Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2013. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2013-05-09T16:15:34Z No. of bitstreams: 1 2013_CristianoGuimaraesAmaralPinheiro.pdf: 98196823 bytes, checksum: 92ddc22d9a3c0935f9972f02346c75be (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-05-14T11:22:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_CristianoGuimaraesAmaralPinheiro.pdf: 98196823 bytes, checksum: 92ddc22d9a3c0935f9972f02346c75be (MD5) / Made available in DSpace on 2013-05-14T11:22:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_CristianoGuimaraesAmaralPinheiro.pdf: 98196823 bytes, checksum: 92ddc22d9a3c0935f9972f02346c75be (MD5) / O papel fundamental dos canais catiônicos dependentes de voltagem (VGCC) nos mais diversos organismos baseia-se no seu complexo mecanismo de ativação, i.e a transição entre dois estado fisiológicos funcionais desses canais: ativado/aberto (AT) e desativado/fechado (RT). Logo após a publicação da primeira estrutura cristalográfica do canal de mamífero Kv1.2 na conformação AT, alguns modelos do estado RT tem sido propostos na literatura para este canal. Para todos esses modelos, análises estruturais tem sugerido um consenso com os dados experimentais, destacando portanto a natureza inequívoca dessas estruturas RT. Tomados em conjunto, os estudos estruturais sobre o Kv1.2 são até agora o único conjunto de dados disponível, no nível das interações atômicas, para o entendimento sobre o mecanismo de ativação da superfamília VGCC. Recentemente, a estrutura cristalográfica de um canal de sódio de procarioto, dependente de voltagem (NavAb), foi resolvida numa conformação interpretada como estado pré-ativado do canal. Como um possível ancestral da superfamília dos canais de sódio e cálcio dependentes de voltagem de vertebrados, o surgimento da estrutura atomística do NavAb nos proporciona a primeira, e até então a única, estrutura de alta resolução para estender nossa compreensão sobre outros membros da superfamília VGCC. Dessa forma, de modo a contribuir com o referido tema, consideramos as estruturas AT e RT do Kv1.2, equilibradas na membrana, como guias estruturais em uma série de simulações de dinâmica molecular no intuito de investigar o processo de ativação do canal NavAb. Além de identificar a estrutura cristalográfica do NavAb como um estado intermediário dentro do caminho de ativação, nosso trabalho permitiu determinar conformações relacionadas aos estados fisiológicos funcionais estruturalmente relacionados às estruturas AT e RT. De maneira geral, os resultados suportam a ideia de um mecanismo de ativação altamente conservado ao longo de toda a superfamília de VGCC. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The critical role of voltage-gated cation channels (VGCCs) relies on a complex voltage-dependent activation mechanism linking two physiologically relevant channel states, activated- open (AT) and resting-closed (RT) states. Following the early publication of the x-ray crystal structure of the mammalian Kv1.2 channel in the AT conformation, atomistic models for the RT state of the channel have been proposed. For all of these models, structural analyses demonstrated a consensual explanation of experimental data, thereby highlighting the unambiguous nature of these RT structures. Taken together, these structural studies on Kv1.2 have contributed so far with most of our atomic-level knowledge on the activation mechanism of VGCCs. More recently, the x-ray structure of a prokaryotic voltage-gated sodium channel, NavAb, was resolved in a conformation that was interpreted as representative of the pre-open state of the channel. As one of the possible ancestors of the large family of vertebrate voltage- + ++gated Na and Ca channels, the appearance of the NavAb structure has provided us with a first, and so far unique, template to extend our knowledge towards other members of the large family of VGCCs. Accordingly, in this contribution, we have considered the well-understood AT and RT structures of Kv1.2, equilibrated in a lipid bilayer, as guide structural models to drive a series of molecular dynamics (MD) simulations aimed at to study the activation process of NavAb. While identifying the reported NavAb structure as an intermediate conformation, not fully-activated, our work has enabled us to determine channel conformations likely related to the RT and AT states of the channel. Overall, the structural results support an activation mechanism highly conserved across the entire family of VGCCs.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2008. / Submitted by Suelen Silva dos Santos (suelenunb@yahoo.com.br) on 2009-10-19T16:55:50Z No. of bitstreams: 1 2008_SyomaraHakikoMatusitaSoaresRezende.pdf: 2481803 bytes, checksum: 686b92c7e5facc7b3520a55d4d76d3d6 (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2009-12-03T18:32:54Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_SyomaraHakikoMatusitaSoaresRezende.pdf: 2481803 bytes, checksum: 686b92c7e5facc7b3520a55d4d76d3d6 (MD5) / Made available in DSpace on 2009-12-03T18:32:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_SyomaraHakikoMatusitaSoaresRezende.pdf: 2481803 bytes, checksum: 686b92c7e5facc7b3520a55d4d76d3d6 (MD5) Previous issue date: 2008 / Baculovírus são vírus de inseto com grande potencial de uso em programas de controle biológico principalmente devido ao seu apelo ecológico, uma vez que são altamente específicos ao inseto alvo e não apresentam toxicidade ao homem e ao meio ambiente. Sua produção tem sido feita basicamente pela sua multiplicação no inseto hospedeiro. Porém, a produção de baculovírus em cultivos celulares oferece vantagens em relação à multiplicação in vivo por ser um sistema controlável, estéril, com alta pureza do produto e por dispor de centenas de linhagens de células de inseto estabelecidas. No entanto, sucessivas passagens do vírus em cultura de células podem resultar em alterações genéticas levando à perda de virulência. A alteração mais comum refere-se à formação de mutantes FP (Few Polyhedra) devido a mutações no gene 25k fp. O baculovírus Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) vem sendo utilizado com sucesso como agente de controle da lagarta da soja (A. gemmatalis). Entretanto, sua produção tem sido feita in vivo e pouco se conhece sobre sua produção em cultivos celulares. Nesse trabalho, os efeitos causados pela passagem do vírus AgMNPV em células BTI-Tn-5B1-4 foram estudados. A porcentagem de células contendo muitos poliedros manteve-se alta e constante até a quinta passagem. A partir desse ponto houve uma redução significante na quantidade de células com muitos poliedros com concomitante aumento na quantidade de células com poucos poliedros. Em paralelo, houve um dramático aumento no título viral pela produção de vírus extracelulares (budded virus). Todos esses parâmetros associados à análise ultraestrutural caracterizam a geração de mutantes FP durante a passagem serial do vírus em cultura de células. Adicionalmente, os perfis de restrição do DNA viral obtido em diferentes passagens mostraram similaridade revelando a ausência de grandes modificações genéticas, como deleções e inserções no genoma do vírus. A indicação da presença de alterações menores como mutações pontuais no locus do gene 25k fp foi comprovada pela determinação da sequência nucleotídica deste gene nos mutantes selecionados (sobrenadante da sétima passagem). Mutações pontuais foram detectadas em três clones (FP1, FP3, FP4) na região do gene 25k fp, incluindo sua região promotora, sendo que apenas um clone (FP5) não apresentou qualquer alteração nesse gene. Com base na cinética de síntese de proteínas utilizado marcação radioativa, uma redução na síntese da poliedrina (principal componente protéico dos corpos de oclusão) foi também observada em todos os clones do tipo FP em