. Some lines showed high tolerance, surviving to 400g/ha imazapyr and presenting no herbicide symptoms. Different levels of tolerance could not be associated to the integrity of the expression cassette. It is also reported in this paper, the introduction in cowpea of an 18 kDa δ-zein gene of maize (Zea mays), which is rich in methionine amino acid residues. Southern blot analysis confirmed the introduction of the transgene into the plant genome at multiple loci. However, the segregation in the progeny did not occurred as expected, being closed to a segregation ration of 1:1, suggesting interference with the production of gametes. Analysis of protein expression in transgenic seeds of single plant segregating was negative. Thus, was not possible to analyze increased levels of methionine in the seed. It is not yet possible to conclude the reason for the negative expression of δ-zein in cowpea, necessitating the generation more number of segregating transgenic events. Among the plants transformed to express the δ-zein gene, two of then showed a sterility phenotype with multiple formation of both shoots and flowers. In addition, a small number of leaves was also observed. These lines had multiple copies of the transgene integrated into the genome, as observed in the Southern blot analysis, increasing the chances that the observed phenotype is related to insertional mutagenesis. Analysis of pollen and ovules showed serious change, and indehiscence anthers, explaining the phenotype of sterility, concluding that it is changes in the gametes maturation. RT-PCR confirmed the presence of sheets of transcripts of the transgene, suggesting that the changes may also be related to the expression of δ-Zein. The data generated are not able to confirm if mutations are due to the transgene or insertional mutagenesis, so further analysis must be performed, including generation of more transgene events. Genome walking libraries were prepared for further analysis and correlation between the locus of insertion of the transgene in the genome of cowpea.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Instituto de Física, Instituto de Química, Faculdade Unb Planaltina, Programa de Pós-Graduação em Ensino de Ciências, Mestrado Profissional em Ensino de Ciências, 2012. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2012-10-05T12:10:29Z No. of bitstreams: 1 2012_KarllaVieiraDoCarmo.pdf: 2069839 bytes, checksum: cf7b94fbe35ebdb837efd2c3491cf57c (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2012-10-05T12:32:45Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_KarllaVieiraDoCarmo.pdf: 2069839 bytes, checksum: cf7b94fbe35ebdb837efd2c3491cf57c (MD5) / Made available in DSpace on 2012-10-05T12:32:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_KarllaVieiraDoCarmo.pdf: 2069839 bytes, checksum: cf7b94fbe35ebdb837efd2c3491cf57c (MD5) / Uma das limitações nos currículos de ciências está em priorizar o processo de ensino pautado nos seus produtos ao invés de valorizar o entendimento dos processos que norteiam o fazer científico. Considerar as habilidades e procedimentos da investigação científica na prática pedagógica não é uma proposta nova, mas continua sendo negligenciada. Por compreender que essa abordagem é necessária no desenvolvimento de um pensamento reflexivo, esta pesquisa teve como objetivo obter as percepções de um grupo de licenciandos em Ciências Biológicas (n=6) acerca de três habilidades e procedimentos da investigação científica (observação, registro e inferência) a partir de uma sequência didática. Durante a sequência utilizou-se algumas atividades em Biologia Celular em Molecular. Optou-se pela abordagem qualitativa para a análise dos dados e, por meio dos resultados constatou-se que os alunos refletiram sobre tais habilidades e procedimentos, mostrando crescente refinamento em suas percepções. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / One of the limitations science education curricula face relates to a kind of a methodology that stresses the teaching of scientific products instead of the skills and processes that originated them. The teaching of those skills and processes is not a new educational endeavor, however, it is still neglected. To be successful in such approach there is a need to the develop students’ reflexive thought. The aim of this study was to investigate the perceptions of a group of pre-service biology teachers (n=6) about the scientific processes of observation, observation record, and inference developed during a teaching unit. Some cell and molecular activities were part of the unit. The data was analyzed using qualitative methods. The findings show that the students were not only able to reflect about the three processes and skills, but demonstrated greater improvement in their perceptions.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Exatas, Departamento de Ciência da Computação, 2012. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2012-12-13T13:01:52Z No. of bitstreams: 1 2012_FelipeAlmeidaLessa.pdf: 5150375 bytes, checksum: 4edd5817b50694327530a7458871646a (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2012-12-20T12:24:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_FelipeAlmeidaLessa.pdf: 5150375 bytes, checksum: 4edd5817b50694327530a7458871646a (MD5) / Made available in DSpace on 2012-12-20T12:24:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_FelipeAlmeidaLessa.pdf: 5150375 bytes, checksum: 4edd5817b50694327530a7458871646a (MD5) / RNAs não-codificadores (ncRNA) são macromoléculas biológicas que, apesar de não codificarem proteínas, realizam funções regulatórias importante nas células. A ferramenta Infernal é principal referência em buscas de ncRNAs por homologia, e o banco de dados Rfam um dos mais importantes repositórios de ncRNAs. Neste trabalho, mostramos que há clusters de famílias de ncRNAs estruturalmente bem similares no Rfam, adaptamos a ferramenta Infernal com novas distribuições a priori específicas a certos grupos de famílias de ncRNAs baseados nesses clusters e mostramos que essas prioris específicas a certos grupos podem tornar o Infernal mais sensível e específico. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Non-coding RNA (ncRNA) molecules do not code for proteins, but instead play an important regulatory role in cells. Infernal is the main tool for homology searches for ncRNAs, and Rfam is one of the main ncRNA databases. On this work, we show that there are clusters of structurally very similar ncRNA families on Rfam, adapt Infernal with new priors constructed especially for certain groups of ncRNA families (based on these clusters) and show that these group-specific priors may improve Infernal’s specificity and sensitivity.