comparação com o vírus padrão. Além disso, a análise ultraestutrural dos clones FP revelou características típicas de formação de mutantes FP como células com poucos ou nenhum poliedro, produção de poliedros amorfos com baixo número de virions e formação de estroma virogênico com intensa produção de nucleocapsídeos. Finalmente, variantes Many Polyhedra (MP), apresentando um maior número de poliedros por célula e um título de budded virus similar ao vírus parental, foram selecionados como parte de uma estratégia para produção do vírus em escala maior em cultivos celulares (biorreatores). _________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Baculovirus are insect viruses with great application potential for biological control programs due mainly to their ecological appeal, once they are highly specific to the host insect and do not present toxicity to man and to the environment. Their production has been made basically by their multiplication in host insects. Nevertheless, baculovirus production in cell cultures offers advantages over the in vivo multiplication for being a controllable, sterile, high pureness product yield process besides the fact of hundreds of cell lines being already established. However, successive passages of the virus in cell culture result in genetic alterations leading to loss of virulence. The most common alteration is the FP (Few Polyhedra) mutants formation due to mutations in the 25k fp gene. Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) baculovirus is being used successfully as control agent of the soybean caterpillar (A. gemmatalis). However, its production has been made in vivo and little is known on its production in cell cultures. In this work, the effects caused by the passage of the AgMNPV in BTI-Tn-5B1-4 cells was studied. The percentage of cells containing many polyhedra remained high and constant until the fifth passage. From this point on there was a significant reduction in the amount of cells with many polyhedra with concomitant increase in the amount of cells with few polyhedra. In parallel, there was a dramatic increase in the viral titer by production of extracellular virus (budded virus). All these parameters associated to the ultra structural analysis characterize the FP mutants generation during serial passage of the virus on cell culture. Additionally, there was similarity in the viral DNA restriction endonuclease digestion profile of different passages reveling no significant genetic modifications, such as deletions and insertions. The indication that small alterations, such as point mutations, present in the 25k fp gene locus was confirmed by this gene nucleic sequence determination in the selected mutants (seventh passage of supernatant). Point mutations in the 25k fp gene region were detected in three clones (FP1, FP3 and FP4), including its promoter region, and only one clone (FP5) did not present any alteration in this gene. Based on the protein synthesis kinetics using radioactive labeling, a reduction in the polhyedrin synthesis (the main component of the occlusion bodies) in all FP clones was also observed in comparison to the standard virus. Moreover, the ultra structural analysis of the FP clones disclosed typical characteristics of FP mutants formation such as cells with few or no polyhedra, amorphous polyhedra production with low virions number and virogenic stroma formation with intense nucleocapsid production. Finally, Many Polyhedra (MP) variants, presenting a larger number of polyhedra per cell and a similar to the parental virus budded virus titer, were selected as part of a strategy for a larger viral scale up production in cell culture (bioreactors).

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2006. / Submitted by Fernanda Weschenfelder (nandaweschenfelder@gmail.com) on 2009-11-06T13:22:40Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao Luciana Oliveira Pereira.pdf: 3419957 bytes, checksum: 43ae3c1efe69a8a2bbcf0d6b0b0d96bd (MD5) / Approved for entry into archive by Gomes Neide(nagomes2005@gmail.com) on 2010-10-27T13:48:50Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertacao Luciana Oliveira Pereira.pdf: 3419957 bytes, checksum: 43ae3c1efe69a8a2bbcf0d6b0b0d96bd (MD5) / Made available in DSpace on 2010-10-27T13:48:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Luciana Oliveira Pereira.pdf: 3419957 bytes, checksum: 43ae3c1efe69a8a2bbcf0d6b0b0d96bd (MD5) Previous issue date: 2006 / A samambaia Pteridium aquilinum é considerada uma das plantas tóxicas mais importantes, não só por sua extensa distribuição geográfica, mas também por provocar, nas diferentes espécies animais que a utilizam como alimento, severos quadros de intoxicação e o desenvolvimento de tumores nos tratos digestório e urinário. Além disso, estudos epidemiológicos têm relacionado a alta incidência de câncer de esôfago e estômago em populações humanas à utilização da samambaia na alimentação e à exposição indireta aos seus carcinógenos, como pela aspiração de seus esporos e pela ingestão de leite de vacas que se alimentaram da planta ou de água contaminada por tais compostos. Para melhor entender dos mecanismos de toxicidade induzida por essa samambaia, este estudo avaliou os efeitos genotóxicos e citotóxicos do extrato aquoso da planta, em três diferentes concentrações (0,20; 0,40 e 0,67 mg/mL), sobre células de glândula submandibular humana (HSG) e de epitélio bucal (OSCC-3). O ensaio de cometa mostrou que o extrato foi genotóxico para ambas linhagens celulares, nas diferentes concentrações estudadas, mas não de forma dosedependente. O experimento de DNA ladder, por outro lado, não demonstrou fragmentação incomum da cromatina, provavelmente em função de uma baixa percentagem de células com material genético severamente alterado, em comparação àquelas pouco afetadas. As análises morfológica, por microscopia de luz, e ultraestrutural, por microscopia eletrônica de transmissão, permitiram observar que o extrato de P. aquilinum provocou alterações evidentes em ambos tipos celulares, como condensações atípicas na cromatina, picnose nuclear, diminuição no volume das células, ruptura do envoltório nuclear, presença de numerosos vacúolos de tamanhos variados e a formação de corpos apoptóticos. Esses resultados, em conjunto com os obtidos com os ensaios de coloração com alaranjado de acridina/brometo de etídeo e de TUNEL, evidenciaram que extrato foi citotóxico para as células HSG e OSCC-3, em todas as concentrações estudadas, e que a principal via de degeneração celular induzida foi a apoptose. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The bracken Pteridium aquilinum is considered one of the most important toxic plants, not only for its extensive geographic distribution, but also for provoking, in different animal species that use it as food, severe poisoning and the development of tumors in the digestory and urinary tracts. Moreover, epidemiologic studies have related the high incidence of esophagus and stomach cancers in human populations to the use of the bracken as food. This incidence may also be related to the indirect exposition to bracken carcinogens, as by the aspiration of its spores, the ingestion of milk from cows feeding on the plant, or by the consumption of water contaminated by such composites. Aiming to better understand the toxicity mechanisms induced by braken fern, this study evaluated the genotoxic and cytotoxic effects of the plant aqueous extract, at three different concentrations (0.20, 0.40 and 0.67 mg/mL), over human submandibular gland (HSG) and buccal epitelium (OSCC-3) cells. The comet assay showed that the extract was genotoxic for both cell lines, at the different studied concentrations, but the results were not dose-dependent. DNA ladder assay, on the other hand, did not show an unusual DNA fragmentation pattern, possibly due to the low percentage of severely damaged cells. The morphological (light microscopy) and ultrastructural (transmission electron microscopy) analyses showed that the extract provoked conspicuous alterations in both cell types, such as cromatin uncommon condensation, nuclear picnosis, cellular volume decrease, nuclear envelope rupture, the presence of numerous vacuoles of different sizes and the formation of apoptotic bodies. This results, added to those obtained with the acridine orange/ethidium bromide fluorescent dyeing test and in the TUNEL assay, clearly demonstrated that the bracken extract was cytotoxic to HSG and OSCC-3 cells, at all the studied concentrations, and that cellular degeneration occurred mainly by apoptosis.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2006. / Submitted by Kathryn Cardim Araujo (kathryn.cardim@gmail.com) on 2009-11-19T10:26:48Z No. of bitstreams: 1 2006_Rodrigo da Rocha Fragoso.pdf: 5736952 bytes, checksum: 13405ab42e898414d9e1cb8e2ec9d4d4 (MD5) / Approved for entry into archive by Carolina Campos(carolinacamposmaia@gmail.com) on 2009-11-25T19:46:48Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2006_Rodrigo da Rocha Fragoso.pdf: 5736952 bytes, checksum: 13405ab42e898414d9e1cb8e2ec9d4d4 (MD5) / Made available in DSpace on 2009-11-25T19:46:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2006_Rodrigo da Rocha Fragoso.pdf: 5736952 bytes, checksum: 13405ab42e898414d9e1cb8e2ec9d4d4 (MD5) Previous issue date: 2006-10-11 / O nematóide formador de galhas Meloidogyne incognita ("southern root-knot nematode", SRN) apresenta distribuição mundial, causando grandes perdas em várias culturas. Seu ciclo de vida compreende seis estádios de desenvolvimento (ovo, larva 1-4 e adulto). A larva L2, fase infectiva, penetra na raiz de planta hospedeira por força mecânica e degradação enzimática para, então, estabelecer a interação planta-patógeno. Em condições favoráveis, as larvas L2 se diferenciam em fêmeas adultas apomíticas, que completam o ciclo de vida após a deposição de mais de 2000 ovos. As práticas agrícolas atuais não são eficientes contra os fitonematóides, de modo que uma estratégia poderosa e promissora para o controle de nematóides é a produção de plantas transgênicas expressando moléculas que afetam o parasitismo. Proteinases são importantes alvos para o controle de nematóides e o primeiro capítulo descreve um estudo das ESTs codificadoras de aspártico, serino e cisteíno proteinases disponíveis em banco de dados, além da completa caracterização de cDNAs isolados anteriormente. Parece existir um abundância de ESTs de aspártico proteinases em fase larval, quando comparado com ovos e fêmeas. Apenas em bibliotecas de ovos se encontram ESTs de serino proteinase. Por outro lado, ESTs de cisteíno proteinase são as mais abundantes e são encontradas em todas as fases. O cDNA Mi-asp1 codifica uma catepsina D-tipo com vários ortólogos conhecidos em nematóides. Análises de expressão temporal e espacial mostram que Mi-asp1 seja mais transcrito em ovos, do que larvas L2 ou fêmeas, sugerindo um importante papel na embriogênese do nematóide. Já no segundo capítulo, objetivando a identificação de genes envolvidos na infecção e nos processos vitais, uma biblioteca de cDNAs foi construída a partir de mRNA de larvas L2, usando o "Superscript Plasmid System with Gateway Technology for cDNA Synthesis and Cloning" (Invitrogen). A biblioteca de ESTs apresentou 2.137 seqüências validadas com 17% de redundância, distribuídas em 1.506 singlets e 197 contigs, gerados de 631 ESTs. A anotação gênica foi obtida por comparação dos resultados do BLASTx (GenBank). A análise in silico das seqüências obtidas foi feita para predição funcional, agrupamento filogenético, predição de transferência horizontal gênica e determinação da importância na interação planta-patógeno. A predição da função gênica por classificação em categorias KOG demonstrou que várias seqüências são relacionadas com mecanismos de transdução de sinais (13%) e modificações pós-traducionais, renovação de proteínas, chaperonas (12%). Os trabalhos de validação de genes-alvo estão em andamento e incluem ensaios in vitro, in vivo e in planta. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The southern root-knot nematode Meloidogyne incognita (SRN) is worldwide distributed, causing great losses in several crops. Its life cycle comprises six developmental stages (egg, four juveniles and adult). The infective stage larva 2 (L2) enters the host root via mechanical force and enzymatic degradation, and establishes the host-pathogen interaction. Under favorable parasitism conditions the L2 differentiates into an apomitic female adult that resumes its life cycle by depositing up to 2000 eggs. Current agronomic traits are not effective against the SRN, so, a powerful and promising strategy to the nematode control is the production of transgenic plants expressing molecules that are able to hinder the infection process. In this way, the promising one is the anti-feeding strategy based upon digestive enzymes inhibition and the first chapter shows an analysis of EST encoding proteinase from the data bank, beyond the complete characterization of isolated cDNAs. Aspartic proteinase ESTs are more abundant in larval stages than eggs or females. Only eggs library showed serine proteinase ESTs. On the other hand, cysteine proteinase ESTs are the most abundant and are found in all life stages. The Mi-asp1 cDNA encodes a cathepsin D-like with several known nematode orthologues. Temporal and spatial expression analysis showed that Mi-asp1 is most transcribed in eggs than larva L2 or female, suggesting an important role during nematode embryogenesis. In the second chapter, in order to identify the genes involved in the infection and other vital processes, a cDNAs library was constructed from L2 mRNAs using the Superscript Plasmid System with Gateway Technology for cDNA Synthesis and Cloning (Invitrogen). Up to the moment, the L2 cDNA library was constructed, in which 2,137 valid sequences with 17% of redundancy, distributed in 1,506 singlets and 197 contigs, generated with 631 sequences. Sequence annotation was obtained by comparing BLASTx results (GenBank). In silico analysis of obtained sequences were performed functional prediction, phylogenetic grouping, horizontal-transferred genes prediction and determination of plant- pathogen interaction. Prediction of gene function by KOG categories classification demonstrated that several sequences are related to signal transduction mechanisms (13%) and postranslational modification, protein turnover, chaperones (12%). Validation works are in test and include in vitro, in vivo and in planta assays.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2007. / Submitted by mariana castro (nanacastro0107@hotmail.com) on 2009-12-16T16:50:35Z No. of bitstreams: 1 2007_LarissaFernandes.PDF: 9893771 bytes, checksum: 6e9d59dc179f263127c47b316b470fc9 (MD5) / Approved for entry into archive by Joanita Pereira(joanita) on 2010-01-06T16:35:43Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2007_LarissaFernandes.PDF: 9893771 bytes, checksum: 6e9d59dc179f263127c47b316b470fc9 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-01-06T16:35:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2007_LarissaFernandes.PDF: 9893771 bytes, checksum: 6e9d59dc179f263127c47b316b470fc9 (MD5) Previous issue date: 2007 / Paracoccidioides brasiliensis é um fungo termo-dimórfico que causa uma micose sistêmica de alta incidência na América Latina. Devido sua participação no controle de morfogênese, diferenciação e virulência em patógenos, decidiu-se caracterizar os genes ras em P. brasiliensis. Foram identificados ras1 e ras2 que codificam para duas proteínas diferentes com alta identidade. O padrão transcricional de ras também foi investigado por RT-PCR durante a transição micélio para levedura (M→Y), choque térmico a 42ºC e após internalização de leveduras em macrófagos murinos. Ambos os genes foram regulados negativamente em leveduras internalizadas em macrófagos e ras1 foi modulado negativamente a 42ºC. Entretanto, os genes ras não apresentaram variação transcricional durante a transição M→Y. O fato de que as proteínas Ras são localizadas na membrana através de farnesilação, permitiu a análise in silico dos genes que codificam para as subunidades das preniltransferases (farnesiltransferase e geranilgeraniltransferase I): ram1, ram2 e cdc43. P. brasiliensis apresenta em seu genoma todos os genes necessários para maquinaria de prenilação. Um inibidor de farnesiltransferase foi utilizado para investigar a importância desse processo no crescimento vegetativo e transição dimórfica. O bloqueio da farnesilação interferiu com o crescimento vegetativo de leveduras e estimulou a produção de tubos germinativos mesmo a 37ºC. Durante a transição Y→M, o inibidor aumentou a filamentação de maneira dosedependente, indicando que o bloqueio da farnesilação favorece a forma miceliana de P. brasiliensis. Os resultados sugerem que os genes ras devem ter um papel no dimorfismo, resposta a choque térmico e na interação patógeno-hospedeiro. Uma estratégia para estudar a função de ras1 em P. brasiliensis também foi desenhada através de interferência no RNA. Cassetes de silenciamento com ras1 senso e antisenso foram construídos para futura investigação detalhada do papel dos genes ras na patobiologia deste fungo. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Paracoccidioides brasiliensis is a thermo-dimorphic fungus that causes a human systemic mycosis with high incidence in Latin America. Due to their participation in the control of pathogen morphogenesis, differentiation and virulence the characterization of ras genes in P. brasiliensis was done. It was identified ras1 and ras2 coding for two different proteins with high identity. The ras transcriptional pattern was investigated by RT-PCR during mycelium-to-yeast (M→Y) transition, heat shock at 42ºC and after internalization of yeast cells by murine macrophages. Both genes were down regulated inside macrophages and ras1, at 42ºC. In contrast, the ras genes did not show any transcriptional variation during the M→Y transition. The fact that Ras proteins are attached to the membrane via farnesylation prompted the search on Pb gene database for the genes coding the subunits of the prenyltransferases (farnesyltransferase and geranilgeraniltransferase I): ram1, ram2 and cdc43. P. brasiliensis has all genes necessary to the prenylation machinary. Also, a farnesyltransferase inhibitor was used to investigate the importance that process to vegetative growth and dimorphic transition. Farnesylation inhibition interfered with vegetative growth of yeast cells and stimulated germinative tube production even at 37ºC. During Y→M transition the inhibitor increased filamentation in a dose-dependent manner, indicating that impairement of farnesylation favors the mycelium form of P. brasiliensis. The results suggest that ras genes might have a role in dimorphism, heat shock response and in host-pathogen interaction. A strategy to study the ras1 function in P. brasiliensis via RNA interference was designed. Cassettes with ras1 sense and antisense were constructed for further investigate in detail the possible roles of ras genes in this fungal pathogen.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2007. / Submitted by Thaíza da Silva Santos (thaiza28@hotmail.com) on 2009-12-15T19:46:20Z No. of bitstreams: 1 2007_PollyannaPfrimer.pdf: 1059709 bytes, checksum: 8164ee6bf9cb611160660a0168601a11 (MD5) / Approved for entry into archive by Lucila Saraiva(lucilasaraiva1@gmail.com) on 2010-01-18T22:07:47Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2007_PollyannaPfrimer.pdf: 1059709 bytes, checksum: 8164ee6bf9cb611160660a0168601a11 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-01-18T22:07:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2007_PollyannaPfrimer.pdf: 1059709 bytes, checksum: 8164ee6bf9cb611160660a0168601a11 (MD5) Previous issue date: 2007-02-15 / A uricase, uma enzima que converte ácido úrico em alantoína, é comumente usada em kits comerciais de dosagem de ácido úrico. Com a finalidade de produzir esta enzima em grande escala por técnicas de Engenharia Genética, o gene da uricase de Bacillus subtilis subtilis foi clonado e expresso em Escherichia coli. Para tanto, foi feita uma PCR utilizando-se como template o DNA cromossomal de B. subtilis e primers específicos para amplificação do gene pucLM. O amplicon foi sub-clonado seguindo-se seqüenciamento para a confirmação da seqüência do gene e clonagem do gene pucLM no vetor de expressão pET21a. Esse vetor de expressão permite a fusão do gene da uricase com uma cauda de histidina His . O vetor resultante, pETURI, foi usado para 6x transformar as linhagens de E. coli BL21 DE3? pLysS, BL21 (DE3) C41, BL21 (DE3) C43, BL21 (DE3) PRILL e SURE, e a indução da expressão. Amostras da linhagem de E. coli BL21 DE3? pLysS foram selecionadas para o presente estudo. Essas células foram coletadas em diversos tempos de indução e analisadas por SDS-PAGE, que revelou a presença de uma proteína de indução de ~63 kDa. A espectrometria de massa foi utilizada para determinar a massa molecular da enzima recombinante, tendo detectado um íon com massa molecular de 58,67 kDa. Análises de Western Blot confirmaram a presença da cauda de histidina na proteína de indução e detectaram degradação da enzima recombinante na porção N-terminal. A purificação foi realizada em uma coluna de afinidade Ni-NTA. Ensaios enzimáticos detectaram uma proteína estável com pH ótimo 8,0, temperatura ótima entre 25ºC e 37ºC e atividade uricásica na fração eluída com atividade específica de 39 U/mg. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Uricase, an enzyme that converts uric acid into allantoin, is commonly used in commercial kits for uric acid detection. Aiming to produce this enzyme in industrial scale using Genetic Engineering techniques, the uricase gene of Bacillus subtilis subtilis was cloned and expressed in Escherichia coli. In order to achieve this, a PCR was performed using B. subtilis cromossomal DNA as template and specific primers to amplify the gene pucL. The amplicon was sub-cloned following sequencing to confirm the gene sequence and cloning of the gene pucL in vector of expression pET21a. This vector of expression permits the fusion of the uricase gene with a histidine tag His . The resulting vector, pETURI, was used to transform the strains of 6x E. coli BL21 DE3? pLysS, BL21 (DE3) C41, BL21 (DE3) C43, BL21 (DE3) PRILL, and SURE, and the expression was induced by adding IPTG to the culture media. Samples of E. coli BL21 DE3? pLysS strain were selected to be used in the present study. These cells were collected in several induction times and analyzed by SDS- PAGE, which revealed the presence of a ~63-kDa induction protein. Mass espectrometry was used to determine the molecular mass of the recombinant enzyme, having detected an ion with molecular mass of 58,67 kDa. Western Blot analyses confirmed the presence of the histidine tag in the induction protein and detected degradation of the recombinant enzyme in the N-terminal portion. Purification was carried out in Ni-NTA affinity column. Enzymatic essays detected a stable protein with optimum pH 8.0, optimum temperature ranging from 25ºC and 37ºC, and uricase activity in the eluding fraction with specific activity of 39 U/mg.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2008. / Submitted by Thaíza da Silva Santos (thaiza28@hotmail.com) on 2010-02-27T13:10:04Z No. of bitstreams: 1 2008_LiliamOliveiraFariaMacaneiro.pdf: 5316928 bytes, checksum: 8b6b4bf2363826478be7e3e2b86f38e9 (MD5) / Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2010-03-02T00:08:13Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_LiliamOliveiraFariaMacaneiro.pdf: 5316928 bytes, checksum: 8b6b4bf2363826478be7e3e2b86f38e9 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-03-02T00:08:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_LiliamOliveiraFariaMacaneiro.pdf: 5316928 bytes, checksum: 8b6b4bf2363826478be7e3e2b86f38e9 (MD5) Previous issue date: 2008-09-12 / Trypanosoma cruzi, agente etiológico da Doença de Chagas, pode persistir por muitos anos no hospedeiro mamífero, sugerindo que este parasita escapa do sistema imunológico através da regulação negativa nas vias de processamento de antígenos. Dentro da via de apresentação de antígenos intracelulares MHC classe I, a grande maioria de peptídeos antigênicos é gerada pelo proteassoma, um complexo multicatalítico responsável pela degradação intracelular de proteínas. Em vertebrados, três subunidades catalíticas b1i, b2i e b5i, cuja expressão é induzida pela citocina interferon-g (IFN-g), substituem três subunidades catalíticas constitutivas b1, b2 e b5 na partícula 20S do proteassoma, formando o imunoproteassoma. Neste trabalho, nós analisamos se a composição ou a expressão de proteassomas 20S e imunoproteassomas foi alterada em células HeLa e L6 infectadas pelo T. cruzi. Experimentos de RT-PCR e de eletroforese bidimensional comparando células controle e infectadas, com e sem tratamento com IFN-g não apresentaram diferença na composição do imunoproteassoma ou na expressão de suas subunidades em ambos os tipos celulares. No entanto, as atividades símile tripsina e símile quimotripsina do proteassoma foram 2,5 e 3,6 vezes maiores nas células infectadas com T. cruzi, do que nas células não infectadas. Entretanto, o nível de expressão protéica das subunidades b1i e b2i do imunoproteassoma foi reduzido quase pela metade em células HeLa infectadas com T. cruzi e tratadas posteriormente com IFN-g por 24 h. Este resultado sugere que a formação do imunoproteassoma é inibida em células infectadas pelo T. cruzi com posterior tratamento com IFN-g, por um mecanismo de regulação traducional das subnidades induzidas. / Trypanosoma cruzi, the etiological agent of Chagas’ disease, may persist for many years in its mammalian host, suggesting that this parasite escape from the immune surveillance by down regulating antigen processing pathway. In the MHC class I pathway, the vast majority of antigenic peptides are generated by the proteasome, a multicatalytic complex responsible for the degradation of intracellular proteins. In vertebrates, three catalytic subunits b1i, b2i and b5i, whose expression is induced by the cytokine gamma interferon (IFN-g), replace the three constitutive catalytic subunits b1, b2 and b5 in the core 20S proteasome, generating the immunoproteasome. Here, we analysed whether proteasome subunit composition or expression of the proteasome 20S and immunoproteasome were altered upon infection of HeLa and L6 cells by T. cruzi. RT-PCR and two-dimensional gel electrophoresis experiments comparing non-infected or infected cells, untreated or treated cells with IFN-g did not show differences between the immunoproteasome and expression of its mRNA subunits. However, the proteasome’s trypsin-like and chymotrypsin-like activities were 2.5 and 3.6 times higher in infected cells than in non-infected cells. On the other hand, in infected HeLa cells followed by treatment with IFN-g for 24 h, expression of the immunoproteasome b1i and b2i subunits was reduced. This result indicates that the generation of immunoproteasomes is inhibited in T. cruzi-infected cells followed treating with IFN-g by a posttranslational mechanism of the inducible subunits.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, 2009. / Submitted by Larissa Ferreira dos Angelos (ferreirangelos@gmail.com) on 2010-03-29T18:28:40Z No. of bitstreams: 1 2009_LeandroNogueiraRamos.pdf: 1947338 bytes, checksum: b0d1d970d899c30989e722fb6a263700 (MD5) / Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2010-04-06T19:43:46Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_LeandroNogueiraRamos.pdf: 1947338 bytes, checksum: b0d1d970d899c30989e722fb6a263700 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-04-06T19:43:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_LeandroNogueiraRamos.pdf: 1947338 bytes, checksum: b0d1d970d899c30989e722fb6a263700 (MD5) Previous issue date: 2009 / O arroz (Oryza sativa L.) é um dos principais cereais cultivados no Brasil, desempenhando um papel social e econômico de grande importância para as mais diversas regiões do país. Esse cereal é conduzido no Brasil sob dois principais sistemas de cultivo, o irrigado, tipicamente utilizado nos estados da região Sul do país e o de sequeiro, tradicional na abertura de novas áreas e nas regiões Centro, Norte e Nordeste do Brasil. Para cada sistema de cultivo são utilizados grupos de cultivares adaptadas a condições específicas, principalmente quanto ao fornecimento de água. (sem parágrafo) A brusone, causada pelo fungo Pyricularia grisea (Cooke) Sacc. cuja fase teleomórfica corresponde a Magnaporthe grisea (Barr), é um dos principais fatores limitantes para a cultura do arroz no Brasil e no mundo. O controle é feito, principalmente, pelo uso de cultivares resistentes e fungidas. No entanto, o controle químico através de fungicidas específicos, além de elevar o custo de produção do cereal, causa vários danos ao meio ambiente, e deve ser utilizado integrado a outras técnicas de manejo. Programas de melhoramento genético de arroz são conduzidos no país por diferentes instituições, gerando, a cada ano, novas cultivares de arroz com resistência vertical a brusone. A estreita base genética dos programas de melhoramento tem contribuído para a quebra de resistência das novas cultivares lançadas por estes programas em apenas 1 ou 2 anos após o lançamento, especialmente no Estado do Tocantins. Quebras de resistência em período tão curto apontam para a necessidade busca de fontes de resistência duráveis à brusone, especialmente nas regiões tropicais de cultivo de arroz, onde a variabilidade genética do patógeno é alta. Para tanto, é de suma importância o conhecimento sobre as populações do patógeno e de suas interações com as plantas hospedeiras. O conhecimento mais aprofundado das características das populações de Magnaporthe grisea da região Centro-Norte do Brasil é condição fundamental na orientação dos programas de melhoramento do hospedeiro. O patossistema arroz/brusone é estudado há muito tempo em várias partes do mundo. Porém, no Brasil ainda foi pouco explorado, havendo necessidade de pesquisas em regiões com alto potencial produtivo, como os Estados do Pará, Rondônia, Acre, Tocantins e Maranhão, especialmente em virtude da expansão da fronteira agrícola do arroz de sequeiro. Objetivou-se, a partir do presente trabalho, identificar a estabilidade da cultivar Oryzica Llanos 5 (modelo de cultivar com resistência durável, oriunda da Colômbia) quando inoculada com isolados de M. grisea coletados na região Centro-Norte do Brasil, mediante avaliações de parâmetros epidemiológicos como período de incubação, latência, severidade e agressividade da doença. Além disso, objetivou-se detectar, a partir de estudos moleculares, a variabilidade genética e a estrutura populacional de isolados coletados no Tocantins, Goiás e Pará. No capítulo 1 desta dissertação descreve-se a ocorrência de isolados de M. grisea, coletados nos estados do Centro-Norte do Brasil, capazes de quebrar a resistência genética na cultivar Oryzica Llanos 5, padrão de resistência à doença, e examinam-se possíveis interações entre a virulência a esta cultivar e alguns parâmetros monocíclicos das epidemias de brusone. Para tanto, foram avaliados 35 isolados monospóricos de M. grisea obtidos nos municípios de Lagoa da Confusão, Dueré, Formoso do Araguaia (Tocantins), Luiz Alves do Araguaia (Goiás) e Paragominas (Pará). Objetivando-se a quantificação do desenvolvimento micelial dos isolados in vitro, calculou-se, a cada 3 dias, a área da colônia, a partir da qual obteve-se a área sob a curva de crescimento micelial (ASCCM) para cada um dos isolados. Os parâmetros epidemiológicos (período de incubação, período de latência, severidade da doença e área sob a curva de progresso da doença ASCPD), foram determinados em casa de vegetação, para todos os 35 isolados em três variedades de arroz (Caloro e Fanny suscetíveis; Oryzica Llanos 5 resistente). As plantas foram avaliadas a cada três dias através de análise visual baseada em uma escala de notas de sete classes (0, 1, 3, 4, 5, 7 e 9). No estudo in vitro, houve diferença significativa (p0,05) da ASCCM entre os isolados, independente do local de coleta. Nos experimentos de casa de vegetação, o período de incubação nas cultivares suscetíveis variou entre 1,00 dia (isolado F-2) e 5,75 dias (isolado LA-2) em Caloro; e entre 1,00 dia (isolado F- 2) e 6,25 dias (isolado LA-2) em Fanny. Quando os isolados monospóricos foram inoculados na cultivar resistente Oryzica Llanos 5, observou-se que 34% dos isolados estudados apresentaram quebra de resistência (F-1, F-2, F-5, F-9, F-10, LC-1, LC-2, LC-4, D-2, P-2 e P- 6). Os isolados que quebraram resistência apresentaram os menores períodos de incubação (ex. isolado D-1, 2,0 dias), enquanto que os isolados que não quebraram resistência apresentaram os maiores períodos de incubação (ex. isolado LA-2, 6,25 dias). Isolados que quebraram resistência apresentaram também o menor período de latência. Observou-se forte correlação positiva entre a severidade da doença aos 6, 9 e 12 DAI e a ASCPD, e uma significativa correlação negativa entre período de incubação ou de latência e a ASCPD. As ASCPDs nas cultivares suscetíveis foram maiores que no padrão de resistência. É importante ressaltar a quebra de resistência genética da cultivar Oryzica Llanos 5, até o momento considerada como padrão de resistência, por isolados de M. grisea coletados no Centro-Norte do Brasil. O resultado desses estudos demonstra claramente a alta diversidade genética do patógeno nesta região. No capítulo 2, objetivou-se identificar a diversidade genética e a estrutura de população de isolados monospóricos coletados em lavouras comerciais de arroz nos Estados de Tocantins, Goiás e Pará. Para tanto, conduziram-se ensaios na Embrapa-CENARGEN, onde foram avaliados 140 isolados monospóricos de M. grisea obtidos nos municípios de Lagoa da Confusão, Dueré e Formoso do Araguaia (Tocantins), Luiz Alves do Araguaia (Goiás) e Paragominas (Pará). Neste estudo, 34 marcadores microssatélites marcados com fluorocromo foram utilizados para a genotipagem automática em sequenciador de DNA. Quatorze marcadores microssatélites mostraram-se altamente eficientes para estimar a diversidade genética e detectar estruturação em população de isolados monospóricos de M. grisea. Alguns deles apresentaram um conteúdo informativo elevado, facilitando a genotipagem em escala e propiciando alta eficiência na análise de polimorfismo de DNA. A média do número de alelos por loco foi 6,35, variando de 2 alelos para os marcadores ms 109 - 110, ms 115 - 116, ms 61 - 62 a 16 alelos para o marcador PG 27. Os índices de diversidade genética (DG), conteúdo polimórfico informativo (PIC) e probabilidade de identidade (PI), confirmaram a eficiência destes marcadores. A população de isolados de M. grisea do Centro Norte do Brasil apresentou substruturação em três sub-populações (K=3). Os isolados de Goiás (Luiz Alves) em sua maioria foram observados no Grupo 1, os isolados de Tocantins (Formoso, Dueré e Lagoa da Confusão) em sua maioria foram observados no Grupo 2 e os isolados do Pará (Paragominas) foram observados no Grupo 3. Os isolados do Pará são os mais distantes geneticamente em relação aos isolados de Goiás e Tocantins. A alta diversidade genética observada na metapopulação de M. grisea do Centro-Norte brasileiro, assim como a evidência de estruturação, sugerem a necessidade de monitoramento específico e emprego de estratégias adequadas pelos programas de melhoramento genético para as sub-populações detectadas. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Rice (Oryza sativa L.) is one of the main cereals cultivated in Brazil, carrying an important social and economical role in several geographical regions. Rice is cultivated in Brazil in two main cropping systems, irrigated, typical of the Southern region and dry land (sequeiro), tradicionally used for opening new areas in the Center, Northern and Northeastern parts of Brazil. For each cultivation system, a group of cultivars, especially adapted to each condition, are used. Rice blast, caused by the fungus Pyricularia grisea (Cooke) Sacc. teleomorph Magnaporthe grisea (Barr), is one of the main limiting factors to rice production in Brazil and elsewhere. Control is mainly by a combination of resistant cultivars and fungicides. However, the use of fungicides increases production costs and may be damaging to the environment, and should be used integrated with other disease management techniques. Several rice breeding programs are conducted in Brazil by a number of different research institutions, every year offering new rice cultivars with vertical resistance to blast to growers. Unfortunately, the narrow genetic basis of the breeding programs has contributed to resistance breakdown of these new rice cultivars just 1 or 2 years after release, as has been observed in the State of Tocantins. Resistance breakdown in such a short period of time points towards the need to find and select durable sources of resistance, especially in the tropical regions, where genetic variability of the pathogen is seemingly very high. However, before beginning the search of sources of host resistance, knowledge of the pathogen population variability is very important, as well as of its interactions with its plant host. Deeper knowledge of the populations of Magnaporthe grisea from Central-North Brazil is a fundamental condition for the orientation of rice breeding programs. The rice blast pathosystem has been studied for some time in other geographic regions, but is still hardly explored in Brazil. Therefore, there is a pressing need to conduct prospective diversity research of the pathogen in regions with high yielding potential, such as the States of Pará, Rondônia, Acre, Tocantins and Maranhão, especially taking into account the expansion of dry land rice. This study aimed to describe the stability of rice cultivar Oryzica Llanos 5 (standard of durable resistance, originated in Colômbia) when inoculated with M. grisea isolates of collected in the Center-Northern Brazil, by estimations of epidemiological parameters, such as period of incubation, latent period, severity and pathogen aggressiveness. In addition, the genetic variability and the populational structure of M. grisea isolates collected in the States of Tocantins, Goiás and Pará were examined by molecular studies. Chapter 1 describes the discovery of isolates of M. grisea from the States of Tocantins (TO), Goiás (GO) and Pará (PA), capable of breaking the resistance of cv. Oryzica Llanos 5, the standard of genetic resistance to rice blast, and examines possible interactions between virulence and some monocyclic components of rice blast epidemics. Towards that end, thirtyfive monosporic isolates of M. grisea from the counties of Lagoa da Confusão, Dueré, Formoso do Araguaia (TO), Luiz Alves do Araguaia (GO) and Paragominas (PA) were studied. Radial mycelial growth was determined in vitro, every third day, and the area under the curve of mycelial growth (AUCMG) of each isolate was compared. Epidemiological parameters (period of incubation, latent period, disease severity and the area under disease progress curve AUDPC) were estimated in the greenhouse, for each of the thirty-four isolates in three rice cultivars (Caloro and Fanny susceptible; Oryzica Llanos 5 resistant). Plants were evaluated visually every third day, with the aid of a diagrammatic scale of seven classes (0, 1, 3, 4, 5, 7 and 9). In the in vitro study, the AUCMG was significantly different among isolates (p0,05), irrespective of geographical origin. Period of incubation in susceptible cultivars varied from 1.00 day (isolate F-2) to 5.75 days (isolate LA-2) on Caloro; and between 1.00 day (isolate F-2) to 6.25 days (isolate LA-2) on Fanny. When the monosporic isolates were inoculated on resistant cv. Oryzica Llanos 5, 34% broke its resistance (F-1, F-2, F-5, F-9, F-10, LC-1, LC-2, LC-4, D-2, P-2 e P-6). The isolates that broke Oryzica Llanos 5 resistance also had the shortest incubation periods (e.g. isolate D-1, 2.0 days), while the isolates that did not show resistance breakdown, generally had the longest incubation periods (e.g. isolate LA-2, 6.25 days). Isolates virulent on Oryzica Llanos also had the shortest latent periods. A significant and positive correlation was observed between disease severity at 6, 9 and 12 days after inoculation and the AUDPC, and a significant and negative correlation was generally observed between period of incubation or latent period and the AUDPC. The AUDPCs of susceptible cultivars were larger than in the resistant cultivar. The resistance breakdown of cv. Oryzica Llanos 5, so far the resistant standard, by isolates of M. grisea from the Brazilian Central-North region is reported here for the first time and is a clear indication of the high genetic diversity of the pathogen in this region, which therefore poses a great threat to rice production in Brazil. In chapter 2, monosporic isolates collected at commercial rice farming at the states of Tocantins, Goiás and Pará were examined for genetic diversity and population structure. In order to examine the diversity, essays were conducted at Embrapa-CENARGEN, where 140 M. grisea monosporic isolates obtained from the counties of Lagoa da Confusão, Dueré and Formoso do Araguaia (Tocantins), Luiz Alves do Araguaia (Goiás) and Paragominas (Pará) were evaluated. For this study, 34 microsatelite markers marked with fluorochrome were used for automatic genotyping in DNA sequencing. Fourteen microsatelites markers appeared highly efficient to estimate genetic diversity and to detect structuration in the M. grisea metapopulation from Central-North Brazil. Some of them had high informative content, facilitating genotyping in scale and DNA polymorphism analysis. The medium number of alleles per loco was 6.35, varying from 2 alleles by markers ms 109 110, ms 115 - 116, ms 61 62 to 16 alleles by marker PG 27. Genetic diversity index (GD), informative polymorphic content (IPC) and identity portability (IP), confirmed these markers efficiency. M. grisea metapopulation from Central-North Brazil was substructured in three sub-populations (K=3). Goiás (Luiz Alves) isolates were mostly observed in Group 1, Tocantins (Formoso, Dueré and Lagoa da Confusão) isolates were mainly observed in Group 2 and Pará (Paragominas) isolates were all observed in Group 3. Group 3 isolates (Pará) were the most genetically distant in relation to isolates of Goiás and Tocantins. The high genetic diversity observed in the M. grisea metapopulation, as well as the evidence of populational sub-structures, suggest the need of specific monitoring and the use of adequate strategies by genetic improvement programs to each of the sub-populations identified.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2009. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2010-03-31T12:08:06Z No. of bitstreams: 1 2009_ViniciusFiuzaDumas.pdf: 2487859 bytes, checksum: 18a4a6f267ffbccc4a5f9c47d3328dc3 (MD5) / Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2010-05-12T14:43:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_ViniciusFiuzaDumas.pdf: 2487859 bytes, checksum: 18a4a6f267ffbccc4a5f9c47d3328dc3 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-05-12T14:43:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_ViniciusFiuzaDumas.pdf: 2487859 bytes, checksum: 18a4a6f267ffbccc4a5f9c47d3328dc3 (MD5) Previous issue date: 2009-05-15 / Nas últimas décadas, a agricultura mundial vem crescendo exponencialmente. Culturas como as da soja recebem destaque por influenciar na geração de divisas e empregos em todo mundo. Essa cultura está vulnerável a diversas pragas, dentre estas, destaca-se a lagarta da soja, Anticarsia gemmatalis Hübner, 1818 (Lepidoptera: Noctuidae), que é a principal desfolhadora da soja no Brasil. Além de provocar danos econômicos no setor agrícola, os insetos podem causar problemas relacionados à saúde pública. O principal exemplo é o Aedes aegypti, que é o vetor de doenças como a dengue e a febre amarela. Uma alternativa para o controle desses insetos é a utilização de agentes de controle biológico, como Bacillus thuringiensis (Bt). Essa bactéria possui a capacidade de produzir inclusões protéicas (proteínas Cry e Cyt) tóxicas para insetos e são largamente utilizadas no controle de pragas na agricultura e no controle de vetores de doenças humanas. Desta forma, o estudo do modo de ação e toxicidade dessas proteínas é importante para um melhor entendimento dos mecanismos de interação entre o patógeno e as pragas. Este trabalho teve como objetivo determinar a toxicidade de quatro proteínas Cry de B. thuringiensis para populações susceptíveis e resistentes de A. gemmatalis, e a construção de um baculovírus e de uma estirpe de Bt recombinantes contendo o gene cyt1Aa. Para o primeiro trabalho, as proteínas Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac e Cry2Aa foram expressas individualmente por estirpes de Bt. As proteínas foram purificadas, solubilizadas, ativadas com tripsina e biotiniladas para a realização de bioensaios, ensaios de ligação e ensaios de competição heteróloga. O ensaio de ligação mostrou que ocorreu interação entre todas as proteínas e os receptores das duas populações de lagartas. O ensaio de competição heteróloga e os bioensaios demonstraram haver competição das proteínas pelos mesmos sítios de ligação para a população resistente de A. gemmatalis e que essa população tornou-se resistente, provavelmente, devido a alterações nos seus receptores. Além disso, os resultados obtidos nos bioensaios demonstraram que, apesar de todas as toxinas testadas apresentarem toxicidade para lagartas de segundo instar de A. gemmatalis, as proteínas Cry1Ab e Cry1Ac possuem toxicidade elevada quando comparadas com as outras proteínas testadas. No segundo trabalho, o gene cyt1Aa da estirpe S1806 de B. thuringiensis subsp. israelensis, foi amplificado por PCR, clonado em um vetor de clonagem e seqüenciado. A análise da seqüência do gene mostrou 100% de identidade com o gene cyt1Aa depositado no GenBank. O gene foi removido do vetor de clonagem, introduzido em um vetor de transferência (pFastBacTM1) e transferido para o genoma do baculovírus AcMNPV, utilizando o sistema Bac-to-Bac (Invitrogen), originando o baculovírus recombinante vFastCyt1Aa. Entretanto, a expressão da proteína recombinante não foi detectada em células de inseto infectadas com o vFastCyt1Aa. Além disso, o gene cyt1Aa foi inserido em um vetor de expressão para células de Bt (pSVP27A) e o plasmídeo recombinante (pSVPcyt1Aa) foi introduzido em uma estirpe de Bt acristalífera. Uma proteína de 27 kDa correspondente ao tamanho esperado para a proteína recombinante Cyt1Aa foi detectada por SDS-PAGE e Western-Blot de extratos de Bt recombinante. Entretanto, o extrato do Bt recombinante mostrou baixa toxicidade para mosquitos. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / In the last decades, the world agriculture has grown exponentially. Crops like soybean have an important role in increasing foreign exchange and jobs all over the world. However, this crop is vulnerable to a diversity of insect pests that cause great economic losses. Among these insect pests, the soybean caterpillar, Anticarsia gemmatalis Hubner, 1918 (Lepidoptera: Noctuidae) is the main defoliator of soybean in Brazil. Besides the economic damage in agriculture, insects can also cause public health problems. Aedes aegypti, the vector of the dengue and yellow fever diseases is the main example. One alternative to control this insect is the use of biological control agents such as Bacillus thuringiensis (Bt). This bacterium produces protein inclusions (Cry and Cyt proteins) that are toxic to insects and are widelly used for the control of insect pests in agriculture and for the control of human disease vectors. Therefore, the study of the toxins mode of action and toxicity has a great importance for understanding the mechanisms of interaction between insect pests and their patogens. The aim of this study was the toxicity determination of four Cry proteins of B. thuringiensis to resistant and susceptible A. gemmatalis populations, and the construction of recombinant baculovirus and Bt containing the cyt1Aa gene. For the first work, the proteins Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac e Cry2Aa were expressed individually by Bt strains. The proteins were purified, solubilized, activated with trypsin and biotinilated for bioassays, binding assays and heterologous competition assays. The binding assay showed binding affinities between all the proteins and the receptors in both populations of caterpillars. The heterologous competition assay and the bioassays showed competition between proteins for the same binding site in the resistant population of A. gemmatalis and this population became resistant probably because of modifications in their receptors. Besides that, the results of the bioassays demonstrate that Cry1Ab and Cry1Ac have higher toxicity to second instar larvae of A. gemmatalis when compared to the others toxins tested. In the second work, the cyt1Aa gene from the strain S1806 of B. thuringiensis subsp. israelensis was amplified by PCR, cloned in a vector and sequenced. The sequence analyses showed that the cloned gene from strain S1806 has 100% identity with a cyt1Aa gene deposited in GenBank. The gene was removed from the cloning vector, introduced into a transfer vector (pFastBacTM1) and transferred to the baculovirus genome AcMNPV, using the Bac-to-Bac system (Invitrogen), originating the recombinant baculovírus vFastCyt1Aa. However, no recombinant protein expression was detected in insect cells infected with vFastCyt1Aa. Furthermore, the cyt1Aa gene was also inserted in an expression vector for Bt cells (pSVP27A) and the recombinant plasmid (pSVPcyt1Aa) introduced into an acrystalliferous strain of Bt. A 27 kDa protein of the expected size for the recombinant Cyt1Aa was detected by SDS-PAGE and Western-Blot in recombinant Bt extracts. However, the recombinant Bt extracts showed low toxicity towards mosquitoes.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2009. / Submitted by Raquel Viana (tempestade_b@hotmail.com) on 2010-04-12T17:42:29Z No. of bitstreams: 1 2009_MarcianoRegisRubini.pdf: 2622231 bytes, checksum: f773aa263b3bbdea97f0aa7e2286386a (MD5) / Approved for entry into archive by Lucila Saraiva(lucilasaraiva1@gmail.com) on 2010-05-03T21:06:00Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_MarcianoRegisRubini.pdf: 2622231 bytes, checksum: f773aa263b3bbdea97f0aa7e2286386a (MD5) / Made available in DSpace on 2010-05-03T21:06:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_MarcianoRegisRubini.pdf: 2622231 bytes, checksum: f773aa263b3bbdea97f0aa7e2286386a (MD5) Previous issue date: 2009-08 / Neste trabalho foram realizados estudos pioneiros de Biologia Molecular com o fungo Penicillium echinulatum linhagem 9A02S1 (DSM 18942), que resultaram no primeiro isolamento e caracterização de um cDNA correspondente ao gene egl1, codificador da endoglicanase 1 (EGL1). O cDNA egl1 foi obtido a partir de uma biblioteca construída sob condições de indução do sistema celulolitico deste fungo. Sua sequência, de 1161 pares de bases, exibe alto grau de identidade com genes de endoglicanases fúngicas da família 5A. Este codifica uma proteína predita de 387 resíduos de aminoácidos, com massa molecular de 41,1 kDa, ponto isoelétrico teórico de 4,99 e um sitio potencial de N glicosilação. A proteína predita possui três diferentes domínios: um domínio catalítico, um domínio de ligação à celulose (CBD) altamente conservado, e uma região de conexão entre os dois domínios (hinge). A partir da seqüência predita de aminoácidos de EGL1 foi possível realizar a modelagem tridimensional, utilizando-se proteínas existentes em banco de dados (PDB). Tal proteína apresenta propriedades estruturais similares às endoglicanases da família 5A. O cDNA egl1 foi clonado em um vetor de expressão de Pichia pastoris, pPIC9. Após a transformação, clones recombinantes exibindo maior atividade enzimática foram selecionados, utilizando-se micro-fermentações em placa Deep Well. Após a seleção do melhor clone produtor, foram avaliadas as propriedades bioquímicas da enzima recombinante, bem como a otimização das condições de cultivo e posterior caracterização de sua cinética enzimática. A enzima recombinante expressa em P. pastoris apresenta características de particular interesse para a utilização em processos indústriais: uma atividade ótima na faixa de pH 5,0 – 9,0, temperatura ótima a 60°C, exibindo alta termoestabilidade a 70°C após uma hora de pré-incubação, sendo a atividade da EGL1 recombinante fortemente estimulada pela adição do íon cálcio na reação. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / This work describes the pioneering molecular biology studies with the fungus Penicillium echinulatum lineage 9A02S1 (DSM 18942), which resulted in the first isolation and characterization of a cDNA corresponding to an egl1 gene, encoding a endoglucanase 1 (EGL1). The egl1 cDNA was obtained from a library constructed under induction conditions of the cellulolytic system of this fungus. The cDNA sequence is 1,161 base pairs long, showing high identity scores with genes of fungal endoglicanases family 5A. It encodes a predicted protein of 387 amino acid residues, with molecular mass of 41.1 kDa, theoretical isoelectric point of 4.99 and a potential site of N-glycosylation. The predicted protein has three different domains: a catalytic domain, a highly conserved carbohydrate binding domain (CBD), and a region linking the two domains (hinge). From the predicted amino acid sequence of EGL1 it was possible to perform a three-dimensional modeli, using protein sequences deposited in data bank (PDB). The solved structure revealed that this protein displays structural properties similar to those observed in family 5A endoglucanases. The egl1 cDNA was cloned in a Pichia pastoris expression vector, pPIC9. Following transformation, recombinant clones with higher enzymatic activity were selected, using microfermentations in Deep Well plates. After selecting the best producer clone, we evaluated the biochemical properties of recombinant enzyme, as well as the optimization of culture conditions and subsequent characterization of the enzyme kinetics. The recombinant EGL1 secreted by the recombinant P. pastoris revealed characteristics of particular interest for industrial applications: an optimal activity over a broad range pH (5.0 – 9.0) and an optimal temperature of 60°C. The recombinant EGL1 showed high thermostability at 70°C after 1 h of pre-incubation, and the activity of recombinant EGL1 was strongly stimulated by the addition of calcium ion in the reaction.